Izolace, separace a detekce...
Transcript of Izolace, separace a detekce...
Izolace, separace a detekce proteinůa nukleových kyselin a jejich význam
VOJTĚCH ADAM
Životní prostředí
Ionty kovů (M)
2GS - MGSH
GSH
GSH Fytochelatinsyntáza
*Aktivace*
PC - M
M
M
VAKUOLA
2GS - MPC - M
Fytochelatiny(γ-glu-cys)n-gly
Rostlinná buňka Živočišná buňka
MTF-1
MREmRNA
MT
MTF-1
MTIMTI
(b)
(c)
(d)
MTF-1
M
M
(a)
Obranné mechanismy
O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 192, 794-800.V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.
I. Genová exprese
II. Rostlinné obranné mechanismy
III. Živočišné obranné mechanismy
Obsah
Obsah
I. Genová exprese
II. Rostlinné obranné mechanismy
III. Živočišné obranné mechanismy
Pokročilé materiály v izolaci nukleových kyselinI. Genová exprese
D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.
A. Přidání vzorku
B. Izolace nukleové kyseliny
C. Separace pomocí magnetu
D. Promývání E. Ohřev
F. Získání cílové molekuly
G. Adsorpce na povrch molekuly
H. Promytí I. Měření
Referentní elektroda
Pracovní elektroda Pomocná
elektroda
Potenciostat/ Galvanostat
85 C
Promývání
3x
Elektrochemická detekce
Promývání
3x
85°CC
A
B
A
D3
2
1
4
5
6
7
8
9
1011
12
2
3
4
5
6
7
13
14
15
16
Izolace nukleových kyselin
D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.
POTENCIOSTAT
GALVANOSTAT
potenciostat
Elektrochemická detekce
Signal
Poloautomatická Automatická
I. Genová exprese
70
80
90
100
110
40 35 30 25 20 15 1050
60
70
80
90
100
110
3.6 3.8 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2
35
55
75
95
170 220 270 320
pH
Frekvence (Hz)
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300Doba akumulace (s)
Teplota (°C)
0
2
4
6
8
0 5 10 15
y = 0.5302x + 0.1444R2 = 0.9901
Koncentrace poly(A) (µg/ml)V
ýška
pík
u
-1.3 -1.4 -1.5 -1.6 -1.7
Square wave voltametrie
1000 (nA)
Potenciál (V)
Výš
ka p
íku
(%)
Výš
ka p
íku
(%)
Výš
ka p
íku
(%)
Výš
ka p
íku
(%)
A B C
D E F
Optimalizace elektrochemické detekce nukleových kyselin
D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.
I. Genová exprese
Je separace založená na paramagnetických částicích v kombinaci s elektrochemickou detekcí využitelná pro analýzu reálných
vzorků?
I. Genová exprese
Izolace mRNA z reálného vzorku
D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411. D. Huska et al. (2009) Chem. Listy, 103, s167-s171.
0
35
70
105
0 5 10 25 50 100
kořen
stonek
Aplikovaná koncentrace kadmia (µM)
Obs
ah m
RN
A (%
)
50 10 5025 100
Kontrolní rostliny
100 mM Cd(II)
0 24 48 72 96 120
50 mM Cd(II)
Doba kultivace (hod.)
Aplikovaná koncentrace kadmia (µM)
I. Genová exprese
Obsah
I. Genová exprese
II.Rostlinné obranné mechanismy
III. Živočišné obranné mechanismy
Fytochelatiny• Významný rostlinný peptid, který má
základní strukturu (-Glu-Cys)n-Gly.• Dipeptidická repetice glutamové
kyseliny a cysteinu (-Glu-Cys) semůže opakovat 2 až 11krát.
• Molekula glutathionu (γ-Glu-Cys-Gly)je substrátem pro syntézufytochelatinů.
• Hlavní funkce této skupiny peptidů jedetoxikace těžkých kovů, která probíhávazbou na thiolové skupiny peptiduschopnost interakce.
II. Rostlinné obranné mechanismy
cystein
Sírany
Methionin
Protein
Redukovaný glutathion
Fytochelatin2
Fytochelatin syntázaII. Rostlinné obranné mechanismy
Cd2+
2GS - CdGSH GSH
GSH FYTOCHELATINSYNTÁZA
*AKTIVACE*
PC - Cd
Cd2+
Cd2+
VAKUOLA
2GS - CdPC - Cd
FYTOCHELATINY(γ-glu-cys)n-gly
γ-glu-cys-gly + γ-glu-cys-gly
γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly
γ-glu-cys- γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly(γ-glu-cys)n=3-gly
(γ-glu-cys) n=2–glyγ-glu-cys-gly
n = 4
n = 5
γ-glu-cys-gly FYTOCHELATIN SYNTÁZA
O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 6, 1367-1381.
Jak komplexně hodnotit reakci rostliny na přítomnost těžkého kovu?
II. Rostlinné obranné mechanismy
Tabáková BY-2 buněčná lineII. Rostlinné obranné mechanismy
Kultivace BY-2 buněk s přídavkem různých koncentrací Cd(II) iontů během třídenní kultivace v tekutém médiu Murashige and Skoog.
• Životnost buněk – stanovena pomocí esterázové aktivity
• Celkový obsah Cd(II) v BY-2 buňkách – stanoven pomocí diferenčnípulzní voltametrie
• Obsah fytochelatinu2 jako produktu fytochelatin syntázy – stanovenpomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickoudetekcí
0 µM 5 µM 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM
O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.
Aktivace fytochelatin syntázyII. Rostlinné obranné mechanismy
N2 (l) Fosfátový pufrs trikarboxy(ethyl)
fosfinem
Homogenizace
CentrifugaceSupernatant
0
0.05
0.1
0.2
1.0
Přídavek Cd + inkubace
30 min. 35 C
Vysoce účinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí
Přídavek redukovaného glutathionuk alikvotům (mM)
Buňky BY-2po kultivaci s Cd(II)
ionty
2.5
5.0
Postup přípravy vzorku
O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.
Km fytochelatin syntázyII. Rostlinné obranné mechanismy
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 5 10 25 50 100
Km
[GSH
(mM
)]
Koncentrace Cd(II) (µM)
O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.
Obsah
I. Genová exprese
II. Rostlinné obranné mechanismy
III. Živočišné obranné mechanismy
20
9 8
5 53 2 2 2 2 1 1 1
C S K G A T N E M P D Q I
Poče
t am
inok
ysel
in
Aminokyseliny
• Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 – 10 kDa).• Metalothionein se skládá ze dvou vazebných domén – α a β.• N-terminální část peptidu – β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty.• C-terminální část peptidu – -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů.• Nejčastější repetice: cystein(C)–serin(S)–cystein(C).
(C – cystein, S – serin, K – lysin, G – glycin, A – alanin, T – threonin, N – asparagin, E – kyselina glutamová, M – methionin, P – prolin, D – kyselina asparagová, Q – glutamin, I – isoleucin)
Metalothionein – proteinIII. Živočišné obranné mechanismy
J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.
α - doménaβ - doména
(a) Vstup iontů kovu do buňky.
(b) Ionty interagují s inhibitoremsyntézy metalothioneinu (MTI).
(c) Spuštění transkripčního faktoru(MTF-1) spojenéhos metaloresponsivním elementem(MRE).
(d) Syntéza mRNA pro translaci MT.
(e) MT se váží ion těžkých kovů,komplex MT-iont těžkého kovu jetransportován do ledviny nebok regulačním proteinům závislýmna těžkém kovu (f).
MTF-1
těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu ?)
?fosforylace?
jádro
cytoplasma
MRE
mRNA
MT
MTF-1
MTIMTI
MT
vyloučeníledvina
(a)
(b)
(c)
(d)
(f)
(e)
MTF-1
Detoxikace těžkých kovůIII. Živočišné obranné mechanismy
V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.
Jak studovat úlohu tohoto proteinu v buňce?
III. Živočišné obranné mechanismy
Tepelná denaturace a přenosová technika
omýváníBrdičkova
reakce
visící rtuťovákapková elektroda
Ag/AgCl/3M KCl
Uhlíková elektroda
Adsorpce při 10 °Cmikroskopické sklo
parafilm
kapka vzorku po tepelné denaturaci
2°C
15 min.
V. Adam, et al. (2008) Sensors, 8, 2293-2305.
250 nARS2Co
Cat1
Cat2
Co(II)
-0.3 –0.8 –1.3 –1.8
Co1
Potenciál (V)
J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.
III. Živočišné obranné mechanismy
Cisplatina a buněčné linie
Mateřská linieRezistentni linie
1 µg
cdd
p/m
l med
ia
0 µg
cdd
p/m
l med
ia
b ca
MT 300 ng MT 300 ngMT 300 ng n.d. n.d.MT v buněčném extraku
Koncentrace cisplatiny (µM)
Mno
žstv
í MT
(%)
Koncentrace karboplatiny (µM)Buněčná linie
100 nA
sken
B
C D E
Mno
žstv
í MT
(%)
Mno
žstv
í MT
(%)
I. Fabrik, et al. (2008) Electroanalysis, 20, 1521-1532.
UKF-NB4 – rezistentní k cisplatině
A
III. Živočišné obranné mechanismy
Pokročilé materiály v izolaci metalothioneinu
A. Navázání protilátek
B. Přidání vzorku
C. Izolace cílové molekuly
D. Separace pomocí magnetu
E. Promývání F. Ohřev
G. Získání cílové molekuly
H. Adsorpce na povrch molekuly
I. Promytí J. Měření
Referentní elektroda
Pracovní elektroda Pomocná
elektroda
Potenciostat/ Galvanostat
M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.
III. Živočišné obranné mechanismy
Nor
mal
izov
aný
sign
ál (%
)N
orm
aliz
ovan
ý si
gnál
(%)
Nor
mal
izov
aný
sign
ál (%
)N
orm
aliz
ovan
ý si
gnál
(%)
Myší IgGKráličí IgG
Vzorek Čas (min.)
Teplota ( C) pH
Optimalizace postupu izolace
22Rv1
M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.
III. Živočišné obranné mechanismy
Analýza prostatické buněčné linie 22Rv1
M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.
Koncentrace Cd(II) (µM) Koncentrace Cu(II) (µM)
Met
alot
hion
ein/
viab
ilita
(%)
Met
alot
hion
ein/
viab
ilita
(%)
Koncentrace Cd(II) (µM) Koncentrace Cu(II) (µM)
MT mRNAMT mRNA
Lyzát: tepelnýLyzát: RIPA
Lyzát: tepelnýLyzát: RIPA
III. Živočišné obranné mechanismy
Shrnutí
Multi-instrumentální přístup
Nové materiály založené na nanotechnologiích
In situ a on line detekce
Praktické aplikace
Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě
Využití moderní a robustní analytické, biochemické a biologické
instrumentace v základní výuce Anorganické a Analytické
chemie a Biochemie.
Unikátní přístroje ve specializovaných chemických a
biochemických předmětech (Bioanalytická chemie,
Biotechnologie životního prostředí, Biosenzory, Biochemické
pokročilé praktikum).
Bakalářské a diplomové práce.
Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě
Pedagogický rozvoj
Nadaní studenti
Odborné vedení
Moderní instrumentace
Biotechnologie rostlinBiotechnologie živočichůZootechnika
Chemie a technologie potravinJakost a zdravotní nezávadnost potravin
Pedagogický rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě
Výchova mladých vědeckých pracovníků
Rozvoj izolačních a separačních postupů založených na
pokročilých materiálech.
Lab-on-chip technologie, aplikace in situ.
Praktická aplikace, studium biochemických procesů
v organismech všech úrovní.
Vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě
Zemědělská chemie
Základní výzkum (grantové projekty národní i evropské)GA ČR 522/07/0692 „Studium tvorby thiolových sloučenin u rostlin –
uplatnění při remediačních technologiích“EU 7H10021„MAS, Nanoelectronics for mobile AAL-Systems“
Zahraniční spolupráceJohn Innes Institute (Prof. Kopřiva)
The estación experimental delZaidín (Dr. Ferrol)
Aplikovaný výzkumNAZV QI91A032 „Výběr
rezistentních genotypů meruněk k PPV s tržní kvalitou plodů“
Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultěIn vivo zobrazovací technologie
Kvantová tečka – quantum dot, ohraničená oblast polovodičeo průměru kolem 30 nm a výšce 8 nm, schopná v důsledkunižší energie ve srovnání s energií vodivostního pásuokolního polovodiče vázat elektrony. Důležitou vlastností jetaké optická schopnost teček se zabarvovat.
kontrola 10 µM 100 µM
Intenzita signálu > 100 000Excitace (440 nm), Emise (790 nm)
http://www.carestream.com
PODĚKOVÁNÍ
PODĚKOVÁNÍLaboratoř metalomiky a nanotechnologií
Prosinec 2005
Duben 2006
Červen 2007
Listopad 2007
Duben 2008
Březen 2009
Květen 2011
Září 2010
Děkuji za pozornost