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ESTUDO DA DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DE ARCABOUÇOS POROSOS DE POLI(ε-CAPROLACTONA) (PCL) E POLI(HIDROXIBUTIRATO-CO-
HIDROXIVALERATO) (PHBV)
A. F. Hell, S. M. Malmonge
Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo (SP), Brasil
E-mail: alessandrafhell@gmail.com
Resumo. Este trabalho teve como objetivo estudar a degradação hidrolítica em meio fisiológico simulado de arcabouços produzidos com os polímeros PCL e PHBV. Arcabouços porosos obtidos por evaporação de solvente com agentes porogênicos foram caracterizados quanto à microestrutura, densidade e porosidade. Os arcabouços foram submetidos ao ensaio de degradação hidrolítica in vitro por 30, 60 e 90 dias e avaliados quanto à perda de massa, variação de Mv, comportamento mecânico, térmico e alterações na morfologia. O presente trabalho possibilitou a obtenção de arcabouços porosos com diâmetro de poros entre 75 e 150 µm. Os resultados indicaram diminuição da massa molar viscosimétrica e alteração das propriedades térmicas, indicativos de degradação hidrolítica. Foi verificado aumento do grau de cristalinidade dos polímeros estudados indicando que houve degradação preferencialmente na fase amorfa. Foi possível concluir que a degradação dos arcabouços de PCL é mais lenta quando comparado com os de PHBV.
Palavras-chave: biomateriais, polímeros biorreabsorvíveis, arcabouços, degradação hidrolítica in vitro.
1. INTRODUÇÃO
A incessante procura por novos materiais que atendam aos requisitos na área
médica é fundamental para aumentar a qualidade dos produtos e métodos já
existentes e principalmente desenvolver novos produtos e metodologias que
facilitem, acelerem e melhorem de forma significativa o tratamento de pacientes em
diversas áreas da medicina e odontologia. A expectativa de vida humana vem
aumentando devido a diversas melhorias relacionadas às tecnologias aplicadas à
saúde, mas nem todos os tecidos e órgãos do corpo podem manter suas funções
com o processo de envelhecimento (1) ou conseguem ser facilmente regenerados em
caso de traumas ou lesões. Neste contexto, a Engenharia Tecidual (ET) se destaca
consistindo em um conjunto de técnicas e conhecimentos para a regeneração de
órgãos e tecidos acometidos por lesões ou processos degenerativos. A técnica
envolve a expansão in vitro de células sobre suportes ou arcabouços de materiais
biorreabsorvíveis, diferenciação e integração das células às matrizes para o início de
formação neotecidual e posterior implante nas regiões lesadas, desencadeando
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assim o processo de regeneração do tecido ou órgão em questão e, enquanto o
novo órgão ou tecido é formado o suporte sofre degradação (2,3).
Os arcabouços podem ser confeccionados com diversos tipos de biomateriais e
são aplicados na ET como suportes para a cultura de células a fim de assegurar e
auxiliar o crescimento de tecidos vivos. Os arcabouços atuam como um suporte
estrutural para acomodar e estimular o crescimento de um novo tecido, atuando
assim como matriz extracelular artificial para o tecido em questão (4).
Polímeros biorreabsorvíveis são largamente empregados na obtenção dos
arcabouços, pois apresentam boa compatibilidade biológica e se degradam in vivo
com eliminação dos subprodutos pelas vias metabólicas do organismo, sem efeitos
colaterais residuais. Entre os polímeros biorreabsorvíveis, o poli(hidroxibutirato-co-
hidroxivalerato) (PHBV) pertencente à família dos polihidroxialcanoatos (PHAs), que
são poliésteres produzidos por microorganismos vem sendo utilizado como matéria-
prima para diversos dispositivos de aplicação biomédica e ET. Também, o poli(ɛ-
caprolactona) (PCL) tem despertado grande interesse como arcabouço, pois além
de ser biorreabsorvível possui excelente compatibilidade biológica e elasticidade (5).
A porosidade e a geometria do arcabouço são fatores determinantes na
velocidade de degradação e também na indução ao crescimento celular (2). Portanto,
o estudo da microestrutura dos arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis é
importante para que possamos compreender a influência na degradação e
consequentes alterações nas propriedades dos dispositivos para que se possa
desenvolver e aprimorar arcabouços a fim de atender os requisitos de sua aplicação.
Este trabalho envolve o estudo da degradação hidrolítica em meio fisiológico
simulado (solução tampão fosfato) de arcabouços produzidos com os polímeros
biorreabsorvíveis poli(ɛ-caprolactona) (PCL) e poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)
(PHBV).
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais
PHBV (18% de hidroxivalerato, lote FE132, PHB do Brasil) e PCL (Aldrich
440744-250G, Mn 70000-90000), triclorometano (clorofórmio) (Synth), NaCl e
solução tampão fosfato (pH 7,4 ± 0,2). Todos os materiais foram utilizados como
recebidos.
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2.2. Preparação dos arcabouços
Os polímeros PCL e PHBV foram solubilizados em clorofórmio sob agitação
magnética. As soluções foram preparadas com concentração de 5% m/v dos
polímeros puros. Para a confecção dos poros utilizou-se como agente porogênico
grânulos de NaCl com diâmetro de 75<Φ<150 μm. Utilizou-se 95,24% m/v de NaCl
para a preparação das soluções e as mesmas foram vertidas em placas de petri, as
placas foram parcialmente tampadas e deixadas em capela com a exaustão
desligada para que a evaporação do solvente ocorresse de forma lenta. Após a
evaporação completa do solvente, as amostras foram submersas em água destilada
para lixiviação das partículas porogênicas. Em seguida, as amostras foram
colocadas por 24h em álcool 95% para desidratação e após evaporação total do
álcool as mesmas foram armazenadas em dessecador sob vácuo.
2.3. Degradação in vitro
Foi utilizada a norma F 1635-11 ASTM (6) para avaliação da degradação
hidrolítica in vitro. Os corpos-de-prova (CPs) foram cortados de forma retangular
com dimensões de 50mm x 10mm. A solução tampão e os instrumentos de
manuseio foram esterilizados, os CPs foram levados à capela de fluxo laminar e
foram desinfectados em álcool 95% para serem inoculados em recipientes plásticos
contendo solução tampão fosfato, os recipientes foram previamente desinfectados.
Após decorrido o tempo de seguimento, os CPs foram incubados a temperatura de
37°C ± 2°C para os tempos de seguimento de 30, 60 e 90 dias. Foram preparados
seis CPs para cada tempo de seguimento. Após, os CPs foram lavados em água
destilada em abundância, foram imersos em álcool 95% para desidratação e foram
colocados na incubadora na temperatura de 37°C ± 2°C para secagem até que sua
massa permanecesse constante.
2.4. Picnometria
A densidade e a porosidade aparente dos arcabouços foram determinadas
utilizando a técnica de picnometria (7), porém optou-se por utilizar álcool etílico
absoluto 99,5% ao invés de água destilada devido as amostras serem menos
densas do que a água e também por suas características hidrofóbicas. Para a
realização do ensaio utilizou-se 4 amostras para cada tipo de polímero e para o
cálculo foram utilizadas as densidades teóricas fornecidas pelos fabricantes dos
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polímeros, para o PHBV foi utilizada ρPHBV = 1,30 g/cm3 e para o PCL ρPCL = 1,145
g/cm3.
2.5. Estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Para caracterizar a superfície dos arcabouços utilizou-se o estereomicroscópio
Physis (SZ40) que possui faixa de ampliação de 10 a 40x e o software de aquisição
de imagens TS View. Para as análises de MEV foi utilizado o microscópio eletrônico
de varredura JEOL (JSM-6010LA). As amostras foram fixadas em suportes
metálicos com auxílio de fita adesiva de carbono. Foi utilizado feixe de elétrons de
3kV e as amostras não foram recobertas.
2.6. Perda de massa
Mediu-se a massa antes da imersão na solução tampão fosfato (m1) e após o
processo de secagem depois de completar os tempos de seguimento (m2). A
porcentagem de perda de massa foi determinada através da Eq. (A):
% perda = [(m1 - m2)/m1]. 100% (A)
2.7. Variação da massa molar média viscosimétrica
Foi utilizada a técnica de viscosimetria capilar e a equação de Mark-Houwink Eq.
(B) (8). O ensaio foi realizado para os tempos de 0 e 90 dias de contato com a
solução tampão fosfato.
[η] = K Mv
α (B)
onde, K e α são constantes para um determinado sistema de
polímero/solvente/temperatura; η é a viscosidade intrínseca; Mv é a massa molar
viscosimétrica média.
O ensaio foi realizado com um viscosímetro capilar do tipo Cannon-Fenske e
como solvente utilizou-se o clorofórmio. Foram preparadas soluções de cada
polímero nas seguintes concentrações 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; e 0,5 g/dl e o tempo de
escoamento do clorofórmio (t0) e das soluções (t) entre as marcações do
viscosímetro foram medidos com um cronômetro. Para cada concentração foram
realizadas 5 medições. As viscosidades inerentes e reduzidas foram obtidas através
das equações da técnica de viscosimetria e foram traçadas as curvas das
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viscosidades x concentração (8). A viscosidade intrínseca foi obtida através da
extrapolação das curvas para a concentração igual a 0. Os valores de K e α
utilizados para o cálculo da Mv foram os mesmos encontrados na literatura para o
cálculo das massas molares de arcabouços densos dos mesmos polímeros para
comparação (9).
2.8. Comportamento mecânico
Foi utilizado à norma ASTM D 882-12 (10) e o equipamento MTS Tytron 250 para
realizar os ensaios de tensão x deformação sob tração dos arcabouços. O ensaio foi
realizado sob tração com velocidade de 1 mm/min e distância entre as garras de 20
mm com o auxílio do software MTS Flex Test. Foram preparados 5 CPs para cada
tipo de polímero com dimensões aproximadas de 50 mm x 10 mm. A espessura e
largura dos CPs foram medidos antes do teste com o auxílio do micrômetro e
paquímetro digital, para cada parâmetro foram realizadas 3 medições para obtenção
de valores médio.
2.9. Comportamento térmico
As análises de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) foram realizadas
utilizando o equipamento DSC Q series (TA Instruments) em atmosfera inerte,
empregando vazão de 50 mL/min de nitrogênio. Foram utilizadas amostras em
panelinhas de alumínio tampadas e como referência utilizou-se panelinha de
alumínio tampada vazia. As amostras foram submetidas à varredura de temperatura
de -50oC a 250oC com velocidade de 10oC/min. O grau de cristalinidade (GC) para
polímeros semicristalinos é calculado a partir do valor da entalpia de fusão (ΔHm)
que é obtida da curva de DSC para o aquecimento, através da integração do pico de
fusão, do valor da entalpia de cristalização (ΔHc) quando houver e conhecendo o
valor teórico do polímero hipoteticamente 100% cristalino (Hm100%). Para o PCL
utilizou-se o valor de Hm100%=136 J/g e para o PHBV Hm100% =146 J/g (11).
(c)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A superfície do arcabouço em contato com o vidro da placa de petri apresentou
menor rugosidade do que a superfície em contato com o ar, comportamento este
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verificado para ambos os polímeros estudados. A menor rugosidade encontrada na
superfície em contato com vidro deve-se provavelmente ao fato da superfície plana e
lisa do vidro atuar como molde para a formação do arcabouço, enquanto que os
cristais se depositam formando uma superfície irregular no lado superior do
arcabouço. Através das imagens obtidas no estereomicroscópio e pela MEV, para os
arcabouços porosos de PCL e PHBV, foi possível notar que foram obtidos
arcabouços com uniformidade de poros e também não foi verificada presença de
NaCl o que indica que o tempo de lavagem das amostras foi adequado. A Fig. 1
apresenta as imagens típicas dos arcabouços obtidas pela técnica de
estereomicroscopia e as Fig. 2 e 3 apresentam as imagens obtidas por MEV dos
arcabouços de PCL e PHBV, respectivamente.
Figura 1 - Estereomicroscopia de amostras típicas de PHBV (A) superfície em contato com ar com aumento de 20x, (B) superfície em contato com vidro com aumento de 20x; amostras típicas de PCL (C) superfície em contato com ar com aumento de 20x e (D) superfície em contato com vidro com aumento de 20x.
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Figura 2 - Imagens típicas de microscopia eletrônica de varredura dos arcabouços de PCL porosos: imagens da esquerda (A) e (C) superfície em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfície em contato com vidro.
Figura 3 - Imagens típicas de microscopia eletrônica de varredura dos arcabouços de PHBV porosos: imagens da esquerda (A) e (C) superfície em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfície em contato com vidro.
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Os valores médios obtidos das densidades aparente foram: para o PCL 0,0934 ±
0,0285 g/cm3 e para o PHBV 0,0658 ± 0,0190 g/cm3. Os elevados valores de desvio
padrão podem estar relacionados à técnica utilizada, que depende muito da
habilidade do operador. Em relação à porosidade aparente, foi encontrado o valor de
91,84 ± 2,49 para o arcabouço de PCL e 94,94 ± 1,46 para o de PHBV. Pode-se
concluir que o resultado da porosidade aparente para os arcabouços porosos está
coerente tendo em vista que foi utilizado 95,24% m/v de NaCl na preparação dos
mesmos.
A Fig. 4 apresenta a perda de massa dos arcabouços (%) em função do tempo
de contato com o meio fisiológico simulado (MFS).
Figura 4: Variação percentual da massa das amostras para diferentes tempos de imersão em solução tampão fosfato.
Os arcabouços de PCL e PHBV perderam massa ao longo do tempo de contato
com a solução tampão fosfato, porém, com redução na velocidade de perda de
massa após 60 dias. Este comportamento ocorreu provavelmente devido à redução
da fase amorfa dos polímeros, já que o acesso das moléculas de água às cadeias é
mais fácil na fase amorfa, esta é consumida primeiro. No primeiro estágio de
degradação, há penetração e difusão da água nas regiões amorfas do polímero e
cisão hidrolítica das ligações ésteres das cadeias poliméricas. Após grande parte da
fase amorfa sofrer degradação começa o segundo estágio na fase cristalina,
portanto, há um aumento percentual do grau de cristalinidade (12).
Tanto para os arcabouços de PCL quanto para os de PHBV houve redução da
massa molar média viscosimétrica após o tempo de contato com o MFS o que indica
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que houve degradação de ambos os polímeros. Para o PCL poroso houve redução
da massa molar de 17,0% enquanto que para o PHBV poroso a redução foi de
25,8% para 90 dias de contato com o MFS.
Analisando o aspecto visual dos arcabouços após o contato com o MFS, não foi
possível notar defeitos (aumento de poros, trincas, diferença na coloração, etc.) que
caracterizassem a perda de massa. Não é possível afirmar que existe
interconectividade dos poros, característica essencial para o emprego dos
arcabouços como suportes em ET a partir das imagens obtidas na MEV.
A degradação dos arcabouços é caracterizada pela perda de massa, diminuição
da massa molar ponderal média (Mw) e consequentemente perda das propriedades
mecânicas (2). Através das curvas tensão x deformação de cada amostra foram
calculados os valores médios e desvios para os parâmetros tensão de escoamento,
tensão máxima, tensão na ruptura e módulo de elasticidade de cada tipo de
membrana. Foram traçados gráficos dos parâmetros em função do tempo de contato
dos arcabouços com a solução tampão fosfato, os quais são apresentados na Fig 5.
Figura 5 – Propriedades mecânicas em função do tempo de contato com a solução tampão fosfato.
Nota-se que os valores médios das propriedades mecânicas dos arcabouços
porosos são baixos. As paredes dos poros dos arcabouços são muito finas em
comparação com o tamanho do poro o que, provavelmente, facilita a ruptura do
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arcabouço devido à propagação de trincas em baixas tensões. Tanto para os
arcabouços de PCL como os de PHBV, não fica evidente a diminuição da resistência
mecânica ao longo do tempo de contato com o MFS.
A Tab. 1 apresenta os dados obtidos pela técnica de DSC para os arcabouços.
Tabela 1 - Valores de Tg, Tc, ΔHc, Tm, ΔHm e GC para as membranas porosas de PHBV e PCL para os tempos de 0, 30, 60 e 90 dias de contato com a solução tampão fosfato.
Tempo Aquecimento PHBV poroso PCL poroso
Tg (oC) Tc (oC) ΔHc (J/g) Tm (oC) ΔHm (J/g) GC Tm (oC) ΔHm (J/g) GC
0 dias 1o Aq. -0,3 - - 159,8 33,8 23,2 63,4 54,4 40,0
2o Aq. -0,8 55,4 7,5 161,1 41,4 23,2 54,9 38,8 28,5
30 dias 1o Aq. -2,3 - - 160,2 20,3 13,9 65,0 62,3 45,8
2o Aq. -4,2 65,2 24,1 153,3 29,8 3,9 55,2 47,5 34,9
60 dias 1o Aq. 0,8 - - 158,8 37,2 25,5 64,3 54,3 39,9
2o Aq. -4,8 68,0 46,1 152,4 54,0 5,4 55,9 40,2 29,6
90 dias 1o Aq. -3,1 - - 159,3 43,9 30,1 65,3 80,2 59,0
2o Aq. -3,4 66,8 47,4 154,3 59,0 7,9 55,0 66,9 49,2
Analisando os dados obtidos através do DSC para os arcabouços porosos de
PHBV, verifica-se aumento no grau de cristalinidade (GC) ao longo do tempo de
degradação para as curvas do primeiro e segundo aquecimento. Para o tempo de 0
dias, a curva do 1° aquecimento representa a fase cristalina resultante do processo
de evaporação do solvente, no caso da amostra que não entrou em contato com o
MFS. Já para os tempos de 30, 60 e 90 dias o GC referente à curva do 1°
aquecimento representa a fase cristalina resultante do processo de evaporação do
solvente e a fase cristalina resultante da evaporação do solvente modificada pela
ação do MFS, isto é, plastificação e/ou degradação. O aumento do GC ao longo do
tempo de degradação corrobora o resultado verificado em relação à diminuição da
velocidade de perda de massa do polímero ao longo do tempo. O MFS atua como
plastificante, provavelmente contribuindo para a diminuição do grau de cristalinidade,
porém ao longo do tempo de contato com o MFS, ocorre quebra das cadeias
(degradação) preferencialmente na fase amorfa com consequente aumento do GC.
Já o GC determinado a partir da curva do 2° aquecimento é resultante do
resfriamento a 10°C/min, desta forma os resultados obtidos mostram que para as
amostras que entraram em contato com o MFS a cristalização por resfriamento na
taxa de 10°C/min parece ser menos eficiente que a cristalização inicial, por
evaporação de solvente. Porém, é importante analisar a cristalização que ocorre
durante o 2° aquecimento. Observa-se aumento do ΔHc em função do aumento do
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tempo de degradação do polímero. Isto deve-se provavelmente a diminuição do
tamanho de cadeias ao longo do tempo em contato com o MFS, o que favorece a
formação de cristais. Observa-se também o aumento do GC resultante do
resfriamento a 10°C/min, indicando mais uma vez a diminuição do tamanho de
cadeia.
Analisando os dados para os arcabouços porosos de PCL também se verifica
aumento no GC ao longo do tempo de degradação para as curvas do primeiro e
segundo aquecimento o que indica que ao longo do tempo de contato com o MFS,
ocorreu quebra das cadeias preferencialmente na fase amorfa com consequente
aumento do GC. Este fato está de acordo com a diminuição da massa molar média
viscosimétrica que foi obtido para as amostras porosas de PCL após contato de 90
dias com o MFS.
4. CONCLUSÕES
O presente trabalho possibilitou a obtenção de arcabouços porosos de PCL e
PHBV com diâmetro de poros entre 75 e 150 µm. Após o contato com o meio
fisiológico simulado e a partir dos dados obtidos nas análises conclui-se que a
degradação dos arcabouços de PCL é mais lenta quando comparado com as de
PHBV. A degradação hidrolítica in vitro resultou em aumento da cristalinidade de
todos os polímeros estudados, indicando que as reações de hidrólise ocorrem
inicialmente na fase amorfa. A diminuição da massa molar viscosimétrica e a
diminuição das propriedades térmicas é um indicativo da degradação. A densidade e
a porosidade aparente não são fatores determinantes na velocidade de degradação
dos arcabouços.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à PHB do Brasil pela doação do PHBV, à Universidade
Federal do ABC e a Central Experimental Multiusuários da UFABC pela
disponibilidade dos equipamentos e materiais.
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fabricados pelo método de esponja polimérica. Cerâmica, v. 60, n. 356, p. 586-593, 2014.
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STUDY OF HYDROLYTIC DEGRADATION OF POROUS SCAFFOLDS OF POLY(ε-CAPROLACTONE) (PCL) AND POLY(HYDROXYBUTYRATE-CO-
VALERATE) (PHBV)
A. F. Hell, S. M. Malmonge
Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo (SP), Brasil
E-mail: alessandrafhell@gmail.com Abstract. The aim of this study was to verify the hydrolytic degradation in a simulated physiological environment of scaffolds produced with the polymers PCL and PHBV. Porous scaffolds obtained by solvent evaporation with porogenic agents were characterized by microstructure, density and porosity. The scaffolds were submitted to in vitro hydrolytic degradation test for 30, 60 and 90 days and evaluated by weight loss, variation of Mv, mechanical performance, thermal performance, and changes in morphology. This study made it possible to obtain porous scaffolds with pore diameter between 75 and 150 µm. The results showed decreased of viscosimetric molar mass and changes of thermal properties, indicative of hydrolytic degradation. It was verified an increase in the degree of crystallinity of studied polymers indicating that was degradation preferably in the amorphous phase. It was concluded that the degradation of PCL scaffolds is slower when compared with those of PHBV.
Keywords: biomaterials, bioresorbable polymers, scaffolds, in vitro hydrolytic degradation.
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