ESTUDO DA DEGRADAO HIDROLTICA DE ARCABOUOS POROSOS DE

POLI(-CAPROLACTONA) (PCL) E POLI(HIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO) (PHBV)

A. F. Hell, S. M. Malmonge

Centro de Engenharia, Modelagem e Cincias Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, So Bernardo do Campo (SP), Brasil

E-mail: alessandrafhell@gmail.com

Resumo. Este trabalho teve como objetivo estudar a degradao hidroltica em meio fisiolgico simulado de arcabouos produzidos com os polmeros PCL e PHBV. Arcabouos porosos obtidos por evaporao de solvente com agentes porognicos foram caracterizados quanto microestrutura, densidade e porosidade. Os arcabouos foram submetidos ao ensaio de degradao hidroltica in vitro por 30, 60 e 90 dias e avaliados quanto perda de massa, variao de Mv, comportamento mecnico, trmico e alteraes na morfologia. O presente trabalho possibilitou a obteno de arcabouos porosos com dimetro de poros entre 75 e 150 m. Os resultados indicaram diminuio da massa molar viscosimtrica e alterao das propriedades trmicas, indicativos de degradao hidroltica. Foi verificado aumento do grau de cristalinidade dos polmeros estudados indicando que houve degradao preferencialmente na fase amorfa. Foi possvel concluir que a degradao dos arcabouos de PCL mais lenta quando comparado com os de PHBV. Palavras-chave: biomateriais, polmeros biorreabsorvveis, arcabouos, degradao hidroltica in vitro. 1. INTRODUO

A incessante procura por novos materiais que atendam aos requisitos na rea

mdica fundamental para aumentar a qualidade dos produtos e mtodos j

existentes e principalmente desenvolver novos produtos e metodologias que

facilitem, acelerem e melhorem de forma significativa o tratamento de pacientes em

diversas reas da medicina e odontologia. A expectativa de vida humana vem

aumentando devido a diversas melhorias relacionadas s tecnologias aplicadas

sade, mas nem todos os tecidos e rgos do corpo podem manter suas funes

com o processo de envelhecimento (1) ou conseguem ser facilmente regenerados em

caso de traumas ou leses. Neste contexto, a Engenharia Tecidual (ET) se destaca

consistindo em um conjunto de tcnicas e conhecimentos para a regenerao de

rgos e tecidos acometidos por leses ou processos degenerativos. A tcnica

envolve a expanso in vitro de clulas sobre suportes ou arcabouos de materiais

biorreabsorvveis, diferenciao e integrao das clulas s matrizes para o incio de

formao neotecidual e posterior implante nas regies lesadas, desencadeando

assim o processo de regenerao do tecido ou rgo em questo e, enquanto o

novo rgo ou tecido formado o suporte sofre degradao (2,3).

Os arcabouos podem ser confeccionados com diversos tipos de biomateriais e

so aplicados na ET como suportes para a cultura de clulas a fim de assegurar e

auxiliar o crescimento de tecidos vivos. Os arcabouos atuam como um suporte

estrutural para acomodar e estimular o crescimento de um novo tecido, atuando

assim como matriz extracelular artificial para o tecido em questo (4).

Polmeros biorreabsorvveis so largamente empregados na obteno dos

arcabouos, pois apresentam boa compatibilidade biolgica e se degradam in vivo

com eliminao dos subprodutos pelas vias metablicas do organismo, sem efeitos

colaterais residuais. Entre os polmeros biorreabsorvveis, o poli(hidroxibutirato-co-

hidroxivalerato) (PHBV) pertencente famlia dos polihidroxialcanoatos (PHAs), que

so polisteres produzidos por microorganismos vem sendo utilizado como matria-

prima para diversos dispositivos de aplicao biomdica e ET. Tambm, o poli(-

caprolactona) (PCL) tem despertado grande interesse como arcabouo, pois alm

de ser biorreabsorvvel possui excelente compatibilidade biolgica e elasticidade (5).

A porosidade e a geometria do arcabouo so fatores determinantes na

velocidade de degradao e tambm na induo ao crescimento celular (2). Portanto,

o estudo da microestrutura dos arcabouos de polmeros biorreabsorvveis

importante para que possamos compreender a influncia na degradao e

consequentes alteraes nas propriedades dos dispositivos para que se possa

desenvolver e aprimorar arcabouos a fim de atender os requisitos de sua aplicao.

Este trabalho envolve o estudo da degradao hidroltica em meio fisiolgico

simulado (soluo tampo fosfato) de arcabouos produzidos com os polmeros

biorreabsorvveis poli(-caprolactona) (PCL) e poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)

(PHBV).

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1. Materiais

PHBV (18% de hidroxivalerato, lote FE132, PHB do Brasil) e PCL (Aldrich

440744-250G, Mn 70000-90000), triclorometano (clorofrmio) (Synth), NaCl e

soluo tampo fosfato (pH 7,4 0,2). Todos os materiais foram utilizados como

recebidos.

2.2. Preparao dos arcabouos Os polmeros PCL e PHBV foram solubilizados em clorofrmio sob agitao

magntica. As solues foram preparadas com concentrao de 5% m/v dos

polmeros puros. Para a confeco dos poros utilizou-se como agente porognico

grnulos de NaCl com dimetro de 75

2.4. Picnometria

A densidade e a porosidade aparente dos arcabouos foram determinadas utilizando a tcnica de picnometria (7), porm optou-se por utilizar lcool etlico

absoluto 99,5% ao invs de gua destilada devido as amostras serem menos

densas do que a gua e tambm por suas caractersticas hidrofbicas. Para a

realizao do ensaio utilizou-se 4 amostras para cada tipo de polmero e para o

clculo foram utilizadas as densidades tericas fornecidas pelos fabricantes dos

polmeros, para o PHBV foi utilizada PHBV = 1,30 g/cm3 e para o PCL PCL = 1,145

g/cm3.

2.5. Estereomicroscopia e microscopia eletrnica de varredura (MEV)

Para caracterizar a superfcie dos arcabouos utilizou-se o estereomicroscpio Physis (SZ40) que possui faixa de ampliao de 10 a 40x e o software de aquisio

de imagens TS View. Para as anlises de MEV foi utilizado o microscpio eletrnico

de varredura JEOL (JSM-6010LA). As amostras foram fixadas em suportes

metlicos com auxlio de fita adesiva de carbono. Foi utilizado feixe de eltrons de

3kV e as amostras no foram recobertas.

2.6. Perda de massa

Mediu-se a massa antes da imerso na soluo tampo fosfato (m1) e aps o processo de secagem depois de completar os tempos de seguimento (m2). A

porcentagem de perda de massa foi determinada atravs da Eq. (A):

% perda = [(m1 - m2)/m1]. 100% (A)

2.7. Variao da massa molar mdia viscosimtrica

Foi utilizada a tcnica de viscosimetria capilar e a equao de Mark-Houwink Eq.

(B) (8). O ensaio foi realizado para os tempos de 0 e 90 dias de contato com a soluo tampo fosfato.

[] = K Mv (B)

onde, K e so constantes para um determinado sistema de

polmero/solvente/temperatura; a viscosidade intrnseca; Mv a massa molar

viscosimtrica mdia.

O ensaio foi realizado com um viscosmetro capilar do tipo Cannon-Fenske e

como solvente utilizou-se o clorofrmio. Foram preparadas solues de cada

polmero nas seguintes concentraes 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; e 0,5 g/dl e o tempo de

escoamento do clorofrmio (t0) e das solues (t) entre as marcaes do

viscosmetro foram medidos com um cronmetro. Para cada concentrao foram

realizadas 5 medies. As viscosidades inerentes e reduzidas foram obtidas atravs

das equaes da tcnica de viscosimetria e foram traadas as curvas das

viscosidades x concentrao (8). A viscosidade intrnseca foi obtida atravs da

extrapolao das curvas para a concentrao igual a 0. Os valores de K e

utilizados para o clculo da Mv foram os mesmos encontrados na literatura para o

clculo das massas molares de arcabouos densos dos mesmos polmeros para

comparao (9).

2.8. Comportamento mecnico

Foi utilizado norma ASTM D 882-12 (10) e o equipamento MTS Tytron 250 para

realizar os ensaios de tenso x deformao sob trao dos arcabouos. O ensaio foi

realizado sob trao com velocidade de 1 mm/min e distncia entre as garras de 20

mm com o auxlio do software MTS Flex Test. Foram preparados 5 CPs para cada

tipo de polmero com dimenses aproximadas de 50 mm x 10 mm. A espessura e

largura dos CPs foram medidos antes do teste com o auxlio do micrmetro e

paqumetro digital, para cada parmetro foram realizadas 3 medies para obteno

de valores mdio.

2.9. Comportamento trmico As anlises de Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) foram realizadas

utilizando o equipamento DSC Q series (TA Instruments) em atmosfera inerte,

empregando vazo de 50 mL/min de nitrognio. Foram utilizadas amostras em

panelinhas de alumnio tampadas e como referncia utilizou-se panelinha de

alumnio tampada vazia. As amostras foram submetidas varredura de temperatura

de -50oC a 250oC com velocidade de 10oC/min. O grau de cristalinidade (GC) para

polmeros semicristalinos calculado a partir do valor da entalpia de fuso (Hm)

que obtida da curva de DSC para o aquecimento, atravs da integrao do pico de

fuso, do valor da entalpia de cristalizao (Hc) quando houver e conhecendo o

valor terico do polmero hipoteticamente 100% cristalino (Hm100%). Para o PCL

utilizou-se o valor de Hm100%=136 J/g e para o PHBV Hm100% =146 J/g (11).

(c)

3. RESULTADOS E DISCUSSO

A superfcie do arcabouo em contato com o vidro da placa de petri apresentou

menor rugosidade do que a superfcie em contato com o ar, comportamento este

verificado para ambos os polmeros estudados. A menor rugosidade encontrada na

superfcie em contato com vidro deve-se provavelmente ao fato da superfcie plana e

lisa do vidro atuar como molde para a formao do arcabouo, enquanto que os

cristais se depositam formando uma superfcie irregular no lado superior do

arcabouo. Atravs das imagens obtidas no estereomicroscpio e pela MEV, para os

arcabouos porosos de PCL e PHBV, foi possvel notar que foram obtidos

arcabouos com uniformidade de poros e tambm no foi verificada presena de

NaCl o que indica que o tempo de lavagem das amostras foi adequado. A Fig. 1

apresenta as imagens tpicas dos arcabouos obtidas pela tcnica de

estereomicroscopia e as Fig. 2 e 3 apresentam as imagens obtidas por MEV dos

arcabouos de PCL e PHBV, respectivamente.

Figura 1 - Estereomicroscopia de amostras tpicas de PHBV (A) superfcie em contato com ar com aumento de 20x, (B) superfcie em contato com vidro com aumento de 20x; amostras tpicas de PCL (C) superfcie em contato com ar com aumento de 20x e (D) superfcie em contato com vidro com aumento de 20x.

Figura 2 - Imagens tpicas de microscopia eletrnica de varredura dos arcabouos de PCL porosos: imagens da esquerda (A) e (C) superfcie em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfcie em contato com vidro.

Figura 3 - Imagens tpicas de microscopia eletrnica de varredura dos arcabouos de PHBV porosos: imagens da esquerda (A) e (C) superfcie em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfcie em contato com vidro.

Os valores mdios obtidos das densidades aparente foram: para o PCL 0,0934

0,0285 g/cm3 e para o PHBV 0,0658 0,0190 g/cm3. Os elevados valores de desvio

padro podem estar relacionados tcnica utilizada, que depende muito da

habilidade do operador. Em relao porosidade aparente, foi encontrado o valor de

91,84 2,49 para o arcabouo de PCL e 94,94 1,46 para o de PHBV. Pode-se

concluir que o resultado da porosidade aparente para os arcabouos porosos est

coerente tendo em vista que foi utilizado 95,24% m/v de NaCl na preparao dos

mesmos.

A Fig. 4 apresenta a perda de massa dos arcabouos (%) em funo do tempo

de contato com o meio fisiolgico simulado (MFS).

Figura 4: Variao percentual da massa das amostras para diferentes tempos de imerso em soluo tampo fosfato.

Os arcabouos de PCL e PHBV perderam massa ao longo do tempo de contato

com a soluo tampo fosfato, porm, com reduo na velocidade de perda de

massa aps 60 dias. Este comportamento ocorreu provavelmente devido reduo

da fase amorfa dos polmeros, j que o acesso das molculas de gua s cadeias

mais fcil na fase amorfa, esta consumida primeiro. No primeiro estgio de

degradao, h penetrao e difuso da gua nas regies amorfas do polmero e

ciso hidroltica das ligaes steres das cadeias polimricas. Aps grande parte da

fase amorfa sofrer degradao comea o segundo estgio na fase cristalina,

portanto, h um aumento percentual do grau de cristalinidade (12).

Tanto para os arcabouos de PCL quanto para os de PHBV houve reduo da

massa molar mdia viscosimtrica aps o tempo de contato com o MFS o que indica

que houve degradao de ambos os polmeros. Para o PCL poroso houve reduo

da massa molar de 17,0% enquanto que para o PHBV poroso a reduo foi de

25,8% para 90 dias de contato com o MFS.

Analisando o aspecto visual dos arcabouos aps o contato com o MFS, no foi

possvel notar defeitos (aumento de poros, trincas, diferena na colorao, etc.) que

caracterizassem a perda de massa. No possvel afirmar que existe

interconectividade dos poros, caracterstica essencial para o emprego dos

arcabouos como suportes em ET a partir das imagens obtidas na MEV.

A degradao dos arcabouos caracterizada pela perda de massa, diminuio

da massa molar ponderal mdia (Mw) e consequentemente perda das propriedades

mecnicas (2). Atravs das curvas tenso x deformao de cada amostra foram

calculados os valores mdios e desvios para os parmetros tenso de escoamento,

tenso mxima, tenso na ruptura e mdulo de elasticidade de cada tipo de

membrana. Foram traados grficos dos parmetros em funo do tempo de contato

dos arcabouos com a soluo tampo fosfato, os quais so apresentados na Fig 5.

Figura 5 Propriedades mecnicas em funo do tempo de contato com a soluo tampo fosfato.

Nota-se que os valores mdios das propriedades mecnicas dos arcabouos

porosos so baixos. As paredes dos poros dos arcabouos so muito finas em

comparao com o tamanho do poro o que, provavelmente, facilita a ruptura do

arcabouo devido propagao de trincas em baixas tenses. Tanto para os

arcabouos de PCL como os de PHBV, no fica evidente a diminuio da resistncia

mecnica ao longo do tempo de contato com o MFS.

A Tab. 1 apresenta os dados obtidos pela tcnica de DSC para os arcabouos.

Tabela 1 - Valores de Tg, Tc, Hc, Tm, Hm e GC para as membranas porosas de PHBV e PCL para os tempos de 0, 30, 60 e 90 dias de contato com a soluo tampo fosfato.

Tempo Aquecimento PHBV poroso PCL poroso

Tg (oC) Tc (

oC) Hc (J/g) Tm (oC) Hm (J/g) GC Tm (

oC) Hm (J/g) GC

0 dias 1o Aq. -0,3 - - 159,8 33,8 23,2 63,4 54,4 40,0 2o Aq. -0,8 55,4 7,5 161,1 41,4 23,2 54,9 38,8 28,5

30 dias 1o Aq. -2,3 - - 160,2 20,3 13,9 65,0 62,3 45,8 2o Aq. -4,2 65,2 24,1 153,3 29,8 3,9 55,2 47,5 34,9

60 dias 1o Aq. 0,8 - - 158,8 37,2 25,5 64,3 54,3 39,9 2o Aq. -4,8 68,0 46,1 152,4 54,0 5,4 55,9 40,2 29,6

90 dias 1o Aq. -3,1 - - 159,3 43,9 30,1 65,3 80,2 59,0 2o Aq. -3,4 66,8 47,4 154,3 59,0 7,9 55,0 66,9 49,2

Analisando os dados obtidos atravs do DSC para os arcabouos porosos de

PHBV, verifica-se aumento no grau de cristalinidade (GC) ao longo do tempo de

degradao para as curvas do primeiro e segundo aquecimento. Para o tempo de 0

dias, a curva do 1 aquecimento representa a fase cristalina resultante do processo

de evaporao do solvente, no caso da amostra que no entrou em contato com o

MFS. J para os tempos de 30, 60 e 90 dias o GC referente curva do 1

aquecimento representa a fase cristalina resultante do processo de evaporao do

solvente e a fase cristalina resultante da evaporao do solvente modificada pela

ao do MFS, isto , plastificao e/ou degradao. O aumento do GC ao longo do

tempo de degradao corrobora o resultado verificado em relao diminuio da

velocidade de perda de massa do polmero ao longo do tempo. O MFS atua como

plastificante, provavelmente contribuindo para a diminuio do grau de cristalinidade,

porm ao longo do tempo de contato com o MFS, ocorre quebra das cadeias

(degradao) preferencialmente na fase amorfa com consequente aumento do GC.

J o GC determinado a partir da curva do 2 aquecimento resultante do

resfriamento a 10C/min, desta forma os resultados obtidos mostram que para as

amostras que entraram em contato com o MFS a cristalizao por resfriamento na

taxa de 10C/min parece ser menos eficiente que a cristalizao inicial, por

evaporao de solvente. Porm, importante analisar a cristalizao que ocorre

durante o 2 aquecimento. Observa-se aumento do Hc em funo do aumento do

tempo de degradao do polmero. Isto deve-se provavelmente a diminuio do

tamanho de cadeias ao longo do tempo em contato com o MFS, o que favorece a

formao de cristais. Observa-se tambm o aumento do GC resultante do

resfriamento a 10C/min, indicando mais uma vez a diminuio do tamanho de

cadeia.

Analisando os dados para os arcabouos porosos de PCL tambm se verifica

aumento no GC ao longo do tempo de degradao para as curvas do primeiro e

segundo aquecimento o que indica que ao longo do tempo de contato com o MFS,

ocorreu quebra das cadeias preferencialmente na fase amorfa com consequente

aumento do GC. Este fato est de acordo com a diminuio da massa molar mdia

viscosimtrica que foi obtido para as amostras porosas de PCL aps contato de 90

dias com o MFS. 4. CONCLUSES

O presente trabalho possibilitou a obteno de arcabouos porosos de PCL e

PHBV com dimetro de poros entre 75 e 150 m. Aps o contato com o meio

fisiolgico simulado e a partir dos dados obtidos nas anlises conclui-se que a

degradao dos arcabouos de PCL mais lenta quando comparado com as de

PHBV. A degradao hidroltica in vitro resultou em aumento da cristalinidade de

todos os polmeros estudados, indicando que as reaes de hidrlise ocorrem

inicialmente na fase amorfa. A diminuio da massa molar viscosimtrica e a

diminuio das propriedades trmicas um indicativo da degradao. A densidade e

a porosidade aparente no so fatores determinantes na velocidade de degradao

dos arcabouos.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem PHB do Brasil pela doao do PHBV, Universidade

Federal do ABC e a Central Experimental Multiusurios da UFABC pela

disponibilidade dos equipamentos e materiais.

REFERNCIAS (1) GALDINO, A. G. S. et al. Anlise de ensaios in vitro do compsito de 50%HA-50%TiO2

fabricados pelo mtodo de esponja polimrica. Cermica, v. 60, n. 356, p. 586-593, 2014.

(2) BARBANTI, S. H.; ZAVAGLIA, C. A. C. & DUEK, E. A. R. Polmeros bioreabsorvveis na

engenharia de tecidos. Polmeros: Cincia e Tecnologia, v. 15, n. 1, p. 13-21, 2005. (3) SILVA, E. F. et al. Engenharia tecidual de cartilagem articular com nfase em

odontologia. RFO, v. 20, n. 3, p. 372-379, 2015. (4) MARTINS, M. I. P. Desenvolvimento de hidrogis base de quitosano/fosfatos de clcio

para aplicaes ortopdicas. 2012, 82p. Dissertao (Mestrado em Cincias e Tecnologias) - Universidade Nova de Lisboa, Almada.

(5) AIRES, A. M. M. Biodispositivos electrnicos implantveis e biodegradveis: nano/microfibras de poli(-caprolactona) (PCL). 2012, 69p. Dissertao (Mestrado em Engenharia Biomdica) - Universidade Nova de Lisboa, Lisboa.

(6) ASTM F-1635-11 Standard Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolytically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for Surgical Implants.

(7) LeBLON, C. E et al. In vitro comparative biodegradation analysis of salt-leached porous scaffolds. Journal of Applied Polymer Science, v. 128, n. 5, p. 2701-2712, 2013.

(8) LUCAS, E. F.; SOARES, B. G.; MONTEIRO, E. Caracterizao de polmeros: determinao do peso molecular e anlise trmica. 1th ed. Rio de Janeiro (RJ): E-papers; 2001. Captulo 6, Viscosimetria; p. 125-149.

(9) FERREIRA, F. A. Polmeros biorreabosorvveis para engenharia biomdica: cintica de degradao hidroltica. 2014, 121p. Dissertao (Mestrado em Engenharia Biomdica) - Universidade Federal do ABC, Santo Andr.

(10) ASTM D-882-12 Standard Test Method for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting. (11) CASARIN, S. A. Blendas de PHBV e PCL para uso em dispositivos de osteossntese.

2010, 158p. Tese (Doutorado em Cincia e Engenharia de Materiais) - Universidade Federal de So Carlos, So Carlos.

(12) BARBANTI, S. H.; ZAVAGLIA, C. A. C. & DUEK, E. A. R. Degradao acelerada de suportes de poli(-caprolactona) e poli(D, L-cido lctico-co-cido gliclico) em meio alcalino. Polmeros: Cincia e Tecnologia, So Paulo, v. 16, n. 2, p. 141-148, 2006.

STUDY OF HYDROLYTIC DEGRADATION OF POROUS SCAFFOLDS OF POLY(-CAPROLACTONE) (PCL) AND POLY(HYDROXYBUTYRATE-CO-

VALERATE) (PHBV)

A. F. Hell, S. M. Malmonge Centro de Engenharia, Modelagem e Cincias Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, So

Bernardo do Campo (SP), Brasil E-mail: alessandrafhell@gmail.com

Abstract. The aim of this study was to verify the hydrolytic degradation in a simulated physiological environment of scaffolds produced with the polymers PCL and PHBV. Porous scaffolds obtained by solvent evaporation with porogenic agents were characterized by microstructure, density and porosity. The scaffolds were submitted to in vitro hydrolytic degradation test for 30, 60 and 90 days and evaluated by weight loss, variation of Mv, mechanical performance, thermal performance, and changes in morphology. This study made it possible to obtain porous scaffolds with pore diameter between 75 and 150 m. The results showed decreased of viscosimetric molar mass and changes of thermal properties, indicative of hydrolytic degradation. It was verified an increase in the degree of crystallinity of studied polymers indicating that was degradation preferably in the amorphous phase. It was concluded that the degradation of PCL scaffolds is slower when compared with those of PHBV.

Keywords: biomaterials, bioresorbable polymers, scaffolds, in vitro hydrolytic degradation.