Προέλευση των γενετικών ανακατατάξεων

• Οι ανακατατάξεις συμβαίνουν α) στη μείωση και β) στη μίτωση, μαζί με το διπλασιασμό του DNA

• Στη μείωση ο ανασυνδυασμός εξυπηρετεί κυρίως την αναδιανομή των γονιδίων ανάμεσα στα χρωμοσώματα

• Στη μίτωση συμβάλει κυρίως στην επιδιόρθωση των μεταλλάξεων σε μια από τις χρωματίδες ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZabcdefghijklmnopqrstuvwxyz

ABCDEFGhijklmnoPQRSTUVWXYZabcdefgHIJKLMNOpqrstuvwxyz

Χιάσματα• Στη άρρενα μείωση (από βιοψία

όρχεων), υπάρχουν κατά μέσο όρο 50 χιάσματα ανά κύτταρο.

• Στη θήλεα μείωση (μεταξύ 16 και 24 εβδομάδων της εμβρυικής ζωής), υπάρχουν κατά μέσο όρο 70 χιάσματα ανά κύτταρο.

• Άρα οι θηλυκοί γαμέτες έχουν περισσότερους ανασυνδυασμούς ανά κύτταρο και σε μεγαλύτερη έκταση του γονιδιώματος από τους άρρενες.

• Όμως λόγω του μεγαλύτερου αριθμού αναπαραγωγικών κυττάρων και της συνεχούς και αδιάλειπτης παρουσίας μειωτικών διαιρέσεων στους άρρενες η πιθανότητα μεταφοράς ανασυνδυασμένου χρωμοσώματος από τον πατέρα είναι μεγαλύτερη

Τυπική κατανομή της πλοειδίας των σπερματοζωαρίων

Using semen flow cytometry to evaluate association of ploidy status and chromatin condensation ofspermatozoa with conventional semen parameters: Clinical application in intrauterine inseminationLeandros Lazaros, Ph.D.,a Apostolos Kaponis, M.D.,a Georgios Vartholomatos, Ph.D.,b Elissavet Hatzi, Ph.D.,aStefania Botsari, M.D.,a Nikolaos Plachouras, M.D.,a Georgios Makrydimas, M.D.,aKonstantinos Zikopoulos, M.D.,a Nikolaos Sofikitis, M.D.,c and Ioannis Georgiou, Ph.D.a

Fertility and Sterility 2010

23-ν < 23 < 23+ν < 46 < 92

Είδη των ανασυνδυασμών

• Ομόλογος (allelic vs non allelic) • Μη ομόλογος (inter chromosomal,

intrachromosomal, intrachromatid)• Ρετρομετάθεση (μέσω ανάστροφης μεταγραφάσης)

Οι χρωμοσωματικές ανακατατάξεις προϋποθέτουν τη παρουσία θραύσεων της διπλής αλυσίδας του DNA (DSBs) και την επανένωση των σημείων θραύσης

μεταγραφή

αντίστροφη μεταγραφή

ενσωμάτωση

ενδιάμεσο RNA

δίκλωνο cDNA

Μηχανισμός ανασυνδυασμού των ρετρομεταθετών στοιχείων

• Αύξηση των ρετρομεταθετικών αντιγράφων στο γονιδίωμα

θέση 1

θέση 2

Copy & Paste

ΡΕΤΡΟΜΕΤΑΘΕΣΗ

μοναδιαία αλληλουχία DNA

Μετρίως επαναλαμβανόμενες μοναδιαίες αλληλουχίες DNA, διάσπαρτες στο γονιδίωμα, που έχουν την ιδιότητα να μεταγράφονται σε RNA>cDNA και να αλλάζουν θέση στα χρωμοσώματα

2.87%

8.29%

20.42%

13.29%

0.15%

0.40%

45%ανθρώπινου γονιδιώματος

Γονιδιωματικές δράσεις και ιδιότητες των ρετρομεταθετών στοιχείων

1. Αναδιοργάνωση του γωνιδιώματος- μωσαικισμός

2. Ρύθμιση της γονιδιακής δομής και έκφρασης

5. Κυτταρικός θάνατος

Παρεμβολή

Ενίσχυση

Ένθεση

Επιγενετικός έλεγχος

4. Μεταλλαξιγένεση

3. Δημιουργία νέων εξονίων (ALU exonization)

Μοριακοί μηχανισμοί και αίτια των δομικών αλλαγών στον άνθρωπο

• Τμηματικοί διπλασιασμοί = ειδικές περιοχές των χρωμοσωμάτων με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που οδηγούν σε γενετικές ανακατατάξεις ή ανωμαλίες :

• μεταθέσεις • αναστροφές • ενθέσεις • ελλείμματα • διπλασιασμούς • marker chromosomesEmanuel and Shaikh, Segmental duplications: an ‘expanding’ role in genomic instability and disease. Nature Reviews Genetics, Volume 2, October 2001, 791-800.

Segmental duplications & Copy number variations

Μηχανισμοί κατά το διπλασιασμό του DNA στη μίτωση

• FoSTeS (fork stalling and template switching) εξηγεί σύνθετους ανασυνδυασμούς .

• MMBIR (microhomology-mediated break-induced replication) γενικευμένος μηχανισμός που προκαλεί τις δομικές παραλλαγές.

• FoSTeS/MMBIR Προκαλούν ανασυνδυασμούς από λίγες εκατοντάδες βάσεις μέχρι πολλές μεγαβάσεις.

• Συμβαίνουν στη μίτωση και προκαλούν διπλασιασμό τριπλασιασμό και ελλείμματα γονιδίων ή ακόμα και εξονίων

Τι μπορεί να κάνει η aCGH στη γενετική διάγνωση

• Ταυτοποίσηση νέων μικροελλειμμάτων και άλλων συνδρόμων που δεν ανιχνεύονται με καρυότυπο

• Αποτελεσματικότερη διάγνωση για ένα φάσμα διαταραχών και συγγενών ανωμαλιών

• Αποσαφήνηση των υποκείμενων μοριακών αλλαγών μιας χρωμοσωματικής ανωμαλίας

DeletionDuplication

Copy number variations (CNV)

Τι δεν μπορεί να κάνει η aCGH στη γενετική διάγνωση

• Να ανιχνεύσει ισοζυγισμένες ανακατατάξεις• Δεν παρέχει πληροφορίες θέσης (π.χ. να διακρίνει

τρισωμία οφειλόμενη σε μετάθεση από ελεύθερη τρισωμία )

• Να ανιχνεύσει τριπλοειδία • Ίδια αποτελέσματα στην ανίχνευση μωσαϊκισμών

• Χρειαζόμαστε ακόμη το κλασσικό καρυότυπο

aCGH• Ανιχνεύει μικρές (η πολύ μικρές) παραλλαγές του

αριθμού των αντιγράφων (CNV)• Το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει δύο τύπους CNV:

1. παθογόνες παραλλαγές 2. ακίνδυνες, καλοήθεις παραλλαγές, χωρίς συνέπειες

3. αυτές που συμβάλλουν έμμεσα στη δημιουργία παθολογικών φαινοτύπων και σχετίζονται με άλλες γενετικές βλάβες

• Προς το παρόν δε γνωρίζουμε όλες τις παραλλαγές (CNVs) και τη σημασία τους στο γονιδίωμα

Blake et al.

Ρετρομεταθετά στοιχεία LINE-1

FoSTeS, MMBIR and NAHR at the human proximal Xp region and the mechanisms of human Xq isochromosome formation.Koumbaris G, et al Hum Mol Genet. 2011

Τι γνωρίζουμε σήμερα για την ανάλυση των χρωμοσωμάτων με μικροσυστοιχίες (aCGH)• Οι aCGH αναγνωρίζουν περισσότερες μη ισοζυγισμένες

ανωμαλίες σε σχέση με τον καρυότυπο και στη προγεννητική και στη μετά τη γέννηση διάγνωση

• Υπάρχουν διαφορές μεταξύ του προγεννητικού ελέγχου και του ελέγχου μετά τη γέννηση

• Οι aCGH δίνουν περισσότερες επιπρόσθετες πληροφορίες για πολλές ανωμαλίες του καρυοτύπου

• Οι aCGH έχουν λιγότερη εργασιακή απασχόληση και μεγαλύτερη ταχύτητα αποτελεσμάτων

Aneuploidy in the human cleavage stage embryo

• Περίπου 60% των εμβρύων 3 ημερών έχουν 1 τουλάχιστον ανευπλοειδία ολόκληρου η μέρους των χρωμοσωμάτων

• Μόνο 20-25% δεν έχουν ανευπλοειδία

• Μωσαϊκισμός διαφορετικών χρωμοσωμάτων είναι η συχνότερη γενετική βλάβη

• Πρώτη αιτία οι ανωμαλίες του κυτταρικού κύκλου στις πρώτες διαιρέσεις του εμβρύου

• Δεύτερη αιτία η γονεϊκή προδιάθεση σε ανωμαλίες της μείωσης και της μίτωσης

Mantzouratou & Delhanty 2011 Review

Polar body analysis by array CGH accurately predicts aneuploidies of maternal meiotic origin in cleavage

stage embryos of women of advanced maternal age • Sixty-nine (93%) aneuploidies were

associated with copy number changes in the polar bodies and 98.5% of these had been predicted to be aneuploid. Also, 95% balanced combinations of chromatid gain/loss in PB1/PB2 accurately predicted normal copy number in the corresponding embryos.

• Most of these involved copy number changes that were smaller than would be expected for whole chromosome or chromatid imbalance and occurred significantly more often in PB1 than PB2 (P < 0.0005).

Christopikou et al Hum Repr 2013

Microarray analysis reveals abnormal chromosomal complements in over 70% of 14 normally developing

human Embryos• main results and the role of

chance: The good-quality embryos exhibited high rates of aneuploidy, 10 of 14 (71.4%) of the embryos being mosaic. While none of the embryos had the same aneuploidy pattern in all cells, 4 of 14 (28.6%) were uniformly diploid.

• Of the 70 analysed blastomeres, 55.7% were diploid and 44.3% had chromosomal abnormalities, while 29% of the abnormal cells carried structural aberrations.

Mertzanidou et al Hum Repr 2012

Αποτελέσματα aCGH

• Τρεις κατηγορίες αποτελεσμάτων :1.Φυσιολογικό 2.Παθολογικό 3.Παραλλαγή άγνωστης κλινικής σημασίας (Variant on unknown significance VOUS)• Στη Τρίτη κατηγορία έχουμε διαγνωστικό πρόβλημαΑ. Στον έλεγχο μετά τη γέννηση δε γνωρίζουμε αν το αποτέλεσμα εξηγεί το φαινότυπο του παιδιού Β. Στη προγεννητική δε γνωρίζουμε αν το έμβρυο θα είναι υγιές η πάσχον

Πως κατοχυρώνεται η «παθογονικότητα» των CNV

Κριτήρια καθορισμού της κλινικής σημασίας :

• Μέγεθος της CNV σε βάσεις• Ανασκόπηση των βάσεων δεδομένων CNV• Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας • Ταυτοποίησή της CNV σε πάσχοντες / υγιείς (controls)• Αν υπάρχει η όχι συγκεκριμένος φαινότυπος • Από το πόσα και ποια γονίδια περιλαμβάνει• Τα ελλείμματα είναι συχνότερα παθογόνα σε σχέση με τους

διπλασιασμούς • Έλεγχος οικογενειακού ιστορικού, διεισδυτικότητας,

εκφραστικότητας ...

DELETION of approximately 1.4Mb in size on the long arm of chromosome 17 (q-arm) at chromosomal band 17q12 (location: 34,823,154-36,248,888). (παιδιατρικός ασθενής με βαριά κυστεοουρητηρική παλιδρόμηση)

The deletion consists of two OMIM disease genes namely Acetyl-Coa Carboxylase-Alpha (ACACA, OMIM#200350) and the Hepatocyte nuclear factor-1-beta (HNF1B, OMIM#189907) ref 4. The deletion is most probably related to the reason for referral and is consistent with the phenotype. (Mitsioni et al 2014)

Παράδειγμα 1

DUPLICATION of approximately 0.2Mb in size on the long arm of chromosome 5 (q-arm) at chromosomal band 15q23.3 (location: 129,483,166-129,703,662). (παιδιατρικός ασθενής με κυστεουρητηρική παλινδρόμηση και νεφρική υποδυσπλασία)

The duplication partially disrupts one Refseq gene namely Chondroitin Sulfate Synthase 3 (CHY3) which is most probably unrelated to the reason for referral (Mitsioni et al 2014).

The change is a VOUS with unknown significance

Παράδειγμα 2

Δεν επιβεβαιώνεται με RT-PCR το εύρημα ούτε το εύρημα

αβέβαιης κλινικής σημασίας

Παράδειγμα 3

aCGH

Η μέθοδος aCGH μπορεί επίσης να ανιχνεύσει :• Τυχαία ευρήματα – ελλείμματα γνωστών παθογόνων

γονιδίων όπως π.χ.– Να διαγνώσει νευροεκφυλιστικές διαταραχές των

ενηλίκων – Να αποκαλύψει την ίδια διάγνωση σε ένα από τους

γονείς πριν από την εμφάνιση της νόσου – Να διαγνώσει προδιάθεση καρκίνου σε παιδί – Να ανιχνεύσει φορεία υπολειπόμενου νοσήματος

• Να αμφισβητήσει τη πατρότητα • Να βρει συγγένεια μεταξύ γονέων (ενδογαμία)

aCGH in PND

• Πολλές Διαφορετικές Μελέτες • Δυσκολία σύγκρισης αποτελεσμάτων, λόγω:

Ετερογένειας τεχνικής πλατφόρμαςΕτερογένειας σειρών ασθενών Διαφορετικών ενδείξεων Αμφιβόλων ανώμαλων ευρημάτωνΟρισμού των VOUS

Additional information from array comparative genomic hybridization technology over conventional karyotypingin

prenatal diagnosis: a systematic review and meta-analysis

S. C. HILLMAN*†, S. PRETLOVE†, A. COOMARASAMY*, D. J. McMULLAN‡, E. V. DAVISON‡,E. R. MAHER*§ and M. D. KILBY*†

All CNVs pathogenic, of unknown significance or benign included Ultrasound Obstet Gynecol 2011; 37: 6–14

Additional information from array comparative genomic hybridization technology over conventional karyotypingin prenatal diagnosis:

a systematic review and meta-analysisS. C. HILLMAN*†, S. PRETLOVE†, A. COOMARASAMY*, D. J. McMULLAN‡, E. V. DAVISON‡,

E. R. MAHER*§ and M. D. KILBY*†

IF ONLY CNVs which are pathogenic or of unknown significance are included advantage drops by 50% Ultrasound Obstet Gynecol 2011

• Overall detection rate 5.3%• 5.5% (140/2533) with significant findings although normal karyotype• 71% of significant CNVs < 10kb (unlikely detection with karyotyping)• Turnaround time mean 7.5 days (median 6 days)• Frequency of VOUS 4.2%, de novo 0.4%

The largest study so far N=5003 from one lab

Prenat Diagn. 2012 Oct;32(10):976-85

Συγκατάθεση για aCGH στη PNDEthical Considerations Aitomaki 2012

• Before prenatal CMA patients need counselling forPossibility of identifying VOUSPossibility of incidental findings

• Patients need to decide what information they want to receive, particularly concerning incidental findings

In conclusion• We should provide our patients with the benefits or

modern genetic technology in prenatal testing

Dr. Diana Wellesley M.D., FRCP, Head, Prenatal Genetics, Wessex

Clinical Genetics Service, Princess Anne Hospital (United Kingdom) Prenatal Arrays in the UK - Proposals

for a National Approach 2014

The diagnostic superiority of aCGH, in the postnatal setting, is now well established and offered as the first line test in most centres. Postnatal experience has also shown us, however, that with the additional diagnoses come less wanted findings, commonly known as Incidental Findings (IF) and Variants of Uncertain Significance (VOUS). In the UK, these issues have delayed the introduction of aCGH, in the prenatal setting, whilst the best way forward is considered. The importance of accuracy, speed and minimal diagnostic uncertainty is recognized, in the knowledge that such results may inform decisions about the outcome of a pregnancy. There is agreement that some tailoring of prenatal aCGH results is appropriate, and that such tailoring is best applied on a national basis but, as yet, no decision has been made on a certain way forward. This is currently under urgent review in the UK. The issues under discussion, and any conclusions drawn, will be presented.

Sagoo et al. 2009

Positive Array results after normal result on chromosome analysis

False Positive Array results after normal result on chromosome analysis

False Positives are similar to Positives Sagoo et al. 2009

>2300 children with CNV associated withintellectual disability and congenital anomalies

Girirajan et al NEJM September 2012

Συμπεράσματα 1

• Οι ανασυνδυασμοί είναι φυσικοί μηχανισμοί προστασίας του γενετικού υλικού στη μείωση και στη μίτωση

• Ένα μέρος των ανασυνδυασμών προκαλεί βλάπτικές αλλαγές στο γονιδίωμα

• Πρέπει να γίνεται διάκριση μεταξύ των βλαπτικών και των ουδέτερων ανασυνδυασμών

• Καμμία τεχνολογία και κανένας δείκτης δεν μπορεί να διαγνώσει όλες τις αλλαγές του γονιδιώματος

Συμπεράσματα 2

• Υπάρχουν διαφορές στις γενετικές ανωμαλίες που εφανίζονται στη

Προεμφυτευτική διάγνωση (μωσαϊκισμοί)Προγεννητική διάγνωση (VOUS)Μετά τη γέννηση (ευρήματα που δεν εξηγούν το φαινότυπο)• Χρειάζεται εθνική στρατηγική καθορισμού

κριτηρίων για την ευρεία εφαρμογή των νέων μεθόδων