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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE
ALIMENTOS
APLICAÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS INIBIDORES DE α AMILASE
PARA O BIOCONTROLE DE Fusarium verticillioides
Gabriela Lemos Mendes
Engenheira de Alimentos
Orientadora Prof Dra Eliana Badiale-Furlong
Rio Grande, RS
2013
ii
Gabriela Lemos Mendes
APLICAÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS INIBIDORES DE α AMILASE
PARA O BIOCONTROLE DE Fusarium verticillioides
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia e Ciência de Alimentos da
Universidade Federal do Rio Grande,
como requisito para a obtenção do título de
Mestre.
Rio Grande, RS
2013
iii
AGRADECIMENTOS
Enfim chegou a hora. São tantos agradecimentos e à tantas pessoas que com certeza
passaria de 2-3 páginas, por isso vou tentar resumir.
Primeiramente à Universidade Federal do Rio Grande e ao Programa de Pós Graduação
em Engenharia e Ciência de Alimentos, pela oportunidade de formação e qualificação.
À CAPES pelo apoio financeiro.
Aos meus pais e meus irmãos!!! Que sempre me incentivaram nos meus estudos, me
acompanharam nas horas mais difíceis e não me deixaram desistir... Me tornaram esta
pessoa que sou. Devo muito a vocês e amo todos muito!
À aquela pessoa que simplesmente me completa, me guia, me auxilia, me atura
diariamente – Hélio de Paiva Brettas Neto, meu marido, meu amor, meu companheiro.
Essa vitória também é tua.
À professora Eliana Badiale Furlong. Que em 2008 aceitou orientar uma guria que nem
conhecia... abriu as portas para o meu conhecimento, me permitiu aprender os
ensinamentos básicos e os nem tão básicos da bioquímica, química e análise, mas os
maiores ensinamentos, com certeza, são os que eu levarei para a vida. Estes não há
diploma ou título que possa expressar. Profe, muito obrigada!!! Obrigada por todas as
nossas conversas, pela paciência, pela disponibilidade, por entender o meu tempo e
aceitar tudo isso!! Com certeza és um exemplo de pessoa e profissional que quero
seguir!! E o aperto no coração hoje é muito mais forte do que aquele que senti quando
sai de casa.
Às professoras Jaqueline Garda Buffon e Leonor Almeida Souza Soares, pela presença
e pela orientação em toda esta caminhada. Pelas sugestões no trabalho e em outros
assuntos também.
Àquela que é minha “lanterninha” no escuro, minha mística preferida. À Maria de Jesus
Pinto Lamego, que me ajudou em todos os dias, seja sorrindo, com uma palavra amiga,
seja me incentivando ou me enchendo o saco por causa da bagunça!!! Jesus és um
exemplo de FORÇA, e são poucas pessoas que eu conheço que sabe levar a vida do
jeito que tu a leva. Obrigada por me lembrar, por inúmeras vezes, que eu sou uma
leonina e por fazer acreditar mais em mim ...
Às minhas ICs, que sem elas com certeza seria muito mais difícil. À Chiara e a Paola C.
Especialmente a Chiara, que me acompanhou desde o início do trabalho, e que mesmo
não me escolhendo, eu a escolhi, e não me arrependo disso, que me ensinou muitas
coisas e a principal é que responsabilidade e dedicação são características que
independe da idade. Tu, com apenas 17-18 anos, já mostra um futuro promissor pela
frente, obrigada por tudo!
iv
À dupla infalível e/ou dinâmica... que até funcionam bem quando separadas, mas
quando estão juntas (que é sempre), funcionam melhor ainda!!! Fernanda e Larine.
Gurias, tenho muito a agradecer a vocês. Fer, obrigada por me apresentar o mundo dos
inibidores enzimáticos, sim eles são ‘um colosso’, obrigada por todas as dicas durante o
trabalho, obrigada por toda a paciência e por ser minha “colega de classe”. Lalá,
obrigada por estar sempre no lab!! Tirando as minhas dúvidas mais ridículas, obrigada
pelos conselhos também, uns bons e outros nem tanto, hehe. À vocês duas, meu
obrigada! Pela diversão, pelas brincadeiras, pelos momentos tensos, pelas atividades
desenvolvidas juntas, por aceitarem conviver comigo...
Às minhas outras ICs, que foram muitas... Anelise, Lu e Adri! Que não foram apenas
uma mão na roda, mas duas!!!! Além das atividades no lab, obrigada por serem minhas
amigas, pelos nossos cafés, almoços, conversas no ônibus e pelas risadas sempre
frequente. Obrigada mesmo gurias!!!!
À Cris Breti, que por tantas vezes me ensinou a reação amido + iodo, e que foi
incansável até achar a proporção certa entre a Fungamyl e o inibidor. Cris, obrigada pela
parceria !!!! Mas não me pergunte se amarelo é bom ou não que eu já não me lembro...
ahahahah
À Fabiane Petry, pela ajuda na coleta das amostras.
Aos colegas e amigos do LCA, que nestes quase 5 anos, a convivência foi diária, e foi
com ela que trocamos experiências, trocamos dicas e ideias... À Rê e a Helen, pelos
ensinamentos no HPLC e pela amizade. À Ana Carla, que chegou junto na parceira
noturna e de final de semana no HPLC. À Priscila, pela parceria na aventura do estágio
de docência Ao Júlio, pelos inúmeros ‘helps’ na eletroforese. Aos outros colegas e
amigos, Lidi, Mi, Cristiano, Tai, Muri, gurias do TCC (Annie, Letícia e Náthali), Fran,
Paula, Guta, Rosana, Paola M., Tiago, obrigada pela convivência sadia e por toda a
ajuda.
As minhas amigas da FURG com parceria do Moralles Turismo (hehe), Pâmela,
Vanessa, Dê, Carol e a mais que especial, Déh, que é uma grande amiga, que entende a
minha bipolaridade matinal e que sempre me acompanhou em todos os momentos.
À todos que contribuíram de alguma forma para o desenvolvimento do trabalho, meu
muito obrigada!
v
“Descobri como é bom chegar quando se tem paciência. E para se chegar, onde quer
que seja, aprendi que não é preciso dominar a força, mas a razão. É preciso antes de
mais nada, querer!”
Amyr Klink
vi
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xii
RESUMO ...................................................................................................................... xiii
ABSTRACT .................................................................................................................. xiv
1. INTRODUÇAO ........................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 3
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 3
2.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 3
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 4
3.1 Fungos ................................................................................................................ 4
3.1.1 Fusarium verticillioides ................................................................................... 6
3.2 Micotoxinas ....................................................................................................... 7
3.2.1 Fumonisinas ..................................................................................................... 8
3.3 Estratégias para o controle fúngico .................................................................. 12
3.3.1 Uso de inibidores de enzimas digestivas para o controle de Fusarium ......... 13
3.4 Trigo (Triticum aestivum L.) como fonte de extração de inibidores enzimáticos 15
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 16
4.1 Material ............................................................................................................ 16
4.1.1 Matéria prima ................................................................................................ 16
4.1.2 Isolado fúngico .............................................................................................. 17
4.1.3 Padrões analíticos e reagentes ....................................................................... 18
4.1.4 Preparo das soluções estoque e trabalho de FB1............................................ 19
4.2 Métodos ........................................................................................................... 19
4.2.1 Caracterização dos cultivares de trigo (Triticum aestivum L.) ...................... 19
vii
4.2.2 Caracterização físico-química dos cultivares mais promissores ................... 24
4.2.3 Biocontrole de Fusarium verticillioides através da aplicação de extratos
proteicos em cultivo in vitro ................................................................................... 28
4.2.4 Análise Estatística ......................................................................................... 30
4.2.5 Descontaminação do material ........................................................................ 30
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 31
5.1 Caracterização dos cultivares de trigo ............................................................. 31
5.1.1 Incidência de micro-organismos e Atividade de água nos grãos de trigo ..... 31
5.1.2 Ocorrência de Fumonisina B1 nas amostras de grãos de trigo ...................... 35
5.1.3 Potencial para a inibição da α amilase fúngica .............................................. 39
5.1.4 Considerações sobre a caracterização dos cultivares de trigo ....................... 42
5.2 Caracterização físico-química dos cultivares mais promissores ...................... 43
5.2.1 Composição centesimal ................................................................................. 43
5.2.2 Perfil enzimático ............................................................................................ 45
5.2.3 Determinação do peso molecular dos extratos proteicos .............................. 47
5.3 Biocontrole de Fusarium verticillioides através da aplicação de extratos
enzimáticos em cultivo in vitro .................................................................................. 50
5.3.1 Efeito da purificação do extrato enzimático sobre a inibição da atividade da α
amilase .................................................................................................................... 50
5.3.2 Inibição do crescimento micelial do F. verticillioides .................................. 52
5.3.3 Inibição do conteúdo de glicosamina e atividade da α amilase ..................... 55
5.3.4 Influência da aplicação dos extratos enzimáticos sobre a manifestação do
potencial toxigênico do F. verticillioides ............................................................... 56
5.3.5 Considerações sobre as respostas de biocontrole de F. verticillioides em
testes in vitro ........................................................................................................... 59
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 63
8. ANEXOS ................................................................................................................ 77
viii
8.1 Fotos do Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F.
verticillioides durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos dos
diferentes cultivares. ................................................................................................... 77
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura Química das Fumonisinas B1, B2 e B3. Fonte: Minami et al. (2004). 9
Figura 2 Rompimento da biossíntese dos esfingolipídios pela FB1. Adaptado de
Heidtmann-Bemvenuti et al. (2011). .............................................................................. 11
Figura 3 Etapas de obtenção dos discos de micélio do Fusarium verticillioides. A.
Cortes realizados no ágar PDA, B. Retirada dos discos de micélio da placa e C.
Transferência dos discos de micélio do patógeno para as placas do cultivo in vitro. .... 18
Figura 4 A. Inserção das amostras nos poços do gel, B. Gel com as amostras e C.
Corrida eletroforética das amostras. ............................................................................... 27
Figura 5 Distribuição percentual do gêneros fúngicos isolados dos grãos de trigo. ...... 32
Figura 6 Cromatograma de eluição do padrão de Fumonisina B1 .................................. 35
Figura 7 Atividade específica da α-amilase, β-amilase, protease e lipase. UA = atividade
enzimática específica.. .................................................................................................... 46
Figura 8 Teste com Gel eletroforese SDS-PAGE ......................................................... 48
Figura 9 Gel eletroforese SDS-PAGE ............................................................................ 49
Figura 10 Crescimento micelial do F. verticillioides nos testes in vitro, com as
diferentes fontes de extração dos extratos inibidores (cultivares), na presença de extrato
bruto (EB) e extrato primariamente purificado (EPP), onde refere-se ao
experimento realizado com EB; refere-se ao experimento realizado com EPP e
refere-se ao experimento controle. ......................................................................... 53
Figura 11. Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar OR Marfim NE, e
os respectivos controles. ................................................................................................. 78
Figura 12 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Quartzo NO, e os
respectivos controles....................................................................................................... 79
Figura 13Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Abalone, e os
respectivos controles....................................................................................................... 80
Figura 14 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Fundacep Raízes,
e os respectivos controles. .............................................................................................. 81
x
Figura 15 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar BRS Tarumã, e os
respectivos controles....................................................................................................... 82
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Espécies de fungos toxigênicos e suas principais micotoxinas ......................... 5
Tabela 2 Cultivares de trigo com as respectivas classes e região de cultivo. ................. 17
Tabela 3 Atividade de água e contaminação fúngica nos cultivares de trigo (102 UFC g
-
1). .................................................................................................................................... 33
Tabela 4 Resultados do estudo de precisão, equação das curvas analíticas e efeito matriz
(EM). .............................................................................................................................. 37
Tabela 5 Ocorrência de Fumonisina B1 nas amostras de grãos de trigo......................... 38
Tabela 6 Inibição percentual e inibição específica (mg amido residual -1
mg -1
proteína-1
)
e conteúdo de proteína solúvel (mg proteína mL -1
). ...................................................... 40
Tabela 7 Composição centesimal (g 100g amostra-1
) dos cultivares de trigo ................ 44
Tabela 8 Inibição da α amilase fúngica por EPP de diferentes fontes de cultivares de
trigo. ................................................................................................................................ 51
Tabela 9 Inibição da produção de glicosamina (IG) e inibição da atividade (IA) da α
amilase para os extratos EB e EPP. ................................................................................ 55
Tabela 10 Níveis de FB1 na biomassa fúngica com a aplicação dos diferentes extratos e
os respectivos controles. ................................................................................................. 57
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
Aa – Atividade de água
ANOVA – Análise de Variância
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância sanitária
AOAC – Association of Official Analitical Chemistry
CONAB – Companhia Nacional do Abastecimento
DNS – Dinitrossalicílico
FB1/ FB2 – Fumonisina B1/ B2
FDA – Food and Drug Administration
Fusarium ID – Fusarium identification database
HPLC- UV/FL – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de
Fluorescência
IARC – International Agency for Research on Cancer
ICH – International Conference on Harmonisaton
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
LMT– limites máximos tolerados
LOD – Limite de detecção
LOQ – Limite de quantificação
n- BLAST– Basic Local Aligment Search Tool
OPA – o-phtaldialdeído
OPA-MCE – o-phtaldialdeído -2- mercaptoetanol
PCA – Análise por principais componentes
QuEChERS – Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged ans Safe
r2 – coeficiente de correlação
RSD % – Desvio padrão relative porcentual
SDS – Dodecil sulfato de sódio
So/Sa- Metabolismo esfinganina/ esfingosina
TCA– Ácido tricloroacético
UFC – Unidades formadoras de colônias
xiii
RESUMO
O Fusarium verticillioides é um fungo endofítico que está frequentemente associado ao
milho, é o principal produtor de FB1, uma micotoxina que representa riscos à saúde da
população e de animais. O controle do F. verticillioides é importante não só para evitar
as perdas econômicas relacionadas a safra mas também para evitar problemas de saúde
pública, baseado nisso, métodos de prevenção da contaminação se tornam interessantes.
Entre estes, os métodos de controle físicos e químicos geram custos elevados, podendo
afetar o ambiente e deixar resíduos nos alimentos, sendo o biocontrole uma alternativa
economicamente viável e menos agressiva. Neste sentido chama a atenção os poucos
relatos quanto a ocorrência de Fumonisinas em trigo embora este seja alvo do complexo
Fusarium. O trigo tem importância relevante no mercado brasileiro e mundial por
constituir a base de diversos alimentos destinados ao consumo humano. O objetivo
deste trabalho foi extrair inibidores enzimáticos de cultivares de trigo potencialmente
fontes de inibidores enzimáticos e aplicar estes inibidores em cultivo in vitro, a fim de
verificar o potencial destes compostos para o biocontrole de F. verticillioides. Os
extratos proteicos de grãos de trigo dos cultivares Codetec 114, Fundacep Raízes, BRS
Tarumã, OR Marfim NO, OR Marfim NE, BRS Guamirim NO, BRS Guamirim NE,
Abalone, Horizonte, Mirante, Fundacep 50, Fundacep Cristalino, Quartzo NO e Quartzo
NE foram testados quanto ao seu potencial de inibir a atividade da amilase fúngica. Os
cultivares selecionados foram Fundacep Raízes, BRS Tarumã, Abalone, Quartzo NO e
OR Marfim NE. A aplicação dos inibidores enzimáticos no cultivo in vitro foi sob duas
formas, o extrato bruto (EB) e o extrato primariamente purificado (EPP). Os EB
inibiram o crescimento micelial do patógeno em 9, 12, 20, 9 e 6%, quando se utilizou os
extratos obtidos dos cultivares Quartzo NO, BRS Tarumã, Fundacep Raízes, Abalone e
OR Marfim NE, respectivamente. Os EPPs dos cultivares Quartzo NO, Fundacep
Raízes, Abalone e OR Marfim NE, inibiram 15, 26, 12 e 11%, respectivamente. O
extrato obtido do cultivar Fundacep Raízes se destacou como melhor inibidor para o
crescimento micelial do fungo. O conteúdo de glicosamina e a atividade da amilase
também foram determinados e serviram como indicativos da inibição microbiana. O EB
do cultivar Quartzo NO teve a maior capacidade de inibição (66%) no conteúdo de
glicosamina e na atividade da enzima (84%). Esses resultados indicam que a utilização
do extrato pode ter ocasionado a inibição do desenvolvimento fúngico através da
inibição da enzima responsável pela obtenção de energia para o patógeno. Para avaliar a
influência das aplicações dos inibidores enzimáticos no potencial toxigênico do
Fusarium verticillioides, foi realizado a extração e quantificação de Fumonisina B1, cuja
a diminuição da produção em média foi de 33% e 47% ao aplicar no cultivo in vitro os
extratos brutos e primariamente purificados, respectivamente. A aplicação do EPP do
cultivar BRS Tarumã inibiu em torno de 80% a produção da micotoxina, sendo que este
cultivar não havia se destacado nos testes de inibição do desenvolvimento fúngico como
os extratos obtidos pelos cultivares Quartzo NO e Fundacep Raízes. Os inibidores
enzimáticos presentes nos grãos de trigo estudados são potenciais agentes antifúngicos e
antimicotoxigênicos contra F. verticillioides demonstrando assim, uma alternativa para
o controle destes fitopatógenos em outros grãos, após avaliação mais aprofundada do
mecanismo de ação.
Palavras-chave: Inibidores enzimáticos, biocontrole; Fusarium verticilliodes,
Fumonisina B1.
xiv
ABSTRACT
The endophytic fungus Fusarium verticillioides is often associated with corn crop and is
the main producer of FB1, a mycotoxin that represents risks to public and animal health.
The control of F. verticillioides contamination is important not only to avoid economic
losses related to harvest but also to prevent health’s public problems. Based on this,
methods to prevent this damage become quite interesting. Among them methods of
physical and chemical control generate high costs, which can affect the environment
and leave residues in food, being the biocontrols processes an economically viable and
less aggressive alternative. In this sense attract attention the few reports about the
occurrence of Fumonisins in wheat although this one is targeted for species Fusarium.
Wheat has a great importance in the mundial and brazilian market because it constitutes
the basis of different foodstuffs destined for human consumption The aim of this work
was to extract enzymatic inhibitors from different wheat cultivars and apply them in
vivo cultivation in order to verify the potential of these compounds in the F.
verticillioides biocontrol. The results obtained demonstrated that wheat grains are good
sources for enzymatic inhibitors extraction, as the extracts inhibited the fungal amylase
activity up to 60%. The application of enzymatic inhibitors in vitro cultivation was
evaluated with crude extract (CE) and primarily purified extract (PPE). The CE
inhibited the pathogen mycelial growth in 9, 12, 20, 9 and 6%, when were used the
extracts from the cultivars Quartzo NO, BRS Tarumã, Fundacep Raízes, Abalone and
OR Marfim NE, respectively. The PPES from cultivars, Quartzo NO, Fundacep Raízes,
Abalone e OR Marfim NE, inhibited 15, 26, 12 e 11%, respectively. The CE obtained
Fundacep Raízes highlighted as the best inhibitor of micelial growth fungus. The
content of glicosamine and amylase’s activity also were determined and serve as
microbial inhibition indicative. CE obtained Quartzo NO had the best inhibition
capacity (66%) in glicosamine content and enzyme activity (84%). These results
indicate that the use of extracts may have caused the inhibition of fungal growth by
inhibition the enzyme responsible from obtaining energy from pathogen. To evaluate
the influence of applications of enzyme inhibitors in toxigenic potential of Fusarium
verticillioides, were performed the extraction and quantification of FB1, whose
production decreased on average by 33% and 47% when applying the in vitro crude
extracts and primarily purified, respectively. The application of the PPE from BRS
Tarumã inhibited about 80% of mycotoxin production, and this cultivar had not been
prominent on tests of inhibition of fungal growth as the extracts obtained by cultivars
Quartz NO and Fundacep Raizes. The enzyme inhibitors present in wheat grains studied
are potential antifungal agents and antimycotoxin against F. verticillioides, thus
demonstrating an alternative for the control of these pathogens in other grains after
further evaluation of the mechanism of action.
Keywords: Enzymatic inhibitors, biocontrole; Fusarium verticilliodes; Fumonisin B1.
1
1. INTRODUÇAO
Os alimentos destinados ao consumo humano sofrem contaminações das mais
variadas. No caso de grãos, o principal risco com relação à infestação microbiana
refere-se ao crescimento fúngico. Em termos práticos, dois aspectos indesejáveis
resultam do crescimento e multiplicação de fungos: a perda econômica e o risco
potencial à saúde, oriunda da produção de micotoxinas (BERND et al., 2008).
Os fungos potencialmente capazes de produzir metabólitos secundários tóxicos
são denominados toxigênicos e podem contaminar os grãos no campo, antes mesmo da
colheita ou durante o armazenamento, persistindo em alimentos e rações destinados ao
consumo humano e à animais de criação (RUPOLLO et al., 2006).
Os fungos da espécie Fusarium são largamente encontrados em cereais por todo
mundo, com várias espécies sendo economicamente relevantes, pois podem infectar e
destruir os tecidos de várias culturas, como o milho, trigo e outros pequenos grãos
(DAMBOLENA et al., 2011). Entre eles, o Fusarium verticillioides Niremberg (=
Fusarium moniliforme Sheldon) é uma das espécies de maior ocorrência e a
contaminação por F. verticillioides ocorre principalmente nas culturas de milho,
causando perdas significativas na produção e na qualidade dos grãos, além de ser um
potencial produtor de FB1 (BERND et al., 2008).
A FB1 tem recebido considerável atenção de agências regulatórias de alimentos,
desde que mostrou efeitos imunotóxicos, neurotóxicos, hepatotóxicos e propriedades
cancerígenas em animais. Esta micotoxina é classificada pela Agência Internacional de
Pesquisa ao Câncer (IARC) no grupo 2B, por ser uma substância potencialmente
carcinogênica (ALTINOK, 2009; DAMBOLENA et al., 2011).
Em vista destes aspectos, nas últimas décadas, o controle das doenças e pragas
na agricultura tem se intensificado, sendo realizado basicamente através do emprego de
produtos sintéticos, com elevados custos e riscos ambientais (desequilíbrio ecológico) e
toxicológicos (elevada concentração nos alimentos). A busca de substitutos para estes
produtos encontra nas próprias plantas uma alternativa de interesse econômico e
ecológico bastante promissor (SOUZA et al., 2007).
2
Assim, o controle biológico de patógenos em plantas despertou o interesse por
permitir o emprego de muitos mecanismos, incluindo antagonismo, antibiose,
competição, indução de resistência ou prevenção da formação de inóculos, sem a
utilização de princípios ativos agressivos à saúde e ao meio ambiente (VUJANOVIC et
al., 2012).
Além disso, a existência de compostos como antibióticos, alcaloides, terpenos,
proteínas ou inibidores de enzimas digestivas, tem sido atribuída ao certo grau de
resistência nas plantas a ataque a patógenos (KUMARI et al., 2012). A atenção maior
está sendo focada na ideia de utilizar inibidores de enzimas digestivas para afetar o
crescimento e desenvolvimento de espécies de pragas (PAGNUSSATT et al., 2012;
KUMARI et al., 2012; MEHRABADI et al. 2012).
Neste contexto, o estudo sobre a ocorrência de inibidores de enzimas digestivas
é relevante a fim de buscar o entendimento e alternativas para o controle de
fitopatógenos, com ênfase nos fungos toxigênicos (SAUNDERS et al, 2001),
especialmente naquelas culturas de maior impacto econômico e de uso mais frequente.
Neste caso, a identificação do mecanismo de defesa natural em trigo pode contribuir
para gerenciar os problemas oriundos do uso de agrotóxicos e fornecer subsídios para o
desenvolvimento de cultivares resistentes de outras espécies vegetais cultiváveis.
3
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Extrair inibidores enzimáticos de diferentes cultivares de trigo e aplicá-los
em cultivo in vitro a fim de verificar o potencial antifúngico e
antimicotoxigênico contra Fusarium verticillioides.
2.2 Objetivos específicos
Validar metodologia para extração e quantificação de FB1 em grãos de trigo;
Caracterizar os cultivares de trigo com relação a atividade de água,
contaminação microbiana, conteúdo de inibidores enzimáticos e ocorrência
de FB1 e selecionar os cultivares mais promissores com base nestas
respostas;
Caracterizar físico-quimicamente e determinar o perfil enzimático dos
cultivares de trigos mais promissores;
Verificar a influência da purificação dos extratos brutos na inibição da
amilase fúngica comercial;
Avaliar potencial de extratos proteicos brutos e parcialmente purificados
para inibir o desenvolvimento e manifestação do potencial toxigênico de F.
verticillioides in vitro.
4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Fungos
Os alimentos, independente da sua origem, apresentam uma microbiota natural
extremamente variável, concentrada principalmente na região superficial. Os fungos e
as bactérias são os micro-organismos de maior destaque, tanto como agentes potenciais
de deterioração do produto, ou como eventuais patógenos para o homem. Porém, nas
diversas etapas de processamentos, os alimentos estão sujeitos à contaminação por
diversos outros micro-organismos que não fazem parte dessa microbiota natural
(ATAYDE, 2009).
Os fungos são organismos heterotróficos, isento de clorofilas, dependentes
exclusivos de fonte externa de componentes orgânicos para suprir a demanda
energética. Esta característica confere a muitas espécies, a necessidade de subsistência
com organismos superiores, através do parasitismo ou saprofitismo, constituindo um
importante contaminante em alimentos, desencadeadores de deterioração. Podem
sobreviver nas sementes e nos restos culturais de inúmeras gramíneas, o que favorece a
continuidade do seu ciclo de vida (SWEENEY e DOBSON, 1998; CASA et al., 2004).
Em função destas características, os grãos são as matérias primas mais
susceptíveis ao ataque fúngico. Além do desenvolvimento no campo, os fungos também
podem permanecer e se desenvolver durante o armazenamento. Os principais fatores
que favorecem este desenvolvimento são umidade, temperatura, período de
armazenamento, nível inicial de contaminação, impurezas, insetos, concentração de CO2
intergranular, condições físicas e sanitárias dos grãos (RUPOLLO et al., 2006).
O requerimento de água divide os fungos presentes nos grãos em dois grupos
ecológicos, denominados fungos de campo e de armazenamento. Os fungos de campo
invadem os grãos no estágio pré-colheita, ou nas espigas pós-colheita antes do
debulhamento, o tempo de sobrevivência desses fungos nas sementes esta diretamente
relacionada com as condições do ambiente. Este grupo requer alto teor de umidade e
inclui os gêneros Alternaria, Cladosporium, Fusarium e Helminthosporium. Os fungos
de armazenamento requerem teor de umidade na faixa de 16% para a invasão micelial e
compreendem as espécies pertencentes ao gênero Aspergillus e Penicillium (TANAKA,
2001; RUPOLLO et al., 2006).
5
Os fungos micotoxigênicos envolvidos com a contaminação da cadeia alimentar
humana são principalmente três gêneros: Aspergillus, Fusarium e Penicillium. Enquanto
que as espécies do Fusarium são fitopatógenos que destroem as plantas e produzem
micotoxinas antes ou imediatamente após a colheita, os gêneros Penicillium e
Aspergillus são comumente encontrados em contaminantes de alimentos durante a
secagem e subsequente estocagem (SWEENEY e DOBSON, 1998). A Tabela 1 mostra
os principais fungos toxigênicos e as micotoxinas produzidas por eles.
Tabela 1 Espécies de fungos toxigênicos e suas principais micotoxinas
Espécie Fúngica Micotoxina
Aspergillus flavus; A. parasiticus Aflatoxinas
A. flavus Ácido Ciclopiazônico
A. ochraceus; Penicilliumviridicatum; P. cyclopium Ocratoxina A
P. expansum Patulina
Fusariumculmorum;F. graminearum; F. sporotrichioides Deoxinivalenol
F. sporotrichioides; F. poae Toxina T-2
F. sporotrichioides; F. graminearum; F. poae Diacetoxiscirpenol
F. culmorum; F. graminearum; F. sporotrichioides Zearalenona
F. moniliforme Fumonisinas
Acremoniumcoenophialum Alcalóides Ergopeptina
A. Lolii Alcalóide Lolitrem
Phomopsisleptostromiformis Fomopsina
Pithomyceschartarum Esporidesminas
Fonte: SWEENEY e DOBSON, 1998.
Os fungos da espécie Fusarium são largamente encontrados em cereais por todo
mundo, com várias espécies sendo economicamente relevantes em decorrência do seu
potencial fitopatógeno, pois podem infectar e destruir os tecidos de várias culturas,
como o milho, trigo e outros pequenos grãos, causando danos na qualidade e
rendimento dos grãos, além de fornecer um grande perigo de exposição aos agricultores
(BATTILANI et al., 2011; DAMBOLENA et al., 2011; PALACIOS et al., 2011).
As espécies de Fusarium produzem longos macroconídios multicelulares, na
forma de canoa ou na forma de banana. Estes grandes conídios assexuados são a
característica morfológica definidora do gênero. Muitas espécies produzem também
microconídios unicelulares na forma fusiforme de oval a esférica (GLEEN, 2007). As
principais espécies são Fusarium graminearum, Fusarium solani, Fusarium
6
proliferatum, Fusarium anthophilum e Fusarium verticillioides (FANDOHAN et al.,
2003).
3.1.1 Fusarium verticillioides
O gênero Fusarium verticillioides (= F. moniliforme) é o fungo patógeno mais
comum que ataca culturas de milho (Zea mays L.). Em condições favoráveis pode
causar várias doenças nas plantas, como podridão de raiz, colmo, espiga e deterioração
nos grãos armazenados. Esses ataques resultam em perdas significativas na
produtividade e na qualidade dos grãos, além de produzir uma série de micotoxinas,
como o ácido fusárico, fusarinas e fumonisinas (MENNITI e NERI, 2010; ALTINOK,
2009).
O Fusarium verticillioides é um fungo endofítico que coloniza as plantas e
produzem toxinas, sem qualquer sinal de que este esteja intimamente associado, e a
planta nunca mostra sinal de que esta sendo infectada. O fungo pode infectar as
sementes ou estabelecer uma infecção sistêmica, neste caso, os conídios ou as micelas
fúngicas podem se formar no interior ou na superfície da semente. Desta forma, o F.
verticillioides se move desde a raiz até o talo e então chega aos grãos (CAVAGLIERI et
al., 2005)
O ciclo de infecção/doença de F. verticillioides é um sistema complexo,
associado com todas as fases do desenvolvimento do vegetal. A fusariose parece iniciar
com a permanência de fungos nos resíduos de colheitas anteriores, capazes de prolongar
a sobrevivência das hifas e contaminam sementes, seguida de disseminação sistêmica ao
colmo e espiga, para o caso de milho. Outra via de contaminação consiste na
disseminação de macro e microconídios pelo ar ou por gotículas de chuvas, atingindo
diretamente o tecido vegetal. A transmissão por insetos integra o fator vetor com injúria
à planta, estabelecendo local adequado para a instalação/germinação de conídios
disseminados pelo ar ou chuva (FIGUEIRA et al., 2003b)
A contaminação por F. verticillioides abrange muitas áreas no mundo,
especialmente em regiões de clima temperado e semi-tropical. Países como a Itália
(MENNITI e NERI, 2010; BATTILANI et al., 2011; COVARELLI et al., 2012), África
do Sul (FANDOHAN et al., 2003), Argentina (PRESELLO et al, 2007; PALACIOS et
al, 2011), Brasil (MALLMANN et al. 2001; OLIVEIRA et al., 2006), Croácia
7
(PLEADIN et al., 2013), Portugal (LINO et al., 2006), tem relatado ocorrência de
contaminação de F. verticillioides nos cereais, afirmando assim a severidade e
frequência da contaminação por este patógeno.
3.2 Micotoxinas
Fungos filamentosos produzem uma imensa diversidade de metabólitos
secundários, como pigmentos, antibióticos, terpenos, alcalóides e compostos tóxicos,
denominados de micotoxinas. As micotoxinas são produzidas principalmente pelas
estruturas miceliais dos fungos e a sua síntese representa uma maneira de os fungos
reduzirem a quantidade de precursores, os quais não são requeridos para o metabolismo
principal (JAY, 2005; BRÃSE et al., 2009; HEIDTMANN-BEMVENUTI et al. 2011).
Segundo Sweeney e Dobson (1998), os fungos para se desenvolverem e
produzirem micotoxinas necessitam de condições favoráveis, e os fatores mais
importantes são: a temperatura, atividade de água e teor de umidade, pH, composição
química do alimento, taxa de oxigenação, período de armazenagem, grau de
contaminação fúngica, condições físicas dos grãos ou sementes, artrópodes e interação
microbiana.
Um mesmo fungo pode produzir simultaneamente diferentes tipos de
micotoxinas, portanto, a mesma cultura, ou o mesmo alimento pode estar contaminado
com várias micotoxinas (OGA et al., 2008). A presença de micotoxinas em grãos está
sujeita à influência de fatores ambientais como umidade do substrato e temperatura
ambiente (SANTURIO, 2002). Além disso, a contaminação por micotoxinas podem
variar de acordo com as práticas de cultivo, métodos de processamento ou produção,
transporte e armazenamento.
As principais características das micotoxinas, na sua grande maioria são amplo
espectro de toxicidade, baixo peso molecular, não-imunogenicidade, termoestáveis e
atuam em baixas concentrações, ressalta-se, ainda, o fato das micotoxinas apresentarem,
de modo geral, grande estabilidade química, o que permite a sua persistência no
alimento mesmo após a remoção dos fungos pelos processos usuais de industrialização
e embalagem. (BOK et al., 2004).
8
A maioria das micotoxinas afetam órgãos e tecidos, induzindo várias
patologias, tais como neoplasia, mutagênese, teratogênese, imunossupressão entre
outras. Os principais órgãos afetados são conhecidos para algumas micotoxinas dentre
elas estão: aflatoxinas o fígado; zearalenona o sistema reprodutor; ocratoxinas A e
citrinina os rins, fumonisinas os pulmões e tecido neural; tricotecenos o trato digestório
e sistema imunológico (TANAKA, 2001; FERREIRA et al., 2006).
Em decorrência de esforços da comunidade científica internacional, desde 1960
outras estruturas de micotoxinas vêm sendo identificadas e caracterizadas,
especialmente os tricotecenos, fumonisinas, e as aflatoxinas, podem ser consideradas de
ocorrência mundial (POZZI et al., 2002).
Além dos problemas causados em relação a saúde, a ocorrência de micotoxinas
apresenta implicações econômicas importantes para diversos setores comerciais
incluindo produtores de grãos, criadores de animais e aves, assim como processadores
de alimentos e rações. As perdas acarretadas podem advir da baixa qualidade dos grãos,
baixa produtividade, baixa performance do animal e/ou necessidade de
descontaminação dos grãos (ONO et al., 2004).
3.2.1 Fumonisinas
As fumonisinas são micotoxinas policetídeas, produzidas principalmente por
Fusarium verticillioides, porém outras espécies também são produtoras desta
micotoxina, como Fusarium proliferatum, Fusarium nygamai, Fusarium anthophilum,
Fusarium dlamini e Fusarium subglutinans (SWEENEY e DOBSON, 1998). A
ocorrência maior de contaminação de fumonisina é em culturas de milho e produtos a
base de milho, no entanto pesquisas demonstram que outros grãos, como arroz (PARK
et al., 2005), trigo e a aveia (MALLMANN et al., 2001) também podem apresentar
contaminação por fumonisina. Não há relatos de transferência desta micotoxina para
produtos derivados dos animais expostos a contaminação, como o leite, e nem que esta
micotoxina seja absorvida nos tecidos (BRÃSE et al., 2009).
As fumonisinas são moléculas estruturalmente relacionadas e 16 já foram
isoladas e caracterizadas: Fumonisinas B1 (FB1), FB2, FB3, FB4, A1 e A2, A3, AK1, C1,
C3, C4, P1, P2, P3, PH1A, PH1B, no entanto, a Fumonisina B1 e Fumonisina B2 são as mais
9
importantes e constituem 70% de todas as fumonisinas naturalmente encontradas em
alimentos e rações (NIDERKON et al., 2009; SEO et al., 2001).
Ao contrário de outras micotoxinas, as fumonisinas não possuem estrutura
cíclica, a estrutura é baseada em uma longa cadeia de hidrocarbonetos. FB1 é um diéster
de propano- 1,2,3-ácido de tricarboxílico (TCA) e 2-amino-12,16-dimetil-3,5,10,14,15-
pentahidroxieicosano, onde que no C14 e no C15 apresenta grupos hidroxilas
esterificados com o grupo carboxila terminal do TCA (NIDERKON et al., 2009). As
variações do grupamento hidroxil das moléculas de fumonisinas determinam seus
diferentes tipos, conforme se observa na Figura 1.
Figura 1 Estrutura Química das Fumonisinas B1, B2 e B3. Fonte: Minami et al. (2004).
As fumonisinas são altamente solúveis em água, ao contrário das outras
micotoxinas não possuem estrutura aromática e um único cromóforo para facilitar
analiticamente sua identificação. Desta maneira são de difícil detecção através do
espectro ultravioleta. São moléculas fortemente polares e solúveis em acetonitrila-água
e insolúveis em solventes orgânicos (MOSS, 1998; POZZI et al., 2002).
A produção de fumonisinas depende de fatores biológicos, enfatizando-se a
susceptibilidade do vegetal à infecção fúngica e a capacidade genética do fungo em
produzir micotoxinas, assim como fatores ambientais envolvidos com as condições de
desenvolvimento da planta, colheita e estocagem de grãos. O teor de umidade do grão e
temperatura são fatores críticos na regulação do crescimento de F. verticillioides e
produção de micotoxinas. Além disso, o grau de maturação do grão influencia a sua
produção, sendo maior em grãos mais maduros (ONO et al., 2004; BERND et al.,
2008).
10
O intenso interesse desta micotoxina é decorrente de duas razões,
primeiramente, as fumonisinas são encontradas em concentrações mensuráveis em
milho cultivados por todo o mundo e estão epidemiologicamente associada com câncer
de esôfago em humanos em algumas áreas como China e na África, o que resultou na
classificação da FB1 pela Agência Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC) no
grupo 2B pela possibilidade de causar câncer em humanos (MENNITI e NERI, 2010).
A primeira etapa para a toxicidade e carcinogenecidade das fumonisinas é o
bloqueio da síntese dos esfingolipídios, conforme demonstrado na Figura 2. As
fumonisinas apresentam semelhança estrutural com as bases esfingóides livres
(esfinganina e esfingosina – intermediários da biossíntese e degradação de outras bases
esfingóides), e por este motivo induzem ao rompimento do metabolismo dos
esfingolipídios, através da inibição competitiva da enzima ceramida sintase [esfingosina
(esfinganina) N-acetiltransferase], enzima chave na via de biossíntese dos
esfingolipídios (GALVANO et al., 2002; MINAMI et al., 2004)
O mecanismo de ação das fumonisinas ocorre de acordo com uma sequência de
três seguintes eventos: (a) inibição da ceramida sintase; (b) incremento de esfinganina e
esfingosina livres e (c) redução da reacilação da esfingosina (SORIANO e DRAGACCI,
2004). O bloqueio do metabolismo dos esfingolipídios é o passo inicial para o início ou
progressão das doenças associadas com as fumonisinas em equinos
(leucoencéfalomalácea), suínos (edema pulmonar) e roedores (defeitos no tubo neural),
além de provocar alterações na proliferação e a comunicação celular, adesão, apoptose,
indução ao estresse oxidativo e modulação da expressão gênica (MINAMI et al., 2004;
MENNITI e NERI, 2010 )
11
Figura 2 Rompimento da biossíntese dos esfingolipídios pela FB1. Adaptado de
Heidtmann-Bemvenuti et al. (2011).
No Brasil recentemente foi instaurada uma nova portaria que prevê limites
máximos tolerados (LMT) para micotoxinas (ANVISA, 2011), que estabelece limites
para as fumonisinas, as quais não constavam na portaria anterior. Para milho em grão
para posterior processamento, o LMT é de 5000 µg kg -1
, para produtos a base de milho
os limites são de 200 – 2500 µg kg -1.
A FDA (2001) (The United States Food and Drug Administration) estabeleceu
limites máximos recomendados de alimentos de 2-4 mg kg -1
, para produtos a base de
milho, e para rações animal o limite é de 5-100 mg kg-1
. O LMT recomendado segundo
União Europeia (2007) é de 1 mg kg -1
para produtos processados a base de milho e 4
mg kg-1
para grãos de milho sem processamento. Assim, mesmo com o registro de
ocorrência de Fumonisinas em outros cereais (MALLMANN et al., 2001; PARK et al.,
2005; BECKER, 2012; PETRARCA, 2012) não há ainda limites ou recomendações
para seus níveis aceitáveis.
Uma das formas de diminuir a produção de FB1 é inibir ou bloquear o
desenvolvimento dos fungos produtores desta micotoxina. No entanto, medidas
12
químicas e agronômicas para o controle do Fusarium não são efetivas, umas vez que o
ataque destas espécies na planta é usualmente no modo sistêmico. A dificuldade reside
em se conhecer a necessidade e o momento ideal de aplicação do fungicida e na
tecnologia a ser empregada, para se obter bons resultados (DEL PONTE et al.,
2004;CHEN et al., 2012).
3.3 Estratégias para o controle fúngico
Embora os fungicidas químicos sejam atualmente usados com relativo sucesso
na agricultura, os graves problemas relacionados ao seu uso, já são amplamente
conhecidos e têm incentivado o desenvolvimento de métodos alternativos de controle
(SILVA et al., 2009). Aliado a isso, o significativo incremento que esses insumos
representam no custo da produção agrícola, além da pressão da sociedade por produtos
livres de agrotóxicos tem exigido da pesquisa maior empenho no desenvolvimento de
programas de controle biológico.
Nas últimas décadas a exploração da atividade de compostos secundários de
plantas tem se tornado uma alternativa no controle de fitopatógenos com potencial
ecológico para minimizar o emprego de produtos sintéticos (VENTUROSO et al.,
2011).
Um grande número de plantas apresenta propriedades antifúngicas em seus
extratos. Essas propriedades são dependentes de uma série de fatores inerentes às
plantas, como órgãos utilizados, idade e estágio vegetativo. A eficiência do produto
também depende da espécie envolvida, do tipo de doença a ser controlada e dos
processos tecnológicos utilizados na obtenção e manipulação do extrato (MENNITI e
NERI, 2010).
Produtos derivados de vegetais, tais como os óleos essenciais, compostos
fenólicos, flavonoides, quinonas e peptídeos com ação antienzimática vêm sendo
intensivamente estudados quanto à eficácia no controle alternativo de doenças de
plantas, para uso em sistemas de produção buscando a redução ou eliminação do uso de
agrotóxicos (BASTOS, 2007; SOUZA et al., 2011; VENTUROSO et al. 2011).
Como exemplo, estudos comprovam que o óleo de menta e mentol, além de
antifúngico, desempenha um papel antibacteriano, controlando o desenvolvimento o
desenvolvimento de Salmonella sp e Staphylococcus sp; entre os fungos controlou-se
13
Alternaria sp, Fusarium sp, Sclerotium rolfsii e Aspergilllus parasiticus (SINGH et al.
1993; PEREIRA et al., 2006).
Souza et al (2007) avaliaram a atividade antifúngica dos extratos de alho (Allium
sativum L.) e capim-santo (Cymbopogon citratus Stapf.) sobre o desenvolvimento de
Fusarium proliferatum, os resultados demonstraram um potencial fungitóxico
satisfatório dos produtos vegetais testados.
Aldeídos e compostos fenólicos também são eficientes para inibição microbiana.
Menniti e Neri (2010) estudaram o efeito dos compostos hexenal-2-trans, carvacrol e
eugenol sobre o Fusarium verticillioides, todos os extratos inibiram o crescimento do
patógeno, porém o hexenal-2-trans foi o mais efetivo contra o controle do patógeno,
nenhum composto reduziu o conteúdo de fumonisinas. Em um trabalho desenvolvido
por Souza et al (2012), ficou demonstrado o efeito de compostos fenólicos, obtidos da
microalga Spirulina platensis, na inibição de 56% do conteúdo de glicosamina do
Aspergillus flavus.
Venturoso et al. (2011) avaliaram a atividade antifúngica dos extratos bruto
aquosos sobre o desenvolvimento micelial dos fungos e concluíram que efetividade da
ação antifúngica sobre o desenvolvimento dos fitopatógenos in vitro, evidenciou que os
compostos presentes nas plantas utilizadas no estudo, na forma de extratos aquosos,
apresentam-se como potenciais no controle alternativo dos fungos fitopatogênicos.
Além dos resultados promissores verificados com os extratos de alho, canela e cravo-
da-índia sobre todos os fitopatógenos, pode-se destacar também a atividade antifúngica
de outros extratos frente a fungos específicos, como o extrato de hortelã sobre
Aspergillus sp., os extratos de jabuticaba e eucalipto sobre Colletotrichum sp. e o
extrato de melão de São Caetano sobre C. kikuchii.
3.3.1 Uso de inibidores de enzimas digestivas para o controle de Fusarium
As α amilases (EC 3.2.1.1) são endoenzimas e catalisam a hidrólise de ligações
α- (1-4)-D- glicosídias, presentes em amilose, amilopectina, glicogênio e várias
maltodextrinas. As α e β amilases são enzimas presentes em todos os cereais e
produzidas por diversos organismos, como baterias, fungos, plantas e animais (GENG
et al., 2008). Assim a importância destas enzimas para a sobrevivência celular tem
motivado o uso da tecnologia de inibidores de enzimas digestivas para controle
14
biológico de contaminação de culturas. O fator de resistência natural de algumas
espécies ao ataque de pragas tem sido atribuído a presença destes inibidores e chamado
a atenção dos pesquisadores (FENG et al., 1996; FIGUEIRA et al., 2003; KUMARI et
al., 2012; MEHRABADI et al., 2012), para o entendimento e aplicação destes
(PAGNUSSATT et al., 2012).
Os inibidores de α amilase realizam um papel importante na regulamentação dos
níveis de α - amilase em trigo e de outros cereais durante o desenvolvimento do grão
(REKHA e PADMAJA, 2002). Normalmente estes inibidores são proteínas que
apresentam atividade inibitória de α amilase e protease e que são detectadas em vários
cereais, como trigo, aveia, sorgo, milho, arroz, triticale e outros (NAKASE et al.,1996;
PAGNUSSATT et al., 2012).
Os mecanismos de interação e especificidade dos inibidores com as α amilases
são complexos e ainda não foram completamente elucidados. Nos inibidores do tipo não
proteináceos, a atividade inibitória das α amilases é devida em parte à sua estrutura
cíclica que se assemelha aos substratos de α amilases e, por isso, possibilita a ligação
nos sítios catalíticos da enzima. Uma vez que a enzima é inibida, a assimilação de
nutrientes pelo organismo patógeno, seja ela inseto ou microbiano, é reduzida e
consequentemente seu desenvolvimento é afetado (MARSARO-JÚNIOR, 2005).
Devido à grande diversidade de inibidores de α amilase e a sua expressiva
variabilidade, além da importância destes para a fisiologia vegetal, é necessária a
seleção das fontes de extração destes compostos, podendo assim selecionar os
inibidores de acordo com a sua eficácia contra as enzimas alvo (MEHRABADI et al.,
2012). Na sequencia, identificar sua estrutura e em caso de estruturas proteicas é
possível chegar ao ponto de codificação genética e emprego de técnicas moleculares
para desenvolvimento de espécies com resistência natural ao ataque microbiano
(OLIVEIRA et al.,2007).
15
3.4 Trigo (Triticum aestivum L.) como fonte de extração de inibidores enzimáticos
O trigo pertence à família das gramíneas e ao gênero Triticum. Em sua maioria,
classifica-se em três espécies: a Triticum aestivum L., predominante na produção
mundial; a Triticum compactum Host. e a Triticum durum Dest. O trigo, comparado
com o resto dos cereais, é uma matéria prima extremamente versátil e,
consequentemente, popular. Os povos que tradicionalmente comiam arroz estão
consumindo mais trigo através dos produtos de panificação, como o pão (SCADE,
1981; BRAGHINI, 2009).
O trigo apresenta uma grande importância para o Brasil e também para o estado,
uma vez que o RS é dos estados com maior produção do grão no Brasil. Segundo o
CONAB (2012), a safra de 2012/13 foi estimada em mais de 4000 mil toneladas. Entre
os fatores que podem afetar a produção de trigo estão a ocorrência e a intensidade das
doenças (DEL PONTE et al., 2004). A giberela, causada pelo fungo Fusarium
graminearum,é uma doença de infecção floral, cujos sítios de infecção são as anteras
das espigas do trigo. De ocorrência generalizada no mundo, é observada causando danos
nas regiões tritícolas onde o clima é úmido e quente, com precipitações pluviais
elevadas (acima de 48 h de molhamento) na fase de floração do trigo (CASA et al.,
2004).
No entanto, a contaminação por Fusarium verticillioides com produção de
Fumonisina B1 em trigo não é frequente (STANKOVIC et al., 2012). Segundo Marin et
al. (1999), vários componentes nutricionais no trigo poderia atuar como inibidores da
biossíntese de fumonisinas, ou um componente presente apenas no milho pode ter a
capacidade para a iniciação da biossíntese de fumonisinas, justificando dessa maneira a
baixa frequência.
Os cereais de forma geral são boas fontes de inibidores enzimáticos, no entanto,
grãos de trigo são particularmente ricos em inibidores de α amilases, assim como, arroz
e aveia (FENG et al., 1996; MARSARO-JUNIOR et al., 2005; PAGNUSSATT et al.,
2012).
Dada a importância econômica do trigo, aspectos nutricionais e também o alto
consumo deste cereal, a investigação da presença de inibidores enzimáticos é
16
interessante a fim de verificar se existe alguma correlação da presença destes compostos
com a ausência de contaminação pelo F. verticillioides.
Além disso, a identificação de potenciais fontes de inibidores enzimáticos seria
uma estratégia interessante a fim de determinar aquelas que são mais susceptíveis a
danos endógenos ou exógenos, fornecendo informações sobre o melhor manuseio do
grão e sobre variedades mais resistentes (PAGNUSSATT et al., 2012).
A partir da verificação desta propriedade, isolar os cultivares mais promissores,
localizar a porção do grão de maior conteúdo dos inibidores, identificar a sequencia
aminoacídica e associá-la a técnicas moleculares de sequenciamento genético é
extremamente estratégico para subsidiar a aplicação de controle biológico da infecção
por F. verticillioides e posterior produção de Fumonisinas.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Matéria prima
Os grãos de trigo (Triticum aestivum L.) utilizados neste estudo foram
gentilmente cedidos de produtores de diferentes regiões do estado do Rio Grande do
Sul/ Brasil, o plantio seguiu as práticas agrícolas convencionais para a cultura de trigo.
Após a colheita da safra 2010/2011, os grãos foram encaminhados para o Laboratório de
Micotoxinas e Ciência de Alimentos, na Universidade Federal do Rio Grande/Brasil,
onde foram selecionados manualmente somente grãos sadios, após foram moídos em
moinhos de facas e peneirados a granulometria de 32 mesh e mantidos a -18°C até
serem analisados. A Tabela 2 apresenta os cultivares utilizados no estudo, com a
respectiva classe e região de cultivo.
17
Tabela 2 Cultivares de trigo com as respectivas classes e região de cultivo.
Cultivar Classe Região de cultivo
OR Marfim Pão Noroeste (RS)
OR Marfim Pão Nordeste (RS)
Abalone Pão Noroeste (RS)
Fundacep Raízes Brando Noroeste (RS)
BRS Tarumã Pão Noroeste (RS)
Horizonte Pão Nordeste (RS)
Mirante Pão Nordeste (RS)
Fundacep 50 Brando Nordeste (RS)
Fundacep cristalino Melhorador Nordeste (RS)
BRS Guamirim Pão Noroeste (RS)
BRS Guamirim Pão Nordeste (RS)
Quartzo Pão Noroeste (RS)
Quartzo Pão Nordeste (RS)
Codetec 114 Pão Nordeste (RS)
4.1.2 Isolado fúngico
O laboratório de Epidemiologia de Plantas da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul/Brasil cedeu a linhagem fúngica de Fusarium verticillioides que foi
isolado de grãos de milho. A identificação da linhagem foi com base nas características
morfológicas através da comparação das estruturas do micélio e esporos com a literatura
(ASTOLFI et al., 2011).
O isolado fúngico foi mantido sob refrigeração em frascos de eppendorf,
contendo Ágar Nutritivo Sintético (SNA). Para a obtenção dos discos de micélios, o
isolado foi transferido para Agar Batata Dextrose (PDA), por 7 dias a 25°C e
fotoperíodo de 12 h. Depois deste período de incubação, o ágar foi recortado, obtendo-
se os discos de micélios com 1 cm de diâmetro (PAGNUSSATT et al., 2012). A Figura
3 apresenta os detalhes do procedimento.
18
A
B
C
Figura 3 Etapas de obtenção dos discos de micélio do Fusarium verticillioides. A. Cortes
realizados no ágar PDA, B. Retirada dos discos de micélio da placa e C. Transferência dos
discos de micélio do patógeno para as placas do cultivo in vitro.
4.1.3 Padrões analíticos e reagentes
Os padrões analíticos da Fumonisina B1 (pureza > 98%) foi obtidos da Sigma-
Aldrich (São Paulo, Brasil), mantidos sob refrigeração até sua utilização. A fase móvel
utilizada para a determinação cromatográfica (acetonitrila grau cromatográfico J. T.
Baker Mallinckrodt, acidificada a 1% com ácido acético e água ultrapurificada em
sistema Direct-Q UV3 ®
de resistividade 18,2 M Ω cm) foi previamente desgaseificada
em banho ultrassônico e a acetonitrila filtrada em filtro Millipore, com poros de 0,45
µm de diâmetro. Todos os demais reagentes utilizados também eram grau analítico.
19
A enzima fúngica comercial doada pela Novozymes (Paraná, Brasil), utilizada
para os testes de inibição foi a Fungamyl®, produzida pelo micro-organismo Aspergillus
oryzae. A enzima foi mantida sob refrigeração até o momento de uso. O padrão de
marcador molecular utilizado no gel de eletroforese foi AMRESCO J383, obtido da
AMRESCO (EUA).
4.1.4 Preparo das soluções estoque e trabalho de FB1
Para o preparo da solução estoque, os padrões de FB1 foram dissolvidos em
metanol:acetonitrila (1:1 v/v), resultando em concentração de 20 µg mL-1
. A solução
trabalho foi preparada a partir da solução estoque, diluída a concentração de10 µg mL-1
.
A solução trabalho foi seca sob fluxo de N2, obtendo-se assim, solução de FB1 com
10 µg. Os frascos com o padrão seco foram armazenados sob refrigeração. Para a
utilização da solução trabalho, o padrão foi ressuspendido na fase móvel, acetonitrila:
água (1:1 v/v) e submetido ao banho ultrassom por 30 segundos.
4.2 Métodos
4.2.1 Caracterização dos cultivares de trigo (Triticum aestivum L.)
4.2.1.1 Isolamento e Identificação da microbiota
O isolamento e identificação da microbiota foram realizados no Laboratório de
Micotoxinas da Universidade de São Paulo/ Brasil. A metodologia utilizada para o
isolamento da microbiota das amostras foi diluição seriada com plaqueamento em
superfície. Para isso, 10 g das amostras, previamente trituradas mecanicamente, foram
agitadas com 90 mL de água destilada estéril (diluição 10-1
). A partir desta, foram
realizadas diluições decimais sucessivas até 10-4
, sendo inoculados 0,1 mL de cada
amostra em meio de cultura DG18, de acordo com metodologia descrita por Pitt e
Hocking (2009).
Após, as placas foram incubadas a temperatura de 25 °C durante 7 dias, sendo
realizada a contagem das colônias formadas. O número de colônias enumeradas foi
corrigido para o fator de diluição, resultando em unidades formadoras de colônia por
grama (UFC g-1
).
20
A microbiota foi identificada através das características morfológicas macro e
microscópicas e confrontadas com descrições da literatura (PITT e HOCKING, 2009).
A confirmação da identificação foi através de análise de sequenciamento do DNA
ribossomal das regiões ITS (WHITE et al., 1990) e Fator de Elongação (CARBONE e
KHON, 1999). As sequencias obtidos foram comparadas com as sequencias depositadas
em bancos de dados, nBLAST e Fusarium ID.
4.2.1.2 Determinação da Atividade de Água (Aa)
A determinação da Aa foi realizada no Laboratório de Micotoxinas da
Universidade de São Paulo/ Brasil. As amostras foram inseridas em um cepo
descartável e a Aa foi determinada em duplicata por ponto de orvalho através do
equipamento Aqualab CX-2 (Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, EUA).
4.2.1.3 Ocorrência de Fumonisina B1
A. Validação do método cromatográfico
Os parâmetros de mérito do método avaliados foram limite de detecção (LOD) e
de quantificação (LOQ), curva analítica do solvente e linearidade, curva na matriz e
linearidade, exatidão (recuperação) e repetibilidade, conforme recomendado pela
ANVISA (2003), INMETRO (2007) e ICH (1996).
Ensaio de recuperação
As amostras foram fortificadas em 3 níveis de concentração de FB1, 1800, 2400
e 3600 µg kg amostra -1
,sendo posteriormente extraída e calculada a recuperação
através da Equação 2. A contaminação das amostras foi realizada 12 h antes do início
determinações, com a finalidade de promover maior interação entre a micotoxina e a
matriz.
(2)
Onde: R = Recuperação do método (%); C1 = Concentração determinada na amostra
fortificada; C2 = Concentração determinada na amostra não fortificada; C3 =
Concentração do padrão utilizado para a fortificação.
21
Curva analítica do solvente e linearidade
Para a construção da curva analítica foram preparadas soluções analíticas nas
concentrações de 0,03; 0,05; 0,07; 0,1; 0,15; 0,2 e 0,3 µg mL-1
. Cada ponto da curva
analítica foi injetada em triplicata e os dados de regressão linear foram obtidos com
auxílio do Software do equipamento. Foram consideradas com boa linearidade curvas
com valores de r2 > 0,90 (INMETRO, 2007).
Limite de Detecção (LOD) e Quantificação (LOQ)
Para a determinação do LOD e LOQ do instrumento foram realizadas sucessivas
injeções da solução padrão de FB1 em ordem decrescente de concentração, até que o
sinal do pico atingisse uma altura de três vezes superior ao sinal/ruído da linha de base,
no tempo de retenção da FB1. O LOQ foi determinado pela menor concentração de FB1
que pode ser quantificados. Os valores de LOD e LOQ foram estabelecidos como a
quantidade de analito que produz uma relação sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente
(INMETRO, 2007).
Repetibilidade
A repetibilidade foi avaliada realizando nove injeções, sendo três níveis de
concentração dos padrões em triplicata. Os resultados foram expressos através da
estimativa do coeficiente de variação percentual (RIBANI et al., 2004).
Efeito matriz
A avaliação do efeito matriz foi realizada com base na comparação da inclinação
da curva analítica da FB1 no solvente e na matriz. Para isso foram preparadas soluções
em sete níveis de concentração no solvente e na matriz sendo realizadas injeções em
triplicata para cada nível de concentração. O efeito da matriz foi calculado conforme
Equação 3.
(3)
Onde: EM = Efeito Matriz (%); Dm = Declividade da curva da matriz; Ds =
Declividade da curva do solvente
22
B. Aplicação do método
Extração da micotoxina
Para a extração da FB1, 10 g de amostra, previamente moídas e peneiradas a 24
mesh, foram agitadas em vórtex por 1 minuto com 20 mL de Acetonitrila 50% (2%
acidificada com ácido acético). Após a adição dos sais, Na2SO4 e NaCl, a mistura foi
agitada novamente sob as mesmas condições e então centrifugada a 3220 x g por 5 min.
A etapa de clean up consistiu na adição dos sais (Na2SO4 e Celite ®) ao extrato, a
mistura foi agitada em vórtex por 30 segundos e centrifugada a 3220 x g por 5 min. O
sobrenadante foi filtrado em membrana de 0,22 μm Millex ® e armazenado, sob
refrigeração, para posterior quantificação (PETRARCA, 2012).
Reação de derivatização
A reação de derivatização da FB1 foi de acordo com a AOAC (2005). O reagente
de derivatização consistia na mistura de 40 mg de OPA, 1 mL de metanol, 5 mL de
solução de tetraborato de sódio 0,1 M (pH 8,9 – 9,1) e 50 μL de 2-mercaptoetanol. O
reagente foi estocado em frasco âmbar, envolto em papel de alumínio, protegido da luz
e em temperatura ambiente.
Para a reação de derivatização consistiu na adição de 225 μL do reagente
derivatizante (OPA-MCE) juntamente com 25 μL de extrato da amostra ou do padrão, e
a mistura foi homogeneizada em banho ultrassom por 30 segundos, a 25 °C sob
proteção da luz e injetada no cromatógrafo (PETRARCA, 2012).
Instrumentação e condições cromatográficas de análise
Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu constituído
por um sistema de bombas (modelo LC-AT), desgaseificador da fase móvel (modelo
DGU), controlador (modelo CBM-20A), injetor manual com alça de amostragem de 20
μL (modelo 7725i) acoplado a detector de fluorescência (modelo FL-10AXL). O
controle do equipamento e aquisição dos dados foi feito pelo software LC Solution. As
análises foram realizadas utilizando-se uma coluna cromatográfica C-18 Kromasil (5
µm, 150 x 4,6 mm), mantida a 30 °C. A fase móvel utilizada foi acetonitrila: água (1:1
v/v), com pH ajustado para 2,45, com eluição no modo isocrático e vazãode 1 mL min-1
(BECKER, 2012).
23
A detecção de Fumonisina B1 foi realizada através da comparação entre os
tempos de retenção da amostra e do padrão, de 6,3 ± 0,3 min e a quantificação através
do método de padronização externa, utilizando-se as áreas dos picos cromatográficos
(BECKER, 2012). Também foi empregada a curva de calibração em extrato de trigo, na
faixa de 680 a 6000 μg.kg-1
, cuja linearidade e efeito de matriz foram comprovados.
4.2.1.4 Potencial de Inibição da α Amilase fúngica
A. Extração dos inibidores enzimáticos
A extração dos inibidores enzimáticos foi realizada utilizando etanol 70% como
solvente extrator, na proporção 1:5 p/v. A mistura foi agitada em mesa orbital por 12 h a
25 °C. Para obtenção do extrato bruto (EB), a mistura foi centrifugada a 3220 x g a 4 °C
por 20 min (Pagnussatt et al., 2012).
B. Atividade inibitória contra α amilase fúngica
O teste da atividade inibitória dos extratos foi realizada contra a enzima amilase
comercial (Fungamyl ®
), empregando o método iodométrico, conforme Pagnussatt et al.
(2012). O teste de inibição consistiu na adição de 0,1 mL da enzima comercial
Fungamyl ® 0,02% (v/v), 0,5 mL do extrato bruto e 0,8 mL de tampão Tris-HCl. A
mistura foi incubada a 25 °C por 30 min, em seguida foram adicionados 0,5 mL de
amido solúvel e novamente incubado nas mesmas condições. No experimento controle,
os extratos foram substituídos por água.
A velocidade da reação enzimática foi definida pela quantidade de amido
residual (mg) produzida em um minuto. A velocidade máxima foi estimada na ausência
dos extratos proteicos de trigo. A Equação 1 define a inibição enzimática .
(1)
Onde: I = Inibição (%); Velocidade C = velocidade da reação da ausência dos extratos
inibitórios; Velocidade I = velocidade da reação na presença dos extratos inibitórios.
A inibição específica dos extratos foi definida como o amido residual (mg)
produzido por min por mg de proteína. O método de Lowry et al. (1951) foi usado para
24
determinar o conteúdo de proteína solúvel dos extratos, estimando a concentração
através de uma curva padrão de Albumina de Soro Bovino (0,3 a 2,5 mg mL-1
).
4.2.2 Caracterização físico-química dos cultivares mais promissores
4.2.2.1 Composição centesimal
Nas amostras de grãos de trigo foram determinados conforme a AOAC (2000).
A umidade, empregando o método gravimétrico de secagem em estufa a 105 °C,
conforme método n° 935.29, o conteúdo de lipídios, através da extração com éter de
petróleo de acordo com o método 920.85 e cinzas, por método gravimétrico, através da
incineração das amostras em mufla a 550 °C, método n° 923. 03. O conteúdo de
proteína foi avaliado pelo método de micro-kjeldahl, método n° 920.87 e o teor de fibra
bruta foi determinado conforme o método n° 994.43. Os carboidratos foram estimados
por diferença.
4.2.2.2 Perfil enzimático
O perfil de atividade enzimática foi avaliado através das determinações das
atividades das enzimas, α e β amilase, protease e lipase. A extração da enzimas α e β
amilase e protease presente nos grãos de trigo consistiu na agitação de 0,5 g da amostra
com 50 mL de NaCl 0,5%, em agitador horizontal por 90 min a 30 °C. O extrato bruto
foi obtido através da centrifugação da mistura a 2240 G por 10 min a 4 °C.
Para a lipase, a extração consistiu na agitação de tampão fosfato pH 7,0 50 mM
juntamente com os grãos de trigo, na proporção 1:10 (p/v), durante 30 min a 37 °C ,
seguido por centrifugação a 2240 x g por 10 min a 4 °C (FERNANDES, 2007).
A atividade enzimática da α amilase foi determinada pela degradação do amido
por método iodométrico (PAGNUSSATT et al., 2011). Para isso foram
homogeneizados 0,4 mL de tampão fosfato de sódio pH 6 e 0,5 mL de solução de amido
1% incubados a 50 °C durante 5 min. Após a adição de 1 mL do extrato enzimático, a
mistura foi incubada novamente por 5 min a 50 °C. A hidrólise do amido foi
interrompida com a adição de 0,5 mL de ácido clorídrico (1M), seguido da adição de 0,1
mL solução de iodo (0,3% de I2 em solução KI 3%) e 11,5 mL de água destilada. A
concentração inicial do amido (tempo zero) foi obtida no reator onde 0,5 mL de HCl
(1M) foi adicionado antes do extrato enzimático.
25
Após 15 min, o complexo formado entre o amido e o iodo teve sua absorbância
determinada em espectrofotômetro a 620 nm. A atividade especifica foi calculada
através da Equação 4. Uma curva padrão de amido foi utilizada para a obtenção da
equação da reta com concentrações variando de 0,04 a 0,4 mg mL -1
.
A α amilase Ci amido- Cf amido
t. proteína (4)
Onde: UA α amilase nidade de atividade da α amilase (mg amido hidrolisado min-1
mg proteína -1
); Ci = Concentração inicial do amido (mg mL-1
); Cf = Concentração final
do amido (mg mL-1
); t = tempo de reação (min); Proteína = Concentração de proteína
solúvel do extrato (mg mL-1
).
A β amilase teve sua ação determinada pela liberação de maltose quantificada
pelo método colorimétrico do ácido 3,5 dinitrosalicílico (3,5 DNS). A reação consistiu
na adição de 0,5 mL de amido solúvel 1% e 1 mL de extrato bruto, a mistura foi
incubada a 60 °C por 5 min. Em seguida foi adicionado 1 mL da solução de 3,5 DNS
levando a mistura a ebulição durante 5 min. A ação da β amilase foi quantificada
através da leitura em da mistura em espectrofotômetro a 546 nm. A atividade especifica
(UA) foi calculada através da Equação 5.
A β amilase mg maltose
t. proteína (5)
Onde: A β amilase nidade de atividade da β amilase (mg maltose hidrolisada min-1
mg proteína -1
); t = tempo de reação (min); Proteína = Concentração de proteína solúvel
do extrato (mg mL-1
).
A atividade das proteases foi determinada empregando albumina como
substrato, medindo tirosina como indicativo de hidrólise. Para a reação, foram
adicionados albumina 0,5 %, extrato bruto e ácido tricloroacético (TCA) 10 % (p/v)
durante 20 min a 47 °C em mesa agitadora orbital. A mistura foi centrifugada a 2240 G
durante 5 min, recolhendo-se uma alíquota do sobrenadante, acrescentando hidróxido de
sódio (NaOH) 1N e reagente de Folin Ciocalteau. Após repouso por 10 min, a
absorbância do cromóforo foi lida em espectrofotômetro a 660 nm e a atividade
específica (UA) estimada conforme a Equação 6.
26
A protease mg tirosina
t. proteína (6)
Onde: UA Protease = Unidade de atividade da protease (mg tirosina liberada min-1
mg
proteína -1
); t = tempo de reação (min); Proteína = Concentração de proteína solúvel do
extrato (mg mL-1
).
A atividade lipolítica foi avaliada utilizando-se uma emulsão de óleo de oliva e
solução de SDS 10 % (v/v), previamente homogeneizada, na proporção 1:3, tampão
fosfato pH 7,0 e extrato enzimático. A mistura reacional foi agitada em agitador
horizontal a utilizando uma temperatura de 37°C por 20 min a 2240 x g. Após a reação
foi interrompida pela a adição de 15 mL de acetona e etanol 1:1(v/v) e os ácidos graxos
liberados, pela ação da lipase, foram titulados com a solução de NaOH 0,05M. Uma
unidade de atividade lipolítica (IA) foi definida como a quantidade de proteína que
libera 1 μmol de ácidos graxos por minuto. A avaliação quantitativa dos ácidos graxos
liberados foi através do cálculo do índice de acidez convertido em um μmol ácido
oléico.
{
}
Onde: Va = Volume titulado da amostra; Vb = Volume titulado do branco; M =
molaridade da solução de NaOH; m = massa da amostra (g); mg proteína = Conteúdo de
proteína solúvel (mg/mL).
4.2.2.3 Determinação da massa molecular dos extratos proteicos
Os extratos proteicos foram preparados a partir da precipitação com acetona P.A,
na proporção 1:2 (v/v), a mistura permaneceu em repouso overnight. Depois deste
período, o solvente foi recuperado e no precipitado foi adicionado 100 µL de Água
Mili-Q, a mistura foi submetida a agitação em vórtex até a completa homogeneização
do precipitado. 10 µL da amostra foram transferidos em frascos de eppendorf contendo
5 µL de glicerol e 30 µL de tampão de desnaturação com β mercaptoetanol, a mistura
foi agitada em vórtex e submetida a banho em ebulição por 7 min, com o objetivo de
desnaturar a proteína contida no extrato.
27
A metodologia para a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes (SDS-PAGE) foi realizado em um gel de separação homogêneo 15%
(LAMMLI, 1970).
O preparo do gel de separação consistiu na adição de 5,25 mL de uma solução
de acrilamida 30%, 2,5 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 e 2,35 mL de Água Mili-
Q, a mistura foi homogeneizada em banho ultrassom por 10 min, logo após foi
adicionado 300 µL de SDS 10%, 100 µL de persulfato de amônio 10% e 12 µL de
Temed. O gel foi adicionado na placa cuidadosamente pelas extremidades.
Após da solidificação do gel de separação, foi adicionado na placa o gel de
concentração, o mesmo foi preparado com a adição de 0,65 µL de solução de acrilamida
30%, 1,25 mL de tampão Tris-HCl 0,5M pH 6,8, 2,75 mL de Água Mili-Q, 50 µL de
SDS 10%, 20 µL de persulfato de amônio 10% e 10 µL de Temed. A mistura foi
adicionada na placa e o pente aplicado. Após a solidificação, o pente foi retirado e
injetado as amostras nos poços formados.
A corrida eletroforética ocorreu a 300 V em uma corrente de 30 mA. As
proteínas no gel de poliacrilamida foram coradas com solução de azul de Coomassie. O
marcador contendo as sete proteínas recombinantes, 15, 25, 35, 50, 75, 100 e 150 kDa
apresentavam uma massa de 20µg, com exceção da proteína de 50 kDa que
continha 40 µg . A Figura 4 as etapas da metodologia.
Figura 4 A. Inserção das amostras nos poços do gel, B. Gel com as amostras e C.
Corrida eletroforética das amostras.
A B C
28
4.2.3 Biocontrole de Fusarium verticillioides através da aplicação de extratos
proteicos em cultivo in vitro
O teste de inibição do F. verticillioides foi realizado com os extratos proteicos
dos cultivares escolhidos para este estudo, através da prévia avaliação das respostas de
microbiota natural nos grãos de trigo, atividade de água, frequência de contaminação
com FB1 e inibição da amilase fúngica comercial (Fungamyl ®). A partir da seleção dos
cultivares, foi realizada a extração dos inibidores enzimáticos e aplicados na forma
bruta (EB) e primariamente purificados (EPP).
A purificação primária do extrato foi conduzida a partir dos extratos brutos, onde
os mesmos foram submetidos a ação do solvente acetona P.A na proporção inicial 1:2
v/v (extrato: acetona), a mistura foi agitada em vórtex por 2 min e depois submetida a
um rápido resfriamento, 15 min a -18 °C, favorecendo a precipitação dos inibidores
enzimáticos. Após este tempo, a mistura foi centrifugada a 3220 x g a 4 °C, e ao
precitado foi adicionado 15 mL de acetona P.A, agitou-se em vórtex por 2 min e a
mistura foi conduzida ao resfriamento rápido. No final desta etapa, foi realizada
novamente a centrifugação a 3220 x g a 4°C e no precitado foi adicionado 15 mL de
acetona P.A e a mistura permaneceu overnight para completa precipitação dos
inibidores enzimáticos. Posteriormente, a acetona foi recuperada, a mistura centrifugada
e então o extrato foi seco sob fluxo de N2 para completa evaporação do solvente.
O teste do biocontrole do F. verticillioides consistiu em um ensaio de cultivo in
vitro, em meio PDA, com a adição de EB e EPP. Após a solidificação do meio, foi
adicionado o disco de micélio do patógeno no centro da placa. O cultivo foi realizado
por 7 dias a 25 °C com fotoperíodo de 12 h. O experimento controle foi conduzido na
ausência dos extratos.
As quantidades de EB e EPP adicionados no cultivo in vitro foram
dimensionadas através do teste de inibição da α amilase fúngica, onde foi calculado o
IC 50, quantidade de EB ou EPP capaz de reduzir 50% da atividade da amilase fúngica,
estimando assim, o volume dos extratos adicionados durante o cultivo.
O efeito dos extratos proteicos sobre o F. verticillioides foi avaliado através da
inibição do crescimento micelial (ALTINOK, 2009), conteúdo de glicosamina (SOUZA
et al., 2011) e atividade da α amilase (PAGNUSSATT et al., 2012). Foi avaliado
29
também a influência dos extratos enzimáticos sobre o potencial toxigênico do F.
verticillioides, pela quantificação da produção de FB1 na biomassa fúngica.
4.2.3.1 Inibição do crescimento micelial do F. verticillioides
O crescimento micelial do patógeno foi estimado diariamente, pela média do
diâmetro da colônia do fungo, realizando medições em sentidos perpendicularmente
opostos, durante os 7 dias de cultivo. Os experimentos foram realizados em triplicatas.
O percentual de inibição do desenvolvimento micelial do patógeno foi calculado
seguido pela Equação 7 (ALTINOK, 2009).
(7)
Onde: IM = Percentagem de inibição do crescimento micelial; C = média do
crescimento micelial do patógeno no experimento controle (cm) e E = média do
crescimento micelial do patógeno no experimento na presença do extrato (cm),
utilizando os dois diferentes extratos, EB e EPP.
4.3.3.2 Inibição do conteúdo de glicosamina
A glicosamina foi extraída a partir da biomassa fúngica seca (0,1 g) com 5 mL
de HCl 6 M, por 40 min a 100 °C. O hidrolisado foi neutralizado utilizando NaOH 3 M
seguido por uma titulação reversa com KHSO4 1%. A glicosamina foi determinado por
método espectrofotométrico a 530 nm, utilizando uma curva padrão de glicosamina
(0,01 a 0,2 g L-1
) (SOUZA et al., 2011). Os experimentos foram realizados em
triplicatas e os resultados expressos % de inibição da glicosamina, calculado conforme a
Equação 8.
(8)
Onde: IG = Percentagem de inibição da glicosamina; Gc = Conteúdo de glicosamina
presente na biomassa no experimento controle (mg glicosamina g fungo -1
); Ge =
Conteúdo de glicosamina presente na biomassa nos experimentos contendo os extratos,
EB ou EPP (mg glicosamina g fungo -1
).
30
4.3.3.3 Inibição da atividade da α amilase
O extrato enzimático contendo a α amilase foi obtido no meio de cultivo com 20
mL de NaCl 0,9% homogeneizado em banho ultrassônico por 40 min, posteriormente
centrifugado e filtrado. A atividade da α amilase foi determinada pela degradação do
amido estimada quantitativamente pelo método iodométrico (BARAJ et al., 2010). A
inibição da atividade da α-amilase foi calculada conforme a Equação 9.
(9)
Onde: IA α amilase Inibição da atividade da α amilase (%); Ac Atividade da α
amilase no meio de cultivo no experimento controle (mg amido hidrolisado min-1
mg
proteína -1
); Ae Atividade da α amilase na biomassa nos experimentos contendo os
extratos, EB ou EPP (mg amido hidrolisado min-1
mg proteína -1
).
4.3.3.4 Influência da aplicação dos extratos enzimáticos sobre o potencial
toxigênico do F. verticillioides
A extração e quantificação de FB1 na biomassa fúngica foi avaliada conforme a
metodologia descrita no item 4.2.1.3.
4.2.4 Análise Estatística
Os resultados para inibição da amilase fúngica, ocorrência de FB1,
caracterização físico-química, perfil enzimático e para as determinações nos testes de
biocontrole foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey
por comparação das médias e teste t, com um nível de significância de 5%.
4.2.5 Descontaminação do material
Todo o material que foi utilizado com padrão de FB1 ou com possível produção
foi descontaminado com solução de hipoclorito de sódio 5% por pelos menos 12 h.
Depois do período de descontaminação, o material foi descartado ou lavado com água
corrente (ANVISA, 2005). Os cultivos fúngicos e o material contaminado com o
micro-organismo foram autoclavados antes de serem descartados.
31
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Caracterização dos cultivares de trigo
5.1.1 Incidência de micro-organismos e Atividade de água nos grãos de trigo
A localização geográfica, clima, práticas culturais, relação entre os micro-
organismos e condições ambientais são todos importantes fatores que influenciam a
diversidade fúngica e distribuição nos ecossistemas (VUJANOVIC et al., 2012). A
atividade de água está entre os principais fatores determinantes para o desenvolvimento
do fungo e produção de toxinas. Em vista disso, em primeira instância foram
determinados a atividade de água e a microbiota presente nos cultivares de trigo a serem
utilizadas neste estudo.
Em todos os grãos analisados foram constatados contaminação fúngica, os
fungos isolados foram Ascomycota pertencentes às ordens Pleosporales (50%),
Hypocreales (12,5 %), Capnodiales (12,5%) e Eurotiales (12,5%) e ordem taxonômica
indefinida (12,5%). O percentual dos gêneros fúngicos identificados nos 14 cultivares
de trigo está ilustrado na Figura 5, na qual se verifica a predominância dos gêneros
Phoma (29%) e Cladosporium (25%). O gênero Fusarium foi o terceiro mais
abundante, com 19% de infecção nos cultivares analisados. A Tabela 3 apresenta os
valores da atividade de água e a contaminação nas amostras analisadas, em unidades
formadoras de colônia (UFC/g).
A atividade de água (Aa) intrínseca de cada matéria é uma medida que
possibilita avaliar a disponibilidade de água livre, indicando as possíveis espécies
microbianas que possam se desenvolver naquela matriz ou ambiente. Em atividades de
água entre 0,40-0,80 há maior possibilidade de reações químicas e enzimáticas rápidas,
e em Aa próximo a 0,6 tem-se um pequeno ou nenhum crescimento microbiano
(BOBBIO e BOBBIO, 2003). As atividades de água encontradas nos grãos de trigo
variam entre 0,53-0,67, indicando que, nesta condição o crescimento fúngico não era
favorecido, como se pode verificar pela contagem inferiores a 103
UFC g -1
.
32
Figura 5 Distribuição percentual do gêneros fúngicos isolados dos grãos de trigo.
No estudo foi verificada a ocorrência de gêneros possuidores de espécies
toxigênicas, um Fusarium foi identificado (F. verticillioides), um
Cladosporium (Cladosporium cladosporioides), seis Phoma (Phoma herbarum, Phoma
putatium, Phoma sojicola, Phoma paspali, Phoma rubrum e Phoma draconis), dois
Epicoccum (Epicoccum nigrum e Epicoccum sorghi), um Alternaria (Alternaria
alternata), três Aspergillus (Aspergillus amstelodami, Aspergillus rubrobrunneus e
Aspergillus restrictus) e um Pyrenophora (Pyrenophora tritici- repentis).
Este mesmo comportamento microbiano também foi evidenciado por Vujanovic
et al. (2012), que ao analisarem a microbiota de trigo duro cultivado no Canadá e
encontraram alta incidência dos fungos das espécies Fusarium, entre eles F.
graminearum, F. avenaceum, F. reticulatum, Cladosporium, entre os identificados C.
cladosporioides e Pyrenophora, P. tritici-repentis.
Phoma spp.
Cladosporium spp.
Fusarium spp.
Alternaria spp.
Epicoccum spp.
Aspergillus spp.
Pyrenophona spp.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Incidência de contaminação (%)
Fungos
33
Tabela 3 Atividade de água e contaminação fúngica nos cultivares de trigo (102 UFC g
-1).
Cultivares Atividade
água
Contaminação fúngica (10 2UFC/g)
Fusarium
spp.
Cladosporium
spp.
Phoma
spp.
Aspergillus
spp.
Alternaria
spp.
Epicoccum
spp.
Humicola
spp.
Pyrenophora
spp.
Fundacep 50 0,56 3 ND 25 ND ND ND ND ND
Fundacep Cristalino 0,56 ND ND 16 ND ND 3 ND ND
OR Marfim NE 0,53 2 1 3 ND ND ND 1 ND
OR Marfim NO 0,62 ND 1 9 ND 1 ND ND ND
Quartzo NE 0,57 2 1 5 1 ND ND ND ND
Quartzo NO 0,63 1 1 ND 1 ND ND ND ND
BRS Guamirim NE 0,65 3 ND 1 1 1 ND ND 1
BRS Guamirim NO 0,67 18 ND ND ND 1 ND ND ND
Fundacep Raízes 0,55 2 1 ND ND ND ND ND ND
BRS Tarumã 0,55 20 20 8 ND ND ND ND ND
Abalone 0,57 25 12 ND ND ND 1 ND ND
Horizonte 0,63 ND 4 1 ND ND 1 ND ND
Mirante 0,56 1 1 6 ND 2 ND ND ND
Codetec 114 0,56 ND 8 44 ND ND ND ND ND
ND = Não detectado a presença do micro-organismo.
34
O perfil da incidência das espécies fúngicas encontradas indica que houve tanto
contaminação no campo (Alternaria sp., Fusarium sp., Epicoccum sp., Cladosporium
sp. e Phoma sp.) como durante o armazenamento (Aspergillus sp.), com a característica
atípica da não ocorrência de F. graminearum, uma vez que o trigo apresenta uma alta
frequência de contaminação por este patógeno e decorrente evolução da giberela (DEL
PONTE et al., 2004; ALVES, 2010). Este resultado pode ter sido influenciado pelas
condições climáticas, uma vez que a giberela é uma doença de infecção floral com
frequente ocorrência, após o início da floração do trigo quando ocorrem períodos
prolongados de chuvas e temperaturas médias de 25 - 27 °C (CASA et al., 2004).
Doohan et al. (2003) ao analisar a influencia de fatores climáticos no
desenvolvimento de espécies de Fusarium, verificou que em uma atividade de água
entre 0,96 - 0,98 e temperatura entre 25 - 37 °C ocorria a fase máxima do
desenvolvimento. Portanto, esta informação justificaria a baixa contaminação deste
gênero e a ausência da espécie F. graminearum nas amostras analisadas neste trabalho.
A presença de fungos está comumente associado a evolução de doenças nas
culturas. Os fungos mais frequentes em trigo são Fusarium graminearum, causando a
giberela, diferentes espécies do gênero Puccinia (ferrugem do colmo, ferrugem amarela
e ferrugem da folha), Bipolaris sorokiniana (mancha marrom), as diferentes espécies do
gênero Septoria e Phoma (manchas foliares), Pyrenophora trichostoma (crestamento da
folha), Rhizoctonia solani (podridão de raízes), F. graminearum, F. avenaceum, F.
culmurom. F. oxysporum, F. solani (podridão radicular) (ALVES, 2010).
O potencial de deterioração que os fungos apresentam, causando danos na
cultura e diminuição da qualidade e rendimento dos grãos, tem norteado a busca de
novas técnicas para o controle e diminuição das infestações, como a adoção de boas
práticas agrícolas e cuidados durante as operações de secagem e armazenamento
(CARVALHO et al., 2010), plantio de cultivares mais resistentes (CHEN et al, 2012) e
produção de novos inseticidas (CHEN et al, 2012). Estes aspectos podem ter
influenciado o comportamento observado neste levantamento.
35
5.1.2 Ocorrência de Fumonisina B1 nas amostras de grãos de trigo
A. Validação do método cromatográfico
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica analítica de
separação frequentemente utilizada, pois apresenta alta sensibilidade e alta
aplicabilidade. As FB1 são moléculas polares, solúveis em água e em solventes polares,
desta forma, são ideais para detecção e quantificação em HPLC. Para sua detecção é
necessário a derivatização para desenvolvimento de fluorescência, mas é pouco intensa
e estável, o que requer rápido registro de sinal (LINO et al., 2006).
A validação da metodologia para a FB1 nas amostras deste trabalho foi realizada
de acordo com os parâmetros sugeridos pela ANVISA (2003) e INMETRO (2007). A
Figura 6 apresenta um cromatograma gerado com as condições padronizadas neste
trabalho.
Figura 6 Cromatograma de eluição do padrão de Fumonisina B1
Os ensaios de recuperação mostraram que a metodologia aplicada foi eficaz para
a extração da FB1. Os percentuais de recuperação foram de 81,1% quando a amostra foi
fortificada com 1800 µg kg-1
; 75,4% quando a amostra foi fortificada com 2400 µg kg-1
e 116,4% com uma fortificação de 3600 µg kg-1
, estes níveis estão compatíveis com os
recomendados pela Comunidade Europeia (2005) e pela legislação brasileira (BRASIL,
FB1
36
2005), uma vez que, é aceitável percentagens de recuperação entre 60 e 120% para
concentrações de FB1 inferiores ou iguais a 500 μg.kg-1
, e de 70 a 110% para
concentrações superiores a 500 μg.kg-1
.
Uma limitação dos ensaios de recuperação é decorrente do fato que o padrão
adicionado na matriz não estar necessariamente na mesma forma que a micotoxina
presente naturalmente na amostra, o que pode resultar em uma melhor detecção e
avaliações otimistas da recuperação do método (INMETRO, 2011), no entanto, os
ensaios de recuperação permitem que o analito de interesse seja avaliado na presença de
possíveis interferentes, como impurezas e outros componentes da matriz.
A Tabela 4 apresenta as equações das curvas analíticas, bem como os
respectivos coeficientes de correlação, precisão intercorrida e efeito de matriz. O
modelo de regressão linear foi adequado para a determinação de FB1, pois os
coeficientes de correlação (r2) de ambas curvas foram maiores que 0,90, conforme
recomendação do Inmetro (2007). Os valores de precisão intercorrida (RSD) foram de
11,3% e 15,8% para as curvas analíticas do solvente e da matriz, respectivamente. O
ensaio de repetibilidade foi realizado com a injeção de 3 concentrações diferentes de
FB1, foram elas, 0,05, 0,10 e 0,20 µg mL-1
, a repetibilidade alcançada nas 3 injeções de
cada concentração foi de 3,4; 5,20; e 3,7%, uma média de 4,1%.
O efeito matriz é considerado baixo para intervalos entre -20% < C% <20%,
médio para os intervalos -50% < C% <-20% ou 20%> C%> 50% e elevado para os
intervalos C% < -50% ou C%> 50% (ECONOMOU et al., 2009).
A matriz apresentou elevado efeito (84%), indicando que o trigo é uma matriz
complexa que apresenta vários componentes, além se sujidades, que podem interferir
na quantificação do analito (FB1). Este efeito pode aumentar ou diminuir o sinal
detectado da FB1, portanto a utilização da curva matriz é necessária para descontar o
efeito inerente a matriz, aumentando a precisão analítica do método.
37
Tabela 4 Resultados do estudo de precisão, equação das curvas analíticas e efeito matriz
(EM).
Os valores de LOD e LOQ foram estabelecidos como a quantidade de analito
que produz uma relação sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente. O LOD foi de
200 µg kg -1
e o LOQ foi de 680 µg kg -1
. Estes limites estão acima dos encontrados na
literatura, Silva et al. (2009) encontraram valores de LOD e LOQ para quantificação de
FB1 em amostras de trigo por LC-MS de 40 e 110 µg kg -1
, respectivamente.
Desmachelier et al., (2010) encontraram um LOQ de 40 µg kg -1
ao analisarem amostras
de arroz, utilizando HPLC. A comparação destes resultados com dados da literatura
utilizando outras técnicas e outra matriz é relevante ao fato que não é frequente a
determinação de FB1 em amostras de trigo utilizando HPLC-FL.
No entanto, os limites proporcionados pelos detectores utilizados foram
adequados para as determinações de FB1, pois permitiram observar os níveis
estabelecidos pelos órgãos de legislação e fiscalização de diferentes países. A comissão
da Comunidade Europeia estabelece limites máximos de 1000 µg kg -1
de FB1 em
produtos derivados de milho, destinados ao consumo direto.
A legislação brasileira (RDC n°7/2011) não prevê limites máximos de FB1 para
alimentos a base de trigo e nem para o grão, somente em 2011 a legislação incluiu uma
nova portaria que estabeleceu limites máximos de FB1 e FB2 para amostras de milho, na
qual, o limite máximo de FB1 para grãos de milho sem processamento é de 5000 µg kg -
1 e para alimentos a base de milho processado os limites são de 200 a 2000 µg kg
-1.
Indicativos de mérito Solvente Matriz
Curva analítica y= 11879,8x – 128726,8 y= 727872,3x +5926,8
Coeficiente de correlação
(r2)
0,997 0,966
Precisão intercorrida
(% RDS, n =3)
11,3 15,8
Efeito Matriz (%) 84
38
B. Aplicação do método
Dos 14 cultivares de trigo analisados, 7 estavam contaminados com FB1 em
níveis maiores que 680 µg kg -1
(>LOQ). Os resultados da análise de variância
(ANOVA) revelaram diferença significativa (p< 0,05) nos níveis de contaminação entre
as diferentes amostras. Nenhuma diferença significativa (p> 0,05) foi constatada no
cultivar OR Marfim procedente de diferentes regiões de cultivo, no entanto, o cultivar
Quartzo proveniente da região noroeste diferiu da mesma cultivar proveniente da região
nordeste, mostrando a importância das variáveis abióticas na manifestação do potencial
toxigênico do complexo Fusarium (DEL PONTE et al., 2004). A Tabela 5 apresenta os
resultados para a ocorrência de FB1 em grãos de trigo.
Tabela 5 Ocorrência de Fumonisina B1 nas amostras de grãos de trigo
Cultivar Fumonisina B1(µg/kg)
BRS Guamirim NE < LOQ
BRS Guamirim NO < LOQ
OR Marfim NE 3664 ± 438 a
OR Marfim NO 3620 ± 239 a
Fundacep Raízes < LOQ
Abalone 5319 ± 27 c
BRS Tarumã < LOQ
Horizonte 963 ± 5,0 b
Codetec 114 1120 ± 37 b
Quartzo NE < LOQ
Quartzo NO 4906 ± 190 a
Mirante < LOQ
Fundacep 50 958 ± 7,0 b
Fundacep cristalino < LOQ
NO = Cultivares plantadas na região noroeste do Estado; NE = Cultivares plantadas na
região nordeste do Estado; Médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente, entre as colunas, pelo Teste de t (p<0,05).
São poucos relatos sobre contaminação em grãos de trigo com FB1
(STANKOVIC et al., 2012), que segundo Marin et al. (1999), a razão para esta baixa
ocorrência em trigo e cevada pode ser determinada pela presença de uma microflora
39
concorrente ( que são muito diferentes do milho) e estes podem inibir a síntese das
fumonisinas por isolados de Fusarium ou podem degradar a micotoxina logo que ela é
produzida. Além disso, segundo o autor, vários componentes nutricionais no trigo
poderia atuar como inibidores da biossíntese de fumonisinas, ou um componente
presente apenas no milho pode ter a capacidade para a iniciação da biossíntese de
fumonisinas.
No entanto, os poucos registros sobre FB1 em outros cereais, além de milho,
revelam altos níveis da toxina. Em grãos de trigo naturalmente contaminados no
Uruguai, a produção de FB1 foi maior que 6000 µg kg -1
(PIÑEIRO e SILVA, 1997).
Grãos de trigo da Sérvia apresentaram ocorrência de 82,1 e 92,0%, com concentrações
de 750- 5400 µg kg -1
, nas safras de 2005 e 2007 (STANKOVIC et al., 2012). Em
alguns casos, os níveis de FB1 são maiores, Mallmann et al. (2001) analisaram a
ocorrência de FB1 em cereais e rações, destes 13 amostras eram de trigo, constataram
que 7,7% das amostras estavam contaminadas com FB1 ao nível de 24350 µg kg -1
; no
arroz a ocorrência foi ainda maior, 80% das amostras estavam contaminadas com níveis
médios de 15360 µg kg -1
e destaca-se também os resultados obtidos para o milho, onde
35,2% das amostras apresentavam contaminação, sendo que esta estava ao nível de 86 a
78920 µg kg -1
Os resultados da Tabela 3 e da Tabela 5 mostram que, alguns cultivares não
apresentaram contaminação com espécies de Fusarium, no entanto, foi verificado
produção de FB1, sendo eles, Codetec 114, Horizonte e OR Marfim NO. Este
comportamento também foi verificado por outros autores, Palacios et al. (2011),
verificaram que 4 amostras de trigo duro, cultivados em Buenos Aires, não
apresentaram contaminação com espécies de Fusarium, no entanto, as mesmas
apresentaram FB1. Segundo os autores, o fato pode ser decorrente da presença de
espécies do complexo Gibberella fujikuroi, que não foram identificados através das
análises morfológicas, justificando a produção da micotoxina.
5.1.3 Potencial para a inibição da α amilase fúngica
As α amilases correspondem a uma classe importante de enzimas que estão
correlacionadas a digestão do amido em animais, vegetais e micro-organismos, como os
fungos. Portanto, a inibição destas enzimas por um agente qualquer é um indicativo
importante sobre a eficiência de um potencial antifúngico (PAGNUSSATT et al.,
40
2012), pois o bloqueio da fonte de energia de patógenos, dificulta ou mesmo inviabiliza
o desenvolvimento. A Tabela 6 apresenta os resultados de percentual de inibição,
conteúdo de proteína solúvel e inibição específica dos extratos enzimáticos obtidos dos
diferentes cultivares de trigo.
Devido à grande diversidade de inibidores de α amilase e a sua expressiva
variabilidade, além da importância destes para a fisiologia vegetal, é necessária a
seleção de fontes de extração destes compostos, para selecionar os inibidores de acordo
com a sua eficácia contra as enzimas alvo (KUMARI et al., 2012).
Tabela 6 Inibição percentual e inibição específica (mg amido residual -1
mg -1
proteína-1
)
e conteúdo de proteína solúvel (mg proteína mL -1
).
Cultivar Inibição percentual
Proteína solúvel
(mg proteína
mL -1
)
Inibição específica
(mg AR min -1
mg
proteína-1
)
Fundacep 50 59,8 ± 0,2a 10,9 ± 0,4
c 0,08 ± 0,003
i
Fundacep Cristalino 58,4 ± 0,4a 8,5 ± 0,4
d,e 0,11 ± 0,006
g,h
OR Marfim NE 41,5 ± 0,5g 7,7 ± 0,04
e,f,g 0,17 ± 002
a,b
OR Marfim NO 43,2 ± 0,4f 8,2 ± 0,6
d,e 0,15 ± 0,01
c,d
Quartzo NE 48,4 ± 0,2d,e
8,0 ± 0,4 e,f
0,15 ± 0,01c,d
Quartzo NO 41,7 ± 0,6g 6,6 ± 0,3
g 0,16 ± 0,006
b,c,d
BRS Guamirim NE 59,9 ± 0,3a 10,5 ± 0,03
c 0,11 ± 0,001
g,h
BRS Guamirim NO 54,4 ± 0,1b 8,0 ± 0,1
e,f 0,10 ± 0,001
h,i
Fundacep Raízes 43,5 ± 0,4f 7,0 ± 0,2
f,g 0,18 ± 0,007
a
BRS Tarumã 50,9 ± 1,2c 8,3 ± 0,5
d,e 0,13 ± 0,005
e,f
Abalone 49,2 ± 0,6d 7,6 ± 0,6
e,f,g 0,15 ± 0,009
d,e
Horizonte 43,6 ± 0,1f 12,2 ± 0,5
b 0,10 ± 0,004
h
Mirante 43,6 ± 0,7f 15,1 ± 0,4
a 0,08 ± 0,003
i
Codetec 114 47,6 ± 0,4e 9,3 ± 0,2
d 0,12 ± 0,003
f,g
NO= Cultivares plantadas na região noroeste do Estado; NE= Cultivares plantadas na
região nordeste do Estado; Médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente, entre as colunas, pelo Teste de Tukey (p<0,05).
Ao analisar os resultados encontrados na Tabela 6 é possível notar que os
cultivares Fundacep 50, Fundacep Cristalino, BRS Guamirim NE e BRS Guamirim NO
41
apresentaram os melhores percentuais de inibição em torno de 60, 58, 60 e 54%,
respectivamente. No entanto, quando se trata de inibição específica, estes cultivares
apresentam os menores valores, 0,08, 0,11, 0,11 e 0,10 mg amido residual -1
mg-
1
proteína -1
. Estes valores são justificados pelo do conteúdo de proteína solúvel, nestes
cultivares estão maior concentração, sugerindo que os inibidores enzimáticos estavam
mais concentrados. Exceto para os cultivares Mirante e Horizonte, os quais
apresentaram alto conteúdo de proteínas, 15,1 e 12,2 mg proteína mL-1
e não
apresentaram alto percentual de inibição, 43,6% para ambos cultivares.
O estudo da inibição da atividade da α amilase tem chamado a atenção de vários
pesquisadores (FENG et al., 1996; KADOZAWA et al., 2006; PEREIRA et al., 2006;
SOUZA et al., 2007; PAGNUSSATT et al., 2012; MEHRABADI et al., 2012;
KUMARI et al., 2012). Evidências da hipótese de que plantas podem expressar
inibidores de enzimas eficientes em seus tecidos, especialmente as α amilases, dada a
importância das mesmas como enzimas digestivas, pode-se supor que a expressão do
inibidor aumentaria a resistência de plantas contra pragas, como insetos ou fungos
(MEHRABADI et al. 2012).
Fakhoury e Woloshuk (2001) salientaram a contribuição dos inibidores
enzimáticos na resistência contra patógenos, assim como pesquisas anteriores
demonstraram a ação promissora de inibidores de caráter peptídico no controle de F.
verticillioides (FIGUEIRA et al., 2003a).
Kadozawa et al. (2006) ao estudar a influência dos inibidores de amilase e
proteases, extraídos de híbridos de milho, contra amilases do inseto Sitophilus zeamais
e do fungo Fusarium verticillioides verificaram que os inibidores foram eficientes,
sugerindo que estes favorecem uma resistência simultânea contra F. verticillioides e
insetos predadores, conferindo características promissoras ao melhoramento genético
de milho visando minimização da contaminação fúngica e produção de micotoxinas.
Oliveira et al. (2007), extraíram e purificaram um inibidor de tripsina, nomeado
de PdKI-2, a partir de sementes de Pithecelobium dumosum e constaram que este
inibidor apresentou atividade contra insetos, em teste in vitro. Além disso, concluíram
que, os resultados obtidos indicam que um transgênico de plantas que expressam o gene
de PdKI-2, poderia provavelmente aumentar a resistência contra potenciais predadores.
42
Sendo assim, através da análise dos resultados apresentados na Tabela 6, é
possível predizer que os cultivares Fundacep Raízes, OR Marfim NE, Quartzo NO, OR
Marfim NO, Quartzo NO, Abalone e BRS Tarumã apresentam características bióticas
que podem conferir maior resistência a patógenos quando comparados aos outros
cultivares.
Cabe salientar que, variações climáticas causam grande influência sob a
susceptibilidade das plantas ao ataque dos patógenos, principalmente quando se trata de
umidade e temperatura. Segundo Rupollo et al., (2006), em condições ambientais
favoráveis, de umidade e de temperatura, os esporos dos fungos germinam,
desenvolvendo hifas, que infestam grãos, rações e outros substratos. Portanto,
corroborando com a hipótese que, o conteúdo de inibidores enzimáticos presentes nos
grãos é uma característica que pode ser observada como uma tendência à resistência ou
susceptibilidade dos cereais a ataques de pragas, mas não pode ser a única variável a ser
julgada para uma seleção.
5.1.4 Considerações sobre a caracterização dos cultivares de trigo
A partir dos resultados obtidos com a caracterização do cultivares de trigo, é
possível verificar que não há um comportamento de relação definida entre os cultivares,
a região de cultivo, produção de FB1, inibição da amilase fúngica e a contaminação
microbiana. Isso indica que, outros fatores podem estar associados a estas
características, influenciando na resposta.
No entanto, ao analisar a média dos resultados desta caracterização, algumas
considerações podem ser realizadas. As duas regiões de cultivo apresentaram o mesmo
percentual de ocorrência de FB1 em 50% das amostras, sendo que, em média, a região
noroeste do Estado apresentou maior produção, 4614 µg FB1 kg trigo -1
, e a região
nordeste, em média, apresentou uma produção de 1696 µg FB1 kg trigo -1
. A atividade
de água nos grãos analisados não demonstraram diferenças quanto a região, no entanto,
os grãos de trigo cultivados na região noroeste, em média tiveram maior atividade de
água de 0,60, o que pode ter proporcionado a maior contaminação microbiana,
justificando assim, a maior produção de FB1 . A inibição da α amilase fúngica foi maior
nos extratos obtidos dos grãos de trigo cultivados na região nordeste do RS, em média o
percentual de inibição foi de 49,5%, para a região noroeste os resultados médios foram
de 48,3%.
43
Segundo Abbas et al. (2006), além da microflora, muitos fatores podem
influenciar na produção de FB1 em cereais. Bernd et al. (2008) verificaram que a
temperatura exerce efeito mais significativo na produção de fumonisinas, comparando o
efeito da umidade e concentração de inóculo. Nayaka et al. (2010) e L’vova et al.
(2003) afirmam que o grau de contaminação de fumonisina depende entre outros
fatores, do calor, seca, grau de estresse da planta, localidade da origem do grão,
condições de cultivo e presença de espécies de fungos competidoras.
A partir do exposto, está demonstrado que grãos de trigo apresentam alta
susceptibilidade a ataques fúngicos, especialmente do complexo Fusarium, que
adicionado a condições ambientes favoráveis possibilita a formação de FB1.
Evidenciando o perigo de exposição aos riscos que FB1 causa, seja em humanos ou
animais, através da ingestão de rações ou alimentos à base de trigo contaminados.
Como os resultados não demonstraram uma linha clara de tendência, a escolha
dos cultivares mais promissores para os testes in vitro foi com base na inibição
específica dos extratos sobre a amilase fúngica, dada a importância desta variável para o
desenvolvimento do patógeno. Os cultivares Fundacep Raízes, OR Marfim NE e
Quartzo NO, Abalone e BRS Tarumã foram selecionados para a extração de inibidores e
aplicação in vitro.
5.2 Caracterização físico-química dos cultivares mais promissores
5.2.1 Composição centesimal
As informações sobre a composição físico-química do trigo é unanime quanto a
ocorrência de polissacarídios complexos, a cerca de 65 a 75% de amido e fibra,
proteínas, 7 a 12%, lipídios, 2 a 6% e água, 12 a 14%, além de micronutrientes. Além
disso, os grãos de trigo são tidos como fonte de minerais (especialmente magnésio) e
vitaminas (HEMERY et al., 2007).
Os cultivares de trigo neste trabalho, foram caracterizados físico-quimicamente,
avaliando a composição centesimal e o perfil enzimático. A Tabela 7 apresenta a
composição centesimal das amostras. Os valores médios dos teores de cada variável
analisada foram expressos em g/100 g amostra, em base úmida, comparados
estatisticamente entre as cultivares.
44
Tabela 7 Composição centesimal (g 100g amostra-1
) dos cultivares de trigo
Cultivar Umidade Lipídios Proteínas Fibras Cinzas CH
Abalone 12,0 ± 0,4ª,b 2,5 ± 0,1a 5,2 ± 1,1
c 1,0 ± 0,1
b 1,8 ± 0,2
a 77,5
BRS Tarumã 11,6 ± 0,4b 1,6 ± 0,0
c 9,3 ± 0
a 1,0 ± 0,1
b 1,4 ± 0
b,c 75,1
Quartzo NO 13,8 ± 0,3a 2,1 ± 0,1
b 6,5 ± 0,3
b,c 1,9 ± 0,2
a 1,4 ± 0,1
b 74,3
OR Marfim NE 10,6 ± 0,6b 1,7 ± 0,4
c,d 8,4 ± 1,4ª
,b 1,1 ± 0,1
b 1,2 ± 0,1
c,d 77,0
Fundacep Raízes 11,9 ± 0,4ª,b 1,4 ± 0,1
d 6,3 ± 1,0
b,c 0,7 ± 0,05
b 1,1 ± 0,1
d 78,6
CH = Carboidratos. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente,
entre as colunas, pelo Teste de Tukey (p<0,05).
A composição do grão e de suas frações está sujeita a variações, seja devido ao
manejo da cultura, processamento ou armazenagem, produzindo grãos com
características nutricionais diferenciadas também em função da distribuição não
uniforme nas porções do grão (Pagnussatt et al., 2011). Conforme a Tabela 7, o
cultivar Quartzo NO apresentou maior teor de umidade (13,8 g 100g-1
), porém não
diferiu estatisticamente das cultivares Abalone e Fundacep Raízes, com 12,0 g 100g -1
e
11,9 g 100g-1
, respectivamente. O teor de umidade é um dos fatores preponderantes na
preservação da qualidade dos grãos durante o armazenamento e para a obtenção de um
produto de melhor qualidade depois do processamento (BERBERT e STENNING,
1999). Segundo a Instrução Normativa nº 8, de 02 de junho de 2005, do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento estabelece que o teor máximo de umidade para
grãos deve estar em torno de 15 g 100 g -1
. Portanto, neste caso, está em condições
adequadas.
Os maiores teores de proteína foram obtidos com os cultivares BRS Tarumã e
OR Marfim NE, 9,3 e 8,4 g 100 g -1
, respectivamente. Os teores de proteína encontrado
por Pagnussatt et al (2011) se mantiveram entre 6,1 a 7,5%, nos cultivares estudados
Safira, Ônix e Pampeano. Fujita e Figueroa (2003) encontraram entre 10,6 a 14,7% para
a espécie de trigo Triticum vulgare. Segundo Mandarino (1994), o teor de proteína pode
variar de acordo com o genótipo do trigo, o grau de desenvolvimento, o solo onde foi
cultivado, as condições climáticas durante o desenvolvimento, dentre outros fatores. A
faixa de variação pode ser de 9 a 18% (GUARIENTI, 1996).
Nos cereais, em geral, o teor de lipídios pode variar de 3-5% (GUARIENTI,
1996). Nos cultivares analisados, o teor se manteve entre 1,4 a 2,5%, sendo o cultivar
45
Abalone o que apresentou maior conteúdo lipídico. Estes resultados coincidem com
Pagnussatt et al. (2011), que encontraram de 1,1 a 2,4% de lipídios para os cultivares
de trigo Safira, Ônix e Pampeano.
O cultivar Abalone apresentou maior teor de cinzas que os demais (1,8 g 100g-1
).
A cinza é constituída pelos sais minerais presentes no grão, que se concentra nas
camadas mais externas do trigo e seu teor pode variar de 1,4 a 2,2% em função do grau
de moagem (GUARIENTI, 1996; PIROZI e GERMANI, 1998).
O cultivar Quartzo NO apresentou maior conteúdo de fibra bruta, diferindo
estatisticamente dos demais (p< 0,05). Na composição das fibras estão presentes
compostos que fazem parte da parede celular dos vegetais. Entre esses compostos estão
a celulose, a lignina, hemicelulose e pectinas (MANDARINO, 1994). Esses resultados
coincidem com aqueles encontrados por Pagnussatt et al (2011), que foram de 0,1 a
3,8%. Os carboidratos foram estimados por diferença e resultaram a valores superiores a
70%.
5.2.2 Perfil enzimático
Nos cereais, a atividade enzimática pode ser detectada durante a germinação
precoce, sendo essencial para o crescimento e obtenção de energia (NANDI et al.,
1995), porém estas propriedades também são características de cada cultivar e pode
estar relacionada com a resistência a germinação ou ataque microbiano. O perfil
enzimático dos cultivares está disposto na Figura 7, onde foram determinados as
atividade de α e β amilase, determinados como mg amido hidrolisado min-1
mg
proteína-1 e mg maltose min
-1 mg proteína
-1, respectivamente. A unidade de atividade
específica da protease foi definida mg tirosina liberada min-1
mg proteína -1
e da lipase,
mg acido oleico liberado min-1
mg proteína -1
.
46
Observa-se que as atividades da α e β amilase foram maiores, quando
comparados com as atividades da protease e lipase, o que faz consistência com a
composição centesimal do grão. O cultivar Quartzo NO apresentou maior atividade
para as duas enzimas e diferiu estatisticamente dos demais cultivares, apresentando uma
atividade média de 1,05 UA para a α amilase e 0,24 A para a β amilase. Este
comportamento também foi relatado por Pagnussatt et al. (2011), que verificaram que as
enzimas α e β amilase apresentaram maior atividade em amostras de trigo, quando
comparadas à atividades encontradas em amostras de arroz e aveia. Segundo os autores,
a alta atividade destas duas enzimas em trigo está relacionado a germinação e
contaminação fúngica, uma vez que o trigo está entre os cereais mais susceptíveis a
Tarumã Marfim NE Abalone Quartzo NO Raizes
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
Ati
vid
ade e
specíf
ica
Cultivares
alfaamilas
betaamilas
protease
lipase
a
b b b
c
B C
C
A B
I I I
I
I
I
I
I
Lipase
Protease
β amilase
α amilase
Figura 7 Atividade específica da α-amilase, β-amilase, protease e lipase. UA = atividade
enzimática específica. Letras minúsculas diferem estatisticamente entre os resultados da
alfa-amilase, enquanto que letras maiúsculas diferem estatisticamente entre os resultados da
beta-amilase. Números romanos diferem estatisticamente entre os resultados para protease.
Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
47
estas alterações. Neste caso estas enzimas podem estar inibidas, pois os grãos não se
encontram em estado de germinação.
Os cultivares BRS Tarumã e OR Marfim NE apresentaram maiores atividades
para a protease, 0,048 e 0,046 UA, respectivamente, e não apresentaram diferença
significativa entre si. Pagnussatt et al. (2011) encontraram para a atividade proteolítica
dos cultivares de trigo Pampeano, Ônix e Safira valores inferiores a 0,2 UA,
constatando que, a atividade proteolítica em grãos de trigo é menor quando comparadas
a atividade de enzimas amilolíticas.
Segundo Galliard (1983), o grão de trigo saudável e armazenado
adequadamente, conserva-se como uma fonte alimentar por meses ou mesmo anos. O
trigo germinado e armazenado em condições inadequadas pode induzir a mudanças que
levem a problemas de rancidez nas matérias primas ou em produtos delas.
As mudanças deteriorativas nos grãos decorrentes de processos oxidativos,
resultam em odores e sabores de rancidez atípicos. A mudança em decorrência da
hidrólise resulta na produção de ácidos graxos livres (POMERANZ, 1974). Não foi
detectado a atividade lipolítica nos grãos de trigo analisados. Portanto, pode-se
considerar que os grãos de trigo não sofreram nenhuma deterioração hidrolítica e foram
armazenados adequadamente.
5.2.3 Determinação do peso molecular dos extratos proteicos
Inicialmente, foi testado dois modos de aplicação dos extratos no gel de
eletroforese. O primeiro foi com o extrato bruto, seco em fluxo de N2 e o segundo foi o
extrato bruto precipitado com acetona P.A. Em ambos os extratos a concentração de
proteínas era a mesma e os procedimentos quanto a desnaturação foram iguais. A Figura
8 apresenta o gel de eletroforese para o teste da aplicação destes diferentes extratos.
A partir do resultado demonstrado na Figura 8, é possível verificar que, o extrato
que foi submetido ao fluxo de N2 não apresentou nenhuma banda no gel de eletroforese,
indicando que, na condição estudada, a metodologia aplicada não foi satisfatória.
48
Figura 8 Gel eletroforese SDS-PAGE, onde 1= extrato enzimático precipitado obtido do
cultivar Fundacep Raízes, 2=extrato enzimático precipitado obtido do cultivar Abalone;
3= extrato enzimático precipitado obtido do cultivar BRS Tarumã; 4= extrato
enzimático precipitado obtido do cultivar Quartzo NO; 5= extrato enzimático
precipitado obtido do cultivar OR Marfim NE; 6= extrato enzimático seco sob N2 obtido
do cultivar Fundacep Raízes.
Portanto, uma nova aplicação dos extratos precipitados foi realizada, utilizando
um marcador de peso molecular. A Figura 9 apresenta o perfil de proteínas contidas nos
extratos enzimáticos precipitados com acetona, obtidos dos diferentes cultivares. O
perfil obtido apresenta proteínas com pesos moleculares de 20 a 150 kDa.
Os inibidores extraídos dos diferentes cultivares de trigo apresentaram proteínas
com variados pesos moleculares, em todos os extratos o comportamento eletroforético
foi o mesmo, conforme é verificado pela Figura 9, porém o cultivar BRS Tarumã
apresentou maior densidade proteica na região de 75 kDa, isto justifica-se pelo conteúdo
de proteína, que neste cultivar é maior que os demais, ocasionando assim o alargamento
das bandas.
49
Os estudos referentes ao peso molecular das proteínas com atividade contra da α
amilase, refletem que estas proteínas apresentam menor peso molecular ao encontrado
por este estudo. Segundo Zoccatelli et al. (2012), os inibidores de α amilase podem ser
fracionados em 3 subfamílias, apresentando estruturas tetraméricas, diméricas e
monoméricas, com uma massa molecular de 60, 20 e 12 kDa, respectivamente.
Feng et al. (1995) encontraram uma mistura de complexo de peptídeos de peso
molecular de 13-14 kDa, ao extrair inibidores de α amilase em farinha de trigo e
concluíram que muitos dos polipeptídios verificados no gel de eletroforese são capazes
de inibir a α amilase ou são componentes de proteínas oligoméricas que são capazes
desta inibição.
Chen et al (1992) extraíram inibidores proteicos de milho e trigo com peso
molecular de 12 e 56 kDa, respectivamente, estes inibidores são completamente
diferentes em suas seletividades, o inibidor obtido do milho, com 12 kDa, inibiu
eficazmente a amilase de Tribolium e Tenebrio. No entanto, não inibiu as amilases da
Figura 9 Gel eletroforese SDS-PAGE, onde 1= Marcadores de peso molecular, 2=extrato
enzimático obtido do cultivar Abalone; 3= extrato enzimático obtido do cultivar BRS
Tarumã; 4= extrato enzimático obtido do cultivar Quartzo NO; 5= extrato enzimático
obtido do cultivar OR Marfim NE; 6= extrato enzimático obtido do cultivar Fundacep
Raízes.
50
saliva humana e nem do pâncreas do porco, indicando que, estruturas poliméricas
diferentes podem apresentar seletividade diferente ao substrato. Neste caso a purificação
primária do extrato dificulta a verificação das frações menores durante a eletroforese.
5.3 Biocontrole de Fusarium verticillioides através da aplicação de extratos
enzimáticos em cultivo in vitro
Os efeitos maléficos das patologias causadas por Fusarium e as micotoxinas
produzidas por esta espécie é reconhecido a bastante tempo (MARASAS et al., 1984;
SWEENEY e DOBSON, 1998; ALTINOK, 2009, MENNITI e NERI, 2010). Diversas
estratégias têm sido estudadas como possíveis soluções para este problema. A
minimização da ocorrência de fumonisinas e F. verticillioides pode ser alcançada por
meio de práticas de cultivo pré e pós-colheita, controle durante a colheita ou ainda por
estratégias genéticas e de descontaminação (BERND et al. 2008).
Nas últimas décadas, a exploração da atividade de compostos presentes nas
próprias plantas, tem se tornado uma alternativa no controle de fitopatógenos com
potencial ecológico para amenizar ou até mesmo substituir os produtos sintéticos
(FENG et al., 1995; SOUZA et al., 2007; SOUZA et al., 2011; VENTUROSO et al.,
2011; PAGNUSSATT et al., 2012). Diante disso, foi estudado o processo de
biocontrole de Fusarium verticillioides através da aplicação de extratos enzimáticos em
cultivo in vitro.
5.3.1 Efeito da purificação do extrato enzimático sobre a inibição da atividade da α
amilase
O processo de purificação dos inibidores enzimáticos pode fornecer informações
importantes, pois pode alterar a estrutura dos compostos e modificar a sua eficiência
contra as enzimas alvo (FENG et al., 1995).
A partir da seleção dos cultivares potencialmente fontes de inibidores
enzimáticos, foi realizado a purificação primária dos extratos brutos, obtendo-se
extratos primariamente purificados (EPP), e então estes foram testados frente à amilase
fúngica e quanto ao seu potencial de inibição específica, estes resultados estão dispostos
na Tabela 8.
51
Tabela 8 Inibição da α amilase fúngica por EPP de diferentes fontes de cultivares de
trigo.
Cultivar Inibição
Percentual
Proteína solúvel
(mg prot mL -1
)
Inibição específica
(mg amido residual
min-1
mg prot-1
)
OR Marfim NE 21,2 ± 0,05b 1,9 ± 0,3
a 0,00419 ± < 0,01
b
Quartzo NO 26,9 ± 0,05a 3,2 ± 0,5
d 0,00277 ± < 0,01
d
Fundacep Raízes 20,0 ± 0,3b 1,8 ± 0,05
a 0,00469 ± < 0,01
a
Abalone 12,2 ±0,4c 2,7 ± 0,2
c 0,00282 ± < 0,01
d
BRS Tarumã 12,7 ± 1,7c 2,6 ±0,1
c 0,00351 ± < 0,01
c
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si, pelo Teste
de Tukey (p<0,05).
A comparação dos resultados das Tabelas 6 e 8 mostram que o processo de
purificação primária dos extratos reduziu o percentual de inibição da amilase fúngica
em relação aos extratos brutos. Um exemplo é a inibição causada pelo extrato bruto
(EB) e a causada pelo extrato primariamente purificado (EPP) do cultivar BRS Tarumã,
onde a inibição percentual é 38 vezes menor, quando foi utilizado o EPP para inibir a α
amilase fúngica. Fato que sugere que no extrato bruto estão presentes compostos que
atuam sinergisticamente para inibir a enzima em estudo. O cultivar Quartzo NO que
apresentou maior potencial inibidor de α amilase (27%) também era o que possuía
maior teor proteico após a purificação, confirmando o proposto efeito sinergístico de
diferentes compostos proteicos.
Os cultivares Fundacep Raízes e OR Marfim NE resultaram em extratos com
maior inibição específica, mesmo com o processo de purificação dos extratos, indicando
que estes cultivares apresentam uma característica diferenciada dos demais no que se
refere ao perfil proteico dos inibidores.
Similarmente, alguns estudos relatam que o processo de purificação diminuiu a
eficiência de extratos enzimáticos contra enzimas alvo, como demonstrado por Gomes
et al. (2005) ao purificar inibidores enzimáticos de tripsina com altas concentrações de
sulfato de amônia (90%) verificaram uma baixa inibição da atividade, quando
comparadas com o processo de purificação com concentrações de sulfato de amônia
menores (60%). Oliveira et al. (2007) também relataram uma diminuição no potencial
52
de inibição contra a papaína de extratos obtidos de sementes de Pithecelobium
dumosum durante o processo de purificação, em até 96%.
5.3.2 Inibição do crescimento micelial do F. verticillioides
O efeito inibitório dos extratos EB ou EPP foi avaliado nos cultivos in vitro da
espécie fúngica de F. verticillioides, onde foram adicionados ao meio em função do IC50
estimado para a inibição da amilase fúngica
O desenvolvimento micelial do F. verticillioides foi progressivo ao longo dos
sete dias de cultivo e o diâmetro máximo das colônias ocorreu em função do extrato
empregado. A Figura 16 apresenta a taxa do crescimento micelial do patógeno na
presença dos diferentes extratos e no experimento controle para os diferentes cultivares.
Os resultados apresentados nas Figuras 11, 12, 13, 14 e 15 mostram que a partir
do segundo dia de cultivo, ocorreu o maior desenvolvimento micelial do fungo, não
sendo possível detectar as fases estacionárias e de declínio do desenvolvimento, exceto
para o experimento utilizando extrato bruto, obtido do cultivar Fundacep Raízes, onde
foi possível distinguir a fase exponencial (3-4° dia) e a fase estacionária (4 – 7° dia).
53
1 2 3 4 5 6 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Quartzo
1 2 3 4 5 6 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
OR Marfim
1 2 3 4 5 6 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Raízes
1 2 3 4 5 6 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Abalone
1 2 3 4 5 6 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tarumã
Cre
scim
ento
mic
elia
l (c
m)
Período de incubação (dias)
Figura 10 Crescimento micelial do F. verticillioides nos testes in vitro, com as diferentes fontes de
extração dos extratos inibidores (cultivares), na presença de extrato bruto (EB) e extrato primariamente
purificado (EPP), onde refere-se ao experimento realizado com EB; refere-se ao experimento
realizado com EPP e refere-se ao experimento controle.
54
A aplicação dos extratos brutos no cultivo in vitro resultou em uma inibição
micelial média do patógeno de 9, 12, 20, 9 e 6%, quando se utilizou os cultivares
Quartzo NO, BRS Tarumã, Fundacep Raízes, Abalone e OR Marfim NE,
respectivamente, como fonte de inibidores enzimáticos. Com a aplicação dos extratos
primariamente purificados, a inibição foi maior para a maioria dos cultivares, 15% para
o cultivar Quartzo NO, 26% para o Fundacep Raízes, 12% para a Abalone e 11% para o
cultivar OR Marfim NE, exceto o cultivar BRS Tarumã, que a inibição apresentou ser
menor utilizando EPP, 10%.
Ao analisar o efeito da aplicação dos extratos sobre o crescimento micelial do
fungo dia após dia (conforme é verificado através dos gráficos do desenvolvimento)
verifica-se que o EB obtido do cultivar Fundacep Raízes no 7° dia de cultivo, foi capaz
de inibir a taxa do crescimento micelial do fungo em até 43%, com a aplicação do EPP
obtido do mesmo cultivar, o maior percentual de inibição foi no 3° dia, 39%.
Estes resultados podem estar correlacionados com as atividades inibitórias da α
amilase fúngica, pois os resultados demonstraram que os extratos EB e EPP obtidos do
cultivar Fundacep Raízes foram os mais eficientes para inibir a enzima, como
apresentado nas Tabelas 6 e 8, demonstrando que este comportamento também foi
mantido durante os testes in vitro, ou seja, em uma condição ótima para o
desenvolvimento fúngico, seja pela temperatura ótima (25 °C), alta umidade e excesso
de inóculo, estes extratos também foram eficientes para a inibição do desenvolvimento
do patógeno. Ficou demonstrado assim que a característica biótica do grão, presença de
inibidores enzimáticos, é um bom parâmetro de eleição de um cultivar resistente ao
ataque fúngico.
Outros estudos também relatam a eficiência de extratos vegetais sobre o
desenvolvimento de patógenos in vitro. Souza et al. (2007) avaliaram o efeito de
extratos vegetais, com componentes inibidores, sobre o crescimento micelial de fungos
fitopatogênicos e verificaram que, extratos em maiores concentrações inibiram até 38%
do crescimento micelial do F. proliferatum, indicando que, estes produtos podem inibir
ou até suprimir o desenvolvimento destes micro-organismos.
Em testes realizados com o Fusarium solani, Venturoso et. al. (2011)
verificaram que ao final do período de incubação, 12 dias, a presença de extrato vegetal
55
de semente de nim no cultivo in vitro inibiu o crescimento micelial do fungo em 14%,
demonstrando um efeito antifúngico do extrato.
5.3.3 Inibição do conteúdo de glicosamina e atividade da α amilase
Os indicativos de inibição de formação de parede celular e de catabolismo são
importantes para verificar o efeito fungitóxico durante a seleção de produtos naturais
com atividade antifúngica; pois através da verificação das alterações morfológicas e
metabólicas dos micro-organismos pode ser estabelecido o modo de ação dos
compostos bioativos e aplicá-los de forma eficiente e segura (Dambolena et al., 2012).
A inibição da produção de glicosamina e a atividade da α amilase, determinados
na biomassa fúngica produzida durante o cultivo com o tratamento dos inibidores
enzimáticos, podem ser indicativos importantes do mecanismo de inibição. A Tabela 9
mostra o percentual de inibição da glicosamina e a inibição da atividade da α amilase na
biomassa fúngica, para os dois extratos utilizados, obtidos a partir dos diferentes
cultivares.
Tabela 9 Inibição da produção de glicosamina (IG) e inibição da atividade (IA) da α
amilase para os extratos EB e EPP.
Cultivar IG (%) IA α amilase (%)
EB EPP EB EPP
OR Marfim NE 24,5 ± 0,4 d,D
22,6 ± 3,8 b,D,E
2,6 ± 1,4 c, D
59,4 ± 3,6 a,B
Quartzo NO 65,9 ± 5,6 a,A
39,7 ± 0,9 a,B
84,01 ± 6,6 a,A
61,7 ± 6,6 a,B
F. Raízes 27,6 ± 7,2 c,d,C,D
12,2 ± 2,9 c,E
42,1 ± 6,6 b,C
35,9 ± 6,2 b,C
Abalone 41,3 ± 0,3 b,B
25,2 ± 4,2 b,D
4,5 ± 2,7 c, D
31,9 ± 7,7 b,C
BRS Tarumã 36,1 ± 0,9 b,c, B,C
19,0 ± 1,8 b,D,E
29,9 ± 8,1 b,C
10,4 ± 4,7 c,D
Médias seguidas da mesma letra minúsculas nas linhas e maiúscula nas colunas não
diferem entre si, pelo Teste de Tukey (p <0,05).
O efeito de extratos inibidores sobre o conteúdo de glicosamina também já foi
estudado por outros autores. Pagnussatt et al (2012) avaliaram o efeito de extratos
inibidores de α amilase obtidos a partir de arroz, aveia e trigo sobre o desenvolvimento
do Fusarium graminearum, em cultivo in vitro por 21 dias, e concluíram que os extratos
inibiram em 75, 91 e 86% a produção de glicosamina na biomassa respectivamente,
56
portanto estes indicativos são uma forma eficiente de mensurar a inibição do complexo
Fusarium.
A percentagem de inibição do conteúdo de glicosamina foi maior no extrato
bruto obtido do cultivar Quartzo NO (66%) da produção de glicosamina na biomassa, a
aplicação do extrato primariamente purificado também manteve o perfil (40% de
inibição). Assim como a inibição da atividade da α amilase, que também foi maior, 84%
e 62%, quando aplicados EB e EPP, respectivamente, do mesmo cultivar.
Houve diferença significativa (p< 0,05) para a inibição da glicosamina entre os
diferentes extratos aplicados para o cultivar Quartzo NO (EB é diferente de EPP) e
também quando comparado aos resultados obtidos com os demais cultivares.
Cabe salientar que o extrato obtido do cultivar Quartzo NO não apresentou os
melhores resultados nos testes preliminares da inibição da α amilase fúngica (Tabelas 6
e 8), e também para o teste in vitro de inibição micelial do patógeno, onde a maior
inibição foi com o EPP no 5° dia, 25% e com o EB a maior inibição foi no 3° dia,
11,5%. Isto indica que, durante o cultivo, os extratos obtidos do cultivar Quartzo NO
tiveram melhores condições para inibir a glicosamina e inibir a amilase fúngica, no
entanto, outros componentes que estão presentes na rota metabólica do desenvolvimento
micelial do patógeno não foram inibidos tão eficazmente.
Além dos extratos obtidos do cultivar Quartzo NO, os extratos dos cultivares
Abalone e BRS Tarumã também mostraram bons resultados de inibição da glicosamina,
e não diferiram entre si, seja comparando os EB e EPP ou comparando as diferentes
origens dos extratos. Para a inibição da atividade da α amilase fúngica, além do cultivar
Quartzo NO, o extrato bruto obtido do cultivar Fundacep Raízes inibiu em torno de 42%
a atividade da enzima, e para o extrato primariamente purificado, o segundo melhor
resultado foi com a aplicação do extrato obtido do cultivar OR Marfim NE.
5.3.4 Influência da aplicação dos extratos enzimáticos sobre a manifestação
do potencial toxigênico do F. verticillioides
Para avaliar a influência das aplicações dos inibidores enzimáticos no potencial
toxigênico do Fusarium verticillioides, foi realizado a extração e quantificação de FB1.
Tabela 10 apresenta os níveis de FB1 presente na biomassa fúngica nos experimentos
utilizando os extratos brutos e primariamente purificados e o respectivo controle.
57
Tabela 10 Níveis de FB1 na biomassa fúngica com a aplicação dos diferentes extratos e
os respectivos controles.
Médias seguidas da mesma letra minúscula na linha não diferem significativa entre o
tratamento com o extrato e o respectivo controle. Médias seguidas da mesma letra
maiúscula na coluna indicam não diferença significativa entre as fontes de extração dos
inibidores (cultivares). Médias seguidas do mesmo número romano na linha indica a
não diferença para o EB e EPP para a mesma fonte.
Em todos os experimentos, os extratos foram capazes de inibir a produção de
FB1. As aplicações dos extratos primariamente purificados (EPP) resultaram em maior
inibição da produção de FB1 quando comparados com a inibição alcançada pela
aplicação dos extratos brutos (EB). Quando estes eram provenientes dos cultivares
Abalone, BRS Tarumã e Quartzo NO.
Pode ser destacado o experimento realizado com EPP obtido do cultivar BRS
Tarumã, onde a produção de FB1 no experimento controle foi de 6725 µg FB1 kg
biomassa-1
e a produção de FB1 na biomassa contendo o extrato foi de 1274 µg FB1 kg
biomassa-1
, uma inibição de 81% na produção dessa micotoxina. Cabe salientar que, o
efeito dos extratos do cultivar BRS Tarumã não haviam se destacado nos testes de
inibição do desenvolvimento fúngico como os extratos obtidos pelos cultivares Quartzo
NO e Fundacep Raízes.
As aplicações dos EPP obtidos dos cultivares Fundacep Raízes e Quartzo NO
também proporcionaram uma significativa diminuição nos níveis de FB1
comparativamente a controle, com uma inibição de 68 e 58%, respectivamente,
associados aos altos níveis de inibição do crescimento micelial, inibição da glicosamina
Cultivar Fumonisina B1 (µg kg biomassa -1
)
EB Controle EPP Controle
ORMarfim NE < LOQ i,D, IX
2206 ± 77 j 1130 ± 52
e,A, X 1579 ± 69
f
Quartzo NO 1123 ± 13 c,B, III
1475 ± 78 d 795 ± 64
g,B, IV 1892 ± 84
h
F. Raízes 787 ± 60 g,C, VII
1260 ± 97 h 1136 ± 65
c,A,VIII 3554 ± 85
d
Abalone 825 ± 12 e,B,V
1057 ± 72 f < LOQ
i,C,VI 1562 ± 11
j
BRS Tarumã 4793 ± 20 a,A,I
4865 ± 85 b 1274 ± 3 ª
,A,II 6759 ± 44
b
58
e inibição da atividade da amilase fúngica, obtidos com os extratos Fundacep Raízes e
Quartzo NO, respectivamente.
As aplicações dos extratos bruto, do cultivar OR Marfim NE, e purificado, do
cultivar Abalone, conduziram a incidência de FB1 menor que o limite de quantificação
(680 µg FB1 kg -1). Comparando os extratos bruto e primariamente purificado, obtidos
da mesma fonte, é possível concluir a 5% de significância que os resultados são
estatisticamente diferentes. Novamente o comportamento na manifestação do potencial
toxigênico é contrário ao de inibição dos indicativos do desenvolvimento no cultivo.
A alta produção de FB1 na biomassa fúngica, pode ter sido favorecida pelas
condições que o cultivo proporciona, como temperatura e umidade. A produção de FB1
por F. verticillioides é fortemente influenciada pela atividade de água além de
condições ambientais favoráveis. Durante o cultivo in vitro, a atividade de água no meio
pode estar entre 0,90- 0,98 e a temperatura se mantem a 25 ± 1°C, estas condições faz
com que a produção de FB1 pelo fungo seja altamente favorecida (BATTILANI et al.,
2011; FANELLI et al. 2012).
Acuña et al. (2005) verificaram uma produção de FB1 por F. verticillioides, em
meio PDA a 25 °C, de 6 a 25846 mg kg -1
, sob as mesmas condições, Lazzaro et al.
(2012) constataram uma concentração de FB1 na biomassa de194, 3822 e 13573µg/ kg
quando aplicado no cultivo 3 diferentes linhagens de F. verticillioides. Portanto, o meio
PDA não dificulta a manifestação toxigênica e o efeito inibitório observado pode ser
atribuído aos EB e EPP.
Marín et al. (2003) estudaram o efeito da interação temperatura, atividade de
água e presença de óleos essenciais na produção de FB1 por espécies de Fusarium, a 20
°C e aa igual a 0,995, a concentração de FB1 encontrada foi de 5000 µg kg -1
e
concluíram que os fatores ambientais são tão determinantes em meios sintéticos como
parecem ser em campo. Estudos utilizando meio de cultura sólido indicam valores
menores para a produção de FB1, Altinok (2009), investigou a produção de FB por
isolados de F. moniliforme quando incubados com grãos de milho encontrando
118 e 72 µg g-1
de FB1 e FB2, respectivamente. Considerando estes aspectos, os cultivos
neste caso foram realizados nas condições ótimas para o desenvolvimento fúngico, sem
o estresse causado pelas variações no ambiente.
59
5.3.5 Considerações sobre as respostas de biocontrole de F. verticillioides em testes
in vitro
Conforme os resultados apresentados verifica-se que não há uma correlação
entre as fontes de obtenção dos extratos enzimáticos e as respostas de inibição do
crescimento micelial, inibição do conteúdo de glicosamina, inibição da atividade da α
amilase e produção de FB1.
Os extratos obtidos do cultivar Fundacep Raízes apresentaram melhores
resultados para a inibição do crescimento micelial do fungo, chegando a 43% de
inibição do crescimento, no entanto, estes extratos não foram os melhores para a
inibição da glicosamina e diminuição da atividade da amilase na biomassa produzida
durante o cultivo, indicando que, há outros processos metabólicos que foram inibidos e
que influenciaram o desenvolvimento do fungo, mas relacionados aos caminhos
metabólicos da produção de glicosamina ou atividade de amilase.
Os extratos EB e EPP do cultivar Quartzo NO apresentaram os maiores níveis
de inibição do conteúdo de glicosamina e da atividade α amilase, chegando a ser 1,5 e 2
vezes maior do que os demais cultivares, respectivamente.
A partir do exposto, fica claro que, a rota do desenvolvimento do fungo
(crescimento micelial) foi fortemente alterada através da aplicação dos extratos obtidos
do cultivar Fundacep Raízes, esta rota metabólica não parece estar associada com os
componentes da parede celular (glicosamina) e nem com a inibição da enzima amilase,
foram mais expressivamente inibidos pelos extratos obtidos do cultivar Quartzo NO,
dessa maneira, talvez fosse necessário determinar o conteúdo de ergosterol (presente na
membra celular), proteínas ou até mesmo ácidos nucléicos, a fim de verificar qual é a
rota metabólica mais afetada pelas aplicações dos extratos enzimáticos.
Para a inibição da produção de FB1, o extrato que foi mais promissor foi obtido
do cultivar BRS Tarumã, o qual foi capaz de inibir em até 80% da produção de FB1
quando se aplicou o EPP. Quando se utilizou o extrato na sua forma bruta do cultivar
OR Marfim NE, a inibição da produção de micotoxina foi mais eficiente (79%). Mais
uma vez, estes cultivares não haviam de destacado até então como bons inibidores do
desenvolvimento fúngico.
60
Cabe salientar que, analisando a média dos resultados verifica-se que há uma
tendência de correlação positiva entre a purificação dos extratos e a inibição do
crescimento fúngico e da produção de FB1 na biomassa. Em geral, os EPP apresentaram
maiores percentuais de inibição no crescimento micelial do fungo, inibiram mais
efetivamente a atividade enzimática da α amilase e diminuíram a produção da FB1,
sugerindo que o processo de purificação, apesar de reduzir o percentual de inibição da
amilase, aumenta os níveis de inibição do crescimento micelial e inibição de FB1.
Essas evidências que os extratos inibidores de amilases podem contribuir para
a resistência a patógenos pela planta, também foram descritos por Figueira et
al.,(2003a). Nesse estudo, os extratos aplicados (EB ou EPP) mostraram ser eficientes
agentes antifúngicos, pois inibiram o desenvolvimento do patógeno, e agentes
antimicotoxigênico, pois inibiram a produção da FB1, demonstrando a importância do
estudo na aplicação destes compostos em cultivo in vitro.
Fatos que são bastante promissores, pois fornecem subsídios parra a
compreensão do mecanismo de defesa natural de plantas que pode ser melhorada
através de técnicas moleculares a partir disto, a engenharia genética de culturas usando
o gene da proteína inseticida é um dos grandes projetos em biotecnologia vegetal, para
conferir a proteção contra pragas até mesmo durante o armazenamento na pós-colheita.
No entanto, há uma necessidade de identificação e triagem de fontes vegetais
possuidores de inibidores de α amilase para fornecer subsídios ao estudo do
melhoramento genético e esclarecer mecanismos de defesa natural das plantas
(MEHRABADI et al., 2012). Portanto, maiores estudos sobre os extratos enzimáticos
presentes em cereais são necessários, a fim de elucidar e esclarecer quais são os
componentes principais destes extratos e a sua relação quanto a defesa natural das
plantas. Este trabalho da continuidade a outro anteriormente realizado neste sentido
envolvendo os cultivares de cereais desenvolvidos para plantio no RS.
61
6. CONCLUSÃO
Foram analisados 14 amostras de grãos de trigo de diferentes cultivares. A
atividade de água dos grãos manteve-se entre 0,53 a 0,67, que favoreceu a baixa
contaminação microbiana. Das espécies identificadas, 29% eram do gênero Phoma,
19,2% Fusarium, 25% Cladosporium, 11,5% Alternaria, 5,8% Epicoccum, 5,8%
Aspergillus,1,9% Pyrenophona e 1,9% do gênero Humicola.
O método analítico para determinação de FB1 por HPLC/FL, utilizando a
metodologia de QuEChERS para a extração da micotoxina foi validado, conforme os
parâmetros das agências regulatórias. A metodologia para extração mostrou-se
adequada para a matriz e para a micotoxina, uma vez que o ensaio de recuperação
apresentou um resultado de 91%. A repetibilidade alcançada através das injeções das
soluções padrão foi de 4,1%. Nos grãos analisados os níveis de FB1, variaram entre 958
e 5319 µg kg -1
em 50% das amostras, nos demais cultivares a produção foi inferior ao
LOQ.
Os cultivares Abalone, Fundacep Raízes, BRS Tarumã, OR Marfim NE e
Quartzo NO resultaram em extratos proteicos com maior capacidade de inibir a amilase
fúngica. O perfil eletroforético deles mostrou 4 bandas de massa molecular, 150, 75, 50
e 20 KDa. A composição centesimal dos cultivares foi semelhante aos relatos pela
literatura e as enzimas mais ativas foram a α e β amilases.
A aplicação dos extratos proteicos na sua forma bruta inibiu o desenvolvimento
do Fusarium verticillioides, avaliado pelo crescimento micelial, teor de glicosamina e
atividade da enzima amilase na biomassa fúngica, em torno de 11, 39 e 32%
respectivamente. A aplicação dos extratos primariamente purificados inibiu em 15%,
24% e 40% do crescimento micelial do fungo, teor de glicosamina e atividade da
enzima amilase, respectivamente.
Os extratos também inibiram a produção da FB1, em média a inibição foi de
33% e 47% ao aplicar no cultivo in vitro os extratos brutos e primariamente purificados,
respectivamente. O extrato purificado do cultivar BRS Tarumã apresentou os melhores
resultados para a inibição da produção de FB1, (80%).
62
Estes resultados mostram que o estudo dos inibidores enzimáticos e sua
aplicação contra o desenvolvimento fúngico é uma ferramenta útil para estimar a
susceptibilidade das culturas aos ataques fúngicos e assim controlar os danos que estes
geram a produção e na qualidade dos grãos.
63
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77
8. ANEXOS
8.1 Fotos do Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F.
verticillioides durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos dos
diferentes cultivares.
78
EB
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
EPP
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
Figura 11. Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar OR Marfim NE, e
os respectivos controles.
79
EB
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
EPP
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
Figura 12 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Quartzo NO, e os
respectivos controles.
80
EB
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
EPP
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
Figura 13Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Abalone, e os
respectivos controles.
81
EB
1º Dia 3º Dia 7º Dia
Controle
1º Dia 3º Dia 7º Dia
EPP
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
Figura 14 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar Fundacep Raízes,
e os respectivos controles.
82
EB
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
EPP
1º D 3º D 7º D
Controle
1º D 3º D 7º D
Figura 15 Acompanhamento do 1°, 3° e 7° dia do desenvolvimento do F. verticillioides
durante o cultivo in vitro, aplicando os EB e EPP, obtidos do cultivar BRS Tarumã, e os
respectivos controles.
