Métodos de cultivoMétodos de cultivo

Importancia del cultivo de Importancia del cultivo de microorganismosmicroorganismos::

• Obtención de cultivos puros.Obtención de cultivos puros.

• Análisis morfológico, fisiológico, genético y Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras características.otras características.

• Producción.Producción.

• Conteo deConteo de

colonias (UFC)colonias (UFC)

¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?medio de cultivomedio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores : Una solución acuosa con los nutrientes y factores de crecimiento necesarios.de crecimiento necesarios.

Los Los μμorganismos crecen en unorganismos crecen en unmedio de cultivo artificial se medio de cultivo artificial se requieren condiciones como:requieren condiciones como:temperatura, temperatura, grado de humedad y grado de humedad y presión de oxígeno presión de oxígeno así como un grado correcto así como un grado correcto de acidez o alcalinidadde acidez o alcalinidad

..

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Según su estado físico LíquidosUsualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientesdisueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevadonúmero de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. SólidosSe pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se lesañaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Seutilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de losmicroorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

Según la naturaleza de sus constituyentesSegún la naturaleza de sus constituyentes

Medios naturales o complejosMedios naturales o complejosEstán constituidos por sustancias complejas de origen animal o Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal vegetal usualmente se complementan con el añadido de minerales y otrasusualmente se complementan con el añadido de minerales y otras

sustancias.sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, niNo se conocen todos los componentes del medio de cultivo, nilas cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.carne, extracto de levaduras.

Medios sintéticos o definidoMedios sintéticos o definidoSe preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto, tanto, Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa.Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

E. coliE. coli

Mediodefinido Medio Complejo

K2HPO4 7 g Glucosa 15 g

KH2PO4 2 g Extracto de levadura 5 g

(NH4)2SO4 1 g Peptona 5 g

MgSO4 0.1 g K2HPO4 2 g

CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml

Glucosa 4-10 g pH 7

Elementostraza(Fe, Co, Mn,Zn, Cu, Ni, Mo)

2-10 µg

Agua destilada 1000 ml

pH 7

3. 3. Según sus propósitos de usoSegún sus propósitos de uso

Medios de enriquecimientoMedios de enriquecimientoAl cultivo en medio líquido que resulte en un incremento Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de en el número de un tipo dado de μμorganismo en relación organismo en relación con el número de otros tipos de con el número de otros tipos de μμorganismos que organismos que puedan estar en el inóculo.puedan estar en el inóculo.

Puede contener sustancias que favorezcan el Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del crecimiento del μμorganismo que nos interesa o que organismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de otro tipo de microorganismos inhiban el crecimiento de otro tipo de microorganismos presentes. presentes.

La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.fuerza iónica, iluminación, aireación etc.

Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.plantas.

Ej. Caldo tetrationato y selenito. utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos.

Agua de peptona alcalina (Vibrio cholerae)

Medios selectivosMedios selectivos

Se diferencian de los enriquecidos por ser medios Se diferencian de los enriquecidos por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.microorganismos específicos.

Ej. COEj. CO22 como fuente de carbono es selectivo para como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen maltosa.única fuente solo crecerán los que usen maltosa.

(Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)(Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis,Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis,

Sacarosa (TCBS): Sacarosa (TCBS): VibrioVibrio

• • Agar Cetrimida: Agar Cetrimida: PseudomonasPseudomonas

Medios diferencialesMedios diferenciales

Son aquellos destinados a facilitar la Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.en dichos medios.

contienen indicadores de productos derivados de contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los la actividad metabólica de los μμorganismos sobre organismos sobre algunos de los componentes del medio. algunos de los componentes del medio.

Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratosfermentación de carbohidratos

.. Agar Eosina Azul de Metileno: Agar Eosina Azul de Metileno:

coliformes y coliformes y E. coliE. coli

Medio de cultivo Tipo de medio Agente bacteriostático Azúcar fermentable Sistema Indicador

ALRF (agar lactosa rojo fenol)

diferencial (no selectivo) ----- lactosa rojo fenol

Agar Cetrimide selectivo bromuro de cetiltrimetil amonio

------- --------

Agar Mac Conkey selectivo y diferencial  cristal violeta, sales biliares

lactosa rojo neutro

SS agar (Salmonella Shigella)

 selectivo y diferencial  verde brillante, sales biliares

lactosa  rojo neutro,  citrato férrico

VRBA (violeta rojo bilis agar)

selectivo y diferencial  cristal violeta, sales biliares

lactosa rojo neutro

Manitol Salt Agar (Chapman)

 selectivo y diferencial cloruro de sodio manitol rojo fenol

EMB agar (eosin methylen blue)

selectivo y diferencial  eosina y azul de metileno lactosa eosina y azul de metileno

XLD agar (xilosa lisina desoxicolato)

 selectivo y diferencial  desoxicolato de sodio lactosa, xilosa, sacarosa rojo fenol, citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio

BiS agar (bismuto sulfito) selectivo y diferencial  verde brillante, sulfito de bismuto

glucosa indicador de sulfito de Bi y sulfato ferroso

Baird Parker agar   selectivo y diferencial  Cloruro de litio y telurito de potasio 

------ yema de huevo, telurito de potasio

TSB + 10% NaCl enriquecimiento selectivo  cloruro de sodio ------ -------

Caldo Tetrationato enriquecimiento selectivo Tetrationato, sales biliares ------ ------

CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)

enriquecimiento selectivo  verde brillante, sales biliares

lactosa  producción de gas

Medios de mantenimientoMedios de mantenimiento

Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.muerte rápida de las células.

Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimientomedios de mantenimiento

PREPARACIÓN DE MEDIOSPREPARACIÓN DE MEDIOS

Siempre preparar los medios con aguaSiempre preparar los medios con agua

destilada (salvo el Marino).destilada (salvo el Marino).

Es necesario ajustar siempre el pH.Es necesario ajustar siempre el pH.

Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios.Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios.

Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa.Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa.

Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o

suspende en el agua.suspende en el agua.

Se esteriliza a 121°C por 20 minSe esteriliza a 121°C por 20 min

Se espera a que enfríe (42°C o hasta que se pueda Se espera a que enfríe (42°C o hasta que se pueda

sostener el recipiente sin quemarse la mano).sostener el recipiente sin quemarse la mano).

• • Servir 20 ml Aprox. en cada caja de PetriServir 20 ml Aprox. en cada caja de Petri

•

Métodos especiales de cultivo;

• Siembra en superficie sobre medio sólido• Siembra en profundidad (vertido en placa)• Dilución y solidificación en tubo• Cultivo en células vivas• Cultivo en animales Mycobacterium leprae

Mantenimiento y preservación de cultivos purosMantenimiento y preservación de cultivos puros..

- Resiembra Resiembra periódica periódica

- en medios frescos.en medios frescos.

- Preservación de cultivos conPreservación de cultivos con- una capa de aceite mineral.una capa de aceite mineral.

- Liofilización.Liofilización. Proceso utilizado Proceso utilizado para la eliminación de agua, para la eliminación de agua, mediante desecación al vacío y a mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas. Con muy bajas temperaturas. Con crioprotectores leche crioprotectores leche descremada 10-20%, suero fetal descremada 10-20%, suero fetal bovino, suero equino, mesclas bovino, suero equino, mesclas de suero, glucosa y extracto de de suero, glucosa y extracto de levadura.levadura. inositol, leche inositol, leche descremada descremada

Almacenamiento a temperaturas Almacenamiento a temperaturas muy bajas muy bajas en presencia de en presencia de agentes estabilizantes como agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido, glicerol, dimetilsulfóxido, glucosa, sacarosa , suero de glucosa, sacarosa , suero de conejo, extracto de malta, conejo, extracto de malta, nitrógeno líquido, (-196ºC)nitrógeno líquido, (-196ºC)