06/11/2017 PC2017/2018 – Lycée La Martinière MonplaisirSolution aqueuse TP n°5 – 1 / 3

TP n°5SÉPARATION DE DEUX ACIDES AMINÉS CONTENUS DANS UN PRODUIT

PHARMACEUTIQUE PAR RÉSINE ÉCHANGEUSE D'IONSCONTRÔLE DE LA SÉPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

(CCM)

Bibliographie :Séparation par méthodes chromatographiques de deux acides α-aminés présents dans un produit pharmaceutique, L. Le Guilly, Bull. Union Phys., 1984, 668, p.269-275.

1. But du TP

On cherche à séparer les deux acides aminés (acide aspartique et arginine) contenus dans un médicament (le Sargenor) grâce à une chromatographie sur résine échangeuse d'ions. Pour cela, on jouera sur le pH de l'éluant. En effet suivant le pH les deux acides aminés peuvent se retrouver préférentiellement sous forme ionique ou neutre et peuvent donc être retenus sur la résine ou non.Une fois la séparation effectuée, celle-ci sera contrôlée par chromatographie sur couche mince.

2. Principe de la chromatographie d’échange d’ions

2.1. Principe

Dans la chromatographie d’échange d’ions, la phase stationnaire comporte des groupements ionisés (positifs ou négatifs) fixes. Des ions mobiles de charge opposée assurent l’électroneutralité. Les ions retenus au voisinage des charges fixes sont échangeables avec les ions présents dans la phase mobile.La séparation est basée sur cette propriété d’échange d’ions et ne peut s’appliquer qu’à des solutés ionisables.

2.2. Les résines échangeuses d’ions

La phase stationnaire est constituée d’un support insoluble dans l’eau (silice, polymère…), sur lequel sont greffés des groupements fonctionnels ionisables. Les groupements fonctionnels sont fixés par des liaisons covalentes sur le support, ils sont de deux types :

Les échangeurs de cations (résine cationique) portent des groupements chargés négativement : –SO3

- ; Na+ ou –CO2- ; Na+ (respectivement sulfonate et carbonate)

Réaction d’échange d’ions : résine-SO3- ; Na+ + C+ = résine-SO3

- ; C+ + Na+

Ce type de résine ne retient ni des anions, ni les molécules neutres.

Les échangeurs d’anions (résine anionique) portent des groupements chargés positivement : –N(CH3)3

+ ; Cl- (ammonium)Réaction d’échange d’ions : résine-N(CH3)3

+ ; Cl- + A- = résine-N(CH3)3+ ; A- + Cl-

Ce type de résine ne retient ni des cations, ni les molécules neutres.

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Les éluants sont des solutions aqueuses qui contiennent des ions échangeables avec les solutés fixés sur la résine :• solutions contenant un ion de densité de charge plus élevée et (ou) de concentration plus élevée ;• solutions d’un pH tel qu’il modifie la charge des ions fixés et (ou) des groupements fonctionnels et

provoque leur libération dans l’éluant.On peut éluer avec une solution de composition constante ou avec un gradient de pH et (ou) de force ionique, pour décrocher successivement les différents ions sur la résine.

3. Mode opératoire

3.1. Description du produit pharmaceutique (Sargenor)

Nous nous proposons de séparer les deux acides aminés contenus dans un produit pharmaceutique : le Sargenor. Le Sargenor est un médicament prescrit pour les états de fatigue. Il se présente sous forme d’ampoules buvables de 5 mL contenant 0,5 g d'acide aspartique et d'arginine (l’ampoule contient aussi 0,01 g de conservateur que nous n’étudierons pas).

Acide aspartique R = -CH2-COOHpKa1 = 2,0 (COOH) ; pKa2 = 3,9 (R avec COOH) ;pKa3 = 10,0 (NH3

+)Arginine R = -(CH2)3-NH-C(=NH)(NH2)pKa1 = 1,8 (COOH) ; pKa2 = 9,0 (NH3

+) ;pKa3 = 13,2 (R avec iminium =NH2

+)

3.2. Séparation sur résine échangeuse d'ions

• Préparation des tubes Préparer un portoir de 11 tubes à essai. En remplir un avec 5 mL d’eau de manière à matérialiser le niveau de 5 mL.

• Addition du mélange à séparer Faire écouler doucement l’eau de la colonne jusqu’à assécher légèrement le dessus de la résine. En aucun cas, plus de 1 mm de résine ne doit être en contact avec l’air.Déposer 1 mL de Sargenor avec une pipette. Faire tomber les gouttes de la hauteur la plus faible possible afin de ne pas détruire la colonne de résine.Ouvrir la sortie de la colonne jusqu’à pénétration complète de l’échantillon tout en récupérant l’éluant dans le tube 1. Le débit de l’éluant doit être contrôlé à une goutte toutes les deux secondes. Ne pas laisser la résine s’assécher.

• Élution L’échantillon étant passé, arrêter l’élution et remplir le haut de la colonne avec la solution 1 (pH = 3,3). Ouvrir la sortie de la colonne et récupérer l’éluant dans les tubes 1, 2 et 3 tout en maintenant constant le débit (une goutte toutes les deux secondes). Au besoin rajouter de l’éluant.On recueille ainsi 15 mL de solution. Arrêter alors l’élution et éliminer par aspiration la solution 1 au-dessus de la résine. Remplir le haut de la colonne avec la solution 2 (pH = 12). Ouvrir la sortie de la colonne et recueillir dans les tubes 4 à 10 en maintenant le débit d’une goutte toutes les deux secondes. Le remplissage du tube 10 étant terminé, arrêter l’élution.

• Régénération de la colonne Éliminer par aspiration la solution 2 au-dessus de la résine. Remplir le haut de la colonne avec la solution 1 et ouvrir la sortie. Laver ensuite à l’eau jusqu’à neutralité de l’éluant sortant. La colonne est prête à servir de nouveau.

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3.3. Contrôle par chromatographie sur couche mince

• Préparation de la cuve L’éluant est un mélange éthanol : eau en rapport 16 : 7 en volume.En placer un fond dans la cuve, la refermer et attendre au minimum 5 minutes pour bien saturer la cuve en vapeur d'éluant.

• Préparation des témoins Il est nécessaire de réaliser trois témoins : le mélange initial (Sargenor), l'acide aspartique et l'arginine.Les témoins pour l'acide aspartique et l'arginine sont déjà prêts (une pointe du produit commercial dissous dans l'éluant).Pour réaliser le témoin du mélange initial, introduire deux gouttes de Sargenor dans un bécher de 10 mL puis 1 mL d'éluant.

• Préparation de la plaque et dépôt des échantillons Prendre deux plaques de gel de silice et tracer légèrement, au crayon à papier, un trait dans le sens de la largeur, à un centimètre du bord. Faire 13 encoches séparées de 5 mm (1 pour le mélange initial préalablement dilué, 2 pour les témoins et 10 pour les tubes).Faire des dépôts, à l’aide d’un capillaire, des solutions de chaque tube, du mélange et des témoins.Avant l'élution, regarder votre plaque sous UV. Des taches doivent apparaître, en particulier celles des trois témoins (si ce n'est pas le cas, en rajouter).

• É lution Il faut compter environ 15 minutes d’élution.

• Révélation Sous la hotte, avec des gants, introduire la plaque dans la solution de ninhydrine (révélateur spécifique des acides aminés).Poser les gants (sans toucher l’extérieur) et les jeter. Prendre la plaque avec une pince métallique et la chauffer sur une plaque à 120°C (sans la poser directement dessus). Au bout d’un certain temps, des taches apparaissent.

4. Compte-rendu

Q1 : Donner les domaines de prédominance des deux acides aminés avec les formules semi-développées correspondant aux différents domaines et l'écriture simplifiée (ex. H2A+).

Q2 : Commenter les valeur des pKa des fonctions acide carboxylique en α des fonctions amine.

Q3 : Expliquer le principe de la séparation (en particulier prévoir l’ordre de sortie des acides aminés).

Q4 : La résine utilisée DOWEX WX2 mesh 100-200 est-elle anionique ou cationique ?

Q5 : D'après la CCM, la séparation des deux acides aminés par la résine échangeuse d’ions a-t-elle réussie ?

Q6 : Identifier et calculer le Rf de chaque acide aminé.

Q7 : Expliquer l’ordre d’élution des acides aminés sur la plaque CCM.