TP Bi514 Physiologie Vegetale (2005-2006)

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TP Licence Biochimie

IBFALICENCE 3

Physiologie Intégrée (Bi514)

Enseignante: Annette BERTRAND,Unité Mixte de Recherche INRA-UCBN EVA

« Ecophysiologie Végétale, Agronomie et nutrition N, C, S »(Bâtiment IRBA, Campus 1)

http://www.rennes.inra.fr/umreva/

Travaux pratiques

MANIPULATION AETUDE DES HEMICELLULOSES ET DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO

ET EXO β - GLUCANASESETUDE DE L’ACTIVITE PECTINE METHYLESTERASE

MANIPULATION B

DOSAGE DE L'AMIDON ET DU GLUCOSEETUDE DES INVERTASES SOLUBLES

DOSAGE DE L'ASCORBATE ET DU DEHYDROASCORBATE

Hordeum vulgare L.



TP Licence 3 (Bi514)

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Préambule

L’objectif de ces deux séances de TP est de comparer deux typesde tissus foliaires : des tissus jeunes en croissance, non (ou peu)

photosynthétiquement actifs et des tissus adultes matures, photosynthétiquement très actifs. Ces deux types de tissus sontrespectivement des puits (importateurs nets de carbone) et des sources(exportateurs nets de carbone) pour le carbone. Cette comparaison sefera sur une poacée, l’orge ( Hordeum vulgare). Chez les poacées, lesfeuilles s’allongent presque exclusivement longitudinalement, le

méristème foliaire est situé à la base de la feuille. Les nouvelles feuillesapparaissent successivement entourées par les feuilles adultes.Lorsqu’une feuille atteint sa maturité, elle se dissocie en gaine foliaire(partie inférieure) et en limbe foliaire (partie supérieure) séparées par laligule (Figure 1).

Lors de ces manipulations, le limbe des feuilles adultes (tissu mature,source de carbone) sera comparé à la base des feuilles en croissance(puits pour le carbone). Chez ces deux types de tissus seront comparés :

- Les activités endo- et exo-β-glucanases.- L’activité pectine methylestérase- Les teneurs en protéines- Les teneurs en amidon et en glucose- Les activités invertasiques solubles acides et alcalines.- Les teneurs en ascorbate et dehydroascorbate

Un compte-rendu par binôme sera demandé à l’issu des deux séances deTP (à rendre pour le 9 novembre, dernier délai) qui comprendra :

- une introduction incluant les objectifs des manipulationseffectuées (quelques lignes)

- Les principes succincts des méthodes utilisées pour répondre àces objectifs (2 pages maximum)

- Les résultats brut obtenus (2 pages maximum)

- Les calculs détaillés (4 pages maximum)- Un tableau récapitulatif de l’ensemble des résultats obtenus

(voir modèle page suivante)

- Une discussion des différents résultats obtenus (2 pagesmaximum)

- Une conclusion (quelques lignes)

feuille en

croissance

racines

zone de croissancefoliaire de la feuille

en croissance

Figure 1 : représentation schématique d’une talle de Poacée.

Manip A

Manip B

gainefoliaire

limbefoliaire

ligulefeuilleadulte




3

Limbesmatures

Base desfeuilles en

croissance

Endoactivités endo- et exo-β-glucanases.

(µmol.h-1.g MF-1) Exo

Activité pectine methylestérase

(µmol.h-1

.g MF-1

)Teneur en protéines

(mg.g MF-1)

Teneur en amidon(mg.g MF-1)

Teneur en glucose(mg.g MF-1)

NeutreActivités invertasiquessolubles

(µmol.h-1.g MF-1) Acide

Teneur en ascorbate(mg.g MF-1)

Teneur en dehydroascorbate

(mg.g MF-1

)Rapport Ascorbate/Dehydroascorbate

Ce tableau est un modèle pour la rédaction du compte-rendu mais il peut également vous servir à cocher progressivement les différentesanalyses au fur et à mesure que vous les effectuez.

Manipulation A

Manipulation B




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MANIPULATION A

Etude des enzymes impliquées dans la dégradation des

hémicelluloses pariétales.

A.I. DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO β -GLUCANASES.

A.II. ETUDE DE LA PECTINEMETHYLESTERASE

A.III. DOSAGE DES PROTEINES

Figure 1 : Vue perspective d'une paroi disséquée montrant les différents niveaux

INTRODUCTION

La microscopie photonique a permis de distinguer plusieurs régions dans la paroi.

Vue perspective d'une paroi disséquée montrant les différents niveaux

- La lamelle moyenne est la formation la plus périphérique de la paroi, elle forme unciment constitué de polysaccharides acides, les pectines. Cette enveloppe hydrophile

polyanionique conditionne la cohésion intercellulaire.- Les niveaux plus internes de parois sont renforcés par une charpente cellulosique.Ces territoires pariétaux apparaissent comme autant de coques concentriques etindividuelles pour chaque cellule, dans lesquelles on distingue deux phases decomposés polysaccharidiques : une phase cristalline discontinue : la cellulose. Celle-ci apparaît chez les végétaux supérieurs sous forme de microfibrilles élémentaires dediamètre compris entre 30 et 40 Å et agencées en faisceaux.

On distingue la paroi primaire; il s'agit d'un réseau hydraté (jusqu'à 80%

d'eau dont la matière sèche renferme en majeure partie des polysaccharides (80-90%)associée à des protéines (10-15%) et des ions minéraux notamment du calcium. Leshémicelluloses représentent un fort pourcentage des polysaccharides et la charpentefibrillaire est relativement lâche. La paroi primaire est la seule enveloppe fibrillairedes cellules jeunes et en croissance. La propriété caractéristique est donc la plasticité.

Lorsque la croissance cesse, des assises nouvelles (appelées S1, S2, S3 dans lecas des cellules du bois du tilleul) sont élaborées: elles constituent la paroisecondaire inextensible. Cette paroi est peu hydratée (20 % ou moins d'eau). Lacharpente fibrillaire y est toujours compacte, la cellulose y est hautement cristalline.

Signalons cependant que certaines parois secondaires ont une architecture fibrillairenon constituée de cellulose, mais d'hémicellulose. Le cas est fréquent chez les algueset les champignons. Il se rencontre aussi chez les plantes supérieures, en particulier dans les cellules de l'albumen de graines qui stockent dans la paroi des polysaccharides de réserve (hémicelluloses).




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Extraits 1 Extraits 2 Etalons et blanc

2 tubes* 2 tubes* 5 tubes

Volumed’extrait (mL) 0 ,2 0,2 0,2

DTT 10 M (mL) 0,2 - -Tampon KP, pH8,5 (mL)

0,4 0,6 0,6

Réduction dudéhydroascorbateen ascorbate

15 mind’incubation àtempérature

ambiante NEM 0,5 %

(mL)

0,2 mL puis 1

min d’attente

- - Neutralisation du

DTT Eau distillée(mL)

- 0,2 0,2

TCA (mL) 1 1 1Acide phosphorique42 % (mL)

1 1 1

2,2’ dipyridil(mL)

0,8 0,8 0,8

FeCl3 (mL) 0,4 0,4 0,4

20 min à 40°C

Dosage del’ascorbate

Lire la DO à 525 nmExtraits 1sommet et basede feuille

Extraits 2sommet et base defeuilles

Etalons et blanc

*1 tube pour le l’extrait de limbes matures et 1 tube pour l’extrait de bases de feuilles encroissance.

PLAN DE TRAVAILMANIPULATION B

Binômes 5 et 6 :1- Préparer les échantillons pour le dosage de l’amidon et des sucres solubles.(extraction des glucides solubles et solubilisation de l’amidon).2- Réaliser l’extraction et l’hydrolyse enzymatique de l'amidon.3- Extraction des protéines pour la mesure des activités invertasiques.4- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits d’amidonhydrolysé5- Purification partielle des protéines pour les activités invertasiques.6- Démarrer les incubations enzymatiques pour les activités invertasiques (30min).

7- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate.8- Arrêt des incubations enzymatiques (invertases).9- Dosage de l'ascorbate et du déhydroascorbate.10- Préparer la gamme d'étalonnage pour le dosage du glucose libéré (activitésinvertases).11- Dosage du glucose (activités invertases).

Binômes 7 et 8 :1- Extraction des protéines pour la mesure des activités invertasiques.

2- Purification partielle des protéines pour les activités invertasiques.3- Démarrer les incubations enzymatiques pour les activités invertasiques (30min).4- Préparer les échantillons pour le dosage de l’amidon et des sucres solubles.(extraction des glucides solubles et solubilisation de l’amidon).5- Réaliser l’extraction et l’hydrolyse enzymatique de l'amidon.6- Arrêt des incubations enzymatiques (invertases).7- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits d’amidonhydrolysé8- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate.9- Dosage de l'ascorbate et du déhydroascorbate.10- Préparer la gamme d'étalonnage pour le dosage du glucose libéré(activitésinvertases).11- Dosage du glucose (activités invertases).

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