Técnicas ópticas aplicadas al estudio de procesos electrofisiológicos.

Nuevos desarrollos.

Determinación del Ca intracelular por métodos ópticos

• Medidas de absorción• Medidas de fluorescencia

x

I C

dI ∝ I C dx

dI = - k(λ) I C dx

I = Io e - k(λ) C X

log (I/Io) = 0.43 k(λ) C X

A = ε (λ) C X

ε (λ) M-1cm-1

Ley de Lambert y Beer

La fluorescencia es el resultado de la absorción y emisión de energía por el indicador fluorescente.

1er paso : Excitación por absorción de un fotón2do paso : En el estado excitado parte de la energía se disipa

como calor o vibraciones3er paso : Emisión de un fotón de menor energía

Iabs ∝ Io ε(λex) d [P]

F = Io ε(λex) d [P] φ(λ ex,λem)

Brillo ≡ ε(λex) φ(λ ex,λem)

F ∝ Iabs

Nro fotones emitidosNro fotones absorbidos

Fluo 3

Ca2+

Fluo-3

longitud de onda (nm)400 450 500 550 600 650

Fluo

resc

enci

a / a

bsor

banc

iaexcitaciónemisiónabsorbancia

F = a[ind] + b[ind-lig]

[Ind] . [lig] [Ind-lig]Kd = ---------------- [lig] = Kd --------------

[Ind-lig] [Ind]

Fmax = b indtot y Fmin = a indtot

¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?

F - Fmin[lig] = Kd --------------

Fmax - F

Ca indicator Mode Kd(nM)

Calcium Green-1 Em 530/Ex 488 190Calcium Green-5N Em 530/Ex 488 14000Fluo-3 Em 525/Ex 488 390Fluo-5N Em 520/Ex 488 90000Oregon Green 488 Bapta-1 Em 520/ex 488 20000

Indicadores raciométricos

Fura 2

Ca2+

Efecto del Ca sobre el espectro de excitación

detección a 510 nm

longitud de onda (nm)250 300 350 400 450

Fluo

resc

enci

a

0

20

40

60

80

100

120

alto Ca

0 Ca

358 nmpto. isosb.

Indicador raciométrico: Fura-2

F2 = a2[ind] + b2[ind-lig]

F1 = a1[ind] + b1[ind-lig]

F1R = -------

F2

[Ind-lig][lig] = Kd --------------

[Ind]

b1Rmax = -------

b2

a1Rmin = -------

a2

R - Rmin[lig] = Kd -------------- . γ

Rmax - R

a2γ = −−−

b2

¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?

• El pigmento debe presentar un corrimiento en el espectro de excitación o emisión al unir el ligandoespecífico.

• Se requiere medir la fluorescencia a dos longitudes de onda.

• La ventaja es que las medidas son independientesde la concentración del indicador, de la longitud del paso, de la intensidad de iluminación y del detector.

Medidas raciométricas

Ca2+ Indicator Mode Kd(nM)

Fura Red Ex 420/480 140Fura 2 Ex 340/380 145Indo-1 Em 405/480 Ex 360 230Mag-fura-2 Ex 340/380 25,000Fura-FF Ex 340/380 35,000

Indicadores raciométricos de Ca

• Fuente de excitación• Óptica adecuada para excitar y para medir• Filtros para seleccionar las λ de excitación y de emisión• Sistema de detección

Instrumentación

0 50 100 150 200

Fluo

resc

enci

a (m

V)

10

15

20

25

Tiempo (ms)0 50 100 150 200

[Ca2+

] (nM

)

0

100

200

300

400

[Ca2+] = KD* (R - Rmin)/(Rmax - R)

Microscopía de epifluorescencia

Microscopía confocal

Fluorescent Microscope

Objective

Arc Lamp

Emission Filter

Excitation Diaphragm

Ocular

Excitation Filter

Objective

Laser

Emission Pinhole

Excitation Pinhole

PMT

EmissionFilter

Excitation Filter

Confocal Microscope

PSF (Point spread function)

Confocal

Wide field

Scanning Galvanometers

x y

Laser in

Laser out

Point Scanning

ToMicroscope

xy scan

5 µm

0 4 8 1612 20 24 28

Sparks at high temporal resolution

F/F00 2.7

5 µm

0 4 8 1612 20 24 28

10 µm500 ms

Enhanced Green Fluorescence Protein

FRET (Fluorescence resonance energy transfer)

Miyaki et al. Nature, 388, 882-887

Proteínas “Camaleon”

Transfección EGFP

RyR1

RyR3

• Microscopía de dos fotones• STED• 4 Pi

OTRAS TECNICAS

University of Durban

Nature Biotechnology, vol 21 (11), 2003

Ventajas de la microscopía multifotón

• Poco scattering por la mayor λ de excitación• Mejor separación de las λ de excitación y emisión• Menor citotoxicidad• Menor blanqueo del pigmento• No es necesario el pinhole• Mayor profundidad

Three-dimensional reconstructed two-photon images of dermal and subcutaneous structures

Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000.

Stimulated emission depletion microscopy

STED

Fundamento STED

Se circuncribe la fluorescencia estimulando la emisión con un segundo pulso de mayor λ con forma de anillo.

Willig et al. Nature 2006http://www.mpibpc.gwdg.de/groups/hell/

Confocal

104 nm

244 nm

Klar et al. PNAS 2000

STED

Hell, PNAS, 2007

Microscopía 4 Pi

G.l.T lmaging & Microscopy 4/2004

G. l.T lmaging & Microscopy 4/2004