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Técnicas ópticas aplicadas al estudio de procesos electrofisiológicos.
Nuevos desarrollos.
Determinación del Ca intracelular por métodos ópticos
• Medidas de absorción• Medidas de fluorescencia
x
I C
dI ∝ I C dx
dI = - k(λ) I C dx
I = Io e - k(λ) C X
log (I/Io) = 0.43 k(λ) C X
A = ε (λ) C X
ε (λ) M-1cm-1
Ley de Lambert y Beer
La fluorescencia es el resultado de la absorción y emisión de energía por el indicador fluorescente.
1er paso : Excitación por absorción de un fotón2do paso : En el estado excitado parte de la energía se disipa
como calor o vibraciones3er paso : Emisión de un fotón de menor energía
Iabs ∝ Io ε(λex) d [P]
F = Io ε(λex) d [P] φ(λ ex,λem)
Brillo ≡ ε(λex) φ(λ ex,λem)
F ∝ Iabs
Nro fotones emitidosNro fotones absorbidos
Fluo 3
Ca2+
Fluo-3
longitud de onda (nm)400 450 500 550 600 650
Fluo
resc
enci
a / a
bsor
banc
iaexcitaciónemisiónabsorbancia
F = a[ind] + b[ind-lig]
[Ind] . [lig] [Ind-lig]Kd = ---------------- [lig] = Kd --------------
[Ind-lig] [Ind]
Fmax = b indtot y Fmin = a indtot
¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?
F - Fmin[lig] = Kd --------------
Fmax - F
Ca indicator Mode Kd(nM)
Calcium Green-1 Em 530/Ex 488 190Calcium Green-5N Em 530/Ex 488 14000Fluo-3 Em 525/Ex 488 390Fluo-5N Em 520/Ex 488 90000Oregon Green 488 Bapta-1 Em 520/ex 488 20000
Indicadores raciométricos
Fura 2
Ca2+
Efecto del Ca sobre el espectro de excitación
detección a 510 nm
longitud de onda (nm)250 300 350 400 450
Fluo
resc
enci
a
0
20
40
60
80
100
120
alto Ca
0 Ca
358 nmpto. isosb.
Indicador raciométrico: Fura-2
F2 = a2[ind] + b2[ind-lig]
F1 = a1[ind] + b1[ind-lig]
F1R = -------
F2
[Ind-lig][lig] = Kd --------------
[Ind]
b1Rmax = -------
b2
a1Rmin = -------
a2
R - Rmin[lig] = Kd -------------- . γ
Rmax - R
a2γ = −−−
b2
¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?
• El pigmento debe presentar un corrimiento en el espectro de excitación o emisión al unir el ligandoespecífico.
• Se requiere medir la fluorescencia a dos longitudes de onda.
• La ventaja es que las medidas son independientesde la concentración del indicador, de la longitud del paso, de la intensidad de iluminación y del detector.
Medidas raciométricas
Ca2+ Indicator Mode Kd(nM)
Fura Red Ex 420/480 140Fura 2 Ex 340/380 145Indo-1 Em 405/480 Ex 360 230Mag-fura-2 Ex 340/380 25,000Fura-FF Ex 340/380 35,000
Indicadores raciométricos de Ca
• Fuente de excitación• Óptica adecuada para excitar y para medir• Filtros para seleccionar las λ de excitación y de emisión• Sistema de detección
Instrumentación
0 50 100 150 200
Fluo
resc
enci
a (m
V)
10
15
20
25
Tiempo (ms)0 50 100 150 200
[Ca2+
] (nM
)
0
100
200
300
400
[Ca2+] = KD* (R - Rmin)/(Rmax - R)
Microscopía de epifluorescencia
Microscopía confocal
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Emission Filter
Excitation Diaphragm
Ocular
Excitation Filter
Objective
Laser
Emission Pinhole
Excitation Pinhole
PMT
EmissionFilter
Excitation Filter
Confocal Microscope
PSF (Point spread function)
Confocal
Wide field
Scanning Galvanometers
x y
Laser in
Laser out
Point Scanning
ToMicroscope
xy scan
5 µm
0 4 8 1612 20 24 28
Sparks at high temporal resolution
F/F00 2.7
5 µm
0 4 8 1612 20 24 28
10 µm500 ms
Enhanced Green Fluorescence Protein
FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
Miyaki et al. Nature, 388, 882-887
Proteínas “Camaleon”
Transfección EGFP
RyR1
RyR3
• Microscopía de dos fotones• STED• 4 Pi
OTRAS TECNICAS
University of Durban
Nature Biotechnology, vol 21 (11), 2003
Ventajas de la microscopía multifotón
• Poco scattering por la mayor λ de excitación• Mejor separación de las λ de excitación y emisión• Menor citotoxicidad• Menor blanqueo del pigmento• No es necesario el pinhole• Mayor profundidad
Three-dimensional reconstructed two-photon images of dermal and subcutaneous structures
Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000.
Stimulated emission depletion microscopy
STED
Fundamento STED
Se circuncribe la fluorescencia estimulando la emisión con un segundo pulso de mayor λ con forma de anillo.
Willig et al. Nature 2006http://www.mpibpc.gwdg.de/groups/hell/
Confocal
104 nm
244 nm
Klar et al. PNAS 2000
STED
Hell, PNAS, 2007
Microscopía 4 Pi
G.l.T lmaging & Microscopy 4/2004
G. l.T lmaging & Microscopy 4/2004
