Σηµειώσεις Βιοχηµείας Α (2007-2008) Ρύθµιση ενζύµων

1. Κύρια σηµεία

a. Τρόποι ρύθµισης της ενζυµικής δραστικότητας: i. Αντιστρεπτή µη-οµοιοπολική τροποποίηση (αλλοστερικός έλεγχος)

ii. Αντιστρεπτή οµοιοπολική τροποποίηση iii. Μη-αντιστρεπτή ενεργοποίηση (πρωτεόλυση) iv. Ενεργοποίηση ή καταστολή από άλλες πρωτεϊνες

b. Η έννοια της επανατροφοδοτικής αναστολής c. Ασπαρτική Τρανσκαρβαµυλάση: καλά µελετηµένο παράδειγµα αλλοστερικής ρύθµισης µε

επανατροφοδότηση d. Ρύθµιση της δραστικότητας ενζύµων µε αντιστρεπτή οµοιοπολική τροποποίηση e. Επίδραση της φωσφορικής οµάδας στην δοµή και την λειτουργία µιας πρωτεϊνης f. Ενεργοποίηση ενζύµου µε την αντιστρεπτή πρόσδεση ενός νουκλεοτιδίου: το παράδειγµα της

PKA g. Ρύθµιση της δραστικότητας ενζύµων µε µη-αντιστρεπτή πρωτεόλυση: προένζυµα (ζυµογόνα) –

ένζυµα. Παραδείγµατα: Οι πρωτεϊνες της πήξης του αίµατος, η ινσουλίνη, οι κασπάσες. h. Τα ενεργοποιηµένα ένζυµα αναστέλλονται ή ενεργοποιούνται προσδενόµενα σε άλλες

πρωτεϊνες (θρυψίνη-αναστολέας θρυψίνης, ελαστάση-α1 αντιθρυψίνη. i. Μεταλλάξεις στοην α1 αντιθρυψίνη προκαλούν εµφύσηµα λόγω υπερλειτουργίας της

ελαστάσης j. Καταρράκτης πήξης του αίµατος k. ∆οµή ινωδογόνου-ινώδους, δράση θροµβίνης. l. Ενεργοποίηση προθροµβίνης, ρόλος γ-καρβοξυγλουταµικού, βιταµίνης Κ και ασβεστίου. m. Τερµατισµός της πήξης του αίµατος-Ρόλος του ιστικού ενεργοποιητή του πλασµινογόνου

2. Βασικές έννοιες Α. Η έννοια της επανατροφοδοτικής αναστολής. Στην επανατροφοδοτική αναστολή έχουµε την αναστολή της δραστικότητας ενός ενζύµου από το προϊόν της αντίδρασης που καταλύει. Εάν η αντίδραση βρίσκεται στην αρχή µιας σειράς συνδεόµενων αντιδράσεων που αποτελούν ένα µεταβολικό µονοπάτι, µπορεί να συµβεί επανατροφοδοτική αναστολή από το τελικό προϊον αυτού του µονοπατιού.

Τυπικά παραδείγµατα επανατροφοδοτικής αναστολής αποτελούν: α) η αναστολή του ενζύµου αφυδρατάση της θρεονινης, το οποίο

καταλύει το πρώτο βήµα στο µονοπάτι βιοσύνθεσης του αµινοξέος ισολευκίνη, από την ισολευκίνη, το τελικό προϊόν του µονοπατιού και

β) η αναστολή του ενζύµου Ασπαρτική Τρανσκαρβαµυλάση, το οποίο καταλύει το πρώτο βήµα στο µονοπάτι βιοσύνθεσης των νουκλεοτιδίων των πυριµιδινών, από την CTP, το τελικό προϊόν του µονοπατιού.

1

Αριστερά: Τυπικό παράδειγµα επανατροφοδοτικής αναστολής από το τελικό προϊόν ενός µεταβολικού µονοπατιού.

2

Η επανατροφοδοτική αναστολή αποτελεί ένα επαναλαµβανόµενο µοτίβο στον µεταβολισµό και εξυπηρετεί την εξοικονόµηη ενέργειας και µεταβολιτών. Συµβαίνει κυρίως στο πρώτο βήµα ενός µεταβολικού µονοπατιού διότι αυτό είναι σηµείο που καθορίζει τον ρυθµό του µονοπατιού και για την αποφυγή των εποµένων βηµάτων όταν το τελικό προϊόν έχει συσσωρευθεί.

Β. Ασπαρτική Τρανσκαρβαµυλάση: καλά µελετηµένο παράδειγµα αλλοστερικής ρύθµισης µε επανατροφοδότηση. Αναστέλλεται από το τελικό προϊόν, την CTP και ενεργοποιείται από την ATP. Σηµασία ενεργοποίησης από την ΑΤΡ: Η συγκέντρωση της ΑΤΡ αποτελεί έναν δείκτη την ενεργειακής κατάστασης ενός κυττάρου. Υψηλά επίπεδα ΑΤΡ σηµαίνουν ότι το κύτταρο διαθέτει την απαιτούµενη ενέργεια για την βιοσύνθεση σύνθετων µορίων όπως τα νουκλεοτίδια. Επίσης, η ενεργοποίηση της ΑΤΚάσης από την ΑΤΡ γίνεται σε µια προσπάθεια εξισορρόπησης των επιπέδων των νουκλεοτιδίων των πουρινών και των πυριµιδινών αφού η ΑΤΡ είναι ένα νουκλεοτίδιο πουρίνης και η CTP ένα νουκλεοτίδιο πυριµιδίνης.

Η ΑΤΚάση είναι ένα αλλοστερικό ένζυµο και όπως όλα τα αλλοστερικά ένζυµα µπορεί να βρεθεί σε δυο διαµορφώσεις: την Τ (Tight = σφικτή) µε χαµηλή δραστικότητα και την R (Relaxed = χαλαρή) µε υψηλή δραστικότητα. Υπάρχει µια ισορροπία µεταξύ των καταστάσεων Τ και R η οποία µπορεί να µετατοπιστεί προς την µια ή την άλλη πλευρά ανάλογα µε την παρουσία υποστρωµάτων ή αναστολέων. Τα υποστρώµατα της ΑΤΚάσης µετατοπίζουν την ισορροπία προς την πλευρά της R ενώ οι αναστολείς (όπω; Π.χ. η CTP) προς την πλευρά της Τ . Σιγµοειδής καµπύλη κινητικής της ΑΤΚάσης. Η ΑΤΚάση ακολουθεί σιγµοειδή κινητική µε συντελεστή αλληλεπίδρασης n = 6. H CTP προκαλεί µετατόπιση της καµπύλης προς τα δεξιά ενω η ΑΤΡ προς τα αριστερά. Μοντέλα αλλοστερικής ρύθµισης: Η ΑΤΚάση ακολουθει το εναρµονισµέο µοντέλο αλλοστερικής ρύθµσης σύµφωνα µε το οποίο η µετατροπή κάθε υποµονάδας του ενζύµου από την κατάσταση Τ στην R από το υπόστρωµα γίνεται µε εναρµονισµένο τρόπο και όχι ανεξάρτητα. ∆ηλαδή, το ένζυµο αποκτά ταυτόχρονα την κατάσταση R µε την δέσµευση του υποστρώµατος έστω και σε µια µόνο υποµονάδα. Αντίθετα, το µοντέλο της ακολουθίας υποστηρίζει ότι η µετάβαση των υποµονάδων ενός αλλοστερικού ενζύµου από την κατάσταση T στην R γίνεται σταδιακά δηλαδή η πρόσδεση του υποστρώµατος στην µια υποµονάδα προκαλεί την ενεργοποίηση µόνο της συγκεκριµένης υποµονάδας αλλά υποβοηθεί την ενεργοποίηση και των υπολοίπων υποµονάδων. Γίνεται µια σταδιακή µετάβαση στην κατάσταση R η οποία ολοκληρώνεται µόλις καλυφθούν όλες οι υποµονάδες από µόρια υποστρώµατος. Γ. Ρύθµιση της δραστικότητας ενζύµων µε αντιστρεπτή οµοιοπολική τροποποίηση

Τα ένζυµα ρυθµίζονται και µε αντιστρεπτή οµοιπολική τροποίηση όπως π.χ. η φωσφορυλίωση καταλοίπων σερίνης, θρεονίνης και τυροσίνης από εξειδευµένα ένζυµα που ονοµάζονται κινάσες. Η αποκάκρυνση του φωσφορικού επιτελείται επίσης από εξειδεκυµένα ένζυµα που ονοµάζονται φωσφατάσες. Για κάθε κινάση υπάρχει τουλάχιστον µια φωσφατάση. Τα έζυµα αυτά αναγνωρίζουν ειδικές ακολουθίες στην αµινοξική ακολουθία µιας πρωτεϊνης και έτσι στοχεύουν συγκεκριµένα κατάλοιπα.

Τυπικό παράδειγµα ενεργοποίησης µιας πρωτεϊνης µε φωσφορυλίωση αποτελεί η

φωσφορυλάση του γλυκογόνου η οποία καταλύει την αποικοδόµηση του γλυκογόνου σε 1-Ρ γλυκόζη. H φωσφορυλάση του γλυκογόνου ενεργοποιείται σε καταστάσεις έλλειψης γλυκόζης ως απόκριση στην ορµόνη γλυκαγόνη. Το σήµα της έλλειψης γλυκόζης στο αίµα µεταβιβάζεται µέσα στα κύτταρα µέσω ενός σηµατοδοτικού µονοπατιού που περιλαµβάνει µια σειρά από φωσφορυλιώσεις πρωτεϊνών µε τελεταίο το ένζυµο φωσφορυλάση του γλυκογόνου. Ετσι, το κύτταρο χρησιµοποιεί τα αποθέµατα γλυκόζης για να εξασφαλίσει την απαραίτητη ενέργεια (η γλυκόζη στη συνέχεια θα οξειδωθεί µέσω της γλυκόλυσης σε πυροσταφυλικό). Πάνω: Το παράδειγµα της ρύθµισης της ενεργότητας της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου µε φωσφορυλίωση-αποφωσφορυλίωση. Γιατί φωσφορυλίωση; •Πρόσθεση 2 επιπλέον αρνητικών φορτίων, σχηµατισµός νέων ενδοµοριακών αλληλεπιδράσεων, αλλαγή στην στερεοδιαµόρφωση του ενζύµου. •∆ηµιουργίαν έων δεσµών υδρογόνου, σχηµατισµός νέων αλληλεπιδράσεων µέσα και έξω από το µόριο. •Παρέχεται ελεύθερη ενέργεια στο σύστηµα (ο φωσφοεστερικός δεσµός που σχηµατίζεται είναι δεσµός υψηλής ενέργειας). •Με τις φωσφορυλιώσεις έχουµε σηµαντική ενίσχυση του αρχικού σήµατος (σε σηµατοδοτικά µονοπάτια). •Το ΑΤΡ είναι δείκτης ενεργειακού φορτίου (σύνδεση ενεργειακής κατάστασης µε την ρύθµιση του µεταβολισµού).

3

4

∆. Ενεργοποίηση ενζύµου µε την αντιστρεπτή πρόσδεση ενός άλλου µορίου: το παράδειγµα της PKA.

Η αντιστρεπτή, µη-οµοιοπολική, πρόσδεση ενός µορίου όπως π.χ. ενός νουκλεοτιδίου σε ένα αλλοστερικό ένζυµο δηµιουργεί επιπρόσθετους δεσµούς και ως αποτέλεσµα αλλάζει την στερεοδιαµόρφωση του ενζυµου. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση ή την µείωση της ενεργότητάς του. Τυπικά παραδείγµατα αποτελούν οι ενεργοποιήσεις πρωτεϊνικών κινασών από κυκλικά νουκλεοτίδια όπως το κυκλικό ΑΜΡ (cAMP) και το κυκλικό GMP (cGMP) τα οποία δηµιουργούνται ως απόκριση σε ορµόνες.

Στην περίπτωση της πρωτεϊνης κινάσης Α (PKA), έχουµε ρύθµιση της ενεργότητας του ενζύµου από τον διαχωρισµό των υποµοναδων σε ρυθµιστικές και καταλυτικές (όµοια µε την ΑΤΚάση). Οταν τα επίπεδα του cAMP µέσα στο κύτταρο είναι χαµηλά, οι ρυθµιστικές υποµονάδες ενώνονται µε τις καταλυτικές και τις απενεργοποιούν. Το cAMP ενώνεται στις ρυθµιστικές υποµονάδες και προκαλεί τον διαχωρισµό τους από τις καταλυτικές. Ετσι, οι καταλυτικές υποµονάδες είναι πια ελεύθερες να φωσφορυλιώσουν τα υποστρώµατά τους. Ε. Ρύθµιση της δραστικότητας ενζύµων µε µη-αντιστρεπτή πρωτεόλυση: προένζυµα (ζυµογόνα) – ένζυµα.

Ορισµενες πρωτεϊνες ενεργοποιούνται µε πρωτεολυτική διάσπαση από πρωτεάσες σε περισσότερα πολυπεπτίδια. Αυτή η διάσπαση έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία νέων άκρων τα οποία συµµετέχουν σε νέους ενδοµοριακούς δεσµούς. Αυτή η τροποποίηση είναι µη-αντιστρεπτή. Παραδείγµατα: Οι πρωτεϊνες της πέψης, της πήξης του αίµατος, η ινσουλίνη και οι κασπάσες.

Τα ενεργοποιηµένα ένζυµα αναστέλλονται ή ενεργοποιούνται προσδενόµενα σε άλλες πρωτεϊνες (θρυψίνη-αναστολέας θρυψίνης, ελαστάση-α1 αντιθρυψίνη, θροµβινη-αντιθροµβίνη). Σηµασία του αναστολέα της θρυψίνης: εµποδίζει την πρόωρη ή την άσκοπη ενεργοποίηση των πρωτεολυτικών ενζυµων στο πάνκρεας και την ανάπτυξη πανκρεατίτιδας.

Η α1 αντιθρυψίνη είναι αναστολέας της ελαστάσης, ενός πρωτεολυτικού ενζύµου που εκκρίνεται από τα ουδετερόφιλα. Μεταλλάξεις στην α1 αντιθρυψίνη προκαλούν εµφύσηµα λόγω υπερλειτουργίας της ελαστάσης. Προδιάθεση για εµφύσηµα προκαλεί επίσης και η οξείδωση της µεθειονίνης 358 του αναστολέα της ελαστάσης από το κάπνισµα. Καταρράκτης πήξης του αίµατος: ∆υο πορείες που συνεργάζονται µεταξύ τους (εξωγενής και ενδογενής) και καταλήγουν σε µια κοινή πορεία η οποία περιλαµβάνει την µετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου σε αδιάλυτο ινώδες. Αντίδραση γλουταµινάσης: προκαλεί διασυνδέσεις µεταξύ των µορίων του ινώδους (δηµιουργία αµιδικών δεσµών µεταξύ των πλευρικών αλυσίδων γλουταµίνης και λυσίνης. Ενεργοποίηση προθροµβίνης: γίνεται µε πρωτεόλυση. Η προθροµβίνη περιέχει στο Ν-τερµτικό της τµήµα ασυνήθιστα κατάλοιπα γ-καρβοξυγλουταµικού τα οποία σχηµατίζονται από ένζυµα που εξαρτώνται από την βιταµίνης Κ. Ο ρόλος του γ-καρβοξυγλουταµικού είναι να δεσµεύει το ασβέστιο και να προκαλεί την πρόσδεση της προθροµβίνης στις µεµβράνες των αιµοπεταλίων όπου υπάρχουν οι πρωτεϊνες της πήξης του αίµατος. Η πρωτεόλυση της προθροµβίνης, που συµβαίνει σε δυο θέσεις στο εσωτερικό του µορίου, απελευθερώνει την θροµβίνη από τις µεµβράνες. Αναστολείς της βιταµίνης Κ προκαλούν θανατηφόρο αιµοραγία.

5

Ο τερµατισµός της πήξης του αίµατος γίνεται από την πλασµίνη η οποία διαλυτοποιεί το ινώδες.Η πλασµίνη ενεργοποιείται από τον ιστικό ενεργοποιητή του πλασµινογόνου (ΤΡΑ), µια πρωτεϊνη η οποία χορηγείται σε ασθενεις µε έµφραγµα για την διαλυτοποίηση των θρόµβων. 3. Ερωτήσεις εµπέδωσης 1. Τι µοντέλο αλλοστερικής συµπεριφοράς ακολουθεί η ΑΤΚαση; 2. Πως ενεργοποιείται η χυµοθρυψίνη; Τι αλλαγές συµβαίνουν στην δοµή του µορίου και τι συνέπειες έχουν; 3. Αναφέρατε ορισµένους τρόπους ρύθµισης της δραστικότητας ενός ενζύµου µε αντιστρεπτή οµοιοπολική τροποποίηση και δώστε ένα συγκεκριµένο παράδειγµα. 4. Ποιος είναι ο ρόλος της πλασµίνης και του ιστικού ενεργοποιητού του πλασµινογόνου (ΤΡΑ) στην λύση του θρόµβου; 5. Πως δρά η ηπαρίνη ως αντιπηκτικό; 6. Ποιός είναι ο φυσιολογικός ρόλος του αναστολέα της πανκρεατικής θρυψίνης και τι αποδείξεις υπάρχουν για την σηµασία του;