PENETAPAN KADAR β-KAROTEN DALAM BUAH...

Seminar Nasional PATPI ( Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia, Jakarta, 3-4 November 2009 1

PENETAPAN KADAR β-KAROTEN DALAM BUAH PAPRIKA MERAH, KUNING DAN HIJAU (Capsicum annuum var. annuum L.)

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Diana Serlahwaty1, Yunahara Farida1, dan Tri Asriyana1

1Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jagakarsa Jakarta 12640,www.univpancasila.ac.id Diana Serlahwaty " <[email protected]>

ABSTRAK

Perubahan gaya hidup masyarakat yang cenderung tidak sehat menyebabkan di dalam tubuh

banyak terkandung radikal bebas yang dapat mengakibatkan berbagai penyakit terutama penyakit degeneratif. Untuk melindungi tubuh dari serangan radikal bebas tersebut, maka tubuh memerlukan antioksidan seperti β-karoten. Salah satu sayur yang mengandung β-karoten adalah paprika, yang dibedakan atas paprika merah, paprika kuning dan paprika hijau. Berdasarkan warnanya, maka kandungan β-karoten yang terdapat dalam paprika juga berbeda-beda. Untuk mengetahui kandungan β-karoten dalam paprika, pada penelitian paprika diekstraksi terlebih dahulu dengan petroleum eter selanjutkan ditetapkan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom C18 dan fase gerak kloroform–tetrahidrofuran–metanol (70:25:5) dengan laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 450 nm. Kandungan β-karoten dalam paprika merah, kuning dan hijau berturut-turut adalah 264,34 bpj ; 15,95 bpj dan 0,50 bpj; dan memberikan ketelitian dengan nilai koefisien variasi < 2% yaitu paprika merah 0,0045%, paprika kuning 0,9614% dan paprika hijau 0,8154 %; dengan batas deteksi dan batas kuantitasi dari β-karoten adalah 0.0259 bpj dan 0.0864 bpj. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode ini dapat digunakan untuk penetapan kadar β-karoten dalam paprika.

Kata kunci : β-karoten, paprika, penetapan kadar, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

ABSTRACT

It is inevitable that the life style changes from healthy to unhealthy style in our society may

result in the increased level of free radicals in our body that can trigger various diseases, espcially degenerative diseases. In order to protect body from free radical attack, body requires antioxidant agent like β-caroten. One of vegetables containing β-caroten is pepper. The content of β-caroten in pepper is different according to its color. In this research, β-caroten in pepper is extracted previously with petroleum eter. The content of β-caroten in extract is then determined using high performance liquid chromatography using column C18 with the eluent of chloroform - tetrahydrofuran-methanol (70:25:5) w/ flow rate of 1 mL/minute and wave length of 450 nm. The result shows that β-caroten content in red, yellow & green pepper are 264.34 bpj, 15.95, 0.50 bpj respectively. In addition, the result shows precision with coefficient of variation < 2% as seen in red pepper (0.0045%), yellow pepper (0.9614%) and green pepper (0.8154%) with limit of detection and limit of quantification of β-caroten are 0.0259 bpj and 0.0864 bpj.

Keywords : β-caroten, pepper, concentration determination, high performance liquid chromatography


PENDAHULUAN

Antioksidan belakangan ini banyak dibicarakan bukan hanya di kalangan ilmuwan tetapi masyarakat pun kini semakin menyadari kehebatannya. Selain dikenal sebagai senjata ampuh untuk menangkal berbagai penyakit antioksidan juga dipercaya bisa membuat awet muda. Seiring dengan perkembangan zaman, menimbulkan perubahan pada gaya hidup masyarakat yang cenderung menjalani gaya hidup yang tidak sehat seperti merokok, minum minuman keras, mengkonsumsi junk food dan terkena paparan sinar ultraviolet secara berlebihan. Akibat dari gaya hidup tersebut, di dalam tubuh banyak terkandung radikal bebas yang sangat membahayakan tubuh. Senyawa radikal bebas ini dapat terbentuk akibat dari proses kimia yang terjadi di dalam tubuh, seperti proses oksidasi, metabolisme dan peradangan. Dalam jumlah tertentu radikal bebas dibutuhkan sebagai bagian dari pertahanan tubuh. Namun pada kenyataannya radikal bebas sering terbentuk melebihi kebutuhannya sehingga peranannya berubah menjadi jahat atau desktruktif (merusak) yang dapat menyebabkan berbagai penyakit seperti pengerasan pembuluh darah, jantung koroner, stroke, kanker dan penuaan dini. Untuk melindungi tubuh dari serangan radikal bebas, maka tubuh memerlukan antioksidan, antara lain terdiri dari β-karoten, vitamin E, vitamin C dan selenium (Kumalaningsih, 2008). β-karoten merupakan salah satu antioksidan yang dapat mencegah penyakit. Senyawa antioksidan ini mampu menetralisir zat-zat radikal bebas dalam tubuh yang merupakan sumber pemicu timbulnya berbagai penyakit terutama penyakit degeneratif. Secara alamiah β-karoten banyak terdapat pada buah-buahan seperti wortel, labu merah, buah merah, semangka, mangga, tomat, melon dan terdapat juga pada cabe. Salah satu cabe yang mengandung β-karoten adalah paprika. Paprika digolongkan kelompok cabe manis (sweet chilli peper). Paprika dibedakan atas paprika merah, paprika kuning dan paprika hijau. Berdasarkan warnanya, maka kandungan β-karoten yang terdapat pada paprika juga berbeda-beda (Astawan, 2008).

Dengan perbedaan kandungan β-karoten dalam paprika dan mengingat β-karoten adalah senyawa antioksidan yang bermanfaat maka

untuk mengetahui kandungan β-karoten diperlukan metode untuk menentukan kadarnya.

Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar paprika menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi dengan menggunakan fase balik. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode yang tepat dan teliti dalam penetapan kadar β-karoten pada paprika, serta mengetahui kandungan β-karoten yang paling tinggi dari paprika merah, kuning dan hijau.

BAHAN DAN METODE

BAHAN Buah paprika merah, kuning dan hijau

yang diperoleh dari Giant Botani Square Bogor, bahan baku β-karoten, kloroform p.a, tetrahidrofuran (THF), metanol, petroleum eter p.a, Aquabides, Acetonitril. ALAT

Kromatografi cair kinerja tinggi (Agilent 1100 series), Spektrofotometer ultraviolet – cahaya tampak (Analytic Jena specord 200), Timbangan analitik (Sartorius Dragon), Timbangan mikro (Sartorius Dragon), Blender (Philips), Rotavapor (Buchi V-800), Corong pisah, Alat – alat gelas, Kertas saring Whatman no 40 METODE 1. Penetapan kondisi optimum KCKT a. Penetapan panjang gelombang

serapan maksimum β-karoten Sejumlah 10 mg β-karoten dimasukkan ke dalam labu tentukur 50-mL larutkan dan encerkan dengan kloroform hingga tanda. Kemudian dipipet sejumlah 2,5 mL dimasukkan ke dalam labu labu tentukur 10-mL diencerkan dengan kloroform sampai tanda. Selanjutnya dibuat spektrum menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 420- 600 nm.

b. Pemilihan fase gerak dan laju alir Sejumlah 10 mg β-karoten dimasukkan ke dalam labu tentukur 50-mL larutkan dan encerkan dengan kloroform hingga


tanda. Kemudian dipipet sejumlah 2,5 mL dimasukkan ke dalam labu labu tentukur 10-mL diencerkan dengan kloroform sampai tanda. Suntikkan sejumlah 20 µl ke dalam alat KCKT menggunakan fase gerak metanol -kloroform (94:6); metanol–tetrahidrofuran–air (67:27:6); kloroform-tetrahidrofuran-air (67:27:6); asetonitril-kloroform (92:8); dan kloroform-tetrahidrofuran-metanol (70:25:5) dengan laju alir 0,5 mL/menit dan 1 mL/menit. Fase gerak dan laju alir yang dipilih adalah yang memberikan pemisahan terbaik dengan waktu retensi yang tidak terlalu lama.

2. Identifikasi β-karoten dalam paprika

merah, kuning dan hijau. • Pembuatan ekstrak :

Paprika segar yang telah dipotong-potong dan dihaluskan, ditimbang sejumlah 10 g (paprika merah), 50 g (paprika kuning), dan 100 g (paprika hijau), diekstraksi menggunakan petroleum eter, kemudian disaring. Residu dibilas dengan petroleum eter. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotavapor pada suhu 400 C. Kemudian dilarutkan dengan 10,0 ml kloroform.

• Pembuatan larutan baku : Sejumlah 10 mg β-karoten dimasukkan ke dalam labu tentukur 50-mL larutkan dan encerkan dengan kloroform hingga tanda. Kemudian dipipet sejumlah 2,5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 10-mL diencerkan dengan kloroform sampai tanda..

• Cara identifikasi : Masing-masing larutan uji disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT, kemudian dibandingkan waktu retensinya dengan waktu retensi baku β-karoten.

3. Uji linearitas Uji linearitas dilakukan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi dengan luas puncak. Satu seri larutan baku β-karoten dibuat dengan konsentrasi 5; 10; 20; 30; 40; 50; 60 dan 70 bpj. Kemudian masing-masing larutan disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT, selanjutnya dibuat kurva hubungan antara konsentrasi sebagai sumbu X dan luas puncak sebagai sumbu Y.

Kemudian dibuat persamaan garis regresi dan dihitung nilai korelasinya.

Persamaan garis : y = a + bx 4. Uji Batas deteksi dan batas

kuantitasi Uji batas deteksi dan batas kuantitasi

dilakukan untuk mengetahui kadar terendah yang masih dapat di deteksi oleh alat.

Sejumlah 10 mg β-karoten dimasukkan ke dalam labu tentukur 50-mL larutkan dan encerkan dengan kloroform hingga tanda. Dipipet 1 mL larutan kedalam labu tentukur 10-mL diencerkan dengan kloroform sampai tanda (10 bpj). Dipipet 0,5 mL larutan diencerkan kloroform sampai 10,0 mL (0.5 bpj). Sejumlah 20 µl larutan disuntikkan sebanyak 10 kali ke dalam alat KCKT, kemudian diukur luas puncaknya dengan kondisi KCKT yang optimum, selanjutnya dihitung nilai simpangan baku relatifnya.

5. Analisis kuantitatif secara kromatografi cair kinerja tinggi

a. Uji kesesuaian sistem Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk mengetahui apakah alat, metode dan kondisi membentuk sistim analisis tunggal. Sejumlah 20 µl larutan baku β-karoten disuntikkan sebanyak 5 kali ke dalam alat KCKT, kemudian diukur luas puncaknya dengan kondisi KCKT yang optimum, selanjutnya dihitung nilai simpangan baku relatifnya.

b. Penetapan kadar β-karoten dalam ekstrak paprika merah, kuning dan hijau secara KCKT. Larutan uji dan larutan baku di sonikasi selama 10 menit. Masing-masing disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT dan diukur luas puncaknya dengan kondisi KCKT yang optimum. Kadar β-karoten ekstrak paprika merah, kuning dan hijau dihitung menggunakan rumus :


Kadar (µg/g) = B

VfpCb(Au/Ab) L×××

dimana : Au = Luas puncak larutan uji Ab = Luas puncak larutan baku Cb = Konsentrasi betakaroten (µg/ml) Fp = Faktor pengenceran (ml) VL = Volume contoh (ml) B = Bobot contoh yang ditimbang (g)

6. Uji Perolehan Kembali

a. Pembutan larutan baku Sejumlah 10 mg β-karoten dimasukan ke dalam labu tentukur 100-ml, dilarutkan dan diencerkan dengan fase gerak sampai tanda (100 bpj).

b. Larutan uji Ke dalam dua labu tentukur 10-mL dipipet sejumlah 1,0 mL larutan paprika merah dan kuning. Kemudian ke dalam labu tentukur pertama ditambahkan 1,0 mL larutan baku 100 bpj, labu tentukur kedua ditambahkan 2,0 mL larutan baku. 100 bpj. Untuk paprika hijau, ke dalam dua labu tentukur 5-mL dipipet 1,0 mL larutan. Ke dalam labu tentukur pertama ditambah-kan 1,0 larutan baku 20 bpj.. Ke dalam labu tentukur kedua ditambahkan 2,0 ml larutan baku 20 bpj.. Pengerjaan selanjutnya sama seperti pada penetapan kadar, persen perolehan kembali dihitung dengan rumus :

% Perolehan kembali = Ab

AsAt − %100×

dimana : At = Luas puncak total (paprika + baku β-karoten) As = Luas puncak paprika

Ab = Luas puncak baku β-karoten

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis kualitatif β-karoten secara KCKT pada ekstrak paprika diperoleh waktu retensi yang mendekati waktu retensi baku β-karoten. Hasil identifikasi β-karoten dapat dilihat pada gambar 1, 2, 3 dan 4.

Gambar 1. Kromatogrm baku β-karoten dengan waktu retensi 1.392 menit

Gambar 2. Kromatogram paprika merah dengan waktu retensi 1.321 menit

Gambar 3. Kromatogram ekstrak paprika kuning dengan waktu retensi 1.329 menit

Gambar 4. Kromatogram ekstrak paprika hijau dengan waktu retensi 1.377 menit

Dari hasil penetapan kondisi optimum, menunjukan bahwa β-karoten memberikan serapan maksimum pada panjang


gelombang 450 nm. Berdasarkan hasil percobaan, perbandingan yang terbaik adalah kloroform–tetrahidrofuran–metanol (70: 25:5) dengan laju alir 1 mL/menit, karena waktu retensinya lebih cepat dan resolusinya baik. Hasil penetapan panjang gelombang dapat dilihat pada Gambar 5; hasil pemilihan fase gerak dan laju alir terlihat pada Gambar 6 dan 7.

Gambar 5. Spektum serapan UV-Vis larutan β-karoten dalam kloroform

:

Gambar 6. Kromatogram β-karoten dengan fase gerak kloroform–tetrahidrofuran–metanol (70:25:5) dengan laju alir 0,5 ml/menit

Dengan laju alir 0,5 ml/menit β-karoten dapat terpisah pada waktu retensi 2,815 menit

Gambar 7. Kromatogram β-karoten dengan fase gerak kloroform–tetrahidrofuran–metanol (70: 25:5)

dengan laju alir 1 ml/meni

Dengan laju alir 1 ml/menit β-karoten dapat terpisah pada waktu retensi 1,392 menit. Dari hasil uji linearitas (Tabel 1), diperoleh nilai r untuk larutan baku β-karoten sebesar 0,9971. Nilai r tersebut menunjukkan nilai yang ideal karena mendekati 1, sehingga koefisien korelasi antara konsentrasi larutan dengan luas puncak yang

terdeteksi oleh KCKT adalah baik dan dapat digunakan untuk penelitian.

Tabel 1. Hasil uji linearitas β-karoten

Zat Konsentrasi

(bpj) Luas

puncak Persamaan

garis r

β-karoten

0,5 10 20 30 40 50 60 70

41,08029 723,80725

1291,97137 1937,96130 2286,79224 2961,18555 3747,17236 4038,92041

y = 97,8110 + 57,9194 x

0,9971

Dari uji batas deteksi didapat bahwa β-karoten dapat di deteksi pada batas deteksi 0,0259 bpj dan batas kuantitasi 0,0864 bpj (Tabel 2).

Tabel 2. Hasil uji batas deteksi dan batas kuantitasi

No Waktu retensi

Luas puncak

Luas puncak rata-rta

SB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1,386 1,373 1,380 1,392 1,383 1,385 1,381 1,391 1,381 1,383

41,08029 40,58343 39,41661 39,97801 40,05453 39,82533 39,57833 40,00523 40,46229 40,42456

40,14086 0,5006

Hasil uji kesesuaian sistem ternyata alat KCKT dapat digunakan untuk menganalisis β-karoten (Tabel 3).

Tabel 3. Hasil uji kesesuaian sistem β-karoten

Zat Waktu retensi

Luas puncak

Luas puncak rata-rata

SB SBR

β-karoten

1.403 1.407 1.397 1.396 1.400

3066.96753 3071.12598 3054.82788 2969.04687 3042.79639

3040.95

41.6940

1.3711

Dari hasil penetapan kadar ekstrak paprika diperoleh kadar rata-rata paprika merah 264,34 µg/g, simpangan baku 0.01, koefisien variasi 4,5 x 10-3%; kadar rata-rata paprika kuning 15,95 µg/g, simpangan baku 0,15; koefisien variasi 0,96% dan kadar rata-rata paprika hijau 0,50 µg/g, simpangan baku 4,1x10-3, koefisien variasi 0,82 %. (Tabel 4)


Tabel 4. Hasil penetapan kadar β-karoten dalam ekstrak paprika

Zat

Bobot

Luas

puncak

Kadar

(µg/ml)

Kadar rata-rata

(µg/g)

SB KV (%)

β-karoten 10 mg 3040,18555 52,5370

Paprika merah

10,2597 10,2013 10,2271 10,2628 10,2490

15432,3 15843,4 15564,7 15776,1 15720,4

259,8673 268,3172 262,9322 265,5763 264,9950

264,34

0,01

0,03

Paprika kuning

50,1321 50,2103 50,1405 50,1302 50,2055

4698,04297 4610,35205 4591,05859 4605,39502 4658,81738

16,9313 16,5894 16,5429 16,5980 16,7653

15,95

0,15

0,94

Paprika hijau

100,7135 100,7012 100,6971 100,7005 100,7312

292,25864 286,75555 290,45710 291,15686 292,93454

0,5013 0,4929 0,4983 0,4995 0,5024

0,50

4,1 x 10

-3

0,82

Keterangan: volume yang digunakan 10,0 mL; paprika yang ditimbang dalam gram; KV = koefisien variasi

Hasil uji perolehan kembali didapat nilai rata-rata perolehan kembali paprika merah 99,88 % (thitung 1,1499); paprika kuning 100,04% (thitung 1,5811) dan paprika hijau 100,02% (thitung 0,3514) nilai ini lebih kecil dibandingkan ttabel yaitu 2,262 untuk jumlah pengukuran n =10 dengan db=9 dan p = 0,05 dengan demikian metode KCKT dapat digunakan untuk penetapan kadar β-karoten dalam paprika (Tabel 5).

Tabel 5. Hasil uji perolehan kembali paprika Sampel

Vol. sampel

Vol β-karoten yang

di+kan

Luas puncak

Perolehan kembali

(%) X

SB

Paprika hijau

1,0

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

138,93291 138,92981 139,02925 139,07408 139,03300 208,27136 208,14471 208,58675 208,97243 208,44681

99,8668 99,8612

100,0154 100,0846 100,0201 99,9052 99,8180

100,1402 100,4278 100,0359

100,02

0,18

Paprika kuning

1,0

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

921,36389 920,46277 921,04047 921,33917 921,64618

1374,33020 1374,34460 1374,29468 1374,81372 1373,44092

100,1065 99,9154

100,0379 100,1012 100,1664 100,0332 100,0347 100,0293 100,0855 99,9370

100,04

0,08

Paprika merah

1,0

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

2683,03320 2688,76050 2685,03857 2685,63013 2684,63452 3139,67505 3140,84009 3138,02637 3140,30835 3138,31812

99,2685 100,4831 99,6938 99,8192 99,6081

100,0033 100,1293 99,8250

100,0718 99,8566

99,88

0,33

KESIMPULAN 1. Metode kromatografi cair kinerja tinggi

menggunakan fase diam zorbak C18, Fase gerak campuran kloroform–tetrahidrofuran–metanol (70:25:5), laju alir 1,0 ml/menit dengan detektor cahaya tampak (visibel) pada panjang gelombang 450 nm pada penetapan kadar β-karoten dalam paprika merah, kuning dan hijau merupakan metode dengan ketelitian dan ketepatan yang memenuhi persyaratan

2. Metode kromatografi cair kinerja tinggi

untuk penetapan kadar β-karoten dalam paprika merupakan metode analisis kuantitatif yang memberikan ketelitian yang baik dengan koefisien korelasi (r) 0,9971, juga memberikan ketepatan yang baik dengan hasil uji perolehan kembali paprika merah 99,88 % (thitung 1,1499); paprika kuning 100,04 % (thitung 1,5811) dan paprika hijau 100,02% (thitung 0,3514) nilai ini lebih kecil dari ttabel 2,262. Batas deteksi dan batas kuantitasi dari β-karoten adalah 0,0259 bpj dan 0,0864 bpj.

3. Kadar β-karoten dalam sampel paprika

merah 264,34 µg/ml dengan koefisien variasi 4,5 x 10-3%; dalam paprika kuning 15,95 µg/ml dengan koefisien variasi 0,96% dan dalam paprika hijau 0,50 µg/ml dengan koefisien variasi 0,82 %.

DAFTAR PUSTAKA

1. Kumalaningsih, Sri. Antioksidan, sumber dan manfaatnya. Diambil dari:

http://antioxidancentre.com/html.

2. Suharyani. Penetapan kadar β-karoten dalam sari buah merah (Pandanus conoldeus Lam.) secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi [skripsi]. Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas Pancasila; 2007.

3. β-karoten dalam buah. Diambil dari: http://bluejack.binus.ac.id.

4. Winarsi, Hery. Antioksidan alami dan Radikal bebas. Jakarta: Kanisus; 2007. Hal 77-82, 155-63


5. British Pharmacutical Commision. British

Pharmacopeia. London : The Station of Office ; 2007. hal 250-1.

6. United State Pharmacopeia Convention. The

United States Pharmacopeia 28 The National Formulary 23. Roskville: United states Pharmacopeia Convention inc; 2007. hal 1509-10.

7. Harwtz, William. Official Methode of

Analysis of AOAC International 17th edition. Volume II. Virginia: AOAC International; 2004. hal 4.

8. Huber, Ludwig. Validation of Analitical

Methods : Review and Strategy. Revision 2.01 Juli 2001. Diambil dari : http://www.labcompliance.com/.

9. Harborne, J.B. Metode Fitokimia.

Terbitan kedua. Bandung : Institut Tehnologi Bandung ; 2000. hal 158-69.

PENETAPAN KADAR β-KAROTEN DALAM BUAH...

Documents

Transcript of PENETAPAN KADAR β-KAROTEN DALAM BUAH...