Paramètres à considérer

-Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3)

16:0palmitic

18:0

stearic

16:1palmitoleic

18:1oleic

18:2n-6

linoleic

18:3n-3

α-linolenicelo elo

Δ7des

Δ12des

Δ15des

Δ9des

Omega 6

Omega 3

Paramètres à considérer

-Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3)

-Pour transformer les acides gras de plantes en LC-PUFAsil faut plusieurs enzymes (désaturases, élongases, mais aussi des acyltransférases, et des enzymes d’activation des acides gras)

-Ceci nécessite donc de transformer des plantes oléagineuses avec plusieurs gènes difficultés technologiques

16:0palmitic

18:0

stearic

16:1palmitoleic

18:1oleic

18:2n-6

linoleic

18:3n-3

α-linolenicelo elo

Δ7des

Δ12des

Δ15des

Δ9des

Omega 6

Omega 3

20:3n-3

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

Δ9elo

Δ8des

Δ6des

Δ6elo

Δ5des

Δ4des

eicosatrienoic

Δ5elo

18:3n-3PCα-linolenic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine

18:4n-3 PC

20:4n-3CoA

20:5n-3 PC

EPA

Δ6des

Δ6elo

Δ5des

Stearidonic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:4n-3CoALPCAT*

*Δ6-specific lysophosphatidylcholine acyltransferase

LPCAT*20:4n-3 PCEicosatetraenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine

Eicosapentaenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine

**Acyl-CoA synthetase

18:4n-3 ACS**

Phospholipid pool

Acyl-CoA pool

Substrats des désaturases et des élongases

Les élongases

-Complexe qui regroupe 4 enzymes-La première enzyme est responsable de la spécificitéde substrat

Wallis et al., TIBS, 2002

Structure des LC-PUFAs désaturases (“front-end desaturase”, front = COOH)

Amino acid sequences of membrane-bound fatty acid desaturases from plants, animals and other organisms have three strongly conserved histidine-rich sequences (His boxes) with the general motifs HXXXH, HXXHH and HXXHH. These boxes are required for enzyme activity and are separated by membrane-spanning domains that must provide the correct orientation for the active sequences. Many enzymes including the mammalian Δ5 and Δ6 desaturases contain a cytochrome b5-like N-terminal extension; this is often accompanied by a change in the third His box to QXXHH (as shown). Electrons acquired from NADH cytochrome b5 reductase are transferred to cytochrome b5 or the cytochrome b5 domain of the desaturase, and then to the active site of the desaturase. The mixed oxidation/reduction reaction proceeds through two iron atoms (green circles) that are stabilized by interaction with the conserved histidine boxes.

(around 450 aa)

or Nannochloropsis oculata

(Thalassiosira pseudonana)

(Pavlova lutheri, Isochrysis galbana)

Les microalgues: une large gamme de choixPart of a maximum-likelihood tree constructed using 18S rRNA sequences

(adapted from Lopez-Garcia P. et al., Nature, 2001)

(Phaeodactylum tricornutum)

De nombreux articles décrivent des profils lipidiques de microalgues

eicosatrienoic

Microalgues = source de gènes codant pour des élongases et des désaturases

Activité Algues et champignons marins

Δ9elo Isochrysis galbana

Δ8des Euglena gracilis

Δ6des Phaeodactylum tricornutum

Thalassiosira pseudonana

Thraustochytrium sp…

Δ6elo Thalassiosira pseudonana

Ostreococcus tauri…

Δ5des Phaeodactylum tricornutum

Thalassisoira pseudonana

Thraustochytrium sp…

Δ5elo Thalassiosira pseudonana

Ostreococcus tauri

Pavlova lutheri

Δ4des Thraustochytrium sp

Euglena gracilis

Pavlova lutheri

Thalasssiora pseudonana

Isochrysis galbana

20:3n-3

20:4n-6

arachidonic

20:3n-6

dihomo-γ-linolenic

18:3n-6

γ-linolenic

20:2n-6

eicosadienoic

18:2n-6

linoleic

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

22:4n-6

adrenic

22:5n-6

ω6-docosapentaenoic

Δ9elo Δ6des

Δ6eloΔ8des

Δ15des

Δ9elo

Δ8des

Δ6des

Δ6elo

Δ5elo

Δ5desΔ5des

Δ4des Δ4des

Omega 6 Omega 3(18:2n-6 et 18:3n-3 are present in plants)

Δ5elo

Cette liste est loin d’être exhaustive…

Oméga 3 désaturase

Faisabilité de la reconstitution de la voie de synthèse du DHA chez un hôte hétérologue

in Yeast18:4n-3

Δ6elo: T. pseudonana

Δ5des: P. tricornutum

Δ5elo: O. tauri

Δ4des: E. gracilis

DHA

Δ8des

20:4n-6

arachidonic

20:4n-6

arachidonic

20:3n-6

dihomo-γ-linolenic

20:3n-6

dihomo-γ-linolenic

18:3n-6

γ-linolenic

18:3n-6

γ-linolenic

18:2n-6linoleic

18:2n-6linoleic

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

22:4n-6

adrenic

22:4n-6

adrenic

22:5n-6

ω6-docosapentaenoic

22:5n-6

ω6-docosapentaenoic

Δ9elo Δ6des

Δ6elo

Δ15des

Δ15des

Δ17des

Δ17des

Δ17des

Δ19des

Δ5elo

Δ5des

Δ4des

Omega 6

20:3n-3

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

Δ9elo

Δ8des

Δ6des

Δ6elo

Δ5des

Δ4des

eicosatrienoic

Omega 3

20:3n-3

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:3n-3

α-linolenic

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

Δ9elo

Δ8des

Δ6des

Δ6elo

Δ5des

Δ4des

eicosatrienoic

Omega 3

Δ5elo

DHA: ~ 0,5-1 % des AG totaux

- objectif: « Si une huile végétale contient environ  5% d’ARA, 5% d’EPA et 5% de DHA, 10 g de cette huile (quantité suffisante pour préparer une vinaigrette) permettraient d’ingérer la quantité journalière suffisante de LC-PUFAs »

Reconstitution de la voie de synthèse des oméga 3 chez les plantes

20:3n-3

20:4n-6

arachidonic

20:3n-6

dihomo-γ-linolenic

18:3n-6

γ-linolenic

20:2n-6

eicosadienoic

18:2n-6

linoleic

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

22:4n-6

adrenic

22:5n-6

ω6-docosapentaenoic

Δ9elo Δ6des

Δ6eloΔ8des

Δ15des

Δ9elo

Δ8des

Δ6des

Δ6elo

Δ5elo

Δ5desΔ5des

Δ4des Δ4des

Omega 6 Omega 3

Δ5elo

Domergue et al., TIPS, 2005

Arabidopsis thaliana

colza

lin

tabac

sojaOméga 3 désaturase

Volume 22, 739-745, 2004

20:3n-3

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

Δ9elo: from I. galbana

Δ8des: from E. gracilis

Δ6des

Δ6elo

Δ5des: from Mortierella alpina

eicosatrienoic

X

X

- Promoteur constitutif- Transformation séquentielle

Ces résultats ont permis de démontrer la faisabilité de ce type d’expérience chez les plantes, mais production chez Arabidopsis et dans les feuilles

- promoteur spécifique des graines- une seule transformation

meilleurs résultats avec la construction C

20:3n-3

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

Δ9elo

Δ8des

Δ6des from

P. tricornutum

Δ6elo from moss

Δ5des from

P. tricornutum

eicosatrienoic

X

X

Production d’EPA que chez le tabac, et dans les graines

20:4n-6

arachidonic

20:3n-6

dihomo-γ-linolenic

18:3n-6

γ-linolenic

18:2n-6

linoleic

22:6n-3

docosahexaenoic, DHA

18:3n-3

α-linolenic

18:4n-3stearidonic

20:4n-3

eicosatetraenoic

20:5n-3

eicosapentaenoic, EPA

22:5n-3

ω3-docosapentaenoic

22:4n-6

adrenic

22:5n-6

ω6-docosapentaenoic

Δ6des

Δ15des

Δ17des

Δ17des

Δ17des

Δ6des

Δ6elo

Δ5elo

Δ5desΔ5des

Δ4des Δ4des

Δ5elo

Δ6elo

Δ15des

- Plante hôte = soja

- Transformation d’embryon somatique par biolistique

- Promoteurs spécifiques des graines

- Pour la production d’EPA: 2 constructions testées(Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des)

(Arabidopsis thaliana Δ15des + Saprolegnia diclina Δ17des) - pour la production de DHA : 2 constructions testées

(Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des) (Pavlova sp. Δ5elo + Schizochitrium aggregatum Δ4des + Saprolegnia diclina Δ17des)

Nouvelles stratégies pour augmenter la production de LC-PUFAs et le stockage dans les TAGs: - Acyl-transférases- Acyl-CoA synthétase specifiques de l’EPA et du DHA ?

Production et stockage des LC-PUFAs

Glycerol 3-P

lysoPA

PA

DAG

TAG

G3PAT

LPAAT

PAPase

DGATPC

lysoPC

CPT

LPCAT

H

H

P

FA1

H

P

FA1

FA2

P

FA1

FA2

FA3

acyl-CoA pool

acyl-CoA

PDAT

Fatty acid synthesis: in plastid (until 18:1), and in endoplasmic reticulum

26:0

28:0

30:0

elo

acyl-CoA synthetase

FAs

elo: elongase

X: X-desaturase

Kennedy pathway: AcylTransferasesin endoplasmic reticulum

Addition de nouvelles enzymes: acyltransférases

ARA: jusqu’à 25% EPA: jusqu’à 15%

Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana

Thalassiosira pseudonana (Diatomée)

Genomic DNA libraryCNAP server 31.03.03

Acyl-CoA synthétase = activation des AG:

AG + ATP + acyl-CoA

acyl-CoA + AMP

Composition en AG et acyl-CoA de Thalassiosira pseudonana

co-elution

Tonon et al., Plant Physiology, 2005

name full length intron

TplacsA Yes 2

TplacsB Yes, n-term frameshift ? 2

TplacsC partial, miss n-term >1

TplacsD partial, miss n-term 3

TplacsE partial, miss both ends >2

TplacsF partial, miss n-term >5

TplacsG partial, miss n-term >5

TplacsI Yes 0

Acyl-CoA synthétases connues

Tonon et al., Plant Physiology, 2005

Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

t3 t4 t2t1

TplacsA (324 bp)

18S rDNA (675 bp)

TplacsI (543 bp)

100 60 305% nitrate degraded

311 237 17395Incubation (h)

t4 t3 t2t1Culture time

Expression des gènes TpLACS

expression hétérologue dans la levure

Tonon et al., Plant Physiology, 2005

Expression de TplacsA dans les levures et incubation en présence de 18:4n3+20:5n3

Résultats similaires en présence de 18:3n6+20:4n6 TpLACSA peut activer les LC-PUFAs

Time after feeding

construct mol % acyl-CoA

14:0 16:0 16:1n7 18:0 18:1n-9 18:4n-3 20:5n-3 22:1n-9

t0 pYES2 1.4±0.2 2.6 ±0.3 76.1±3.1 0.7±0.2 17.9±2.6 n.d. n.d. 4.7±0.3

pYLACSA 2.2±0.1 1.5±0.2 76.1±1.3 0.6±0.1 16.3±2.0 n.d. n.d. 5.6±0.3

5 min pYES2 1.5±0.1 1.5±0.1 76.1±2.0 0.4±0.1 17.9±2.0 0.3±0.1 n.d. 4.3±0.3

pYLACSA 2.3±0.2 1.2±0.0 77.3±1.4 0.4±0.0 13.0±0.5 1.3±0.2 1.6±0.5 6.2±0.3

60 min pYES2 1.4±0.1 2.4±0.6 77.1±3.3 0.6±0.2 17.2±2.7 0.5±0.1 n.d. 4.6±0.2

pYLACSA 3.3±0.6 2.1±0.1 78.9±1.7 0.5±0.1 8.9±0.8 2.3±0.7 1.4±0.4 7.1±0.9

24 h pYES2 1.2±0.2 4.9±0.3 85.1±0.7 1.1±0.1 7.4±0.3 0.5±0.1 0.2±0.0 7.8±0.5

pYLACSA 2.8±0.5 9.7±0.8 69.4±3.9 4.1±0.7 6.8±0.2 1.3±0.2 3.6±1.0 8.3±1.0

Tonon et al., Plant Physiology, 2005

Fatty acid substrate

Yea

st e

xtra

cts

spec

ific

act

ivit

y (p

mol

e/m

in/m

g p

rote

in)

PA

CS

sp

ecif

ic a

ctiv

ity

(pm

ole/

min

/mg

pro

tein

)

16:0 18:3n-6 18:4n-3 20:4n-6 20:5n-3 22:6n-3

Activité spécifique de TpLACSA

PACS = Pseudomanas sp. acyl-CoA synthetase (Sigma), connue pour son spectre large d’activité

TpLACSA est très active sur les LC-PUFAs, en particulier le DHA

Tonon et al., Plant Physiology, 2005

0

20

40

60

80

0

500

1000

1500

2000

pYES2pYLACSAPACS

Parameters considered pYES2 pYLACSA

% of FA incorporated in TAGs 50±1 63±40

nanomoles of FA incorporated in TAG per mg dried weight 140±13 272±28

% of DHA incorporated in TAG 54±2 81±5

nanomoles of DHA incorporated in TAG per mg dried weight 13±1 86±10

TpLACSA peut-elle augmenter le stockage du DHA dans la levure?

La réponse est oui prochaine étape = expression chez la plante

Tonon et al., Plant Physiology, 2005