Paramètres à considérer
-Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3)
16:0palmitic
18:0
stearic
16:1palmitoleic
18:1oleic
18:2n-6
linoleic
18:3n-3
α-linolenicelo elo
Δ7des
Δ12des
Δ15des
Δ9des
Omega 6
Omega 3
Paramètres à considérer
-Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3)
-Pour transformer les acides gras de plantes en LC-PUFAsil faut plusieurs enzymes (désaturases, élongases, mais aussi des acyltransférases, et des enzymes d’activation des acides gras)
-Ceci nécessite donc de transformer des plantes oléagineuses avec plusieurs gènes difficultés technologiques
16:0palmitic
18:0
stearic
16:1palmitoleic
18:1oleic
18:2n-6
linoleic
18:3n-3
α-linolenicelo elo
Δ7des
Δ12des
Δ15des
Δ9des
Omega 6
Omega 3
20:3n-3
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
Δ9elo
Δ8des
Δ6des
Δ6elo
Δ5des
Δ4des
eicosatrienoic
Δ5elo
18:3n-3PCα-linolenic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine
18:4n-3 PC
20:4n-3CoA
20:5n-3 PC
EPA
Δ6des
Δ6elo
Δ5des
Stearidonic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:4n-3CoALPCAT*
*Δ6-specific lysophosphatidylcholine acyltransferase
LPCAT*20:4n-3 PCEicosatetraenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine
Eicosapentaenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine
**Acyl-CoA synthetase
18:4n-3 ACS**
Phospholipid pool
Acyl-CoA pool
Substrats des désaturases et des élongases
Les élongases
-Complexe qui regroupe 4 enzymes-La première enzyme est responsable de la spécificitéde substrat
Wallis et al., TIBS, 2002
Structure des LC-PUFAs désaturases (“front-end desaturase”, front = COOH)
Amino acid sequences of membrane-bound fatty acid desaturases from plants, animals and other organisms have three strongly conserved histidine-rich sequences (His boxes) with the general motifs HXXXH, HXXHH and HXXHH. These boxes are required for enzyme activity and are separated by membrane-spanning domains that must provide the correct orientation for the active sequences. Many enzymes including the mammalian Δ5 and Δ6 desaturases contain a cytochrome b5-like N-terminal extension; this is often accompanied by a change in the third His box to QXXHH (as shown). Electrons acquired from NADH cytochrome b5 reductase are transferred to cytochrome b5 or the cytochrome b5 domain of the desaturase, and then to the active site of the desaturase. The mixed oxidation/reduction reaction proceeds through two iron atoms (green circles) that are stabilized by interaction with the conserved histidine boxes.
(around 450 aa)
or Nannochloropsis oculata
(Thalassiosira pseudonana)
(Pavlova lutheri, Isochrysis galbana)
Les microalgues: une large gamme de choixPart of a maximum-likelihood tree constructed using 18S rRNA sequences
(adapted from Lopez-Garcia P. et al., Nature, 2001)
(Phaeodactylum tricornutum)
De nombreux articles décrivent des profils lipidiques de microalgues
eicosatrienoic
Microalgues = source de gènes codant pour des élongases et des désaturases
Activité Algues et champignons marins
Δ9elo Isochrysis galbana
Δ8des Euglena gracilis
Δ6des Phaeodactylum tricornutum
Thalassiosira pseudonana
Thraustochytrium sp…
Δ6elo Thalassiosira pseudonana
Ostreococcus tauri…
Δ5des Phaeodactylum tricornutum
Thalassisoira pseudonana
Thraustochytrium sp…
Δ5elo Thalassiosira pseudonana
Ostreococcus tauri
Pavlova lutheri
Δ4des Thraustochytrium sp
Euglena gracilis
Pavlova lutheri
Thalasssiora pseudonana
Isochrysis galbana
20:3n-3
20:4n-6
arachidonic
20:3n-6
dihomo-γ-linolenic
18:3n-6
γ-linolenic
20:2n-6
eicosadienoic
18:2n-6
linoleic
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
22:4n-6
adrenic
22:5n-6
ω6-docosapentaenoic
Δ9elo Δ6des
Δ6eloΔ8des
Δ15des
Δ9elo
Δ8des
Δ6des
Δ6elo
Δ5elo
Δ5desΔ5des
Δ4des Δ4des
Omega 6 Omega 3(18:2n-6 et 18:3n-3 are present in plants)
Δ5elo
Cette liste est loin d’être exhaustive…
Oméga 3 désaturase
Faisabilité de la reconstitution de la voie de synthèse du DHA chez un hôte hétérologue
in Yeast18:4n-3
Δ6elo: T. pseudonana
Δ5des: P. tricornutum
Δ5elo: O. tauri
Δ4des: E. gracilis
DHA
Δ8des
20:4n-6
arachidonic
20:4n-6
arachidonic
20:3n-6
dihomo-γ-linolenic
20:3n-6
dihomo-γ-linolenic
18:3n-6
γ-linolenic
18:3n-6
γ-linolenic
18:2n-6linoleic
18:2n-6linoleic
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
22:4n-6
adrenic
22:4n-6
adrenic
22:5n-6
ω6-docosapentaenoic
22:5n-6
ω6-docosapentaenoic
Δ9elo Δ6des
Δ6elo
Δ15des
Δ15des
Δ17des
Δ17des
Δ17des
Δ19des
Δ5elo
Δ5des
Δ4des
Omega 6
20:3n-3
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
Δ9elo
Δ8des
Δ6des
Δ6elo
Δ5des
Δ4des
eicosatrienoic
Omega 3
20:3n-3
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:3n-3
α-linolenic
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
Δ9elo
Δ8des
Δ6des
Δ6elo
Δ5des
Δ4des
eicosatrienoic
Omega 3
Δ5elo
DHA: ~ 0,5-1 % des AG totaux
- objectif: « Si une huile végétale contient environ 5% d’ARA, 5% d’EPA et 5% de DHA, 10 g de cette huile (quantité suffisante pour préparer une vinaigrette) permettraient d’ingérer la quantité journalière suffisante de LC-PUFAs »
Reconstitution de la voie de synthèse des oméga 3 chez les plantes
20:3n-3
20:4n-6
arachidonic
20:3n-6
dihomo-γ-linolenic
18:3n-6
γ-linolenic
20:2n-6
eicosadienoic
18:2n-6
linoleic
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
22:4n-6
adrenic
22:5n-6
ω6-docosapentaenoic
Δ9elo Δ6des
Δ6eloΔ8des
Δ15des
Δ9elo
Δ8des
Δ6des
Δ6elo
Δ5elo
Δ5desΔ5des
Δ4des Δ4des
Omega 6 Omega 3
Δ5elo
Domergue et al., TIPS, 2005
Arabidopsis thaliana
colza
lin
tabac
sojaOméga 3 désaturase
Volume 22, 739-745, 2004
20:3n-3
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
Δ9elo: from I. galbana
Δ8des: from E. gracilis
Δ6des
Δ6elo
Δ5des: from Mortierella alpina
eicosatrienoic
X
X
- Promoteur constitutif- Transformation séquentielle
Ces résultats ont permis de démontrer la faisabilité de ce type d’expérience chez les plantes, mais production chez Arabidopsis et dans les feuilles
- promoteur spécifique des graines- une seule transformation
meilleurs résultats avec la construction C
20:3n-3
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
Δ9elo
Δ8des
Δ6des from
P. tricornutum
Δ6elo from moss
Δ5des from
P. tricornutum
eicosatrienoic
X
X
Production d’EPA que chez le tabac, et dans les graines
20:4n-6
arachidonic
20:3n-6
dihomo-γ-linolenic
18:3n-6
γ-linolenic
18:2n-6
linoleic
22:6n-3
docosahexaenoic, DHA
18:3n-3
α-linolenic
18:4n-3stearidonic
20:4n-3
eicosatetraenoic
20:5n-3
eicosapentaenoic, EPA
22:5n-3
ω3-docosapentaenoic
22:4n-6
adrenic
22:5n-6
ω6-docosapentaenoic
Δ6des
Δ15des
Δ17des
Δ17des
Δ17des
Δ6des
Δ6elo
Δ5elo
Δ5desΔ5des
Δ4des Δ4des
Δ5elo
Δ6elo
Δ15des
- Plante hôte = soja
- Transformation d’embryon somatique par biolistique
- Promoteurs spécifiques des graines
- Pour la production d’EPA: 2 constructions testées(Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des)
(Arabidopsis thaliana Δ15des + Saprolegnia diclina Δ17des) - pour la production de DHA : 2 constructions testées
(Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des) (Pavlova sp. Δ5elo + Schizochitrium aggregatum Δ4des + Saprolegnia diclina Δ17des)
Nouvelles stratégies pour augmenter la production de LC-PUFAs et le stockage dans les TAGs: - Acyl-transférases- Acyl-CoA synthétase specifiques de l’EPA et du DHA ?
Production et stockage des LC-PUFAs
Glycerol 3-P
lysoPA
PA
DAG
TAG
G3PAT
LPAAT
PAPase
DGATPC
lysoPC
CPT
LPCAT
H
H
P
FA1
H
P
FA1
FA2
P
FA1
FA2
FA3
acyl-CoA pool
acyl-CoA
PDAT
Fatty acid synthesis: in plastid (until 18:1), and in endoplasmic reticulum
26:0
28:0
30:0
elo
acyl-CoA synthetase
FAs
elo: elongase
X: X-desaturase
Kennedy pathway: AcylTransferasesin endoplasmic reticulum
Addition de nouvelles enzymes: acyltransférases
ARA: jusqu’à 25% EPA: jusqu’à 15%
Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana
Thalassiosira pseudonana (Diatomée)
Genomic DNA libraryCNAP server 31.03.03
Acyl-CoA synthétase = activation des AG:
AG + ATP + acyl-CoA
acyl-CoA + AMP
Composition en AG et acyl-CoA de Thalassiosira pseudonana
co-elution
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
name full length intron
TplacsA Yes 2
TplacsB Yes, n-term frameshift ? 2
TplacsC partial, miss n-term >1
TplacsD partial, miss n-term 3
TplacsE partial, miss both ends >2
TplacsF partial, miss n-term >5
TplacsG partial, miss n-term >5
TplacsI Yes 0
Acyl-CoA synthétases connues
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
t3 t4 t2t1
TplacsA (324 bp)
18S rDNA (675 bp)
TplacsI (543 bp)
100 60 305% nitrate degraded
311 237 17395Incubation (h)
t4 t3 t2t1Culture time
Expression des gènes TpLACS
expression hétérologue dans la levure
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
Expression de TplacsA dans les levures et incubation en présence de 18:4n3+20:5n3
Résultats similaires en présence de 18:3n6+20:4n6 TpLACSA peut activer les LC-PUFAs
Time after feeding
construct mol % acyl-CoA
14:0 16:0 16:1n7 18:0 18:1n-9 18:4n-3 20:5n-3 22:1n-9
t0 pYES2 1.4±0.2 2.6 ±0.3 76.1±3.1 0.7±0.2 17.9±2.6 n.d. n.d. 4.7±0.3
pYLACSA 2.2±0.1 1.5±0.2 76.1±1.3 0.6±0.1 16.3±2.0 n.d. n.d. 5.6±0.3
5 min pYES2 1.5±0.1 1.5±0.1 76.1±2.0 0.4±0.1 17.9±2.0 0.3±0.1 n.d. 4.3±0.3
pYLACSA 2.3±0.2 1.2±0.0 77.3±1.4 0.4±0.0 13.0±0.5 1.3±0.2 1.6±0.5 6.2±0.3
60 min pYES2 1.4±0.1 2.4±0.6 77.1±3.3 0.6±0.2 17.2±2.7 0.5±0.1 n.d. 4.6±0.2
pYLACSA 3.3±0.6 2.1±0.1 78.9±1.7 0.5±0.1 8.9±0.8 2.3±0.7 1.4±0.4 7.1±0.9
24 h pYES2 1.2±0.2 4.9±0.3 85.1±0.7 1.1±0.1 7.4±0.3 0.5±0.1 0.2±0.0 7.8±0.5
pYLACSA 2.8±0.5 9.7±0.8 69.4±3.9 4.1±0.7 6.8±0.2 1.3±0.2 3.6±1.0 8.3±1.0
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
Fatty acid substrate
Yea
st e
xtra
cts
spec
ific
act
ivit
y (p
mol
e/m
in/m
g p
rote
in)
PA
CS
sp
ecif
ic a
ctiv
ity
(pm
ole/
min
/mg
pro
tein
)
16:0 18:3n-6 18:4n-3 20:4n-6 20:5n-3 22:6n-3
Activité spécifique de TpLACSA
PACS = Pseudomanas sp. acyl-CoA synthetase (Sigma), connue pour son spectre large d’activité
TpLACSA est très active sur les LC-PUFAs, en particulier le DHA
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
0
20
40
60
80
0
500
1000
1500
2000
pYES2pYLACSAPACS
Parameters considered pYES2 pYLACSA
% of FA incorporated in TAGs 50±1 63±40
nanomoles of FA incorporated in TAG per mg dried weight 140±13 272±28
% of DHA incorporated in TAG 54±2 81±5
nanomoles of DHA incorporated in TAG per mg dried weight 13±1 86±10
TpLACSA peut-elle augmenter le stockage du DHA dans la levure?
La réponse est oui prochaine étape = expression chez la plante
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
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