OXIDAÇÃO DE COMPOSTOS β-DICARBONÍLICOS POR ... ... mecanismo pelo qual...

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  • UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

    FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS

    OXIDAÇÃO DE COMPOSTOS β-DICARBONÍLICOS

    POR PEROXIDASES

    ANA PAULA RODRIGUES

    ARARAQUARA – SP 2007

  • ANA PAULA RODRIGUES

    OXIDAÇÃO DE COMPOSTOS β-DICARBONÍLICOS

    POR PEROXIDASES

    Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

    em Análises Clínicas da Faculdade de Ciências

    Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista

    “Júlio de Mesquita Filho” como parte dos

    requisitos para obtenção do grau de DOUTOR em

    Análises Clínicas. Área de concentração:

    Bioquímica

    Orientador: Prof. Dr. Iguatemy Lourenço Brunetti Co-Orientador: Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes

    ARARAQUARA – SP 2007

  • Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

    Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara

    Rodrigues, Ana Paula R696o Oxidação de compostos β-dicarbonílicos por peroxidase. / Ana Paula

    Rodrigues. – Araraquara, 2007. 141 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita

    Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Análises Clínicas

    Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti Co-orientador: Valdecir Farias Ximenes 1.Peroxidase. 2.Compostos Beta dicarbonílicos. 3.Espécies reativas de

    oxigênio. 4.ADEPT. I.Brunetti, Iguatemy Lourenço, orient..II.Ximenes, Valdecir Farias, co-orient. III.Título.

    CDD: 574.192

    CAPES: 40300005

  • FOLHA DE APROVAÇÃO

    _______________________________ Prof. Dr.Iguatemy Lourenço Brunetti Orientador e Presidente _______________________________ Prof. Dr. Antonio Cardozo dos Santos Membro Titular _______________________________ Profa. Dra. Mariza Pires de Melo Membro Titular _______________________________ Profa. Dra. Olga Maria Mascarenhas Faria Oliveira Membro Titular _______________________________ Profa. Dra. Chung Man Chin Membro Titular

    Araraquara, 26 de novembro de 2007

  • Dedico este trabalho...

    ...À DEUS, por ter me dado a vida, saúde e por sempre iluminar o meu

    caminho, fazendo com que minhas buscas não sejam em vão.

    ...À minha mãe, pelo exemplo de perseverança, luta e alegria, mesmo

    diante dos mais difíceis obstáculos. Saudades...

    ...Ao meu pai, que sempre foi e será modelo de dedicação à profissão,

    justiça e honestidade. Por todo apoio dedicado à família e aos nossos

    estudos.

    ...Ao meu irmão Marcos, minhas irmãs Luciana e Thais, e meus

    cunhados André e Maria Fernanda por todos os momentos de

    convivência e palavras de apoio e incentivo.

    ...Às minhas queridas sobrinhas Maria Luiza e Marina, pela alegria

    que sempre trazem para todos nós.

  • Ao Professor Iguatemy

    ...pela dedicação ao ensino, à pesquisa e orientação segura e paciente

    que possibilitou a realização deste trabalho

    ...pela convivência diária e amizade sincera e atenciosa

    ...pela confiança em mim depositada

    Ao Professor Valdecir

    ...pelas valiosas discussões e estímulo

    ...por acompanhar meu trabalho, auxiliando-me sempre que precisei

    “Se consegui ver mais longe,

    foi porque me apoiei em ombros de gigantes”

    Isaac Newton

  • “Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,

    mas não esqueço de que a minha vida

    é a maior empresa do mundo.

    E que posso evitar que ela vá à falência.

    Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver,

    apesar de todos os desafios,

    incompreensões e períodos de crise.

    Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas

    e se tornar um autor da própria história.

    É atravessar desertos fora de si,

    mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma.

    É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida.

    Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.

    É saber falar de si mesmo.

    É ter coragem para ouvir um “não”.

    É ter segurança para receber uma crítica,

    mesmo que injusta.

    Pedras no caminho?

    Guardo todas,

    um dia vou construir um castelo...”

    Fernando Pessoa

  • Agradeço...

    Ao Laboratório de Bioquímica e Enzimologia Clínica, do Departamento de Análises

    Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, onde

    este trabalho foi desenvolvido,

    Aos professores que fizeram parte da banca examinadora, pelas sugestões e críticas

    que certamente contribuíram para o enriquecimento deste trabalho,

    Às professoras Dra. Maria Teresa Pepato e Dra. Regina Célia Vendramini pela

    amizade e agradável convívio,

    À professora Dra. Olga Maria M. de Faria Oliveira, por sempre permitir uso de seu

    laboratório,

    Ao professor Dr. Luiz Marcos da Fonseca pela colaboração e amizade,

    Ao Professor Dr. Antonio Cardoso dos Santos, por me receber em seu Laboratório

    na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP, colaborar com

    nosso trabalho e pelo início de uma parceria,

    Ao Cezar, doutorando na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –

    USP, pelo auxílio, dedicação e paciência em experimentos realizados em conjunto,

    À Tirene, pelo empenho em ajudar sempre que precisei, e por ser acima de tudo,

    uma grande amiga,

    Às secretárias do programa de Pós Graduação, Cláudia, Laura e Sônia, pelo auxílio,

    paciência e amizade,

    Aos colegas Marília, José Carlos, Najeh, Vanessa, Karina, Roberta, Helen pela

    amizade e momentos compartilhados,

  • À Maria Irani Coito, bibliotecária da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

    Araraquara, pelo auxílio na revisão das referências bibliográficas,

    À todos os funcionários da biblioteca da FCFAR-UNESP, pela ajuda na busca de

    periódicos,

    Aos técnicos Valéria e Marcos, pelo auxílio e amizade,

    A todos os meus amigos, pelo incentivo, momentos de alegria e descontração,

    À todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, meus

    sinceros agradecimentos

    Obrigada!!

  • RESUMO

    A terapia ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) tem sido

    caracterizada, em vários estudos experimentais focalizados na destruição de células

    tumorais, como uma alternativa à fármacos citotóxicos sistêmicos (anti-

    proliferativos). Nesta técnica, o pró-fármaco é ativado por enzimas exógenas que

    são levadas à célula tumoral por meio de anticorpos monoclonais (Mab). Neste

    contexto, horseradish peroxidase (HRP) e ácido 3-indolacético (IAA) constituem um

    dos sistemas mais citados de enzima e pró-fármaco aplicados à destruição de

    células tumorais com conjugados HRP-Mab. Peroxidases são enzimas inespecíficas

    e várias moléculas podem ser oxidadas pela suas formas ativas HRP-l e HRP-ll no

    ciclo clássico da peroxidase, que é dependente de peróxido de hidrogênio ou

    hidroperóxidos orgânicos. Por outro lado, somente NADH, dihidroxifumarato e a

    auxina de planta IAA, têm sido descritos como substratos para HRP em reação

    independente de peróxido de hidrogênio. O objetivo deste trabalho foi estudar o

    mecanismo pelo qual compostos β-dicarbonílicos são oxidados por HRP e explorar

    suas aplicações. Foi demonstrado que os compostos dicarbonílicos 2,4-

    pentanodiona (PD) e 3-metil-2,4-pentanodiona (MePD) são eficientemente oxidados

    pela HRP, na ausência de peróxido, em tampão fosfato pH 7,4, consumindo oxigênio

    presente em solução, o que não ocorreu com outros compostos β-dicarbonílicos

    testados (dimedona e acetoacetato). Observou-se também, via espectrofotometria,

    durante a reação com PD e MePD, que a enzima nativa passou à sua forma HRP-lll,

    além disso, a reação produziu espécies reativas de oxigênio (ERO), detectadas por

    quimiluminescência dependente de luminol e fluorescência dependente de

    diclorofluoresceína. Também foram realizadas reações de consumo de oxigênio com

    outros compostos que possuem grupamento heme (citocromo C, hemina, mioglobina

    e mieloperoxidase) para avaliar a especificidade da HRP nessa reação de oxidação;

    a MePD foi eficientemente oxidada pela hemina e mioglobina. Metilglioxal (MG) foi

    detectado como produto da reação PD/HRP