Lucrari Practice La Biochimie Generala_BiochimieI_2013

of 41 /41
BIOCHIMIE GENERALĂ BIOCHIMIE GENERALĂ LUCRĂRI PRACTICE Biochimie I 2012/2013 Aminoacizi si proteine/ Glucide

Embed Size (px)

description

Biochimie

Transcript of Lucrari Practice La Biochimie Generala_BiochimieI_2013

  • BIOCHIMIE GENERAL

    LUCRRI PRACTICE

    Biochimie I2012/2013Aminoacizi si proteine/ Glucide

  • -aminoacidCarbon central (carbon );Grupare amino;Grupare carboxil;Atom de hidrogen;Grupare R.

    Aminoacizii din structura proteinelor sunt -aminoacizi.

    Excepie: Prolina (Pro) (iminoacid)

  • Proprieti n soluie la pH neutru amfiioni gruparea amino = protonat / gruparea carboxil = disociat;

    Majoritatea punct de topire ~300 C;

    Solubilitate crescut n solveni polari comparativ cu solvenii nepolari.

  • LP 1Reacii de identificare a aminoacizilor

  • Aminoacizi testai in cadrul L.P.

    Reacii de identificare a aa.

  • Reacii de identificare a aminoacizilorReacia cu acid azotos;

    Reacia cu ninhidrin;

    Reacia xantoproteic;

    Reacia Millon;

    Reacia cu nitroprusiat.Reacii de culoare

  • Reacia cu acidul azotos

    Metoda van Slyke- aa. reacioneaz cu acidul azotos la temperatura camerei cu degajare de azot. Cantitativ- un mol de aa. degaj 22,4 l azot.

    Reactivi: - HCl 2M; - NaNO2 10% - aminoacizi de testat: Gly, TyrGlyHCl 2MTyrHCl 2MHCl 2M+ NaNO2 10% degajare de N2 n primele 2 eprubete

  • Reacia cu ninhidrin

  • LP 2Determinarea proteinelor sericecu reactiv Weichselbaum

  • Principiul metodei:

    Compuii cu legturi peptidice reacioneaz cu ionii de Cu2+ n mediu alcalin, rezultnd un compus de culoare albastru-violet a crui intensitate este direct proporional cu numrul de legturi peptidice.

    Metoda poate fi folosit pentru determinarea concentraiei proteinelor din serul sanguin.

  • Reactivi:

    soluie de NaOH 10%;

    reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH + sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;

    soluie standard proteic cu concentraia cunoscut (10 mg/ml) de albumin seric bovin (BSA);

    proba de analizat reprezentat de ser sanguin diluat corespunztor.

  • Pt. curba etalon:

    BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita Pt. probaSer sanguin+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

    Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 546nm.

  • Spectrofotometrie generalitati

    Metoda spectrofotometric se bazeaz pe proprietatea substanelor de a absorbi selectiv radiaiile electromagnetice i este folosit pentru identificare, determinarea puritii i dozare.

    Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul de radiaii continue prin substana de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbit depindede structura i de numrul moleculelor i al atomilor substanei cu care interacioneaz fascicululde radiaii.

    n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbia luminii se deosebesc: metodespectrofotometrice n ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice n vizibil (400-800nm)i metode spectrofotometrice n infrarou (peste 800nm).

  • Spectrofotometrie - generalitati

    Principiul spectrofotometriei se bazeaz pe determinarea concentraiei soluiilor colorate latrecerea unui fascicul emis de o surs luminoas printr-o soluie omogen constituit din substanade analizat.

    Astfel se determin absorbia radiaiei luminoase, care este direct proporional cuconcentraia substanei absorbante n conformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg T = L C

    A = absorbana;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatea luminii transmise;T = transmitana;L = grosimea stratului de absorbie (cm);C = concentraia soluiei absorbante (moli/l); = absorbtivitatea molar (constant caracteristic fiecrei substane absorbante).

    Lungimea de und a luminii incidente este cea a culorii complementare a soluiei de analizat.

  • Spectrofotometru UV-VIS

  • Curba etalonReprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul nostrua absorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata de concentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscuta pentru determinarea unei concentratii necunoscute.

  • LP 3

    Metoda biuretului

  • Reacia este utilizat pentru determinarea cantitativ a proteinelor. Asemntor compusului numit biuret, peptidele i proteinele conin grupri CO-NH- care reacionaez cu o soluie alcalin de sulfat Cu (II) i determin apariia unei coloraii albastru-violet. Intensitatea culorii este o msur a numrului de legturi peptidice prezente ntr-o protein.

  • Reacia nu este specific pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.

    Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).

  • Reactivi:

    Reactiv biuret;

    soluie standard proteic cu concentraia cunoscut (5 mg/ml) de albumin seric bovin (BSA);

    proba de analizat reprezentat extract proteic total.

  • Pt. curba etalon:

    BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita Pt. probaEPT diluat corespunzator+ reactiv biuret

    Incubare 10/ 37C. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 540nm. Citirea se face fata de A.D.

  • LP 4Reacii de identificare a glucidelor

  • Glucide testate in cadrul L.P.

    Reacii de identificare a glucidelor

    Glucoza Fructoza

  • Glucide testate in cadrul L.P.

    Reacii de identificare a glucidelor

    Zaharoza

  • Reacii de identificare a glucidelorReacia Molisch;

    Reacia cu iodul;

    Reacia Benedict;

    Reacia Seliwanoff;

    Reacia Fehling.Reacii de culoare

  • Glucide cu caracter reducator - glucozaEchilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.

  • LP 5Dozarea zaharurilor reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina

  • Principiul metodei:

    In prezenta acidului acetic, la cald, zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat care prezinta un maxim de absorbtie la 630 nm.

    Metoda poate fi folosit pentru determinarea concentraiei glucozei din serul sanguin.

  • Reactivi:

    Reactiv o-toluidina;

    Solutie standrad de glucoza 100 mg%;

    proba de analizat reprezentat de extract de portocala diluat corespunztor.

  • Pt. curba etalon:

    Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.Diferite volume sol. st. glucoza si AD concentratie diferita Pt. probaExtract de portocala + r. o-toluidina

    Incubare 10/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 630 nm fata de blanc.

  • Reactia glucozei cu o-toluidina

  • LP 5Dozarea lactozei din lapte

  • Lactoza dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vac i 2-3% din laptele uman.

  • Principiul metodei:

    Concentraia lactozei poate fi determinat prin orice metod caracteristic pentru zaharuri reductoare, dup deproteinizarea laptelui.

    n cazul acestui experiment, se realizeaz deproteinizarea laptelui cu o soluie de wolframat de sodiu, dozarea efectiv realizndu-se prin metoda Nelson. n cazul acestei metode, ionii de Cu (II) sunt redui la ioni de Cu (I), care la rndul lor reduc acidul fosfomolibdenic la un produs de reacie albastru.

  • Reactivi:

    reactiv alcalin de cupru;

    reactiv fosfomolibdenic;

    soluie 10% de wolframat de sodiu;

    soluie M/3 de H2SO4;

    soluie stoc de lactoz 1%;

  • La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaug 2 ml de soluie de wolframat de sodiu 10% i, ncet, sub agitare constant, 2 ml M/3 soluie de acid sulfuric. Amestecul este adus la un volum final de 100 ml, iar dup 5 minute de staionare este filtrat printr-o hrtie de filtru.

    E1E2E3Filtrat1 ml-Apa distilata1 ml-2 mlSoluie standard de lactoz*-2ml-Reactiv alcalin de cupru2 ml2 ml2 mlSe incubeaz timp de 8 minute pe baie de ap la fierbere; ulterior eprubetele se rcesc i se adug n fiecare eprubet reactiv fosfomolibdenic.Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 mlDupa 1 min. de staionare, amestecurile de reacie se dilueaz la un volum final de 25 ml cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4. Se citete densitatea optic a probelor E1 i E2 fa de blanc E3, la 630 nm.

  • Calculul rezultatelor

    Densitile optice fiind proporionale cu concentraiile este valabil relaia:D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraia lactozei dinm standard (0,6 mg). Concentraia lactozei din lapte, exprim n g/100 ml este dat de relaia:(D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)

    *****