BIOCHIMIE GENERAL LUCRRI PRACTICE

Biochimie I2012/2013Aminoacizi si proteine/ Glucide

-aminoacidCarbon central (carbon );Grupare amino;Grupare carboxil;Atom de hidrogen;Grupare R.

Aminoacizii din structura proteinelor sunt -aminoacizi.

Excepie: Prolina (Pro) (iminoacid)

Proprieti n soluie la pH neutru amfiioni gruparea amino = protonat / gruparea carboxil = disociat;

Majoritatea punct de topire ~300 C;

Solubilitate crescut n solveni polari comparativ cu solvenii nepolari.

LP 1Reacii de identificare a aminoacizilor

Aminoacizi testai in cadrul L.P.

Reacii de identificare a aa.

Reacii de identificare a aminoacizilorReacia cu acid azotos;

Reacia cu ninhidrin;

Reacia xantoproteic;

Reacia Millon;

Reacia cu nitroprusiat.Reacii de culoare

Reacia cu acidul azotos

Metoda van Slyke- aa. reacioneaz cu acidul azotos la temperatura camerei cu degajare de azot. Cantitativ- un mol de aa. degaj 22,4 l azot.

Reactivi: - HCl 2M; - NaNO2 10% - aminoacizi de testat: Gly, TyrGlyHCl 2MTyrHCl 2MHCl 2M+ NaNO2 10% degajare de N2 n primele 2 eprubete

Reacia cu ninhidrin

LP 2Determinarea proteinelor sericecu reactiv Weichselbaum

Principiul metodei:

Compuii cu legturi peptidice reacioneaz cu ionii de Cu2+ n mediu alcalin, rezultnd un compus de culoare albastru-violet a crui intensitate este direct proporional cu numrul de legturi peptidice.

Metoda poate fi folosit pentru determinarea concentraiei proteinelor din serul sanguin.

Reactivi:

soluie de NaOH 10%;

reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH + sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;

soluie standard proteic cu concentraia cunoscut (10 mg/ml) de albumin seric bovin (BSA);

proba de analizat reprezentat de ser sanguin diluat corespunztor.

Pt. curba etalon:

BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita Pt. probaSer sanguin+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 546nm.

Spectrofotometrie generalitati

Metoda spectrofotometric se bazeaz pe proprietatea substanelor de a absorbi selectiv radiaiile electromagnetice i este folosit pentru identificare, determinarea puritii i dozare.

Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul de radiaii continue prin substana de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbit depindede structura i de numrul moleculelor i al atomilor substanei cu care interacioneaz fascicululde radiaii.

n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbia luminii se deosebesc: metodespectrofotometrice n ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice n vizibil (400-800nm)i metode spectrofotometrice n infrarou (peste 800nm).

Spectrofotometrie - generalitati

Principiul spectrofotometriei se bazeaz pe determinarea concentraiei soluiilor colorate latrecerea unui fascicul emis de o surs luminoas printr-o soluie omogen constituit din substanade analizat.

Astfel se determin absorbia radiaiei luminoase, care este direct proporional cuconcentraia substanei absorbante n conformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg T = L C

A = absorbana;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatea luminii transmise;T = transmitana;L = grosimea stratului de absorbie (cm);C = concentraia soluiei absorbante (moli/l); = absorbtivitatea molar (constant caracteristic fiecrei substane absorbante).

Lungimea de und a luminii incidente este cea a culorii complementare a soluiei de analizat.

Spectrofotometru UV-VIS

Curba etalonReprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul nostrua absorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata de concentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscuta pentru determinarea unei concentratii necunoscute.

LP 3

Metoda biuretului

Reacia este utilizat pentru determinarea cantitativ a proteinelor. Asemntor compusului numit biuret, peptidele i proteinele conin grupri CO-NH- care reacionaez cu o soluie alcalin de sulfat Cu (II) i determin apariia unei coloraii albastru-violet. Intensitatea culorii este o msur a numrului de legturi peptidice prezente ntr-o protein.

Reacia nu este specific pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.

Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).

Reactivi:

Reactiv biuret;

soluie standard proteic cu concentraia cunoscut (5 mg/ml) de albumin seric bovin (BSA);

proba de analizat reprezentat extract proteic total.

Pt. curba etalon:

BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita Pt. probaEPT diluat corespunzator+ reactiv biuret

Incubare 10/ 37C. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 540nm. Citirea se face fata de A.D.

LP 4Reacii de identificare a glucidelor

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacii de identificare a glucidelor

Glucoza Fructoza

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacii de identificare a glucidelor

Zaharoza

Reacii de identificare a glucidelorReacia Molisch;

Reacia cu iodul;

Reacia Benedict;

Reacia Seliwanoff;

Reacia Fehling.Reacii de culoare

Glucide cu caracter reducator - glucozaEchilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.

LP 5Dozarea zaharurilor reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina

Principiul metodei:

In prezenta acidului acetic, la cald, zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat care prezinta un maxim de absorbtie la 630 nm.

Metoda poate fi folosit pentru determinarea concentraiei glucozei din serul sanguin.

Reactivi:

Reactiv o-toluidina;

Solutie standrad de glucoza 100 mg%;

proba de analizat reprezentat de extract de portocala diluat corespunztor.

Pt. curba etalon:

Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.Diferite volume sol. st. glucoza si AD concentratie diferita Pt. probaExtract de portocala + r. o-toluidina

Incubare 10/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 630 nm fata de blanc.

Reactia glucozei cu o-toluidina

LP 5Dozarea lactozei din lapte

Lactoza dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vac i 2-3% din laptele uman.

Principiul metodei:

Concentraia lactozei poate fi determinat prin orice metod caracteristic pentru zaharuri reductoare, dup deproteinizarea laptelui.

n cazul acestui experiment, se realizeaz deproteinizarea laptelui cu o soluie de wolframat de sodiu, dozarea efectiv realizndu-se prin metoda Nelson. n cazul acestei metode, ionii de Cu (II) sunt redui la ioni de Cu (I), care la rndul lor reduc acidul fosfomolibdenic la un produs de reacie albastru.

Reactivi:

reactiv alcalin de cupru;

reactiv fosfomolibdenic;

soluie 10% de wolframat de sodiu;

soluie M/3 de H2SO4;

soluie stoc de lactoz 1%;

La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaug 2 ml de soluie de wolframat de sodiu 10% i, ncet, sub agitare constant, 2 ml M/3 soluie de acid sulfuric. Amestecul este adus la un volum final de 100 ml, iar dup 5 minute de staionare este filtrat printr-o hrtie de filtru.

E1E2E3Filtrat1 ml-Apa distilata1 ml-2 mlSoluie standard de lactoz*-2ml-Reactiv alcalin de cupru2 ml2 ml2 mlSe incubeaz timp de 8 minute pe baie de ap la fierbere; ulterior eprubetele se rcesc i se adug n fiecare eprubet reactiv fosfomolibdenic.Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 mlDupa 1 min. de staionare, amestecurile de reacie se dilueaz la un volum final de 25 ml cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4. Se citete densitatea optic a probelor E1 i E2 fa de blanc E3, la 630 nm.

Calculul rezultatelor

Densitile optice fiind proporionale cu concentraiile este valabil relaia:D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraia lactozei dinm standard (0,6 mg). Concentraia lactozei din lapte, exprim n g/100 ml este dat de relaia:(D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)

*****