BIOCHIMIE GENERALĂBIOCHIMIE GENERALĂ

LUCRĂRI PRACTICE

Biochimie I2012/2013

Aminoacizi si proteine/ Glucide

α-aminoacid

1. Carbon central (carbon α);

2. Grupare amino;3. Grupare carboxil;4. Atom de hidrogen;5. Grupare R.

Aminoacizii din structura proteinelor sunt α-aminoacizi.

Excepţie: Prolina (Pro) (iminoacid)

ProprietăţiProprietăţi

în soluţie la pH neutru – amfiioni gruparea amino = protonată / gruparea carboxil = disociată;

Majoritatea – punct de topire ~300° C;

Solubilitate crescută în solvenţi polari comparativ cu solvenţii nepolari.

LP 1Reacţii de identificare a

aminoacizilor

Aminoacizi testaţi in

cadrul L.P.

Reacţii de identificar

e a aa.

Reacţii de identificare a Reacţii de identificare a aminoaciziloraminoacizilor

Reacţia cu acid azotos;

Reacţia cu ninhidrină;

Reacţia xantoproteică;

Reacţia Millon;

Reacţia cu nitroprusiat.

Reacţii de culoare

Reacţia cu acidul azotosReacţia cu acidul azotos

Metoda van Slyke- aa. reacţionează cu acidul azotos la temperatura camerei cu degajare de azot. Cantitativ- un mol de aa. degajă 22,4 l azot.

Reactivi: - HCl 2M; - NaNO2 10% - aminoacizi de testat: Gly, Tyr

GlyHCl 2M

TyrHCl 2M HCl 2M

+ NaNO2 10%

degajare de N2

în primele 2 eprubete

Reacţia cu ninhidrină

LP 2Determinarea proteinelor

sericecu reactiv Weichselbaum

 Principiul metodei:

Compuşii cu legături peptidice reacţionează cu ionii de Cu2+ în mediu alcalin, rezultând un compus de culoare albastru-violet a cărui intensitate este direct proporţională cu numărul de legături peptidice.

Metoda poate fi folosită pentru determinarea concentraţiei proteinelor din serul sanguin.

Reactivi:

soluţie de NaOH 10%;

reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH + sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;

soluţie standard proteică cu concentraţia cunoscută (10 mg/ml) de albumină serică bovină (BSA);

proba de analizat reprezentată de ser sanguin diluat corespunzător.

Pt. curba etalon:

BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita

Pt. proba

Ser sanguin

+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 546nm.

Spectrofotometrie – generalitati Metoda spectrofotometrică se bazează pe proprietatea

substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificare, determinarea purităţii şi dozare.

Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul de radiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită depindede structura şi de numărul moleculelor şi al atomilor substanţei cu care interacţionează fascicululde radiaţii.

În funcţie de domeniile spectrale în care are loc absorbţia luminii se deosebesc: metodespectrofotometrice în ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice în vizibil (400-800nm)şi metode spectrofotometrice în infraroşu (peste 800nm).

Spectrofotometrie - generalitati Principiul spectrofotometriei se bazează pe determinarea

concentraţiei soluţiilor colorate latrecerea unui fascicul emis de o sursă luminoasă printr-o soluţie omogenă constituită din substanţade analizat.

Astfel se determină absorbţia radiaţiei luminoase, care este direct proporţională cuconcentraţia substanţei absorbante în conformitate cu legea Lambert-Beer: AA== lg I lg I00/I = -lg T /I = -lg T = = ε ε L CL C

A = absorbanţa;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatea luminii transmise;T = transmitanţa;L = grosimea stratului de absorbţie (cm);C = concentraţia soluţiei absorbante (moli/l); ε = absorbtivitatea molară (constantă caracteristică fiecărei substanţe absorbante).

Lungimea de undă a luminii incidente este cea a culorii complementare a soluţiei de analizat.

Spectrofotometru UV-VIS

Curba etalonCurba etalonReprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul

nostrua absorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata de concentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscuta pentru determinarea unei concentratii necunoscute.

LP 3

Metoda biuretului

Reacţia este utilizată pentru determinarea cantitativă a proteinelor. Asemănător compusului numit biuret, peptidele şi proteinele conţin grupări –CO-NH- care reacţionaeză cu o soluţie alcalină de sulfat Cu (II) şi determină apariţia unei coloraţii albastru-violet.

Intensitatea culorii este o măsură a numărului de legături peptidice prezente într-o proteină.

Reacţia nu este specifică pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.

Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).

Reactivi:

Reactiv biuret;

soluţie standard proteică cu concentraţia cunoscută (5 mg/ml) de albumină serică bovină (BSA);

proba de analizat reprezentată extract proteic total.

Pt. curba etalon:

BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD concentratie proteica diferita

Pt. proba

EPT diluat corespunzator

+ reactiv biuret

Incubare 10’/ 37°C. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 540nm. Citirea se face fata de A.D.

LP 4Reacţii de identificare a

glucidelor

Glucide testate in

cadrul L.P.

Reacţii de identificar

e a glucidelor

Glucoza

Fructoza

Glucide testate in

cadrul L.P.

Reacţii de identificar

e a glucidelor

Zaharoza

Reacţii de identificare a Reacţii de identificare a glucidelorglucidelor

Reacţia Molisch;

Reacţia cu iodul;

Reacţia Benedict;

Reacţia Seliwanoff;

Reacţia Fehling.

Reacţii de culoare

Glucide cu caracter reducator - Glucide cu caracter reducator - glucozaglucoza

Echilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.

LP 5Dozarea zaharurilor

reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina

 Principiul metodei:

In prezenta acidului acetic, la cald, zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat care prezinta un maxim de absorbtie la 630 nm.

Metoda poate fi folosită pentru determinarea concentraţiei glucozei din serul sanguin.

Reactivi:

Reactiv o-toluidina;

Solutie standrad de glucoza 100 mg%;

proba de analizat reprezentată de extract de portocala diluat corespunzător.

Pt. curba etalon:

Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.

Diferite volume sol. st. glucoza si AD concentratie diferita

Pt. proba

Extract de portocala

+ r. o-toluidina

Incubare 10’/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 630 nm fata de blanc.

Reactia glucozei cu o-toluidina

LP 5Dozarea lactozei din lapte

Lactoza – dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vacă şi 2-3% din laptele uman.

 Principiul metodei:

Concentraţia lactozei poate fi determinată prin orice metodă caracteristică pentru zaharuri reducătoare, după deproteinizarea laptelui.

În cazul acestui experiment, se realizează deproteinizarea laptelui cu o soluţie de wolframat de sodiu, dozarea efectivă realizându-se prin metoda Nelson. În cazul acestei metode, ionii de Cu (II) sunt reduşi la ioni de Cu (I), care la rândul lor reduc acidul fosfomolibdenic la un produs de reacţie albastru.

Reactivi:

reactiv alcalin de cupru;

reactiv fosfomolibdenic;

soluţie 10% de wolframat de sodiu;

soluţie M/3 de H2SO4;

soluţie stoc de lactoză 1%;

La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaugă 2 ml de soluţie de wolframat de sodiu 10% şi, încet, sub agitare constantă, 2 ml M/3 soluţie de acid sulfuric. Amestecul este adus la un volum final de 100 ml, iar după 5 minute de staţionare este filtrat printr-o hârtie de filtru.

E1 E2 E3Filtrat 1 ml -

Apa distilata 1 ml - 2 ml

Soluţie standard de lactoză* - 2ml -

Reactiv alcalin de cupru 2 ml 2 ml 2 ml

Se incubează timp de 8 minute pe baie de apă la fierbere; ulterior eprubetele se răcesc şi se adugă în fiecare eprubetă reactiv fosfomolibdenic.

Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 ml

Dupa 1 min. de staţionare, amestecurile de reacţie se diluează la un volum final de 25 ml cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4.

Se citeşte densitatea optică a probelor E1 şi E2 faţă de blanc E3, la 630 nm.

Calculul rezultatelor

Densităţile optice fiind proporţionale cu concentraţiile este valabilă relaţia: D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraţia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraţia lactozei dinm standard (0,6 mg).  Concentraţia lactozei din lapte, exprimă în g/100 ml este dată de relaţia: (D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)