A. TUJUAN

1. Memahami dan melakukan Isolasi RNA dari Candida albicans

2. Mengetahui prinsip perhitungan konsentrasi RNA hasil isolasi dengan

spektrofotometer

3. Memahami dan melakukan sintesis cDNA - Reverse Transcriptase PCR (RT-

PCR)

4. Melakukan Transformasi E.coli DH5α dan plasmid PUC 19

B. DASAR TEORI

1. Asam Ribonukleat (RNA)

Asam nukleat terdapat dua jenis yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan

asam ribonukleat (RNA). Asam-asam nukleat ini adalah molekul-molekul yang

membuat organisme hidup dapat mereproduksi komponen-komponen kompleksnya

dari satu generasi ke generasi berikutnya (Campbell, 2002). RNA merupakan

bagian terbesar asam nukleat dalam setiap sel dan lima sampai sepuluh kali lebih

melimpah daripada DNA. Peran utamanya dan yang paling difahami ialah perannya

dalam menerjemahkan informasi genetic ke dalam molekul protein. Namun RNA

berperan serta dalam fungsi-fungsi endonuklease khusus tertentu yang boleh jadi

mengatur beberapa langkah pada ekspresi gen. Virus-virus tertentu-retrovirus dan

beragam virus tunggal dan ganda hewan, tumbuhan dan insek, mempunyai genom-

genom yang tersusun dari RNA (Moeljopawiro dkk, 1992).

Berbagai jenis RNA terdapat dalam semua sel yaitu RNA ribosomal

(rRNA), RNA pemindah (tRNA) dan RNA duta (mRNA), sebagian juga

mengandung RNA sitoplasmik kecil lain (scRNA). Kurang lebih 80 persen RNA

seluler tersusun dari ketiga atau keempat spesies rRNA dan kurang lebih 15 persen

merupakan hampir 100 jenis tRNA dan kurang dari 5 persen adalah beberapa ribu

mRNA yang berbeda-beda. Kurang dari 2 persen jumlah seluruhnya adalah

sejumlah tak terhitung rRNA nuclear dan rRNA sitoplasmik kecil (Moeljopawiro

dkk, 1992).

1

RNA adalah polinukleotida-polinukleotida yang ukurannya berkisar

sedikit sekitar 70 nukleotida dalam beberapa tRNA sampai lebih dari 10.000 dalam

beberapa mRNA. Dua nukleotida purin (adenine dan guanin) dan satu pirimidin

(sitosin) umumnya ada pada nukleotida RNA dan DNA. Namun timin (5-

metildiketopirimidin) yang ada pada DNA diganti oleh urasil pada RNA yang tidak

mempunyai 5-metil. Adanya 2’-OH yang berbatasan dengan hubungan fosfodiester

antar nukleotida membuat ikatan P-O yang peka terhadap alkali dan terhadap enzim

yang membelah RNA (Moeljopawiro dkk, 1992).

Gambar 1. Basa penyusun RNA

Pentosa yang berikatan dengan basa nitrogen adalah ribosa pada

nukleotida RNA dan deoksiribosa pada molekul DNA. Perbedaan satu-satunya di

antara kedua gula ini adalah bahwa deoksiribosa tidak memiliki satu atom oksigen

pada karbon nomor 2-nya yang membuat namanya disebut deoksi. Dalam suatu

polimer asam nukleat atau polinukleotida, nukleotida-nukleotida dihubungkan

dengan ikatan kovalen yang disebut ikatan fosfodiester antara fosfat dari suatu

nukleotida dan gula dari nukleotida berikutnya. Pengikatan ini menghasilkan suatu

tulang belakang dengan suatu pola gula-fosfat-gula-fosfat yang berulang. Di

sepanjang tulang belakang gula-fosfat ini terdapat tempelan tambahan yang terdiri

atas basa-basa nitrogen (Campbell, 2002).

2

Kebanyakan RNA seluler berantai tunggal, meskipun beberapa genom

virus hewan (misalnya reovirus) terdiri dari molekul RNA beruntai ganda

menyerupai DNA bentuk A. Untai-untai tunggal hampir selalu membentuk

potongan-potongan helical ganda, pendek, intramolekuler. Ini timbul karena

kebanyakan rantai RNA mempunyai daerah-daerah pendek urutan-urutan

komplementer yang memperbolehkan rantai menyimpul balik membentuk daerah-

daerah helical terbatas. Di daerah-daerah beruntai ganda, A berpasangan dengan U

dan G berpasangan dengan C. G juga dapat membentuk pasangan basa dengan U,

namun kurang stabil daripada pasangan G-C standart, karena sebagai gantinya tiga

ikatan hidrogen, mereka hanya membuat dua ikatan. Segmen-segmen helical ganda

yang terbentuk dengan cara ini biasanya pendek dan terputus, karena urutan basa

pada dua daerah yang berinteraksi, jarang berkomplementer sempurna

(Moeljopawiro dkk, 1992).

Seperti halnya pada DNA, daerah-daerah helical ganda pada RNA

dikacaukan oleh kenaikan suhu dan pH tinggi. Namun berbeda dengan yang ada

pada DNA, ikatan-ikatan fosfodiester pada RNA dibelah pada pH tinggi, karena

panjang daerah-daerah helical pada RNA untai tunggal pendek dan sering tidak

sempurna, daerah-daerah ini mudah dikacaukan. Namun RNA untai ganda

komplementer penuh, meleleh tajam pada kisaran suhu yang sempit, seperti untai

ganda DNA. Seperti DNA, denaturasi untai ganda RNA menghasilkan dua untai

tunggal komplementer yang dapat berasosiasi kembali bila suhu diturunkan secara

lambat. Pada RNA untai tunggal, sesudah renaturasi lebih sulit untuk membentuk

kembali daerah-daerah pasangan basa yang sama dan beberapa struktur pilihan

dapat dibentuk (Moeljopawiro dkk, 1992).

2. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

Teknik RT-PCR dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap

molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam

sel. Sebelum teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya

dilakukan dengan metode hibridisasi in situ, northern blot, dot blot atau slot blot,

3

analisis menggunakan S1 nuklease atau dengan metode pengujian proteksi RNase

(RNase protection assay). Metode hibridisasi in situ bersifat sangat sensitif

sehingga dapat digunakan untuk analisis molekul mRNA yang terdapat dalam

jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit untuk dilakukan. Metode-metode

yang lain meskipun lebih mudah dilakukan, tidak cukup sensitif. Oleh karena itu,

kemudian dikembangkan teknik RT-PCR untuk mengatasi kelemahan-kelemahan

metode yang lain tersebut (Yuwono, 2006).

Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA

sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse

transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA

(complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai

cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi

ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning dan analisis,

maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono, 2006).

Gambar 2. Sintesis cDNA

4

Teknik RT-PCR memerlukan enzim transkriptase balik (reverse

transcriptase). Enzim transkriptase balik adalah enzim DNA polimerase yang

menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk menyintesis molekul DNA

(cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim

transkriptase balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse

transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun

oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV) dan Tth DNA polimerase. RTase

yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu

menyintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polimerase

mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1 -2 kb (Yuwono, 2006).

Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa

macam primer yaitu: 1) Oligo (dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang akan melekat

pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA mamalia. Primer semacam ini pada

umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap. 2) Heksanukleotida acak, yang

akan melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian manapun.

Primer ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial). 3) Urutan

nukleotida spesifik, yang dapat digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA

tertentu (Yuwono, 2006).

3. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu

campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan, dibawah

pengaruh medan listrik (Suhartono, 1989). Elektroforesis adalah suatu teknik

pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan

medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang

akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik

yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul

yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa,

kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya,

maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan

5

gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya,

serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono, 2005).

Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis virus, DNA, RNA,

protein (enzim dan protein lain), molekul-molekul organik dengan berat molekul

rendah seperti asam-asam amino (Suhartono, 1989; Yuwono, 2005). Elektroforesis

DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil

pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-

potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa yaitu suatu

bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel

agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan

baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven

gelombang mikro (microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan berupa

menjadi cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang

biasanya terbuat dari (Perspex). Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel

tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang

dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang

masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil

terbentuklah lubang-lubang kecil. Ke dalam lubang-lubang kecil itulah sampel

molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk kemudian

dimasukkan ke dalam suatu tangki yang berisi buffer yang sama dengan yang

digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan tris-asetat-

EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2005).

Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan.

Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan

kutub lainnya positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul-molekul

DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian

direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromide. Etidium bromida akan

menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etiidium bromida

dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan

memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah,

6

maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-

molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Molekul RNA

dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarosa, namun

dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang mengandung formaldehid

(Yuwono, 2005).

Teknik elektroforesis DNA berkembang sehingga analisis molekul DNA

tidak hanya dapat dilakukan dengan prinsip elektroforesis linear. Beberapa teknik

baru dikembangkan, misalnya teknik pulse field gel electrophoresis (PFGE),

orthogonal field alternation gel electrophoresis (OFAGE), transverse alternating

field electrophoresis (TAFE) dan lain-lain. Disamping itu, untuk keperluan tertentu

misalnya untuk penentuan urutan basa DNA (DNA sequencing), elektroforesis

DNA dilakukan dengan menggunakan gel yang berbeda yaitu gel poliakrilamid

(Yuwono, 2005).

4. Transformasi

Transformasi adalah proses pemasukan molekul DNA yang ada dalam

keadaan bebas di dalam satu lingkungan ke dalam suatu sel penerima, misalnya

bakteri. Transformasi dapat terjadi secara alami maupun karena induksi in vitro.

Proses transformasi pertama kali ditemukan oleh Frederik Griffith pada bakteri

Streptococcus pneumoniae termasuk genus Pneumoniae yang membentuk kapsul

bersifat virulen, sedangkan yang tidak membentuk kapsul bersifat avirulen. Strain

avirulen dapat berubah menjadi virulen jika diinkubasikan dengan ekstrak sel

virulen yang sudah dimatikan. Pada tahun 1944, Avery, McLeod dan McCarty

menemukan bahwa proses transformasi dari avirulen menjadi virulen tersebut

disebabkan oleh molekul DNA yang berasal dari strain yang virulen (Moeljopawiro

dkk, 1992).

Transformasi diketahui terjadi pada genera bakteri lain termasuk

Haemophilus, Neisseria, Xanthomonas, Rhizobium, Bacillus dan Staphylcoccus.

Proses transformasi yang diinduksi secara in vitro dapat juga berlangsung pada E.

Coli, khamir Saccharomyces cerevisiae, bahkan tanaman tingkat tinggi meskipun

7

mekanisme molekulernya berbeda dari proses transformasi yang terjadi di alam

(Moeljopawiro dkk, 1992).

Salah satu syarat utama agar transformasi dapat berlangsung adalah

kompetensi sel. Sel yang kompeten adalah sel yang dapat menerima molekul DNA

dari luar. Kondisi yang mempengaruhi kompetensi sel bervariasi dari satu spesies

ke spesies lain. Kompetensi merupakan implikasi terjadinya perubahan pada

dinding sel bakteri dan diduga berhubungan dengan sintesis materi dinding sel pada

tahapan pertumbuhan tertentu. Dalam proses perkembangan kompetensi sel, akan

terbentuk reseptor pada dinding sel yang merupakan tempat melekatnya molekul

DNA pada awal proses transformasi. Banyaknya reseptor yang aktif bervariasi dari

satu jasad ke jasad lain, misalnya pada S. pneumoniae ada 80 reseptor, pada B.

subtilis ada 50 reseptor, sedangkan pada Haemophilu influenzae hanya ada 4

reseptor (Moeljopawiro dkk, 1992).

Kompetensi akan terjadi pada tahapan pertumbuhan tertentu, biasanya

pada fase eksponensial akhir dan dipengaruhi oleh medium pertumbuhan serta

aerasi. Banyaknya fraksi suatu kultur yang menjadi kompeten juga tergantung pada

spesies. Sebagai contoh, kompetensi pada S. pnemoniae dapat diinduksi sampai

mencapai 100% namun kondisi tersebut hanya berlangsung beberapa menit.

Sebaliknya, pada B. subtilis kompetensi hanya akan mencapai 20% akan tetapi

dapat berlangsung selama beberapa jam (Moeljopawiro dkk., 1992).

Pada umumnya proses pemasukan molekul DNA dari luar ke dalam sel

inang bersifat tidak spesifik, artinya tidak tergantung pada spesies inang tersebut.

Dengan demikian jika dua macam molekul DNA yang berasal dari sumber berbeda

digunakan untuk transformasi sel yang sama, maka kedua macam DNA tersebut

akan berkompetisi dalam proses transformasi (Moeljopawiro dkk., 1992).

Transformasi dapat terjadi secara alami maupun karena induksi. Dalam

proses transformasi secara alami, misalnya Pneumococcus, sel dapat menerima

DNA untai ganda berbentuk linier. Agar DNA tersebut dapat direplikasikan dan

diturunkan ke sel anakan, maka donor tersebut harus diintegrasikan dengan

mekanisme rekombinasi pada daerah gen yang homolog pada sel penerima. Plasmid

8

yang dapat digunakan untuk transformasi semacam ini biasanya adalah plasmid

yang dapat melakukan replikatif secara independen sehingga tidak perlu ada proses

rekombinasi dengan genom sel penerima. Pada umumnya sel penerima yang

digunakan dalam transformasi secara induksi adalah sel yang tidak mampu

melakukan rekombinasi (recA). Hal ini dimaksudkan agar tidak terjadi proses

penyusunan genom kembali (rearrangements). Meskipun demikian, dalam

beberapa prosedur kloning gen, kadang-kadang juga digunakan plasmid yang tidak

mampu melakukan replikasi secara independen sehingga plasmid tersebut harus

diintegrasikan ke dalam genom sel penerima (integratting plasmid) agar gen yang

dibawa oleh plasmid dapat direplikasikan. Pada bakteri E. coli, induksi transformasi

dapat dilakukan dengan menginkubasikan sel penerima di dalam larutan CaCl22

dingin sebelum dicampur dengan DNA donor (Moeljopawiro dkk, 1992).

Pada bakteri lain, misalnya Bacillus subtilis, transformasi biasanya dilakukan

dengan metode transformasi protoplas. Dalam hal ini, dinding sel dihilangkan

terlebih dahulu dengan enzim tertentu. Penghilangan dinding sel tersebut dilakukan

di dalam larutan tertentu, misalnya sukrosa pada konsentrasi tertentu, untuk

mempertahankan tekanan osmose sehingga protoplas yang terbentuk tidak akan

lisis. Transformasi dapat juga dilakukan dengan metode elektroporasi yaitu dengan

menggunakan pulsa listrik bervoltase tinggi dalam waktu singkat (Moeljopawiro

dkk., 1992).

Pada praktikum kali ini plasmid yang digunakan untuk transformasi

adalah PUC 19. Plasmid pUC 19 merupakan salah satu vektor kloning yang biasa

digunakan dalam penelitian – penelitian biologi molekuler. Plasmid ini berukuran

2686 pasang basa dan memiliki tiga bagian utama yaitu gen resisten ampisilin, gen

lac-Z yang mengandung Multiple Cloning Site (MCS), dan Origin of Replication

(ORI) (Lodge, 2007).

9

Gambar 3. Struktur Plasmid PUC 19 (Lodge, 2007)

C. METODE

1. Isolasi RNA dari Candida albicans

a. Alat : tabung eppendorf, mikropipet, vortex merk “Beckmen”, sentrifuge

b. Bahan : Trizol 1 ml, Kloroform 200 µl, iso-propyl alcohol 500 µl, etanol 1

ml, RNAase free water

c. Cara Kerja : Tambahkan 1 ml Trizol ke dalam sampel Candida Albicans.

Tambahkan 200µl kloroform ke dalam 1 ml Trizol. Inversi selama 15 detik.

Inkubasi pada suhu ruang (15-30 oC) selama 3 menit. Sentrifus 3.000 rpm

selama 30 menit pada suhu 4 oC. Ambil lapisan bagian atas (colorless) lebih

kurang 60% total suspensi trizol, pindahkan ke tabung baru. Tambahkan 0,5

ml iso-propyl alcohol dalam setiap trizol yang digunakan. Inkubasi 15-30 oC

(suhu ruang) selama 10 menit. Sentrifus 3.000 rpm selama 20 menit pada 10

suhu 4 oC. presipitat RNA tampak seperti gel di sisi dasar/ tepi tabing. Buang

supernatant. Cuci pellet RNA dengan 1 ml etanol 75%. Vortex sebentar.

Sentrifus pada 3.000 rpm selama 5 menit. Buang supernatant, keringanginkan

pellet selama 10 menit. Larutkan RNA dalam RNAase free water 20µl.

simpan dalam suhu -80 oC.

2. Pengukuran konsentrasi RNA hasil isolasi

a. Alat : mikropipet, spektrofotometer

b. Bahan : RNA hasil isolasi, RNAase free water, aquadest

c. Cara Kerja : Ambil 2 µl RNA hasil isolasi, masukkan dalam cuvet,

tambahkan 98 µl RNAase free water, homogenkan. Masukkan dalam

spektrofotometer. Tera pada panjang gelombang 260 nm.

3. Pembuatan cDNA – Reverse Transcriptase PCR

a. Alat : tabung eppendort, mikropipet, alat PCR “Gene AMP PCR system

2400”

b. Bahan : hasil isolasi RNA, Anchored-oligo (dT) 18 primer, RNA template,

RNAase free water, Spesific reverse primer, RNA template, transcription

buffer, protector RNAase inhibitor, deoxynucletid mix, transcriptionn RT

enzyme

c. Cara kerja :

1) Siapkan sampel isolasi RNA

Kelompok 1 : 996

Kelompok 2 : 662

2) siapkan campuran template RNA dan primer pada tabung PCR 0,2 ml

dengan komposisi sebagai berikut :

Kelompok 1 Jml (µl) Kelompok 2 Jml (µl)

11

Anchored-oligo (dT) 18 primer 1 Spesific reverse primer 3

RNA template 5 RNA template 5

RNAase free water 7 RNAase free water 5

total 13 total 13

Primer yang dipakai :

RTA3-F CGA AGG CAA ACC AAG TCC AT

RTA3-R TAC CAA TCA TTG CTG CAT CC

3) ke dalam masing-masing campuran template-primer tambahkan reagensia

sebagai berikut :

transcription buffer 4 µl

protector RNAase inhibitor 0,5 µl

deoxynucletid mix 2 µl

transcriptionn RT enzyme 0,5 µ

total 7 µl

sehingga total campuran = 13 + 7 = 20 µl

4) Setting PCR

cDNA synthesis 55 oC selama 30 menit

Denaturasi 1 siklus ; 94 oC selama 2 menit

Amplifikasi PCR 35 siklus ;

Denaturasi : 94 oC selama 30 detik

Annealing : 50 oC selama 1 menit

Extention : 68 oC selama 2 menit

Final extension 85 oC selama 5 menit

Hold 4 oC

4. Elektroforesis hasil RT-PCR12

a. Alat : Erlenmeyer, timbangan analit, Microwave, Cetakan Gel Agarose, sisir

cetakan, Alat elektroforesis, Mikropipet, Tabung Eppendorf

b. Bahan : agarose 2 gram, TAE, ethidium bromide 4µ

c. Cara kerja : buat agarose dengan konsentrasi 2 % dengan cara menimbang 2

gram agarose,, tambahkan 100 ml TAE. Panaskan dalam oven selama 2

menit (tiap 30 detik Erlenmeyer dikeluarkan + digoyang-goyang).

Tambahkan ethidium bromide 4µl. campur. Pasang sisir dalam cetakan.

Tuangkan agarose dalam cetakan, tunggu sampai beku. Copot sisir + pasang

gel pada alat. Tambahkan buffer TAE sampai gel terendam. Masukkan

sampel yang akan dirunning. Run pada 100 volt. Visualisasi dengan UV

5. Transformasi

a. Alat : mikropipet, tabung ependorf, sentrifuge, vortex, incubator + shaker,

batang drugalski/ batang L, bunsen

b. Bahan : E.coli DH5α, plasmid PUC 19, LB medium, larutan MOP, CaCl2,

RbCl, LB padat yang mengandung amphicilin

c. Cara kerja : Tumbuhkan bakteri E.coli DH5α dalam LB medium semalam.

Culture diambil 200 µl dimasukkan dalam LB medium 5 ml. inkubasi pada

37˚C selama 2-3 jam dengan goyangan (OD=0,54). Ambil 1.5 ml culture

bakteri, dimasukkan dalam eppendorf. Sentrifus selama 5 detik. Supernatant

dibuang, pellet dicuci dengan 250 µl larutan MOP, CaCl2, RbCl. Sentrifus 5

detik. Supernatant dibuang, pellet disuspensikan dengan MOP, CaCl2, RbCl

400 µl (suspensikan pelan-pelan) diamkan dalam es selama 45 menit.

Sentrifus 5 detik. Supernatant dibuang, pellet disuspensikan dengan 150 µl

larutan MOP, CaCl2, RbCl. Tambahkan DNA 2 µl, diamkan dalam es selama

45 menit. Panaskan dalam waterbath, 42˚C selama 2 menit. Dinginkan dalam

es selama 1-2 menit. Tambahkan LB medium, inkubasikan pada incubator

37˚C, selama 1 jam. Ambil culture 100-150 µl, dituang pada LB padat yang

mengandung antibiotic amphicilin,, ratakan. Plate diinkubasikan pada

incubator 37˚C semalam.

13

D. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Isolasi RNA dan pengukuran konsentrasi

Isolasi RNA melalui 5 tahapan yaitu: 1). Homogenisasi, 2). Separasi, 3)

Presipitasi RNA, 4). Pencucian RNA, 5). Redissolving RNA. Tahap homogenisasi,

sampel Candida albicans ditambah reagen Trizol LS. Proses separasi dilakukan dengan

penambahan chloroform ke dalam sampel yang telah dihomogenisasi. Setelah

disentrifuge, sampel akan terpisah menjadi 2 bagian: bagian atas adalah fase air (bening)

& bagian bawah adalah sel yang rusak (coklat tua), diantara kedua fase tersebut terdapat

padatan berwarna putih susu. Fase air mempunyai volume sebesar 70% dari volume

reagen Trizol LS yang digunakan. RNA berada dalam fase air tersebut. Memasuki tahap

presipitasi, fase air diambil kemudian ditambah dengan isopropanol. Fungsi isopropanol

adalah untuk membantu presipitasi RNA. Pellet RNA baru akan terlihat, setelah

dilakukan sentrifuge. Pellet RNA berwarna putih susu. Setelah itu pellet RNA dicuci

dengan menggunakan ethanol 75%. Pellet RNA kemudian dianalisis konsentrasinya

dengan menggunakan spektrofotometer. Analisis dilakukan dengan panjang gelombang

260 nm. Pembacaan 260 nm memungkinkan untuk menghitung konsentrasi asam

nukleat. OD yang diperoleh dari panjang gelombang tersebut kemudian dimasukkan

dalam rumus untuk menghitung konsentrasi RNAnya.

Rumus = OD 260 x pengenceran x konstanta = ….µg/ ml

Konstanta RNA = 40

Kemurnian RNA yang diperoleh dalam praktikum dapat dilihat dalam Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Spektrofotometer RNA

14

Kelompok Kode OD 260 pengenceran konstanta Konsentrasi (µg/ml)

1

110-0 0,0280

50 40

5,6996-0 0,0080 1,6662-0 0,0160 3,2300-0 0,0120 2,4

2

110-0,6 0,003 0,6996-0,6 0,004 0,8662-0,6 0,0300 6300-0,6 0,0260 5,2

Konsentrasi RNA yang diperoleh yang tertinggi adalah 6 µg/ml dan yang

terendah 0,6 µg/ml. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan dalam perbedaan

pengambilan supernatant, pengenceran dengan RNAase free water untuk

spektrofotometer atau pembersihan cuvet yang kurang maksimal sehingga range OD

yang diperoleh bervariasi.

2. Pembuatan cDNA dan Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

RNA yang telah diisolasi kemudian digunakan sebagai template untuk

mensintesis DNA dalam proses PCR. Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan

menggunakan RNA sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi

balik (reverse transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul

cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai

cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR memerlukan enzim transkriptase balik

(reverse transcriptase). Enzim transkriptase balik adalah enzim DNA polimerase yang

menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk menyintesis molekul DNA (cDNA)

yang komplementer dengan molekul RNA tersebut (Yuwono, 2006).

Sampel yang dipakan untuk pembuatan cDNA ada dua buah yaitu kode 1-996

dan 2-662. RT-PCR yang dilakukan dalam praktikum melalui beberapa tahap yaitu

sintesis cDNA (55oC selama 30 menit), pre denaturasi (94oC selama 2 menit), denaturasi

(94oC selama 30 detik), annealing (50oC selama 1 menit), extension (68oC selama 2

menit) dan final extension ((85oC selama 5 menit) sebanyak 35 kali (siklus). Menurut

15

Artama (1991), kostruksi cDNa meliputi beberapa langkah mulai sintesis DNA yang

komplementer dengan sekuen mRNA, dimana reaksi ini memerlukan jarak cetakan

(template) RNA, primer komplementer, reverse transkriptase dan dNTP. Molekul yang

biasanya dipaki sebagai inisiasi sintesis cDNA adalah oligo dT karena molekul ini dapat

membentuk hibrid dengan poli A dari ujung 3’ template RNA, namun demikian random

oligomer DNA juga dapat berfungsi sebagai primer. Pemakaian oligomer spesifik (oligo

dT) menghasilkan pembentukan kopi panjang (penuh) dari mRNA, dapat mengetahui

sekuen yang dikehendaki dan juga dapat mentranskripsi langsung dari satu atau lebih

mRNA. Akan tetapi secara garis besar cDNA yang diproduksi sangat tergantung dari

kualitas reverse transkriptase, panjang dari mRNA yang akan dikopi serta derajat

interferensi antara struktur sekunder mRNA dengan primer oligo (dT).

Reaksi pelipatan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi

DNA template sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan

terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan dengan

menggunakan panas (95oC) selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55oC

(1-2 menit) sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah

terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan

cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu 55oC yang

digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi

akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah (37oC), tetapi biasanya

akan terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Pada suhu

yang lebih tinggi (55oC), spesifisitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara

keseluruhan efisiensinya akan menurun (Yuwono, 2006).

Primer merupakan suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida)

yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada

dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai

DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat dan oligonukleotida yang kedua identik dengan

sekuen pada ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain. Setelah dilakukan annealing

oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72oC

selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi

16

rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah

terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan

adanya ikatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan

adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil

polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi

95oC. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi

reaksi polimerasi berikutnya (Yuwono, 2006).

Reaksi-reaksi tersebut diulangi lagi sampai 25-30 kali (siklus) sehingga pada

akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil

polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA

cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi

DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak diperlukan 25 siklus untuk

melipatgandakan satu kopi sekuen DNA target di dalam DNA genom mamalia agar

hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforesis gel agarose. Akan

tetapi, pada umumnya konsentrasi DNA polimerase Tag menjadi terbatas setelah 25-30

siklus amplifikasi (Sambrook et al., 1989 cit. Yuwono, 2006).

3. Elektroforesis hasil RT-PCR

Elektoforesis yang digunakan dalam praktikum adalah elektroforesis gel agarose.

Elektroforesis bertujuan untuk memisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya,

dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan (Yuwono, 2005). Elektroforesis dalam

praktikum digunakan untuk membuktikan ada tidaknya DNA dalam sampel yang

dianalisis. Elektroforesis gel agarose juga digunakan sebagai pemurnian sampel cDNA

sebelum digunakan untuk kloning (Yuwono, 2006)

Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan

menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya sehingga bisa diketahui

perkiraan ukuran DNA sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil

elektroforesis adalah jumlah DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang

dipengaruhi oleh ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus

17

listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa,

dan komposisi buffer elektroforesis.

Konsentrasi gel agarose yang diguanakan dalam penelitian ini adalah 2%. Setelah

agarose ditimbang dan diberi TAE maka selanjutnya yaitu dipanaskan dengan oven yang

bertujuan unutk melarutkan dengan sempurna agarose. Langkah selanjutnya yaitu

penambahan ethidium bromide pada gel agarose. Intercalating agent Ethidium bromide (EtBr)

merupakan pewarna berfluorescent yang biasa digunakan untuk mendeteksi asam nukleat.

Sesaat setelah EtBr ini ditambahkan ke dalam gel agarosa, maka akan terjadi pengikatan

molekul ini diantara sela – sela pasangan basa DNA. Penambahan EtBr ke dalam gel agarosa

dimaksudkan untuk memudahkan kita dalam mengamati hasil elektroforesis karena hanya

sedikit saja yaitu sekitar 1 ng molekul DNA yang dapat dideteksi tanpa menggunakan EtBr. EtBr

akan menghasilkan perpendaran ketika dipaparkan di atas sinar UV. Namun demikian, perlu

diperhatikan bahwa EtBr dapat mengurangi mobilitas linier dari molekul molekul DNA sampai

15 % dan juga sifatnya yang karsinogenik atau zat mutagen kuat. Selanjunya sampel yang telah

ditambah loading buffer dimasukkan ke dalam sumuran lalu dirunning pada 100 volt. Hasil

Elektroforesis dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 4. Hasil elektroforesis : 1. Marker, 2. cDNA 996, 3. cDNA 662,

4. PCR, 996, 5. PCR 662, 6. PCR ready to go

18

Hasil elektroforesis cDNA maupun hasil RT-PCR tidak menunjukkan band-band

seperti yang diharapkan. Hal ini kemungkinan karena konsentrasi hasil isolasi RNA

yang digunakan untuk pembuatan cDNA terlalu rendah (berdasarkan pengukuran

spektrofotometer). Band yang muncul hanya band dari marker (paling kiri). Konsentrasi

minimal sampel untuk PCR minimal adalah 50 ng/ µl sampel. Sedangkan konsentrasi

sampel yang digunakan yaitu 1,6 dan 6 µg/ml sehingga band pada elektroforesis tidak

dapat terdeteksi.

Kemungkinan lain yaitu karena konsentrasi agarose yang digunakan (2%) tidak

sesuai dengan ukuran DNA pada sampel yang dirunning. Penggunaan gel agarosa

dengan konsentrasi yang berbeda akan menghasilkan laju migrasi molekul – molekul

DNA yang berbeda juga. Penentuan konsentrasi gel agarosa yang akan digunakan harus

memperhatikan ukuran molekul – molekul DNA yang akan diruning. Umumnya,

konsentrasi yang tinggi dari gel agarosa biasanya digunakan untuk memfasilitasi

pemisahan molekul – molekul DNA yang berukuran kecil, sedangkan konsentrasi gel

agarosa yang lebih rendah, umumnya digunakan untuk memisahkan molekul – molekul

DNA dengan ukuran yang lebih besar.

19

4. Transformasi

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang

bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah

karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut.

Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Pada

praktikum dilakukan transformasi E.coli DH5α dan plasmid PUC 19 yang mengandung

gena yang resisten terhadap amhycilin. Agar dapat menerima gen baru, maka E. Coli

dibuat menjadi sel kompeten dengan cara penambahan CaCl22, RbCl2 dan perlakuan

kejut panas-dingin. Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel kompeten

mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada

permukaan sel. Penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan

kejut panas. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori

pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya

plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi

untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang

ekstrem.

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi

apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena

plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di

dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh

plasmid tersebut. Hasil transformasi kemudian ditanam di media LB padat yang

mengandung amphycilin untuk melihat apakah transformasi berhasil yaitu ditunjukkan

dengan tumbuhnya koloni E.coli pada medium yang mengandung amphycilin. Hasil

penanaman pada LB padat dapat dilihat pada gambar berikut.

A1-100 µl B1-100 µl

20

A2-100 µl B2-100 µl

A1-150 µl B1-50 µl

Gambar 5. Hasil transformasi E.coli yang ditanam pada LB yang mengandung ampyhcilin

21

Pada semua plate, E.coli dapat tumbuh membentuk koloni-koloni yang

menandakan proses trasnformasi telah berhasil. Koloni yang terbentuk

merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel.

Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari

bakteri transforman saja.

Tabel 2. Hasil penghitungan koloni

Plate Jumlah Koloni

a1-100 TBUDa2-100 TBUDb1-100 TBUDb2-100 TBUDa1-150 TBUDb1-50 96 CFU

*TBUD : terlalu banyak untuk dihitung

Hasil TBUD pada penghitungan jumlah koloni kemungkinan disebabkan

karena jumlah suspense bakteri yang ditanam terlalu banyak atau karena waktu

inkubasi yang terlalu lama. Waktu inkubasi ideal menurut protocol adalah 16

jam, sedangkan pada praktikum ini waktu inkubasinya melebihi protocol (44

jam).

Pada praktikum ini tidak dikerjakan perlakuan sebagai control/

pembanding yaitu E.coli tanpa proses transformasi (tidak resisten amphycilin)

yang dapat digunakan sebagai perbandingan antara E.coli yang dapat dan tidak

dapat tumbuh dalam media LB yang mengandung amphycilin.

Koloni E.coli yang tumbuh telah berhasil disisipi plasmid yang

mengandung gen yang resisten terhadar amphycilin. Gen penyandi ini akan

mengeksploitasi enzim b-lactamase ke dalam plasma sel bakteri inang, dimana

enzim ini akan mengkatalisis proses hidrolisis cincin b lactam sehingga jika

proses transformasi berhasil, maka sel bakteri inang akan memiliki kemampuan

untuk hidup dan tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik amphisilin

22

E. KESIMPULAN

1. Konsentrasi RNA hasil isolasi dari sampel Candida albicans yaitu 5,6 µg/ml; 1,6

µg/ml; 3,2 µg/ml; 2,4 µg/ml; 0,6 µg/ml; 0,8 µg/ml, 6 µg/ml, dan 5,2 µg/ml.

2. Hasil isolasi RNA Candida albicans tidak dapat langsung digunakan untuk

template PCR, namun terlebih dahulu harus dibuat cDNA agar bisa menjadi

template untuk PCR (Reverse Transcriptase PCR).

3. Elektroforesis agarose dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan

menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya sehingga bisa diketahui

perkiraan ukuran DNA sampel, melalui prinsip perbedaan kecepatan migrasi di

dalam gel.

4. Hasil elektroforesis pada praktikum tidak menunjukkan band-band, diduga

karena jumlah DNA dalam sampel sangat kurang atau konsentrasi gel agarose

yang tidak sesuai dengan ukuran DNA.

5. Proses transformasi E.coli DH5α dan plasmid PUC 19 berhasil, ditunjukkan

dengan tumbuhnya koloni-koloni dalam LB yang mengandung amphycilin.

23

DAFTAR PUSTAKA

Artama, W. T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi,

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Campbell, N. A., J. B. Reece dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Edisi Kelima. Jilid I.

Penerbit Erlangga, Jakarta.

Lodge,J. Lund, P. Minchin, S. 2007. Gene Cloning. Taylor and Francis Group.

University of Birmingham. UK

Moeljopawiro, S., Sudjadi, Ismadi, S. Sodoadisewoyo, H. Hartiko, W. Asmara, T.

Yuwono dan Sisimindari. 1992. Genetika Molekuler. Reviewer: Joedoro

Soedarsono. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Suhartono, M. T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Antar Universitas

Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Penerbit Erlangga, Jakarta.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. C. V. Andi

Offset, Yogyakarta.

24

LAPORAN PRAKTIKUM

DIAGNOSTIK MOLEKULERSEMESTER 2 TAHUN AJARAN 2009/2010

PRAKTIKUM 2

ISOLASI RNA, PEMBUATAN cDNA dan RT-PCR,ELEKTROFORESIS, TRANSFORMASI

OLEH :

Nama : ENDAH SUPRIYATINIM : 09/ 291022/ PMU/ 6025Kelompok : ITanggal Percobaan : Minggu III dan IV

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGISEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS GADJAH MADA

25

2010DAFTAR ISI

A. Tujuan.................................................................................................................. 1

B. Dasar teori............................................................................................................ 1

1. Asam Ribonukleat (RNA)............................................................................. 1

2. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)......................................................... 3

3. Elektroforesis................................................................................................ 5

4. Transformasi................................................................................................. 7

C. Metode................................................................................................................. 10

1. Isolasi RNA dari Candida albicans................................................................ 10

2. Pengukuran konsentrasi RNA hasil isolasi.................................................... 11

3. Pembuatan cDNA – Reverse Transcriptase PCR........................................... 11

4. Elektroforesis hasil RT-PCR.......................................................................... 13

5. Transformasi................................................................................................... 13

D. Hasil dan Pembahasan......................................................................................... 14

1. Isolasi RNA dan pengukuran konsentrasi...................................................... 14

2. Pembuatan cDNA dan Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)..................... 15

3. Elektroforesis hasil RT-PCR.......................................................................... 17

4. Transformasi................................................................................................... 20

E. Kesimpulan.......................................................................................................... 23

Daftar Pustaka.......................................................................................................... 24

26