La synthèse de l'acide δ-aminolévulinique et de la chlorophylle lors de l'éclairement d'Euglena...

Biochimica et Biophysica Acta, 313 (1973) 130-149 Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

BBA 27151

LA SYNTHI~SE DE L'ACIDE 6-AMINOLI~VULINIQUE ET DE LA CHLORO-

PHYLLE LORS DE L'I~CLAIREMENT D'EUGLENA GRACILIS I~TIOLI~ES

FR~DI~RIC RICHARD et VICTOR NIGON

Section de Biologie gdndrale et appliqude, Laboratoire associd au C.N.R.S., Universit~ de Lyon-I, 43, boulevard du 11 novembre 1918, 69621-Villeurbanne (France)

( R ~ u le 2 janvier, 1973)

SUMMARY

Synthesis of 6-aminolevulinic acid and chlorophyll dur&o illumination of etiolated Euolena oraeilis

1. Addition to greening Euolena of levulinic acid, a competitive inhibitor of 6-aminolevulinate dehydratase, temporarily stops chlorophyll synthesis and produces accumulation of 6-aminolevulinate. The amount of 6-aminolevulinate accumulated 30 min after inhibitor addition is stoichiometrically equivalent (within :[: 10 %) to the chlorophyll produced in control cells during the same time.

2. In the presence of inhibitor, a small quantity of 6-aminolevulinate is produced by etiolated Euolena during growth in the dark. In greening Euglena returned to dark, the synthesis of 6-aminolevulinate is progressively abolished after 20 rain. Thus, the synthesis of 6-aminolevulinate in Euolena shows an indirect dependance towards light.

3. The observations lead to the recognition of at least three ways of control for the synthesis of 6-aminolevulinate and its precursors: one way is related to cellular growth in the dark, the second depends on active photosynthesis and may be blocked by 3(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dimethylurea (DCMU), and the last, unimpaired by DCMU, depends on light but not on photosynthesis. This last way is effective at the beginning of greening, and is turned off before the end of the process. Besides, 6-aminolevulinate synthesis can be limited by factors related with the abundance and mobility of cellular reserves.

4. Addition of 6-aminolevulinate does not increase the production of chlorophyll, except during the terminal phase of greening, when cellular reserves are nearly consumed. Thus, the synthesis of chlorophyll pigments seems to be regulated either by a limitation of 6-aminolevulinate precursors or by a limitation in the last stages of the synthesis, according to the stage of greening. In the latter case, a feedback control limits 6-aminolevulinate production.

La formation des pigments chlorophylliens laisse place ~t diverses incertitudes portant, d'une part, sur la nature des interm6diaires de la synth6se, d'autre part, sur les m6canismes qui pr6sident ~t la r6gulation de la chalne biosynth6tique.

SYNTH~SE DE ~$-AMINOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 131

Les auteurs admettent g6n6ralement que la biosynth6se de la chlorophylle passe par la formation d'acide tS-aminol6vulinique selon un sch6ma similaire ~t celui d6crit pour l'6dification des porphyrines animales et de la bact6riochlorophylle chez Rhodopseudomonas spheroides. Les arguments reposent, pour une part, sur l'6tude, dans diverses conditions, de la synth6se de pigments chlorophylliens et des interm6di- aires correspondants apr6s addition d'acide &aminol6vulinique ou de pr6curseurs de l'acide &aminol6vulinique 1-7. D'autres preuves sont fournies par l'action de l'acide 16vulinique, inhibiteur coml~titif de la transformation de l'acide 6-aminol6vulinique, qui r6duit la synth6se de la chlorophylle et entralne l'accumulation d'acide 6-amino- 16vulinique; cette derni6re observation a 6t6 faite chez les chlorelles 8,9, chez Euglena gracilis ~ o, chez le ma'is et le haricot ~. Cependant, on n'a obtenu, jusqu'~t pr6sent, que des r6sultats n6gatifs dans toutes les tentatives effectu6es en vue de mettre en 6vidence, in vitro, ~ partir d'extraits v6g6taux, l'activit6 de l'acide tS-aminol6vulinique- synth6tase, enzyme qui catalyse la formation d'acid 6-aminol6vulinique h partir de glycine et de succinyl-CoA; l'insucc6s de ces tentatives a conduit certains auteurs chercher la production 6ventuelle d'acide tS-aminol6vulinique par d'autres voies 12.

Le r61e limitant des synth6ses prot6iques dans la formation de la chlorophylle est attest6 par de nombreuses exp6riences faisant appel ~t l'emploi d'inhibiteurs des synth6ses prot6iques. Cependant, selon les travaux, on observe que raddition d'acide &aminol6vulinique exog6ne permet ou non, dans ces conditions de prot60synth6se bloqu6e, d'observer une formation de chlorophylle. De sorte que, d'apr6s certains auteurs, la r6gulation par les synth6ses prot6iques s'op6rerait au niveau d'enzymes intervenant dans la synth6se de l'acide t~-aminol6vulinique 1,a. D'apr6s d'autres, elle s'exercerait dans les phases terminales de la synth6se de chlorophylle, par l'intervention de prot6ines ~t activit6 stoechiom6trique 2. II est ~t noter, d'ailleurs, que les parti- sans de eette derni6re hypoth6se sugg6rent qu'une r6troaction, s'exer~ant ~t partir des phases terminales de la biosynth6se de la chlorophylle, vient limiter la synth6se d'acide ~-aminol~vulinique a a.

Le pr6sent travail est consacr6 ~t l'&ude d'un certain hombre de facteurs susceptibles d'intiuencer la production d'acide 6-aminol6vulinique et de chlorophylle chez les eugl6nes &iol6es en cours de verdissement h la lumi6re.

Les hypoth6ses auxqueUes conduisent les r6sultats observ6s ne diff6rent pas signifieativement de celles des auteurs sauf pour admettre, que, selon les moments et les conditions, les facteurs limitants majeurs peuvent r6pondre, chez l'eugl6ne, ~t l'un ou ~t l'autre des deux m6canismes envisag6s. En outre, nous avons observ6 l'existence transitoire, au cours du verdissement, d'une voie de synth6se d'acide 6-aminol6- vulinique dont la d6pendance, vis ~t vis de l'6clairement, s'exerce ind6pendamment de la photosynth6se.

MATl~RIEL ET MI~THODES

Les &udes ont 6t6 effectu6es sur Euglena #racilis Z (souche 1224 5/25). Les eugl6nes sont maintenues 6tiol6es par culture permanente h l'obscurit6, depuis six ann6es, sur le Milieu NCa 14. Les exp6riences sont effectu6es sur des cultures parvenues en phase stationnaire et plac6es, ~t ce moment, durant 4 ~t 7 jours, sur un milieu ne permettant pas la croissance. Ce milieu de jeOne est constitu6 soit par la fraction min6rale du Milieu NCa, d6pourvue d'ammonium, soit par une solution de KCI 0.01 M,

132 F. RICHARD, V. NIGON

acide citrique 0.02 M, amen6e ~t pH 3.0 par addition de potasse. Les d6nombrements cellulaires sont effectu6s h l'aide d'un compteur Coulter.

L'6clairement des cultures destin&s h verdir est fourni par une lampe ~t vapeur de Na donnant environ 4700 lux au niveau des cultures. Au moment de l'6clairement, celles-ci reqoivent une addition de NH4C1 les amenant h la concentration de 20 mM.

Dosage de la chlorophylle Extraite par l'ac6tone pure, la chlorophylle est dos6e dans l'ac&one amen6e

80 %, en utilisant la formule d 'Arnon 15. Les r6sultats sont exprim6s en moles en adoptant la valeur de 900 comme poids mol6culaire moyen des chlorophylles.

Dosage de l" acide 6-aminol~vulinique ddhydratase 4 °C, un culot d'eugl6nes lav6es est broy6 h la presse de French dans un

tampon Tris-HCl 0.05 M, pH 7.8; fl-mercapto6thanol 0.01 M. Les d6bris cellulaires sont 61imin6s par centrifugation ~t 4000 × g durant 10 min. L'activit6 enzymatique est mesur6e, h 25 °C, dans le surnageant, selon Shemin 16, par dosage du porphobilino- g6ne form6, en employant un r6actif d'Ehrlich modifi6 selon Urata et Granick 17. Un terme correctif (inf6rieur ~t 1%) est introduit pour tenir compte du porphobilino- g6ne transform6 en porphyrines (dos6es par la bande de Soret ~t 406 nm en pr6sence d'HC1 2.5 M). L'activit6 enzymatique est exprim6e en nmoles de porphobilinog6ne form6, par heure et pour 106 cellules.

Dosage et purification de l'acide 6-aminoldvulinique 4.5 ml de culture sont additionn6s de 0.5 ml d'acide trichlorac6tique pur. Le

m61ange est alors centrifug6 pour 61iminer les cellules et le surnageant est soumis au dosage. Dans certains cas, en vue de doser s6par6ment la teneur en tS-aminol6vulinate des cellules et celle du milieu de culture, la culture est centrifug~ avant addition d'a- cide trichlorac&ique. On ajoute ensuite 0.5 ml d'acide trichlorac6tique pur au milieu de culture tandis que le culot de cellules reqoit 5 ml d'acide trichlorac6tique 10 % (v/v).

La caract6risation de l'acide 6-aminol6vulinique ainsi que sa concentration, dans les circonstances o~ l'extrait initial apparait trop dilu6, ont 6t6 effectu6es apr6s chromatographies successives sur Dowex 1 et Amberlite IRC 50 ~7.

L'acide 6-aminol6vulinique est dos6 apr6s condensation avec l'ac6tylac6tone et addition de r6actif d'Ehrlich 17. L'intensit6 de la coloration est lue dans l'extrait dos6 et dans une s6rie &alon, h raide d'un spectrophotom&re Cary 16 en utilisant une cuve de trajet optique 5 cm. Le traitement de l'extrait condens6 h l'ac6tylac&one par l'6ther rectifi6, avant addition de r6actif d'Ehrlich, n'a pas montr6 la pr6sence de compos6s susceptibles de r6agir avec le r6actif d'Ehrlich en faussant le dosage de l'acide ~-amino- 16vulinique 2°.

Mesure de la production d'oxyg~ne photosynth~tique Les mesures sont effectu6es h l'aide d'un Oxygraphe Gilson respectivement

la lumi6re et ~t l'obscurit6.

RI~SULTATS

Activit$ de l'acide 6-aminol~vulinique d$hydratase en presence d'acide l$vulinique L'influence de l'inhibiteur sur des extraits enzymatiques d'eugl6nes a 6t6 v6ri-

fi6e en dosant l'activit6 de l'acide 6-aminol6vulinique d6hydratase en pr6sence de

SYNTH~SE DE ~-AM1NOLI~VULINATE-ET DE CHLOROPHYLLE 133

0,5

0,25

r

I i i 1 5 10

Fig. 1. Inhibition de l'activit6 de l'acide 6-aminolSvulinique-dShydratase par l'acide l~vulinique. Un extrait est pr6par6 ~ partir d'une culture d'eugl~nes 6tiol6es, 6clair6e depuis dix heures. L'extrait est additionn6 d'aeide 6-aminol6vulinique et d'acide lSvulinique. On dose la quantit6 de porphobilino- gbne produit aprSs 1 h. Abscisses: concentration du milieu r6actionnel en acide 16vulinique (raM). Ordonn6es: inverse de l'activit6 enzymatique exprim6e en nmoles de porphobilinog6ne fortunes par h et par 106 ceUules. Concentrations initiales d'acide 6-aminol6vulinique dans le milieu: 1 ram (Fq); 3 mM (,); 7 mM (©); 10 mM (~).

concentrations variables d'acide 16vulinique et d'acide 6-aminol6vulinique (Fig. 1). On observe une inhibition de type comp6titif (K,=0.4 raM).

La production d'acide 6-aminol~vulinique par les EuglOnes en presence d'acide lOvulinique

L'addition d'acide 16vulinique ~t des cultures d'eugl6nes 6tiol~es en cours de verdissement entratne l 'accumulation d'acide 6-aminol6vulinique. L'efficacit~ de rinhibiteur s'av6re plus forte h p H acide (pH 3.0) qu'~t p H neutre: on peut supposer que cet effet r6sulte d 'une influence du pH sur la perm6abilit6 cellulaire. L'analyse quantitative des effets de l 'inhibiteur a 6t~ poursuivie d 'abord sur des cultures 6tiol6es soumises h la lumi6re depuis 8 h. Dans les conditions de nos exp6riences, la synth6se de chlorophylle pr6sente, ~t ce moment, ehez les t6moins, une vitesse maximale, stable durant plusieurs heures. Par la suite, l 'analyse a 6t6 poursuivie sur des cultures pr61ev6es ~t divers stades du verdissement afin d'examiner l'6volution du processus.

La production d'acide 6-aminol~vulinique par des cultures d'Eugl~nes $tiolOes soumises gl 8 h de verdissement

D~roulement de la production et localisation de l' acicte 6-aminolOvulinique (Fig. 2). Apr6s addition d'acide 16vulinique, la quantit6 d'acide 6-aminol6vulinique produite augmente, sans latence mesurable, pendant une dur6e de 4 h environ. Durant les 30 premi6res min, l 'augmentation de la quantit6 d'acide 6-aminol6vulinique suit une loi lin6aire pour s'infl6chir ensuite progressivement. Si, apr6s s6paration des cellules et du milieu par centrifugation (voir Mat6riel et M6thodes) on dose les quantit6s d'acide 6-aminol6vulinique, respectivement pr6sentes darts les cellules elles-mSmes et darts le milieu de culture, on observe que, durant 1 h, la totalit6 de l'acide 6-aminol6vulinique form6 est situ6e ~t l'int6rieur des cellules; par la suite, il passe progressivement dans le

134 F. R I C H A R D , V. N I G O N

milieu de culture, tandis que la teneur intracellulaire passe par un maximum puis d6crott pour devenir tr6s faible apr6s 24 h. Corr61ativement, la synth~se de chlorophylle pr6sente une valeur n6gligeable aussit6t apr6s addition de l'inhibiteur, pour reprendre par la suite. L'ensemble du processus peut s'expliquer si l'on suppose que l'inhibiteur, bloquant le fonctionnement de l'acide 6-aminol6vulinique d6hydratase, entratne l'accumulation d'acide 6-aminol6vulinique et l'arr~t de synth6se de la chlorophylle. Celle-ci reprend lorsque la concentration intracellulaire d'acide 6-aminol6vuli- nique est devenue suffisante pour entrer en comp6tition avec l'effet de l'inhibiteur. A partir de ce moment, l'acide 6-aminol6vulinique produit est m6tabolis6, 6chappant l'accumulation. Dans la suite du travail, on examinera syst6matiquement la production d'acide 6-aminol6vulinique dans les 30 min qui suivent l'addition de l'inhibiteur: elle se d6roule alors avec une vitesse constante traduisant, si ron admet les hypoth6ses pr6c6dentes, la vitesse effective de synth6se de l'acide 6-aminol6vulinique.

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Fig. 2. Production d'acide 6-aminol6vulinique par des eugl6nes 6tiol6es apr~s 8 h d'6clairement. Apr~s 8 h d'6clairement, une culture d'eugl~nes 6tiol6es rec, oit 17.5 m M d'acide 16vulinique. Des aliquotes sont pr61ev6es pour doser l'acide 6-aminol6vulinique: dans l'ensemble de la culture ( O - O ) ; dans les cellules (O . . . . . O ) et dans le milieu ( , - - -*) apr~s s6paration par centrifugation. Ordon- n~es: production d'acide 6-aminol6vulinique en nmoles/106 cellules. (a) Abscisses: h It partir de l'addition d'acide 16vulinique. (b) Abscisses: min tt partir de l'addition d'acide 16vulinique.

SYNTHESE DE ~-AMINOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 135

I I I I I 5 tO 15 2 0 2 5

Fig. 3. Influence de la concentration d'acide 16vulinique sur la production d'acide t~-aminol6vulinique. Apr~s 8 h d'6clairement, une culture d'euglenes 6tiol6~s est partag6e en aliquotes qui re~oivent, chacune, une addition d'acide 16vulinique. 20 rain apr~s cette addition, la production d'acid¢ t~- aminol6vulinique est dos6e. Abscisses: concentration de l'acide 16vulinique en raM. Ordonn6es: vitess¢ de production de l'acide 6-aminol6vulinique en nmoles/h par l06 collules.

V/1// / / / / / /° .~°°. , ,~, ' / / / / / / I / / l l / I 8 ~ 4 heure$

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Fig. 4. Effet des alternances lumi~re-obscurit6 sur la production d'acide ~-aminol~vulinique. Apr~s 8 h d'~clairement, une culture d'eugl~nes 6tiolges est divis6e en deux aliquotes qui sent port~es /L l'obscurit6. La Partie 1 (O) re~oit en m~me temps de l'acide l~vulinique (17.5 raM). La Pattie 2 ( 0 ) re~oit une addition d'acide 16vulinique 3 h 55 min apr~s la raise/l l'obscurit6, puis est 6clair~e 5 rain plus tard. Abscisses: temps en min apr~s les additions d'acide 16vulinique. Ordonn6cs: vitesse de production d'acide 6-aminol6vulinique en nmoles/10 s cellules par min. - . . . . , evolution au cours de la phase d'obscurit6; - - - , evolution durant la phase d'6clairement.

Effets de la concentration d'acide ldvulinique (Fig. 3). Pour des concentra t ions faibles et croissantes d ' inhibi teur , on observe en 30 min, une p roduc t ion croissante d 'ac ide 6-aminol6vulinique. Celle-ci atteint, ~t par t i r de l0 m M d 'acide 16vulinique, un m a x i m u m qui se maint ient ju squ '~ 20 m M d' inhibi teur . Des concentra t ions plus

61ev6es entra tnent une p roduc t ion plus faible. Main tenues durant 24 h, les concen- t rat ions 61ev6es entra inent un blanchissement des cellules. Ce blanchissement peut Etre d6finitif, ce qui semble indiquer une influence de l ' inhibi teur sur l '6volut ion des structures plastidiennes. L 'existence de cet effet justifie 6galement la l imitat ion de


notre 6tude au cadre de l'influence exerc6e durant les trente minutes qui suivent raddition de l'inhibiteur.

Effets des alternances lumi~re-obscurit~. Lorsqu'une culture ayant requ de l'acide 16vulinique est report6e ~t l'obscurit6, la production d'acide 6-aminol6vulinique se poursuit en diminuant rapidement pour s'annuler 25 min apr6s le retrait de la lumi6re (Fig. 4). Si une culture, 6clair6e pendant 8 h puis report6e pendant 4 h l'obscurit6, est remise ~t la lumi6re en pr6sence d'acide 16vulinique, la production d'acide 6-aminol6vulinique reprend progressivement d6s le d6but de ce r66clairement, avec une latence non mesurable. La vitesse de production d'acide 6-aminol6vulinique se stabilise alors tr6s rapidement au niveau qui avait 6t6 atteint apr6s 8 h d'6clairement continu.

Effets du 3-(3,4-dichloroph~nyl)-l,l-dim~thylur~e (DCMU). Le r6tablissement rapide de la production d'acide 6-aminol6vulinique lors d 'un r66clairement conduit ~t poser la question d'une relation 6ventuelle entre la production d'acide 6-aminol6vuli- nique et la photosynth6se. Celle-ci peut ~tre bloqu6e par l'emploi de divers inhibiteurs. Parmi ceux-ci, le DCMU est particuli6rement efficace b. faible concentration. Nous avons observ6, en effet, que raddition de DCMU (1 • 10 -5 M) entraine, en quelques secondes, la chute de la production photosynth6tique d'oxyg6ne ~t moins de 3 ~ de la valeur observ6e chez les t6moins.

Lorsque le DCMU est ajout6, en pr6sence d'acide 16vulinique, h une culture 6alair6e depuis 8 h et maintenue ~ la lumi6re, la production d'acide 6-aminol6vulinique tombe en 5 rain h 35 ~ de la valeur observ6e chez les t6moins. Cette production r6siduelle se maintient par la suite (Fig. 5). Si une culture reqoit du DCMU durant 30 rain 5. la lumi6re pour ~tre ensuite port6e ~t l'obscurit6 et additionn6e d'acide 16vuli- nique, la production r6siduelle d'acide 6-aminol6vulinique diminue progressivement et s'annule 20 min apr6s le retour ~t l'obscurit& Si le D CMU est ajout6 en m6me temps que la culture est report6e ~t l'obscurit6, la production d'acide 6-aminol6vulinique 6volue de la m~me faqon que dans les cultures port6es h l'obscurit6 sans DCMU.

Les r6sultats de ces exp6riences peuvent &re port6s en coordonn6es semi- logarithmiques (Fig. 6). On observe alors des graphes lin6aires respectivement pour l'6volution de la production d'acide 6-aminol6vulinique ~t l'obscurit6 dans une culture pr6atablement limit6e par le DCMU (Graphe []), et pour l'6volution de la production d'acide 6-aminol6vulinique ~ la lumi~re apr6s addition de DCMU (Graphe ©). En revanche, le report ~ l'obscurit6 en l'absence de DCMU fournit une repr6sentation biphasique (Graphe , ) .

L'ensemble de ces observations conduit ~t introduire une hypoth6se d'apr6s laquelle la lumi6re exercerait son contr61e sur la production d'acide 6-aminol6vulinique par deux voies. L'une de ces voies, bloqu6e par l'addition de DCMU, serait life au d6roulement de la photosynth6se: nous d6signerons eette voie par l'abr6viation DCs (DCMU sensible).

Apr6s addition de DCMU, cette voie s'6teint en suivant une cin6tique repr6- sent6e par le Graphe (3 (Fig. 6). Une autre voie est insensible h raddition de DCMU et sera d6sign6e sous le nom de DCr (r6sistant au DCMU). En passant ~t l'obscurit6, cette seconde vole s'6teint en suivant une cin&ique repr6sent6e par le Graphe []. Dans cette hypoth6se, le report ~t l'obscurit6 d'une culture, en l'absence de DCMU, devrait entrainer l'extinction simultan6e des voies DCs et DCr. Si l 'on suppose, en premi6re approximation, que la cin6tique d'extinction de la voie DCs est identique qu'elle soit

SYNTHI~SE DE t~-AMINOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 1'37

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Fig. 5. Influence du DCMU sur la production d'acide ~-aminol6vulinique. Apr/~s 8 h d'~clairement, une culture d'eugl6nes 6tiol6es est additionn~e d'acide 16vulinique (17.5 raM) et partag6e en quatre aliquotes. La Partie 1 est maintenue ~t la lumi~re ([]); la Partie 2 est port6e h l'obscurit6 (O); les Parties 3 et 4 re~oivent en m~.me temps du DCMU (1 • 10 -5 M), la Partie 3 6tant maintenue/t la lumi~re (*), tandis que la Partie 4 est port6e/l l'obscurit6 ( 0 ) . Abscisses: temps en min apr/~s addition d'acide l~vulinique. Ordonn~.es: vitesse de production d'acide ~-aminol6vulinique en nmoles/10 a cellules par min. - . . . . , evolution/t l'obscurit6; - - , evolution ~t la lumi~re.

Fig. 6. D~Scroissance de la vitesse de production d'acide 6-aminol6vulinique dans diverses conditions. Les donm~es des Figs 4 et 5 sont port6es en coordonn~es semi-logarithmiques. Abscisses: temps en min apr~s addition d'acide l~vulinique. Ordonn~es: logarithme de la vitesse de production d'acide 6-aminol6vulinique en nmoles/10 a cellules par min. (* . . . . -~, action conjugu~e de l'acide 16vulinique et du report h l'obscurit6 sur une culture sans DCMU; O . . . . . O , action conjugu6e de l'acide 16vuli- nique et du D C M U h la lumi~re (on a port6 ici la diff6rence de vitesses entre la production d'acide ~-aminol(~vulinique/~ l'instant observ6 et la production stable d'acide 6-aminol6vulinique observ6e 15 min apr~s l'addition des r6actifs); FI-[], action conjugu~e de l'acide 16vulinique et du retour ~t l'obscurit6 sur une culture additionn~e de DCMU 30 min auparavant; • . . . . O, somme des valeurs obtenues en O et fq.

p r o v o q u 6 e p a r un passage h l ' obscu r i t 6 o u p a r une a d d i t i o n de D C M U , le r e p o r t d ' u n e

cu l tu re h l ' obscur i t6 , en l ' a b s e n c e de D C M U ( G r a p h e , ) dev ra i t c o r r e s p o n d r e h la

r6su l tan te des c in6t iques repr6sent6es r e s p e c t i v e m e n t p a r les G r a p h e s [] et O. Ce t t e r6su l tan te a 6t6 ca lcul6e ( G r a p h e O) : o n c o n s t a t e qu ' e l l e p r6sen te e f fec t ivement une s imi lar i t6 n o t a b l e avec le t rac6 du G r a p h e *. Effets du r@dclairement en prdsence de DCMU. Si des cu l tu res soumises ~t l ' i n f luence c o m b i n 6 e du D C M U et de l ' obscu r i t 6 s o n t r66clair6es, o n obse rve une repr ise de la p r o d u c t i o n d ' a c i d e 6 - amino l6vu l in ique . Cel le-c i r e t r o u v e , u n ce r t a in t e m p s apr6s le d6bu t du r66clairernent , la vi tesse r6siduel le cons ta t6e apr6s a d d i t i o n de D C M U a v a n t

le r e p o r t h l ' obscur i t6 , c ' e s t4 t -d i re la v i tesse ca rac t6 r i s t ique de la vo ie DCr. Ce r6ta- b l i s s emen t de la p r o d u c t i o n d ' a c i d e cS-aminol6vul inique s ' op6re p lus ou m o i n s vi te


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0 10 20 30 40 50

Fig. 7. Effet des alternances lumi~re-obscurit~ sur la production d'acide 6-aminol6vulinique en presence de DCMUo Apr~s 8 h d'6clairement, une culture d'eugl/:nes 6tiol6es reqoit du DCMU (1 • 10-5 M). 30 rain plus tard, la culture est partag6e en 7 aliquotes. Les Parties I e t 2 sont alors additionn6es d'acide 16vulinique, la Partie 1 restant h la lumi~re (O), tandis que la Partie 2 est port6e ~ l'obscurit6 (I-q). Les autres parties sont port6es ~ robscurit6 pendant des dur6es variables; elles reqoivent de l'acide 16vulinique et sont r66clair6es. Dur6es de s6jour h l'obscurit6:5 min (,); 10 min (©); 30 min (11); 1 h (A) et 4 h (6toile ouverte). Abscisses: temps en rain apr~s les additions d'acide 16vulinique. Ordonn6es: vitesse de synth~se de l'acide ~-aminol6vulinique en nmoles/10 a ceilules par rain.

selon la dur6e de la phase d 'obscur i t6 (Fig. 7). Le m a x i m u m est a t te in t moins de 10 rain apr6s le d6but du r66clairement si la phase d 'obscur i t6 n ' a pas dur6 plus de 10 rain. Apr6s des phases d 'obscur i t6 prolong6es, il est a t te in t plus lentement , exigeant 50 min pou r des dur6es d 'obscur i t6 6gales ou sup6rieures a 1 h.

Cette observa t ion d6mont re que l ' influence de l '6clairement sur le d6roulement de la voie DCr s 'exerce sans doute h plusieurs niveaux qui pr6sentent, lors du re tour

l 'obscuri t6, des dur6es de survie diff6rentes. En par t icul ier , l 'une des composan tes de la voie DCr doi t se d6grader ~t l ' obscud t6 avec une cer taine lenteur et se reconst i tuer len tement ~ la lumi6re. Si le s6jour ~t l 'obscur i t6 a 6t6 t r op b re f pou r autor i ser la d6grada t ion de cette composan te , une autre composan te devient visible caract6ris6e pa r une r6act ion plus rap ide lors du re tour ~t la lumi6re.

En outre, si l ' on adme t que la recons t i tu t ion de la voie DCr, lors du r66claire- ment, s 'effectue de la m~me mani6re en pr6sence ou en l ' absence de D C M U , on abou t i t h la conclus ion qu ' au d6but du r66clairement sans D C M U , la voie DCs suppl6e ~t la d6ficience momentan6e de la voie DCr de faqon complbte: en effet, la p roduc t ion d ' ac ide 6-aminol6vul inique a t te in t a lors la m~me valeur qu 'apr6s un 6clairement cont inu. Or, dans les condi t ions de cette exp6rience, la voie DCr est inactive au d6but du r66clairement, tandis qu 'el le est active lors d ' un 6clairement cont inu.

Evolution de la production d'acide 6-aminoldvulinique au cours des dtapes du verdissement

La production lots d'un dclairement eontinu. Nous avons 6valu6 la vitesse de p roduc t ion d ' ac ide 6-aminol6vul inique en la mesuran t du ran t les 30 min qui suivent

SYNTHESE DE tS-AMINOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 139

l'addition de l'acide 16vulinique. Cette mesure, pratiqu6e ~t divers moments du verdissement sur diff6rentes aliquotes d'une mSme culture, montre que la production 6volue de mani6re caract6ristique.

Les aliquotes recevant une addition d'acide 16vulinique durant les 3 premi6res h qui suivent le d6but de l'6clairement montrent une production d'acide 5-aminol6vuli- nique qui augmente en fonction des temps d'6clairement croissants. Si les vitesses ainsi observ6es sont report6es, sur un graphique, ~t l'instant qui correspond & l'addition de l'inhibiteur, on constate une relation approximativement lin6aire (Fig. 8a). On notera toutefois que les points repr6sentatifs des 20 premi6res min se trouvent syst6- matiquement en dessous de la droite trac6e. L'interpr&ation de ce dernier fair re-

0.1

0.05

I ~ ~

1 2 3

0.4 •

0.2 r ~" ~" ~,

o ' " q - - - ~ - - ~ o 20 40

Fig. 8. Evolution, au cours du verdissement, des productions d'acid¢ t~-aminol6vulinique et de chlorophylle. Une culture d'eugl~nes 6tiol~cs est 6clair~¢. Des aliquotes pr61ev~s & divers intervalles permettcnt de doser, d'une part, la quantit6 de chlorophylle form6e ¢t la vitess¢ de synth~s¢ dans l'intervall¢ de deux mesures (O), d'autre part, apr~s addition d'acide 16vulinique, la vitess¢ de production d'acide 6-aminol6vulinique en pr6sence de DCMU (6toile ouverte) et ¢n l'absence de DCMU (*). Sur une culture parall61¢, additionn6e de DCMU dos 1¢ d6but de l'6clairement, on dose la production de chlorophylle (O). Abscisses: temps ¢n h & partir du d6but de l'6clairement. Ordonn~es: production pour 10 6 cellules et par h. Chlorophylle ¢n nmoles; acidc ~-aminol6vulinique ¢n nmoles/8.


quiert une certaine prudence car le dosage exige alors une concentration du produit, par passage sur une colonne de r6sine, susceptible d'entrainer des pertes; cette concentration n'est plus indispensable dans les cultures 6clair6es depuis plus de 30 min. Une production d'acide 6-aminol~vulinique croissant relativement moins vite au d6but de l'~clairement pourrait aussi indiquer soit l'&ablissement progressif de l'acc616ration caract~ristique du ph6nom~ne, soit l'existence d'une phase de latence, de 10 min environ, int6gr6e dans une mesure qui s'6tale sur 30 min.

Par la suite, la vitesse de production d'acide 6-aminol6vulinique croit moins vite pour atteindre un palier apr~s 6 ~t 8 h d'~clairement. Celui-ci se maintient jusqu'~ 20 h environ apr~s le d6but de l'6clairement. Puis la production d'acide 6-aminol6vuli- nique d6crott pour tomber ~t une valeur faible apr~s 40 h d'6clairement (Fig. 8b). Rappelons que, dans les conditions de ces exp6riences, la multiplication cellulaire est tr~s faible ou nulle.

On a 6galement mesur6, apr~s addition d'acide 16vulinique, la production d'acide 6-aminol~vulinique dans des cultures ~tiol~es maintenues ~t l'obscurit6. En phase stationnaire, ces cultures ne produisent pas d'acide 6-aminol6vulinique en quantit6 mesurable. Au contraire, une culture en phase exponentielle produit de l'acide 6-aminol6vulinique ~t la vitesse de 0.018 nmoles/106 ceUules par h. Cette synth~se d'acide 6-aminol6vulinique se d6roulant ~t l'obscurit6 permet de supposer l'existence d'une troisi+me modalit6 de contr61e, life cette fois ~t la croissance cellulaire: nous la d6signerons par l'abr6viation Cod (croissance ~t l'obscurit~ d6pendante).

Les eomposantes du eontr61e. Sur des eugl~nes 6tiol6es, la pr6sence d'une faible quantit6 de pigments chlorophylliens susceptibles d'&re photoconvertis par un bref 6clairement ne peut donner lieu qu'~t une photosynth~se tr~s limit6e. Cette simple r6flexion permet de supposer qu'au d6but du verdissement, le contrfle de la synth~se d'acide 6-aminol6vulinique par la lumi6re ne peut gu~re s'op6rer par la photosynth~se et doit done r6pondre h la modalit6 DCr. Cette supposition est v6rifi~e si l 'on compare la production d'acide 6-aminol6vulinique dans des cultures en d6but de verdissement, respectivement en pr6sence et en l'absence de D C M U (Fig. 8a). On observe alors que ces deux cat6gories de cultures fournissent des quantit6s d'acide 6-aminol~vulinique identiques durant 1.5 h apr~s le d6but de l'~clairement. Pass~ ce d61ai, la production d'acide 6-aminol~vulinique est affaiblie en presence de DCMU, traduisant alors l'intervention d'une composante DCs en m~me temps que la production photosynth6tique d'oxyg~ne devient d6celable. Au-delh de ce moment, la composante DCr cessera bient6t de s'aceroitre pour se maintenir h une valeur relativement stable durant 6 8 h; apr~s quoi elle d6croit et devient tr6s faible 30 h apr~s le d6but de l'6clairement.

En d6finitive, le d6but du verdissement apparait marqu~ par le d6veloppement de la composante DCr qui cesse de s'accrottre lorsqu'apparait la composante DCs; le d6veloppement de cette derni6re est 1i6 ~t l'existence d'une photosynth6se notable. Par la suite, la composante DCr s'6teint progressivement jusqu'h ne plus laisser subsister que la composante DCs.

La baisse d'activit6 de DCs, en fin de verdissement, s'op~re en m~me temps que s'~puisent les r6serves carbonics de la cellule 1 ~. Afin de v6rifier si une baisse d'appro- visionnement carbon6 constitue un facteur limitant ~t ce moment, on a examin6 reffet exerc6 par l'addition d'un nutriment carbon~ exog~ne, l'&hanol. Dans ce but, une culture d'eugl6nes 6tiol~es, ~clair~e depuis 26 h, est partag~e en quatre aliquotes. Des additions d'6thanol (30 mM) et d'acide l~vulinique sont effectu~es sur ces aliquo-

SYNTHI~SE DE ~-AMINOLI~VUL1NATE ET DE CHLOROPHYLLE

TABLEAU I

INFLUENCE D'UNE ADDITION D'ETHANOL SUR LA PRODUCTION D'ACIDE 6- A MINOLI~VULIN1QUE

Les chiffres indiquent la production d'acide t$-aminol6vulinique en nmoles/106 cellules par h.

141

Addition d' acide ldvulinique

Apr~s 26 h Apr~s 30 h d' dclairement d' dclairement

T6moins sans addition d'6thanol 1.56 1.02

Addition d'6thanol apr~s 26 h d'6clairement 1.48 1.24

tes, distribu6es selon les indications du Tableau I. La production d'acide ~-aminol~vulinique est mesur6e dans les 30 min suivant l 'addition d'acide 16vulinique.

On observe, sur ce tableau, un effet positif exerc6 par un suppl6ment d'6thanol. Cet effet se manifeste avec un certain retard par rapport au moment de l'addition; il est insuflisant pour emp~cher toute d6croissance dans la productivit6 d'acide fi-amino- 16vulinique.

Influence des phases d'obscurit~. On peut comparer la production maximale d'acide ~-aminol6vulinique avant et apr6s une phase d'obscurit6 de 4 h. Cette expe- rience a 6t6 d6crite plus haut pour un report h l'obscurit6 survenant 8 h apr6s le d6but de l'6clairement: on a vu alors que les maxima de production sont identiques avant et apr6s la phase obscure. Le fait qu'apr6s 8 h d'6clairement, et dans des conditions d'illumination continue, la production d'aeide tS-aminol6vulinique se trouve dans une phase tr6s stable, peut suffire h expliquer ce r6sultat. Des exp6- riences similaires ont done ~t6 pratiqu~es respectivement 4 h apr6s le d6but de l'6claire- ment, c'est-b.-dire dans une phase croissante de la production d'acide fi-aminol~vulinique, et apr6s 26 h d'6clairement continu, dans une phase d6croissante de la synth6se d'acide ~-aminol6vulinique.

Apr6s 4 h d'6clairement suivies d'une phase d'obscurit6 de 4 h (Fig. 9a), l'6clai- rement restitue une production d'acide di-aminol6vulinique 6qqivalente ~t celle obser- v6e apr6s 4 h d'6clairement seulement, nettement inf6rieure h la production constat6e apr~s 8 h d'6clairement continu. La m~me exp6rience pratiqu6e apr6s 26 h d'6claire- ment (Fig. 9b) donne lieu, lors du r66clairement, ~t une production d'acide fi-amino- 16vulinique qui d6passe ~t la lois la production observ6e apr6s 26 h d'6clairement et la production, plus faible que la pr6c6dente, obtenue apr6s 30 h d'~clairement continu.

I1 s'av6re, en d6finitive, que la lumi6re intervient, non seulement pour activer les syst6mes producteurs d'acide tS-aminol6vulinique, mais encore pour ajuster le d~veloppement de ces syst6mes et fixer les limites de leur activit6. Dans les deux conditions &udi6es, le passage b. l'obscurit~ bloque l'6volution normale de ces limites observ~e chez les t6moins, que cette 6volution soit eroissante ou d6croissante. Bien plus, dans le cas de l'6volution d6croissante observ6e apr6s 26 h d'6clairement, le passage ~t l 'ob- scurit6 entraine un effet inverse et aboutit ~t une certaine eroissance de la production d'acide tS-aminol6vulinique. Si r o n admet que, dans la derni6re phase du verdissement, l 'un des facteurs de eontr61e soit repr6sent6 par l'6puisement des r6serves, on peut


0.5

1

- - - - c I I 0 15 30

0.6

0.3

o

~ b

15 30

Fig. 9. Respectivement 4 h (a) ou 26 h (b) apr6s le d6but de l'6clairement, deux cultures d'eugl6nes 6tiol6es sont partag6es en trois aliquotes. Les Parties 1 ( 0 ) reqoivent imm6diatement de l'acide 16vulinique (17.5 raM). Les Parties 2 (*) reqoivent l'acide 16vulinique apr~s un 6clairement suppl6- mentaire de 4 h. Les Parties 3 (©) sont port6es/l l'obscurit6 durant 3 h 55 rain puis re~oivent de racide 16vulinique et sont 6clair6es 5 rain plus tard. Abscisses: temps en rain apr~s addition de l'acide 16vulinique. OrdonnEes: production d'acide t~-aminol~vulinique en nmoles/106 cellules.

ch~ofophylle ~ ~ ~ " ~ activit~ ¢ ~ , ~ _ _ ~ enzymatrque

15 /~" 30

//,2/--'/-- . . . . o-- . . . . --o . . . . . . . . ---

, / / f ~ _ 5i ~ 10

- - Q ~ ~---~

0 I I 0 20 40

Fig. 10. Evolution de l'aetivit~ de l'acide ~-aminol(~vulinique d~hydratase et de la teneur, cellulaire en chlorophylle au cours de l'6clairement. Une culture d'eugl~nes 6tiol6es est ~clair6e. Au cours du verdissement, des aliquotes sont pr61ev6es r6guli~rement et report~es/t l'obscurit6. Activit6 de l'acide &-aminol6vulinique d6hydratase darts les cultures constamment 6clair6es (C)- - O ) et darts des cultures report6es ~t l'obscurit6 apr~s un certain temps d'6clairement (C)--(3). Teneur cellulaire en chtorophylle dans les cultures constamment 6clair~S ( O ~ O ) et dans des cultures r e p o r t ' s / t rob- scurit6 aprSs un certain temps d'6clairement ( 0 - 0 ) . Abscisses: temps en h apr~s le d6but de l'6clai- rement. Ordonn6es: chlorophylle (nmoles/106 cellules); activit6 enzymatique (nmoles de porphobilinog~ne form6es par h et par l0 s cellules).

suppose r que la m o b i l i s a t i o n de cel les-ci , se p o u r s u i v a n t h l 'obscur i t614, a l imen te un p o o l de m a t 6 r i a u x i m m 6 d i a t e m e n t d i spon ib le s d o n t l ' u t i l i s a t ion est m o i n s r a p i d e l ' obscu r i t 6 q u ' h la lumi6re ; dans ces c o n d i t i o n s , ce p o o l p o u r r a i t se t r o u v e r m o m e n t a - n 6 m e n t ampl i f i6 p a r un r e t o u r pas sage r ~t l 'obscur i t6 . Si le v o l u m e de ce p o o l repr6sen- tai t , ~t ce t te phase t e r m i n a l e du ve rd i s semen t , un f ac t eu r l imi tan t , on p o u r r a i t e x p l i q u e r l 'effet p a r a d o x a l observ6 lors du r e t o u r ~ la lumibre .

SYNTHl~SE DE 6-AM1NOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 143

La production de chlorophylle L'tvolution de la teneur cellulaire en chlorophylle et celle de l'activit6 de l'acide

t~-aminoltvulinique dthydratase montrent un certain paralltlisme au tours du verdissement (Fig. 10). Ainsi, ~ partir de 12 h d'tclairement, le rapport entre l'activit6 enzymatique et la teneur cellulaire en chlorophylle reste pratiquement constant. Lorsque les cultures sont reporttes ~t l'obscuritt, on observe un arr& de la croissance, tant pour la chlorophyUe que pour l'activit6 enzymatique.

Si l'on compare, ~t divers moments du verdissement, la vitesse de production de la chlorophylle dans une culture ttmoin et la vitesse de production de l'acide 6- aminoltvulinique observte dans une aliquote durant les 30 rain qui suivent l'addition d'acide 16vulinique, on observe, ~t tout moment, entre les deux param&res, une 6qui- valence stoechiomttrique avec une prtcision de :k_ 10 % environ (Fig. 8).

On peut aussi comparer, dans des cultures 6tioltes en phase exponentielle, maintenues, ~t l'obscuritt, la production de protochlorophylle et l'aptitude ~t produire racide 6-aminoltvulinique. Nous avons mesur6 une production de protochlorophylle se montant ~t 1.65 pmoles/106 cellules par h. Comme il faut 8 moles d'acide 6-amino- 16vulinique pour former 1 mole d'htme, la valeur prtctdente est compatible avec une production d'acide 6-aminoltvulinique qui, dans les m~mes conditions, s'~l~ve ~t 18 pmoles/106 cellules par h. De m~me, la production d'acide 6-aminoltvulinique apr~s retour ~t l'obscurit~ d'une culture 6clairte se monte ~t 270 pmoles/106 cellules et doit ~tre compar~e ~t la teneur en protochlorophylle par cellule estimte ~t 31.5 pmoles/ 106 cellules.

L'emploi des inhibiteurs montre des paralltlismes similaires. Ainsi, on a mesur6 l'tvolution de la production de chlorophylle dans des cultures constamment soumises ~t l'action du DCMU au cours du verdissement. Dans ces conditions, la synth~se de chlorophylle s'op~re malgr6 une morphogen~se chloroplastique anormale 19. Nos observations (Fig. 8b) montrent que l'tvolution de la synth~se est alors parall~le celle du processus DCr pendant les 5 premieres h d'$clairement. Par la suite, la synth~se de chlorophylle se maintient plus longuement. Rappelons que l'tvolution du processus DCr a 6t6 suivie sur des cultures dans lesquelles le DCMU n'a ~t~ ajout6 que durant le temps ntcessaire pour en effectuer la mesure. On peut supposer que la prtsence constante du DCMU, interdisant le d6veloppement du processus DCs, entraine une prolongation du processus DCr. Malgr6 tout, celui-ci finit par s'tteindre et la quantit6 de chlorophylle ainsi produite reste notablement inftrieure ~t celle que l'on trouve chez les ttmoins.

Enfin, on notera que la fourniture d'acide 16vulinique bloque totalement la production de chlorophylle durant 1 h environ. Aprts quoi la synthtse de chlorophylle reprend, pendant un certain temps, ~ une vitesse comparable h celle des ttmoins. On peut supposer que cette reprise de la synthtse de chlorophylle intervient lorsque l'accumulation de l'acide 6-aminoltvulinique produit lui permet de surmonter la coml~tition de l'inhibiteur.

Afin de savoir si la production d'acide 6-aminoltvulinique peut &re considtrte comme un facteur limitant dans la production de chlorophylle, nous avons examin6 la synthtse de chlorophylle dans des cultures en voie de verdissement recevant un suppltment d'acide 6-aminoltvulinique dans le milieu. Les Figs l la, l ib et l lc rtsument les rtsultats de cette exptrience. Dans les premitres heures d'tclairement, l'addition d'acide gi-aminoltvulinique exogtne rtduit la vitesse de synthtse de la


. . .

/ , , : 7 /

' ...;'

I I 20 40

100~

50

b

I |

0.2

0.1

/ f o ~

I I 10 20 0 10 20

Fig. 11. Effet d'une addition d'acide 6-aminol6vulinique exog6ne sur la synth6se de chlorophylle. Des cultures d'euglbnes 6tiol6es re9oivent une addition d'acide 6-aminol6vulinique au d6but de l'6clairement. (a) Concentrations d'acide 6-aminol6vulinique ajout6es: 0 mM ( 0 - 0 ) ; 5 mM (T]- - -V]). 10 mM (C)---(3); 20 mM (* . . . . . . ,). Abscisses: h apr6s le d~but de l'6clairement. Ordonn6es: teneur en chlorophylle (nmoles/10 ° cellules). (b) Abscisses: concentration d'acide 6-aminol6vulinique exog6ne en raM. Ordonn6es: vitesse de synth6se de la chlorophylle apr6s 5 h d'6clairement en ~ du t6moin. (c) Abscisses: concentration d'acide 6-aminol6vulinique exog~ne en raM. Ordonn6es: vitesse de synth6se de la chlorophylle apr6s 40 h d'6clairement (en nmoles/10 ° cellules par h).

chlorophylle. Dans une deuxi6me phase, la synth6se de chlorophylle 6volue parall61e- ment dans les diverses cultures, comme si l 'acide 6-aminol6vulinique exog6ne n'exer- qait aucune influence, Enfin, apr6s 20 h d'6clairement, 1'addition d'acide 6-amino- 16vulinique exog6ne entralne une augmenta t ion de la synth6se de chlorophyIle.

Les effets observ6s en d6but et en fin de verdissement d6montrent que l 'acide 6-aminol6vulinique exog6ne p6n6tre effectivement dans la cellule. Il y produit , dans les condit ions de nos exp6riences, des effets diff6rents selon les phases du verdissement consid6r6es. Ce qui doit entra iner h une tr6s grande prudence pour interpr6ter les corr61ations entre les product ions d'acide 6-aminol6vulinique et de chlorophylle. On reviendra sur ce point dans la discussion.

SYNTHESE DE ~-AMINOLI~VULINATE El" DE CHLOROPHYLLE 145

DISCUSSION

Les observations effectu6es conduisent/t une certaine repr6sentation du syst6me qui contr61e la synth6se d'acide t$-aminol6vulinique et la coordonne avec la synth6se de chlorophylle. Cette repr6sentation conserve encore un caract6re relativement g6n6ral et hautement conjectural. Son int6rSt principal r6side dans la nature des exp6riences qui se trouvent ainsi sugg6r6es.

Les diverses modalitds darts ie contrdle de la synthdse d' acide 6-aminoldvulinique Nous avons 6t6 conduits/ t distinguer trois modalit6s pour le contr61e de la

synth6se d'acide tS-aminol6vulinique d6sign6es respectivement par les abr6viations Cod (croissance/~ l'obscurit6 d6pendante), DCs (sensible au DCMU) et DCr (r6sis- tante au DCMU).

La modalit6 Cod est observ6e sur des eugl6nes 6tiol6es en voie de croissance /t robscurit6.

La distinction entre les modalit6s DCs et DCr repose sur l'analyse des effets exere6s par le DCMU. On doit se demander, toutefois, si cette distinction est bien fond6e; il se pourrait, en effet, que le D C M U introduise une inhibition partielle sur un processus unique. Une telle hypoth6se expliquerait diflicilement que le DCMU exeree, sur la synth6se d'acide tS-aminol6vulinique et selon les conditions de son emploi, une activit6 inhibitrice susceptible de varier entre 0 et 100 %. Si l 'on veut chercher une explication/t ces variations dans une perm6abilit6 diff6rente des cellules vis/t vis de l'inhibiteur, on devrait s'attendre ~t trouver des variations parallbles dans ses effets sur la photosynth6se, ce qui ne parait pas observ6. En outre, lors des retours h l'obscu- rit6 ou des additions de DCMU, la d6croissance de chacune des modalit6s DCs et DCr pr6sente une p6riode qui lui est propre, signifiant sans doute que les processus correspondants si6gent dans des compartiments diff6rents.

Principaux paramdtres du contr6le Chacune des modalit6s de contr61e se d6finit par ses conditions d'activit6 d'une

part, par les param6tres de cette activit6 d'autre part. Certains param6tres caract6risent r6volution d'un processus/t court terme apr6s un changement apport6 aux conditions externes de son activit6. D'autres param6tres d6finissent l'6volution du processus sur de longues dur6es lorsque les conditions externes sont maintenues constantes.

Les modalitds inddpendantes de la photosynthdse active. La modalit6 Cod est difficile h analyser en raison de la tr6s faible synth6se d'acide 6-aminol6vulinique qu'elle autorise. Elle ne donne naissance qu'/t de la protochlorophylle ce qui, pr6cis6ment, pourrait entrainer le blocage de son d6veloppement dans la mesure of 1 l'accumulation de protochlorophylle inhiberait la synth6se d'acide tS-aminol6vulinique 17. Son lien avec la croissance peut 8tre envisag6 soit sous la forme d'une limitation par une substance que la croissance ceUulaire vient diluer, soit sous celle d'une structure rapidement satur6e (holochrome?) et dont la formation serait li6e /l la croissance cellulaire.

La modalit6 DCr pr6sente, au contraire, plusieurs param6tres analysables. Lors- que, en pr6sence de DCMU, une culture passe de la lumi6re/t l'obscurit6, on observe une cin6tique de d6croissance darts la production d'acide cS-aminol6vulinique, une cin6tique de croissance lors du passage inverse. La cin&ique de d6croissance est lin6aire en coordonn6es semi-logarithmiques sugg6rant l'intervention d 'un comparti-


ment interm6diaire en voie d'6puisement; la stimulation lumineuse permettrait d'approvisionner ce compartiment. La cin6tique de croissance appara~t nettement plus complexe et d6pend, en particulier, de la dur6e de la phase d'obscurit6. Apr6s un s6jour bref ~t l'obscurit6, la synth~se d'acide 6-aminol6vulinique revient/t sa valeur maximale en quelques minutes, ce qui peut representer le temps n6cessaire pour re- garnir le compartiment pr6c6dent, apr6s 6puisement total ou partiel. Le m~me r~sultat est atteint apr6s 1 h seulement si la phase obscure a dur6 50 rain; on peut supposer qu'une seconde composante, lente ~t se reconstituer, se d6grade progressivement ~t partir de 30 rain d'obscurit6: ou bien cette composante &ait pr6sente en exc6s jusqu' alors et sa d~gradation ne devient perceptible qu'~t partir du moment off elle est d6jh assez importante, ou bien sa d6gradation est subordonn6e ~t l'6puisement pr~alable d'une autre composante. Enfin, la croissance butte dans tousles cas sur un maximum identique; celui-ci n'est pas modifi~ par un retour ~t l'obscurit6 et son 6volution rel6ve des param6tres ~t long terme. L'ensemble de ces observations 6voque donc rexistence, au sein de la voie DCr, de trois composantes 6voluant selon des cin6tiques diff6rentes lors des alternances lumi6re-obscurit6.

La modalit~ DCs. Les composantes h court terme de cette modalit6 se caract6ri- sent par des cin6tiques particuli~rement rapides. Lors d'une addition de DCMU, le compartiment correspondant est 6puis6 en moins de 5 min; lors d 'un r66clairement, I'activit6 maximale est r6tablie en moins de 3 min. D'autre part, une composante qui reste stable durant un s6jour h l'obscurit6 fixe un maximum ~t l'activit6 de cette moda- lit6; les variations de ce maximum rel6vent des param6tres ~t long terme. Cette derni6re composante semble s'imposer h la r6sultante des processus DCr et DCs. En effet, on observe le m~me maximum lors d'un r66clairement quelle que soit l'activit6 du processus DCr ~t ce moment. Cette composante peut &re con~ue soit sous la forme d'une limitation au niveau d'un pr6curseur commun, soit sous la forme d'une r6tro- action s'exerqant, ~t partir d'une m~me origine, sur l'activit6 des modalit~s DCr et DCs.

ModUles hypoth~tiques pour le contr6le de la biosynthdse D'apr6s nos observations, la coordination entre la synth6se d'acide 6-amino-

l~vulinique et la synth6se de chlorophylle peut, selon les stades du verdissement, revStir des singifications tr6s diff6rentes, confirmant ainsi, simultan6ment, les th6ses, apparemment contradictoires, des auteurs.

A certains moment, l 'addition d'acide ~-aminol~vulinique permet d'obtenir une synth6se accrue de chlorophylle attestant l'existence d'un effet limitant primaire exerc6 par la quantit6 d'acide 8-aminol6vulinique synth6tis~e. Cet effet lui-m~me peut sans doute d6couler de causes diverses dont l'6puisement de certaines r6serves ne repr6sente vraisemblablement qu'un aspect. Le plafonnement observ6 alors dans la production de chlorophylle en pr6sence d'acide 6-aminol6vulinique exog6ne peut ~tre attribu6 soit h une p6n&ration limit6e de l'acide tS-aminol~vulinique, soit ~t la mani- festation d'un autre eflbt limitant, apr6s lev6e de la limitation par l'acide g-amino- 16vulinique.

Au d6but du verdissement, au contraire, la fourniture d'acide ~-aminol6vuli- nique exog6ne d~prime la production de chlorophylle. Cet effet n6gatif ne peut, pour le moment, recevoir que des explications conjecturales difficiles ~ v~rifier. Nous en retiendrons seulement la conclusion que cet effet atteste la p6n6tration de l'acide ~-aminol6vulinique exog6ne dans la cellule d6s le d6but du verdissement.

SYNTHESE DE tS-AM1NOLI~VULINATE ET DE CHLOROPHYLLE 147

A d'autres moments, l 'addition d'acide 6-aminol6vulinique reste impuissante ~t modifier la synth6se de chlorophylle. On doit penser alors que l'effet limitant primairc s'excrcc ~ un niveau situ6 en aval de la production d'acide &aminol6vuliniquc, susceptible de retentir secondaircment sur celle-ci. Ce type de limitation implique uric forme quelconque de relation r6troactive entre les fractions terminales et les fractions ant6- rieures de la cha~m¢ biosynth6tique: une substance, fortune ou contr61b~ au nivcau des 6tapes tcrminales de la biosynth~se de la chlorophyllc, doit influencer l'activit6 des 6tapes ant6rieures de la chain¢ biosynth6tique. On peut imaginer ainsi Faction d'une substance inhibitrice, m6tabolite interm6diaire s'accumulant apr6s saturation des 6tapes terminales. On peut concevoir aussi une substance activatrice dont la formation s'op6re par l'activit6 des 6tapes tcrminales et s¢ trouve suspenduc lorsque ceUes-ci sont satur&s ou bloqu6es. L'activit6 de telles substances r6gulatrices peut s'exercer au niveau de la transcription du message g6n6tique 13, au niveau de sa tra- duction 12, au niveau de l'activit6 d'enzymes responsables ou mSme sous la forme d'un pr6curseur n6cessaire. I Ine semble pas que les donn6es actuellement existantes per- mettent d'effectuer un choix entre ces hypoth6ses.

Comparaison avec les observations faites sur d'autres organismes On rel6ve de nombreuses diff6rences entre les conditions dans lesquelles nous

avons examin6 les synth6ses d'acide 6-aminol6vulinique chez les eugl6nes et les conditions employ6es pour l'6tude de chlorelles 8' 9 ou de plantes sup~rieures 11. Parmi ces diff6rences, nous noterons, en particulier, dans nos exp6riences, l'emploi de conditions largement h6t6rotrophiques et les mesures limit6es ~t 30 rain apr6s l'addition de l'inhibiteur, s'opposant, darts les exp6riences des auteurs, ~t l'emploi de conditions photo- trophiques et aux mesures commenc~es plusieurs heures seulement apr6s addition de l'inhibiteur. Ces diff6rences de conditions, jointes ~t des diff6rences 6videntes dans la physiologie et la structure des organismes 6tudi6es, doivent inciter ~t une certaine prudence dans la comparaison.

Au niveau des r6sultats, l'une des diff6rences les plus notables tient au fait que chez l'eugl6ne, l'aceumulation d'acide tS-aminol6vulinique est suspendue lorsque reprend la synth6se de chlorophylle, tandis que chez les plantes la synth6se de chlorophylle se poursuit concurremment ~t un d6versement d'acide &aminol6vulinique; dans ce dernier cas, on aboutit ~ une production d'acide 6-aminol6vulinique dix lois sup6rieure h la quantit6 pr6visible d'apr6s le d6ficit en chlorophylle. Chez les chlorelles, une situation plus fluide montre tant6t une 6quivalence stoechiom6trique entre la production d'acide 6-aminol6vulinique et le d6ficit en chlorophylle a, tant6t une production d'acide 6-aminol6vulinique sup6rieure aux pr6visions dans une proportion de 15 ~t 50 % (ref. 9). L'addition d'acide 6-aminol6vulinique exog6ne ~t des plantules d'orge ne produit une quantit6 accrue de chlorophylle que durant les premi6res heures du verdissement a, ce qui indique simultan6ment l'existence initiale d'une limitation par l'acide 6-aminol6vulinique et la substitution ult6rieure de cette limitation par un facteur de nature diff6rente correspondant vraisemblablement h une r6gulation par r6troaction.

Ainsi, l'absence de coordination entre la synth6se d'acide 6-aminol6vulinique et la synth6se de chlorophylle apr6s introduction d'acide 16vulinique peut relever alors soit d'une absence (momentan~e ?) du processus r6troactif, soit ~t ses conditions propres d'activit6. Et l 'on peut imaginer, par exemple, que l'accumulation d'acide


6-aminol6vulinique, caus6e par la pr6sence de l'inhibiteur, entraine son excr6tion hors du milieu cellulaire, sous la forme d'une "fuite" 6chappant aux interactions r6gulatives. Bien que cette supposition, ou d'autres similaires, ne puisse en aucune fa¢on ~tre consid6r6e comme prouv6e, il semble n6anmoins que les observations discordantes effectu6es n'interdiraient nullement de consid6rer que les syst6mes de contr61e mis en oeuvre chez l'eugl6ne soient pr6sents chez les autres esp6ces 6tudi6es.

On notera enfin que, d'apr6s Senger et Bishop is, la synth6se de chlorophylle la lumi6re chez un mutant de Scenedesrnus, qui ne forme pas de chlorophylle ~t l'obscurit6, est pratiquement insensible h raddition de D CMU durant les 12 premi6res h d'6clairement, tandis qu'elle se trouve bloqu6e ensuite par cet inhibiteur. Sans que r o n puisse affirmer une identit6 absolue avec les observations faites chez l'eugl6ne, on notera le caract6re vraisemblable d'un rapprochement avec la distinction entre les processus DCr et DCs.

CONCLUSIONS GI~NERALES

L'ensemble des observations confirme que la synth6se d'acide 6-aminol6vulinique repr6sente une &ape dans la biosynth6se de la chlorophylle. La production d'acide 6-a- minol6vulinique, not6e ~ l'obscurit6 endiverses circonstances, montre que la synth6se de cette substance elle-m~me ne requiert pas directement la fourniture d'gnergie lumineuse. L'influence 6vidente de l'6clairement sur la formation d'acide 6-aminol6vulinique doit donc s'exercer de faqon indirecte, par l'interm6diaire d'une action sur la production de pr6curseurs, d'interm6diaires 6nerg6tiques, de transporteurs ou d'enzymes. Cette action de la lumi6re s'exerce ~t plusieurs niveaux de la chaine biosynth6tique dont la structure comporte certainement plusieurs interrelations de nature r6gulative. Malgr6 des diff6rences 6videntes, le syst6me qui apparait ainsi peut 6ventuellement trouver des analogies darts les syst6mes de morphogen6se plastidienne des Chlorelles et des v6g6- taux sup6rieurs. La nature exacte des sites de contr61e, le m6canisme de leur fonctionnement restent compl6tement inconnus et ne peuvent faire l'objet que de conjectures. Cependant, les donn6es acquises concernant l'architecture du syst6me de contr61e sugg6rent de nombreuses exp6riences dont le d6veloppement devrait permettre d'ap- procher une analyse plus directe des processus en cause.

REMERC1EMENT

Ce travail a b6n6fici6 d'une subvention du Commissariat ~t l'Energie atomique.

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