15

 

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi Kerangka Baca Terbuka human Interferon-alfa2a (hifn-α2a)

Amplifikasi kerangka baca terbuka (KBT) hifn-α2a dari plasmid rekombinan pcDNA3.1+IFN-gene yang dilakukan menggunakan sepasang primer (F-IFN dan R-IFN) memperlihatkan pita DNA berukuran sekitar 500 bp (Gambar 3). Pita tebal tersebut merupakan pita DNA gen hifn-α2a dengan ukuran 522 bp, dan sesuai dengan ukuran gen hifn-α2a yang terdapat pada GenBank.

Gambar 3 Produk PCR gen human ifn-α2a. (1): kosong, (2): DNA

Ladder 1 kb,(3 & 4): amplikon gen hifn-α2a

Analisis Plasmid Rekombinan

Kontrol negatif (sel XL1 blue tanpa penambahan hasil reaksi ligasi) memberikan hasil yang diharapkan, yaitu tanpa koloni. Hasil transformasi produk ligasi memberikan banyak koloni-koloni tunggal. Koloni yang tumbuh secara teoritis mengandung plasmid dengan sisipan insert hifn-α2a.

Isolasi plasmid rekombinan dilakukan terhadap 24 transforman. Pemilihan koloni dilakukan secara acak.Visualisasi hasil restriksi plasmid rekombinan (8 transforman) pada gel agarosa 1% menghasilkan dua pola pita DNA dengan ukuran yang berbeda. Pita plasmid pPICZαB berukuran sekitar 3600 bp, sedangkan pita gen hifn-α2a berukuran sekitar 500 bp (Gambar 4). Hasil analisis ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan sudah berhasil disintesis.

1 2 3 4 5

hifn α -2a 2

500

250

bp

750

10000

16

 

Gambar 4 Hasil restriksi plasmid rekombinan (pPICZαB-ifnα2a) dengan enzim Xho1 & Xba1. 1-8: klon 1-8, 9: DNA ladder 1 kb, 10: klon 6 tidak dipotong

Purifikasi Plasmid Rekombinan untuk Analisis Sekuensing

Purifikasi terhadap plasmid rekombinan bertujuan agar DNA plasmid lebih murni. Sebelum dilakukan sekuensing plasmid rekombinan yang telah dihasilkan dipurifikasi dengan Qiagen™ plasmid purification. Delapan klon plasmid rekombinan yang telah direstriksi dengan Xho1 dan Xba1 dipilih satu klon (klon 6) untuk dipurifikasi DNA-nya. Hasil isolasi dari delapan klon tersebut memperlihatkan ada 7 klon yang terestriksi dengan baik (klon 1-7), yang ditunjukkan adanya 2 pita DNA dengan ukuran yang diharapkan. Klon 6 dipilih untuk purifikasi sebagai tahap awal saja, karena metode yang digunakan untuk teknik ini memerlukan jumlah media yang banyak. Hasil purifikasi klon 6 ditampilkan pada Gambar 5.

Gambar 5 Hasil purifikasi plasmid rekombinan klon 6 (Maxiprep) (1): DNA marker 1 Kb, (2): klon 6 dipotong Xho1 & Xba1, (4): klon 6 tidak dipotong

Plasmid rekombinan klon 6 hasil purifikasi dihitung konsentrasinya dengan Nanofotometer dan ditampilkan pada lampiran 4. Hasil purifikasi terhadap klon

        1    2    3    4   5    6   7   8   9    10

hifn-α2a

pPICZαB

1      2      3    4

250 

10000 

750 

500 

bp 

250

500

750

bp

10000

pPICZαB

hifnα‐2a

3500

17

 

ini sudah memuaskan sehingga purifikasi terhadap klon-klon yang lain tidak dilakukan.

Analisis Sekuensing

Analisis sekuensing dilakukan untuk mengidentifikasi urutan nukleotida dari plasmid rekombinan yang telah dihasilkan. Urutan nukleotida transforman nomor 6 hasil sekuensing selanjutnya disejajarkan dengan urutan nukleotida kerangka baca terbukan hifn-α2a yang terdapat pada GenBank. Berdasarkan analisis urutan nukleotida menggunakan primer 5’AOX dan 3’AOX diperoleh hasil bahwa gen hifn-α2a telah berhasil disisipkan pada vektor pPICZαB. Plasmid rekombinan selanjutnya dinamakan pPICZαB-ifnα2a. Hasil pensejajaran dapat dilihat pada Gambar 6 dan 7. Electropherogram ditampilkan pada Lampiran 1 dan 2.

Gambar 6 Hasil pensejajaran urutan nukleotida hifn-α2a pada plasmid

rekombinan pPICZαB-hifnα2a dengan primer 5’AOX

18

 

Gambar 7 Hasil pensejajaran urutan nukleotida hifn-α2a pada plasmid

rekombinan pPICZαB-hifnα2a dengan primer 3’AOX

Linearisasi Plasmid Rekombinan

Hasil pemisahan plasmid rekombinan linear dengan elektroforesis agarosa 1% disajikan pada Gambar 8.

Gambar 8 Hasil linearisasi klon 6. (1): DNA marker 1 Kb, (2): plasmid

rekombinan pPICZαB-ifnα2a tidak dipotong, (3): kosong, (4): plasmid rekombinan pPICZαB-ifnα2a dipotong BstX1

1 2 3 4 5 bp

10000

250

750

19

 

Transformasi Rekombinan Plasmid linear ke P. pastoris Galur X33

Transformasi ke dalam genom galur X33 P. pastoris dilakukan dengan metode elektroporasi menggunakan Gene Pulser Xcell Electroporation Systems BIO-RAD. Koloni-koloni yang ditumbuhkan pada media YPDS + 100µg/ml zeocin muncul setelah diinkubasi 24 jam (1 hari) dan berwarna putih (Gambar 9).

Gambar 9 Koloni-koloni rekombinan P. pastoris pada media YPDS +

zeocin 100 ug/ml

Skrining Positif Transforman

Ditumbuhkan sebanyak 22 koloni pada media YPDS yang mengandung 2000 ug/ml zeocin untuk proses skrining pada suhu 30°C. Dihasilkan 18 transforman yang tumbuh pada media YPDS + 2000 ug/ml zeocin (gambar 8). Terdapat 14 koloni (transforman) yang tumbuh setelah 2 hari masa inkubasi, yaitu klon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19 dan 20. Sisa 4 koloni tumbuh setelah diinkubasi selama 4-5 hari, yaitu klon 7, 16, 18 dan 22. Koloni yang tumbuh pada kondisi tersebut secara teori merupakan positif transforman. Koloni yang tumbuh setelah diinkubasi 2 hari selanjutnya dilakukan studi ekspresi.

Gambar 10 Koloni hasil seleksi transforman pada media YPDS + 2000

ug/ml zeocin

20

 

Analisis Ekspresi metode Dot blot

Sebanyak 14 koloni transforman diuji ekspresinya, yaitu klon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19 dan 20. Analisis ekspresi menggunakan metode Dot blot (14 klon), metode SDS PAGE dan Western blot masing-masing 7 klon ( klon 2, 4, 6, 8, 9, 11 dan 13).

Hasil analisis menggunakan Dot blot ditampilkan pada Gambar 11. Semua klon yang dianalisis memberikan dot-dot berwarna pada membran. Hasil dari metode ini menunjukkan semua sampel yang dianalisis memberikan hasil positif, dengan intensitas ketebalan pita yang berbeda.

Gambar 11 Analisis ekspresi hifn-α2a dengan Dot blot

Analisis SDS-PAGE dengan Pewarnaan CBB

Supernatan yang telah dikumpulkan (7 klon) kemudian dianalisis dengan SDS-PAGE dan divisualisasi dengan pewarnaan Comassie Brilliant Blue (CBB). Hasil analisis dapat dilihat pada Gambar 12. Semua sampel supernatan memberikan pola pita yang ketebalannya berbeda-beda. Bobot molekul (BM) protein hasil karakterisasi dengan metode ini adalah sekitar 24,05 kDa. Hasil analisis protein dengan metode ini menunjukkan bahwa hifn-α2a telah berhasil diekspresikan dalam P. pastoris.

1 

6 

15 

2 3 4 5

8

17

9 11 13

19 20 (+) kontrol

21

 

Gambar 12 SDS PAGE protein IFN-α2a dengan pewarnaan CBB. (1): Protein marker, (2-8): supernatan klon 2, 4, 6, 8, 9 ,11 dan 13.

Analisis Western Blot

Hasil analisis dengan Western blot dapat dilihat pada Gambar 9. Pita protein hasil ekspresi berukuran sekitar 24,050 kDa dan memberikan informasi bahwa terjadi interaksi antara antigen (protein IFN) dengan antibodi (Ab anti IFN). BM protein hasil analisis dengan SDS PAGE dan Western blot adalah sama.

Gambar 13 Analisis Western blot IFN-α2a (1): positif kontrol (IFN ekspresi

di E. coli), (2): protein marker, (3): klon 2, (4): klon 4, (5): klon 6, (6): klon 8, (7): klon 9, (8): klon 11, (9): klon 13, (10): negatif kontrol (X33 kosong)

Perbandingan ukuran pita-pita protein dari supernatan pada hasil SDS-

PAGE dan Western blot menunjukkan adanya perbedaan ketebalan pita dari masing-masing klon yang dianalisis.

Pembahasan

Kloning gen merupakan metode in vivo untuk menghasilkan banyak salinan dari satu gen tunggal atau fragmen gen yang diinginkan. Kloning DNA adalah

hIFN-α2a

hIFNα-2a 20 

25 

120 

35 

50 

kDa 

kDa 

1      2        3           4         5         6          7           8

1      2     3      4         5          6        7         8       9    10

20 

25 

35 

50 

85 

120 

kDa 

22

 

memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu sel bakteri. Pada penelitian ini DNA yang akan dikloning adalah DNA dari gen human ifn-α2a yang menyandi protein interferon-α2a (IFNα-2a). Gen ini terletak spesifik pada kromosom manusia nomor 9 (Stuart & Sidney, 1993; Guido, 2008). Gen ini secara natural dapat diisolasi dari sel leukosit manusia (Gunther et al. 1991). Dalam melakukan kloning dibutuhkan vektor sebagai wahana atau kendaraan untuk mengangkut gen atau fragmen gen yang akan diklon ke dalam sel, juga memerlukan beberapa persyaratan seperti: enzim restriksi dan ligase, transformasi, kemudian identifikasi sel yang mengandung DNA target (Toha, 2001).

Hasil kloning gen hifn-α2a pada sel XL1 blue telah berhasil dilakukan terbukti dengan diperolehnya fragmen DNA berukuran sekitar 500 bp dari amplifikasi dengan teknik PCR, plasmid rekombinan pPICZαB-hifnα2a juga berhasil disintesis, hasil analisis restriksi terhadap plasmid rekombinan memberikan dua pita DNA yang berbeda, yaitu pita berukuran 3600 bp (vektor) dan pita berukuran sekitar 500 bp (insert).

Plasmid atau vektor merupakan salah satu persyaratan penting yang dibutuhkan jika kita hendak melakukan kloning dan ekspresi suatu gen. Vektor digunakan sebagai wahana, tempat gen DNA disisipkan. Sifat-sifat plasmid yang dapat digunakan sebagai sarana dalam teknologi DNA rekombinan adalah: molekul DNA plasmid harus mampu bereplikasi dalam sel inangnya. Selain itu DNA plasmid harus memiliki paling sedikit satu marker genetik, seperti gen pengkode sifat resistensi terhadap antibiotik tertentu. Sifat penting lain plasmid untuk teknologi DNA rekombinan adalah memiliki urutan nukleotida spesifik yang dikenali dan mampu dipotong oleh enzim restriksi tertentu (Toha, 2001).

Pada penelitian ini vektor yang digunakan adalah pPICZαB (Invitrogen) yang berukuran 3593 bp. Sangat penting mengklon gen in frame dengan signal sekuen faktor α jika menggunakan plasmid ini (Invitrogen, 2001). Plasmid pPICZαB merupakan salah satu vektor ekspresi yang digunakan untuk mengekspresikan protein target pada sel P. pastoris. Plasmid ini merupakan shuttle vektor sehingga dapat digunakan sebagai vektor kloning di E. coli dan vektor ekspresi di sel P. pastoris. Vektor P. pastoris umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Vektor pPICZαB membawa marker zeocin sehingga seleksi dapat dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeocin juga dapat digunakan untuk E. coli sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain dan pengurangan ukuran vektor.

Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing harus memenuhi hal-hal sebagai berikut, yaitu DNA plasmid (vektor) harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai sehingga terbuka. DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor (insert) untuk membentuk rekombinan juga harus dipotong dengan enzim yang sama. Pada penelitian ini enzim restriksi yang digunakan untuk memotong kedua DNA tersebut adalah enzim restriksi endonuklease Xho1 dan Xba1. Tujuan pemotongan rantai DNA sehingga menjadi fragmen ini adalah agar dapat menggabungkan antara fragmen DNA insert (hifn-α2a) dengan fragmen DNA vektor (pPICZαB).

Proses penggabungan antara insert dan vektor dilakukan menggunakan enzim ligase, yang berfungsi mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang

23

 

menghubungkan nukleotida insert dengan nukleotida vektor sehingga dihasilkan plasmid rekombinan. Pembentukan ikatan fosfodiester ini terjadi antara ujung fosfat bebas dari polinukleotida dan gugus 3’-OH dari polinukleotida yang lain (Toha, 2001).

Proses masuknya plasmid rekombinan ke sel bakteri disebut transformasi dan proses ini dapat menyebabkan fenotip sel bakteri mengalami perubahan. Plasmid rekombinan ini ditansformasi ke dalam galur XL1 blue (E. coli). Vektor rekombinan yang memasuki sel inang dapat merubah sifat asli sel tersebut sesuai dengan gen yang dibawanya. Sel inang biasanya memiliki sifat sensitif terhadap antibiotik tertentu. Dan sifat ini yang direkayasa untuk digunakan dalam proses kloning. Perubahan sel inang dapat dijadikan indikator untuk mengetahui keberhasilan proses transformasi sel (Toha, 2001).

Proses transformasi mencakup beberapa tahap. Tahap awal adalah merangsang pembengkakan sel sampai terbentuk spheroplast dengan bantuan kalsium klorida (CaCl2). Pada kondisi ini protein periplasmik hilang, sehingga terbentuk pori-pori pada dinding sel. Kemudian DNA yang ditambahkan membentuk resisten DNAse dengan ion kalsium yang melekat pada permukaan sel. Tahap terakhir diketahui sebagai proses pengambilan kompleks tersebut sewaktu dilakukan Heat shock (Toha, 2001).

Proses seleksi terhadap sel transforman dilakukan untuk mengetahui apakah sel bakteri telah mengandung plasmid rekombinan, dengan cara menumbuhkan sel bakteri yang telah ditransformasi pada media padat LB low salt yang mengandung antibiotik zeocin. Zeocin sangat sensitif terhadap kondisi garam dan pH yang ekstrim, oleh karena itu konsentrasi garam pada media dibuat rendah. pH media dibuat menjadi 7,5. Adanya koloni-koloni tunggal yang tumbuh pada media tersebut dapat dianggap bahwa sel bakteri telah mengandung plasmid rekombinan, selanjutnya diisolasi DNA plasmid rekombinannya. Isolasi DNA bertujuan untuk mendapatkan DNA tanpa debris sel. Prinsip teknik isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang berbeda-beda setiap tahapnya. Tahap pertama adalah penghancuran dinding sel, tahap kedua adalah lisis sel, sedangkan tahap ketiga adalah membersihkan debris sel.

Analisis hasil isolasi DNA dilakukan dengan metode elektroforesis. elektroforesis adalah teknik yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran. Karena mengandung fosfat yang bermuatan negatif, DNA akan bergerak menuju elektroda positif dalam medan listrik. Pengamatan hasil elektroforesis dilakukan di dawah sinar UV dengan bantuan etidium bromida (EtBr) yang dapat berfluorosensi bila disinari UV. Etidium bromida mempunyai kemampuan membentuk khelat dengan molekul DNA, sehingga jumlah molekul EtBr sebanding dengan ukuran rantai DNA yang diamati dan ukuran DNA yang dianalisis dapat diketahui. Pemberian EtBr dilakukan sebelum atau sesudah proses elektroforesis (Toha, 2001).

Sintesis terhadap plasmid rekombinan pPICZαB-hifnα2a dalam bakteri E. coli telah berhasil dilakukan. Analisis restriksi menggunakan dua macam enzim restriksi Xho1 dan Xba1 menunjukkan adanya dua pita DNA yang ukurannya berbeda. Pita DNA berukuran 3600 bp merupakan DNA vektor (pPICZαB), sedangkan yang berukuran 500 bp adalah pita DNA insert (hifn-α2a). 

Vektor pPICZαB mengandung gen sh ble dari Streptoalloteichus hindustanus yang dapat bekerja di E. coli, yeast (termasuk P. pastoris) dan

24

 

eukariot lain. Gen ini berukuran kecil (375 bp) dan resisten terhadap zeocin (Cregg et al. 2007). Seleksi transforman menggunakan antibiotik zeocin terjadi melalui mekanisme khusus. Mekanisme kerja dari zeocin dalam menyeleksi koloni-koloni yang mengandung transforman adalah sebagai barikut: zeocin mengandung kelat tembaga (Cu) yang jika tidak digunakan berada dalam bentuk non aktif. Ketika antibiotik masuk ke dalam sel, kation tembaga direduksi dari Cu2+ menjadi Cu1+ dan dipindahkan oleh senyawa sulfhydryl yang terdapat di dalam sel, selama pemindahan tembaga zeocin menjadi aktif dan akan berikatan dengan DNA dan merusaknya, sehingga menyebabkan kematian sel (Invitrogen 2001).

DNA sekuensing merupakan proses identifikasi urutan DNA dari molekul DNA rekombinan hasil kloning. Teknik ini digunakan untuk mengidentifikasi kesalahan pada urutan DNA (Muladno 2002). Hasil analisis sekuensing (klon 6) menggunakan primer 5’AOX dan 3’AOX menunjukkan bahwa urutan basa DNA dari gen human ifnα-2a yang di subklon pada vektor pPICZαB telah sesuai dengan yang diharapkan (in frame). Hasil ini semakin memperkuat bahwa plasmid rekombinan yang diperoleh adalah benar.

Salah satu hal penting dalam mengekspresikan protein menggunakan promotor AOX1 adalah proses linearisasi plasmid rekombinan. Linearisasi dapat menstimulasi rekombinasi ketika plasmid ditransformasikan ke dalam P. pastoris (Invitrogen 2001). Plasmid rekombinan yang telah dianalisis kebenaran sekuensnya (klon 6) dilinearisasi menggunakan enzim BstX1 sebelum ditransformasikan ke sel X33 P. pastoris. DNA vektor linear dapat menghasilkan transforman yang stabil melalui rekombinasi homolog antara sekuens-sekuens dari vektor dengan sekuens homolog pada genom inang (Cregg et al. 2007).

Transformasi ke dalam sel P. pastoris menggunakan metode elektroporasi. Elektroporasi merupakan metode yang mudah dan cepat untuk transformasi ke P. pastoris (Pingzuo et al. 2007). Prinsip dari metode ini adalah menggunakan kejutan listrik untuk memperbesar pori-pori membran sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini sel P. pastoris (X33) harus terlebih dahulu ditumbuhkan pada media YPD hingga mencapai masa pertengahan fase log (OD600= 1.3-1.5). Sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori membran sehingga molekul yang berukuran seperti DNA dapat masuk ke dalam sel. Elektroporasi dapat menghasilkan 103-104 transforman per mikrogram DNA linear dan tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel Pichia (Invitrogen, 2001).

Ekspresi gen merupakan rangkaian proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa pada DNA dan RNA) menjadi protein, dan lebih jauh lagi fenotipe. Ekspresi gen asing ke dalam P. pastoris harus memenuhi beberapa syarat, yaitu: insersi gen ke dalam vektor ekspresi dan integrasi vektor ekspresi ke dalam genom P. pastoris (Cregg et al. 2007).

Galur sel P. pastoris yang digunakan untuk mengekspresikan hifn-α2a adalah X33. X33 termasuk galur dengan fenotip Mut+ (methanol utilization plus) dan dapat digunakan untuk seleksi positif transforman menggunakan zeocin. Galur ini dapat tumbuh pada media YPD. Galur Mut+ tumbuh cepat pada media yang mengandung metanol sehingga dapat dengan cepat memproduksi protein asing. X33 banyak digunakan oleh peneliti dalam memproduksi protein rekombinan. Dilaporkan bahwa ekspresi hifn-α2b pada galur Mut+ lima kali lebih

25

 

tinggi daripada ekspresi pada galur Muts (methanol utilization slow) (Shi et al. 2007).

Yeast metilotropik menggunakan metanol sebagai sumber karbonnya. Galur X33 sangat responsif dengan metanol, maka ia juga sensitif terhadap metanol pada konsentrasi tinggi, sehingga perlu dilakukan regulasi dalam penambahan metanol ke dalam media. Metanol dengan konsentrasi tinggi menghambat pertumbuhan sel. Konsentrasi metanol yang baik ditambahkan pada media adalah ≤ 0,4% ( Zhang et al. 2000) atau 0,5% (Invitrogen 2001, Santoso et al. 2012). Pada penelitian ini konsentrasi metanol yang digunakan adalah 0,5%. Terdapat dua gen pada genom P. pastoris yang mengkode alcohol oxidase (AOX), yaitu aox1 dan aox2, namun hanya gen aox1 yang bertanggung jawab untuk sebagian besar aktivitas alcohol oxidase di dalam sel. Ekspresi gen aox1 diregulasi dan diinduksi oleh metanol dan akan terhambat kerjanya dengan keberadaan gliserol atau glukosa (Tschopp et al. 1987). Regulasi gen aox1 adalah sama dengan regulasi gen gal1 pada S. cereviseae, yang terjadi melalui dua mekanisme yaitu: mekanisme represi/de-represi dan mekanisme induksi. Keberadaan metanol sangat penting untuk menginduksi pada level transkripsi (Cregg et al. 2007).

Waktu inkubasi yang dilakukan dalam studi ekspresi adalah 48 jam. Pemilihan lamanya waktu inkubasi ini berdasarkan riset-riset yang telah dipublikasikan yang menyebutkan bahwa 48 jam waktu inkubasi merupakan waktu terbaik dalam produksi protein rekombinan menggunakan inang P. pastoris (Santoso et al. 2012; Gurkan et al. 2003). Waktu inkubasi yang lebih lama dapat menyebabkan protein yang disekresikan terdegradasi oleh protease (Sinha et al. 2004).

Pichia pastoris merupakan kelompok yeast metilotropik yang menggunakan metanol sebagai sumber energi dan sumber karbonnya. Pada saat yeast ditumbuhkan dalam media yang mengandung metanol, maka enzim yang terlibat dalam metabolisme metanol akan terinduksi dengan kuat dan organel-organel yang terikat pada membran seperti peroksisom akan bertambah secara besar-besaran. Enzim penting yang terlibat dalam metabolisme metanol ini, yaitu AOX1 terdapat di dalam peroksisom. Apabila sel ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, jumlah peroksisom hanya sedikit. Jika sel ditumbuhkan pada media yang mengandung metanol maka jumlah peroksisom mencapai 80% dari total volume sel (Yurimoto et al. 2011). Hidrogen peroksida yang dihasilkan dari oksidasi metanol dapat dirusak dengan bantuan enzim khusus yang terdapat di dalam peroksisom, sehingga tidak ada zat toksik yang dihasilkan selama proses ini.

Tahap kerja produksi protein menggunakan strain Mut+ terjadi melalui dua fase. Fase pertama penggunaan gliserol untuk memperoleh jumlah biomassa tertentu sehingga densitas sel tinggi. Fase kedua adalah reduksi gliserol dan penggunaan metanol untuk biosintesis protein rekombinan (Brierley et al. 1990 dalam Celik et al. 2009).

Analisis level ekspresi diidentifikasi menggunakan metode Dot blot, SDS-PAGE dan Western blot. Dot blot adalah uji serologis yang fungsinya sama dengan Western blot, yaitu untuk mendeteksi kespesifikan reaksi antara antigen dan antibodi. Hasil positif apabila terbentuk dot-dot (noda-noda) berwarna coklat keunguan pada membran setelah diinkubasi dengan antibodi dan reagen-reagen yang dibutuhkan. Kualitas hasil dilihat berdasarkan gradasi warna. Pada penelitian

26

 

ini dilakukan metode Dot blot dengan tujuan dapat secara langsung dan cepat melihat adanya interaksi antara antigen dengan antibodi dari 14 transforman yang dihasilkan. Uji ini dilakukan sebagai uji awal untuk pemilihan transforman yang akan dianalisis ekspresinya dengan SDS-PAGE dan Western blot. Dihasilkan dot-dot (noda) berwarna coklat keunguan pada semua sampel protein yang dianalisis, yang menerangkan bahwa semua protein (supernatant yang dianbalisis) dapat berinteraksi dengan antibodi anti IFN.

SDS-PAGE dapat memberikan informasi tentang ukuran (bobot molekul) dari protein IFN dengan cara membandingkan pita yang dihasilkan dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton (kDa) (Gambar 12). Analisis dengan metode ini dilakukan terhadap 7 klon, pemilihan klon dilakukan secara acak, karena informasi yang dibutuhkan adalah berapa BM protein IFN yang dihasilkan. Hasilnya diperoleh 7 pita protein yang berukuran sekitar 24,05 kDa.

Western blot mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipisahkan antara satu dengan yang lain menurut ukurannya melalui elektroforesis. Blot merupakan sebuah membran biasanya berupa nitrosellulose dan polivinilidine fluoride (PVDV). Pada penelitian ini blot yang digunakan adalah membran nitosellulose (NC).

Sampel protein terlebih dahulu dipisahkan dengan SDS-PAGE dan selanjutnya ditransfer ke membran. Setelah langkah blocking menggunakan susu bebas lemak, membran diprobe dengan antibodi primer (antibodi anti IFN). Setelah pencucian membran kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (anti mouse) yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Enzim yang dikonjugasi dengan anti mouse adalah alkaline phosphatase (AP) yang akan berpendar setelah diberi pewarnaan dengan substratnya (NBT-BCIP). Warna pita coklat kemerahan yang muncul pada membran NC menunjukkan protein IFN-α2a hasil transfer dari gel SDS-PAGE diikat oleh antibodi anti IFN. Pita-pita tersebut menunjukkan adanya respon antigen-antibodi spesifik pada berat molekul 24,05 kDa. Hasil ini menunjukkan bahwa protein yang disekresikan ke media oleh sel P. pastoris adalah benar protein hIFN-α2a (Gambar 9).