TINJAUAN PUSTAKA

Enzim β-Galaktosidase

Enzim β-galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat

menghidrolisis ikatan β-D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu β-D-

galaktosa (Gambar 1). Nama sistematiknya adalah β-D-galaktosida

galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase (IUBMB Enzyme

Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisis ikatan β-(1,4)-

glikosida pada laktosa. Penggunaan enzim β-galaktosidase dalam proses hidrolisis

ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak

mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam

reaksi hidrolisis (Boyer 2002).

Enzim β-galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast

sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena

akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004).

Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase dapat dilihat pada Tabel 1. Enzim β-

galaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada pH

rendah (dibawah pH 5,5) dengan suhu berkisar 30-60ºC (Itoh et al. 1980; Cesca et

al. 1984). Enzim β-galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan

Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada pH 6-8 dengan suhu berkisar 25-40ºC.

Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan

Aspergillus oryzae aktif pada pH rendah berkisar 2,5-6,0 serta bersifat

termostabil (Mahoney 2004).

Matthews (2005) menyatakan enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri 4

rantai polipeptida (monomer) serta bobot molekul sekitar 464 kDa. Setiap

monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini mempunyai situs aktif pada

Glu 461, Glu 537, dan Trp 999. Glu 461 terlibat pada stabilisasi elektrostatik pada

keadaan transisi. Glu 537 berperan sebagai nukleofili. Trp 999 berperan mengikat

ligan. Ion natrium akan berinteraksi dengan gugus hidroksil dari ligan (Huber et

al. 1994). Langkah pertama mekanisme katalitiknya adalah laktosa membentuk

intermediet dengan nukleofil Glu 537 dan dibantu dengan asam (A: Glu 461 atau

ion Magnesium). Selanjutnya Glu 461 mendonorkan proton dengan memberikan

5

H+ pada oksigen glikosidik yang disertai pemutusan ikatan glikosidik dan

pelepasan glukosa. Langkah kedua adalah pembentukan intermediet transient

triagonal oxocarbonium yang dibantu oleh basa (B: Glu 461) lalu terjadi

protonasi dari Glu 461 yang dikatalisis air dan diakhiri dengan transfer galaktosil

ke air atau gula lain. Jika akseptor berupa air maka akan terjadi proses hidrolisis

sehingga terbentuk glukosa dan galaktosa. Jika akseptornya berupa gula lain maka

akan terjadi proses transglikosilasi yang akan membentuk galaktooligosakarida

(Gambar 2) (Matthews 2005).

Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase.

Gambar 2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase (Matthews 2005).

β-Galaktosidase

Laktosa D-Galaktosa D-Glukosa

+ H2O +

Laktosa

Pembentukan intermediet

Glukosa

Pemutusan ikatan

Intermediet transient triagonal

6

Tabel 1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase (Mahoney 2004).

Sumber Jenis-jenis Yeast Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, Kluyveromyces

bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus, Pichia pastoris

Fungi Alternaria alternata, Alternaria palmi, Aspergillus foetidus, A. fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, Bauvaria bassiana, Curvalaria inaequalis, Fusarium moniliforme, Mucor meihei, Mucor pusillus, Paecilomyces varioti, Penicillium conescens, P. chrysogenum, P. notatum, P. simplicissum, P. melloti, Rhizomucor spp., Saccharopolyspora rectivirgula, Scopulariopsis spp., Sirobasidium magnum, Streptomyces violaceus, Trichoderma reesei

Bakteri Arthrobacter spp., Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacilus subtilis, Bacteroides polypragmatus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Erwinia aroieae, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. delbruecki, L. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. helveticus, L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento, Pseudoalteromonas haloplanktis, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus thermophillus, Sulfolobus solfataricus, Thermoanaerobacter spp., Thermus ruber, Thermus thermophillus, Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris

Perbandingan reaksi transglikosilasi laktosa dan hidrolisis laktosa

tergantung dari jumlah substrat yang tersedia. Reaksi transglikosilasi akan terjadi

pada konsentrasi laktosa yang tinggi sekitar 15-50% sehingga akan terbentuk

galaktooligosakarida (Greenberg & Mahoney 1983). Jika konsentrasi laktosa

rendah yaitu sekitar 5% maka akan terjadi reaksi hidrolisis yang akan membentuk

glukosa dan galaktosa (Burvall & Dahlqvist 1979). Oleh karena itu, enzim ini

digunakan pada industri pangan untuk mereduksi laktosa pada susu dan whey

serta produksi galaktooligosakarida (Mahoney 1998).

β-galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis

laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai pH optimum 6 (Campbell

7

et al. 2005). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, laktosa

yang mempunyai sifat osmotik yang tinggi ini dapat menarik air dan cairan tubuh

ke dalam saluran pencernaan usus kecil. Masuknya cairan tubuh ke dalam usus

kecil akan merangsang gerakan peristaltik dinding usus menjadi lebih cepat. Hal

ini akan mendorong isi usus kecil berpindah secara cepat pula ke dalam usus

besar. Di dalam usus besar ini bakteri-bakteri akan memfermentasikan laktosa

menghasilkan berbagai asam organik dan gas. Akibatnya, akan timbul gejala sakit

perut, mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). β-

galaktosidase dapat diaplikasikan untuk penderita laktosa intoleran dengan cara

hidrolisis laktosa pada susu serta konsumsi suplemen β-galaktosidase (Rusynyk &

Still 2001).

Enterobacter cloacae

Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut kingdom Bacteria, filum

Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili

Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae.

Bakteri ini mempunyai dua subspesies yaitu E. cloacae subsp. cloacae dan E.

cloacae subsp. dissolvens (Holt et al. 1994). E. cloacae merupakan bakteri

berbentuk batang (Gambar 3), Gram negatif, anaerobik fakultatif, ukurannya

berkisar (0,3-0,6) µm × (0,8-2,0) µm, dan motil. Bakteri ini bergerak dengan

menggunakan flagelum peritrikus yaitu flagela yang secara merata tersebar

diseluruh permukaan sel. E. cloacae dapat hanya menggunakan sitrat dan asetat

sebagai sumber karbon. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari buah-buahan, usus

hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1988).

Gambar 3 Enterobacter cloacae.

8

E. cloacae menghasilkan enzim β-galaktosidase, arginin dihidrolase, dan

ornitin dekarboksilase (Huber 1999). β-Galaktosidase dari E. cloacae B5 yang

diisolasi dari tanah mempunyai aktivitas transglikosilasi dan menghasilkan

galaktooligosakarida sekitar 55% dari 275 g/L laktosa pada suhu 50ºC selama 12

jam. Enzim β-galaktosidase ini merupakan homotetramer dengan bobot molekul

442 kDa. Suhu optimumnya pada 35ºC dan aktif pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et

al. 2009)

Susu UHT

Susu adalah hasil ekskresi normal kelenjar susu induk mamalia betina untuk

memberi makan anaknya. Secara kimiawi susu merupakan emulsi lemak dalam

air yang mengandung gula, garam-garam mineral, dan protein dalam bentuk

suspensi koloidal (Rahman et al. 1992). Menurut Walstra et al. (1999), komponen

utama susu adalah air, lemak, protein, laktosa, asam organik, dan mineral (Tabel

2). Selain komponen-komponen dengan persentase besar, di dalam susu juga

terdapat komponen lainnya seperti vitamin (vitamin B, C, dan D) dan enzim

(fosfatase, peroksidase, lipoprotein lipase, protease). Berdasarkan kandungan

lemaknya susu terbagi menjadi dua macam, yaitu susu berlemak (whole milk) dan

susu skim (skim milk). Susu skim mengandung lemak yang lebih rendah

dibanding susu berlemak.

Susu merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme

karena komposisinya yang sangat kompleks. Hal ini menyebabkan susu mudah

sekali mengalami kerusakan oleh mikroorganisme, terutama oleh beberapa jenis

bakteri patogen. Bakteri tersebut akan merusak susu sehingga menurunkan daya

simpannya (Kusnawati 2004). Salah satu upaya untuk mengurangi jumlah bakteri

patogen adalah dengan pemanasan.

Fennema (1996) menyatakan bahwa ada tiga jenis pemanasan pada proses

pengolahan susu, yaitu sterilisasi, pasteurisasi, dan ultra high temperature (UHT).

Sterilisasi biasa dilakukan pada suhu 107-115ºC selama 20-40 menit atau pada

suhu 120-130ºC selama 8-12 menit. Proses ini berpengaruh besar terhadap

kandungan protein karena protein akan tereduksi hingga lebih dari 20%.

Pasteurisasi terdiri dari Holding Methode dan High Temperature Short Time

9

(HTST). Holding Methode merupakan pemanasan dengan suhu 63ºC selama 30

menit. Sedangkan HTST merupakan pemanasan pada suhu 72ºC selama 15 detik.

Tujuan pasteurisasi adalah untuk menghilangkan bibit penyakit sehingga

mengurangi jumlah total bakteri untuk meningkatkan kualitas simpan. Semua

produk pasteurisasi harus disimpan pada suhu rendah karena masih mengandung

bakteri yang tahan panas seperti bakteri termofilik, bakteri asam laktat, bakteri

penghasil spora, dan beberapa jenis bakteri aerobik dan bakteri aerobik fakultatif

seperti Bacillus spp. (Early 1998). UHT merupakan pemanasan pada suhu yang

sangat tinggi diatas 135ºC dalam waktu yang sangat singkat.

Susu UHT dibuat dari susu cair segar yang diolah dengan menggunakan

pemanasan pada suhu tinggi dan dalam waktu yang singkat untuk membunuh

seluruh mikroba sehingga memiliki mutu yang baik. Proses UHT biasanya

dilakukan pada suhu 136-138ºC selama 5-8 detik atau pada suhu 140-145ºC

selama 2-4 detik (Fennema 1996). Kelebihan susu UHT adalah susu ini sangat

higienis karena bebas dari mikroba dan spora sehingga potensi kerusakan

mikrobiologis sangat kecil. Enzim-enzim pada susu seperti fosfatase, protease,

katalase, lipoprotein lipase, laktoperoksidase, sulfhidril oksidase, dan xantin

oksidase mengalami inaktivasi sehingga tidak akan merusak susu (Walstra et al.

1999). Oleh sebab itu, susu UHT mempunyai daya simpan yang panjang pada

suhu kamar hingga 6 bulan. Kontak panas yang sangat singkat pada proses UHT

menyebabkan mutu sensori seperti warna, aroma, dan rasa relatif tidak berubah

(Fennema 1996). Nutrisi yang terkandung sedikit menurun seperti terjadinya

reduksi protein berkisar 2-4%, menurunnya kadar vitamin B dan C, dan reaksi

Maillard yang lebih rendah. Reaksi Maillard merupakan reaksi pencoklatan non

enzimatik yang terjadi antara laktosa dan protein susu akibat proses pemanasan

(Walstra et al. 1999).

Tabel 2 Komponen utama susu (Walstra et al. 1999)

Komponen Rata-rata (%) Kisaran Normal (%) Air 87,1 85,3-88,7

Laktosa 4,6 3,8-5,3 Lemak 4,0 2,5-5,5 Protein 3,25 2,3-4,4 Mineral 0,7 0,57-0,83

Asam organik 0,17 0,12-0,21

10

Purifikasi Enzim

Pemekatan Enzim

Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses purifikasi sebelum

tahap purifikasi selanjutnya (seperti kromatografi) dan dapat digunakan untuk

keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode

yaitu analitik dan preparatif. Metode analitik menggunakan pengendapan asam

(contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan

denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap

mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif

misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik,

ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pemekatan

β-galaktosidase biasanya menggunakan pengendapan dengan garam.

Pengendapan protein pada tahap awal purifikasi berfungsi untuk

memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan

memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki.

Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang

berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan

daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam

biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, dan amonium

sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan

KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi

dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan.

Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan

kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan

garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out).

Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim, hal

ini karena sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh

perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan

dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang

mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling

berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1993).

11

Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan β-galaktosidase

karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik,

murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Pada proses pengendapan, terjadi

penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein

pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk

pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat

menyebabkan denaturasi protein.

Tahap selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan

molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran

semipermeabel. Kantong dialisis selofan (MWCO 10 kD) dalam bufer mampu

memisahkan molekul-molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti

ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya. Molekul yang besar dan

mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran

seperti β-galaktosidase. Setelah enzim dimasukkan ke kantong dialisis dan

direndam dalam larutan bufer maka akan terjadi proses difusi dan osmosis.

Konsentrasi garam di dalam kantong dialisis lebih tinggi sehingga larutan bufer

akan masuk ke dalam kantong dialisis menggantikan garam yang keluar sehingga

terjadi proses kesetimbangan (Scopes 1993).

Kromatografi Filtrasi Gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran

molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam

bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan

silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori

dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang

maka makin kecil ukuran pori. Polimer yang membentuk gel matrik harus

mempunyai syarat: tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH, suhu,

dan kekuatan ionik yang lebar; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah

efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan

laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai

jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam

(Boyer 2000).

12

Gel yang dapat digunakan untuk kromatografi filtrasi gel berupa dekstran,

poliakrilamida, agarosa, kombinasi poliakrilamida-dekstran, dan kombinasi

dekstran-agarosa. Gel yang pertama dikembangkan adalah dekstran yang berasal

dari polisakarida. Dekstran mempunyai nama dagang sephadex. Jika dekstran

berikatan silang dengan N,N-metilenbisakrilamida dinamakan Sephacryl. Gel

poliakrilamida diproduksi dari kopolimerisasi akrilamida dengan N,N-

metilenbisakrilamida. Agarosa terbuat dari galaktosa dan anhidrogalaktosa. Nama

dagang gel agarosa adalah Bio Gel-A, Sepharose, dan Superose. Kombinasi

poliakrilamida-dekstran mempunyai nama dagang Ultragel. Sedangkan kombinasi

dekstran-agarosa dinamakan Superdex (Boyer 2000).

Superdex tersusun dari pengikatan kovalen antara dekstran dan agarosa.

Superdex 200 dapat memisahkan fraksi protein dengan bobot molekul sekitar

10.000-600.000 Dalton dengan ukuran gelnya berkisar 13 µm. Superdex 200

stabil antara pH 1-14. Superdex 200 mempunyai keunggulan yaitu tingkat resolusi

yang tinggi walaupun dalam keadaan laju alir yang cepat (Hellberg, Ivarsson,

Johansson 1996).

Teknik Amobilisasi

Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan

secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Metode amobilisasi yang

ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami

amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan radikal bebas selama

proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya (Cao 2005). Bahan

penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi.

Menurut Illanes et al. (2008), teknik amobilisasi terdiri atas penempelan

pada permukaan padat (adsorpsi), ikatan kovalen (covalen bonding), ikatan silang

(crosslinking), mikroenkapsulasi, dan penjebakan (entrapment) (Gambar 4).

Teknik amobilisasi adsorpsi berdasarkan interaksi ikatan ionik, interaksi ikatan

hidrogen, ikatan hidrofobik atau gaya Van der Waals antara enzim atau sel mikrob

dan bahan penyangga (Ramakrishna & Prakasham 1999). Bahan penyangga yang

biasa digunakan adalah alumina, kaca, tanah liat dan penukar ion. Amobilisasi

dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim

seperti –OH, -SH, -NH2, dan -COOH atau sel mikrob dengan bahan penyangga

13

anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan

kovalen ini akibat penambahan agen pengikat. Bahan penyangga yang digunakan

adalah silika gel yang terlapisi glutaraldehida. Glutaraldehida digunakan untuk

membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga.

Amobilisasi dengan menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan

menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah

polietilenglikol (PEG) dan glutaraldehida. Polietilenglikol sebagai agen presipitasi

dan glutaraldehida sebagai pembentuk ikatan silang (Illanes et al. 2008). Teknik

mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikrob

dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1-

100 µm. Walaupun molekul enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran,

substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan

yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao 2005). Teknik amobilisasi dengan

penjebakan adalah membuat enzim atau sel mikrob terjebak di dalam polimer

butiran gel (Illanes et al. 2008).

Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan

rigid yang berfungsi mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium namun

substrat masih tetap dapat masuk ke dalam butiran gel (beads). Butiran gel berupa

polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan

gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan

poliakrilamid paling luas dipakai pada teknik amobilisasi sel maupun enzim.

Alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat

(Najafpour et al. 2004). Alginat berasal dari alga coklat yang secara luas telah

dipakai sebagai pengental, penstabil, gel, dan film.

Penjebakan sel atau enzim menggunakan alginat karena alginat tidak larut

air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan

natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen

misalnya kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation

multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh

adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan

tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi

kalsium alginat dalam bentuk butiran gel (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium

14

alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi

yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran gel tanpa membatasi transfer

masa.

Keuntungan teknik amobilisasi adalah lebih mudah memisahkan produk

yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, penggunaan kembali biokatalis,

produktivitas volumetrik yang tinggi, dan mereduksi biaya produksi. Enzim yang

teramobilisasi mempunyai half-live lebih panjang dan dapat diprediksi rata-rata

kerusakannya (Cao 2005).

Gambar 4 Teknik amobilisasi enzim. (a) pengikatan kovalen; (b)pengikat silang;

(c) adsorpsi; (d) penjebakan; (e) enkapsulasi.

Karakterisasi Enzim

Suhu dan pH

Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Suhu dapat

meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak struktur enzim. Suhu

optimum merupakan batas keduanya (Dixon & Webb 1978). Peningkatan suhu

sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik

enzim karena energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi, yaitu pada saat

15

kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga

memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini

mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Martin

1981).

Efek pH pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang

dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan pH dapat

mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim

sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar pH

yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada

konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim

mempunyai pH optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal.

Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau

penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang

tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan pH lingkungannya (Lehninger

2004).

Aktivator dan Inhibitor

Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila

komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor,

sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor

dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang

berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat

dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat,

senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Ion K+ dan

Mg2+ dibutuhkan agar aktivitas enzim β-galaktosidase optimum (Mahoney 2004).

Parameter Kinetik

Kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai

konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim

dijaga konstan. Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan

reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya

konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini

16

dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan

bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh

substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004).

Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan

sebagai tetapan Michaelis-Menten (KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada

saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum

(vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat

tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk

hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi

substrat ([S]), kecepatan awal (v0), vmaks, dan KM (Lehninger 2004). Persamaan

Michaelis-Menten adalah sebagai berikut.

[S] K[S] v

vM

maks0

Persamaan Michaelis – Menten dapat ditransformasikan ke suatu

persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan

menghasilkan nilai vmaks dan KM yang lebih tepat karena pemetaan 1/v0 terhadap

1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut KM/vmaks,

perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/vmaks dan perpotongan pada sumbu x

sebesar -1/KM (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai

berikut.

maksmaks

M

0 v

1

S

1K1

][.

vv