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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA α- GLUCOSIDASA (α-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA PEREIRA 2013
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA α- GLUCOSIDASA
(α-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES
IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2013
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA α- GLUCOSIDASA
(α-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES
IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ
CÓDIGO: 1087992796
TRABAJO DE GRADO
MONOGRAFÍA
Requisito parcial para optar al título de Químico Industrial
DIRECTOR DEL PROYECTO
OSCAR MARINO MOSQUERA MARTÍNEZ
Profesor Titular
Universidad Tecnológica de Pereira
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2013
NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA α- GLUCOSIDASA
(α-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES
MONOGRAFÍA
Presentado por:
IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ
El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada
la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota
de: __________________.
Con la connotación: __________________.
Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 20 de Noviembre de
2013.
Director: __________________________
Oscar Marino Mosquera Martínez
Jurado: ___________________________
Juan Carlos Sepúlveda Arias
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por estar siempre de mi lado.
A mi madre, María Inés Ortiz Vélez por darme la vida, su infinito amor,
comprensión, por la oportunidad de creer en mí y en que puedo ser
alguien importante.
A mi abuelo, Vicente Avellaneda eres un ejemplo a seguir, un gran orgullo
para mí; gracias por tu apoyo incondicional y tu hermosa humildad.
A Juan Manuel Gordillo González, Rubiela Vélez, Janet y Aaron
Goffman, por la ayuda brindada.
A todos los miembros de mi familia, por ayudarme de alguna u otra
manera a resolver muchos de los obstáculos que encontré en el camino.
Quiero agradecer especialmente a mi madrina, Elba Ortiz Vélez.
A mis profesores, especialmente Oscar Marino Mosquera y Jaime Niño
Osorio, por brindarme la oportunidad de pertenecer al Grupo
Biotecnología – Productos Naturales (GB-PN), por su paciencia, concejos,
apoyo y comprensión durante la ejecución del proyecto.
A mis compañeras y compañeros del grupo GB-PN, por quienes tengo
mucho respeto, cariño y admiración.
A mi amigo de carrera, Andrés Mauricio Arias González porque siempre
luchamos bajo todas las circunstancias académicas y nació una sincera
amistad.
A la Universidad Tecnológica de Pereira.
I
TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... 3
TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................. I
ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................... V
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. VII
ÍNDICE DE ANEXOS ...................................................................................................... X
1. INTRODUCCIÓN....................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO......................................................................................................... 3
2.1 HIDROLASAS .......................................................................................................... 3
2.1.1 Aspectos Básicos .................................................................................................. 3
2.1.2 Distribución y función de las α-Glucosidasas (α-GLC) en los seres
vivos .................................................................................................................................... 5
2.1.3 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) ................................................. 6
2.1.3.1 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según la Unión
Internacional de Bioquímica (UIB)............................................................................ 7
2.1.3.1.1 Mecanismos de hidrolisis de las glicósido hidrolasas .......................... 7
2.1.3.2 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según su especificidad
por el sustrato ................................................................................................................ 9
2.1.3.3 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según la secuencia de
aminoácidos en su estructura primaria .................................................................... 9
2.1.4 Actividades biológicas asociadas con la inhibición de las α-
Glucosidasas (α-GLC) ................................................................................................... 11
2.1.5 Los inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC).......................................... 12
II
2.1.5.1 Inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC) con actividad
farmacológica ................................................................................................................ 12
2.5.1.2 Inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC) con actividad anti-
alimentaria ...................................................................................................................... 13
2.1.5.3 Inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen natural y de
origen sintético reportados en ola literatura...................................................... 15
2.1.6 Los métodos para la evaluación de la actividad inhibitoria de la α-
Glucosidasa (α-GLC) in vitro en extractos vegetales ........................................ 17
2.1.6.1 Fundamento del método fotométrico para la evaluación de la
actividad inhibitoria de la α-Glucosidasa (α-G) in vitro .................................... 18
2.1.6.2 Sustratos utilizados en el estudio de la actividad enzimática
glucósido hidrolasas (GH) ......................................................................................... 20
2.2 VARIABLES DE LA CINÉTICA DE UNA ENZIMA ................................... 21
2.3 ZONAS DE ESTUDIO ....................................................................................... 23
2.3.1 Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) ............................................. 23
2.3.2 Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) ................................................ 24
2.3.3 Familias de plantas de estudio ..................................................................... 25
2.3.3.1 Familia Annonaceae ....................................................................................... 25
2.3.3.2 Familia Apocynaceae .................................................................................... 26
2.3.3.3 Familia Asclepiadaceae .............................................................................. 26
2.3.3.4 Familia Asteraceae....................................................................................... 27
2.3.3.5 Familia Clusiaceae ......................................................................................... 27
2.3.3.6 Familia Costaceae ......................................................................................... 27
2.3.3.7 Familia Euphorbiaceae ................................................................................. 28
2.3.3.8 Familia Lamiaceae ......................................................................................... 28
2.3.3.9 Familia Lauraceae ......................................................................................... 29
2.3.3.10 Familia Malvaceae ....................................................................................... 29
III
2.3.3.11 Familia Melastomataceae .......................................................................... 30
2.3.3.12 Familia Passifloraceae ............................................................................... 30
2.3.3.13 Familia Piperaceae ...................................................................................... 30
2.3.3.14 Familia Solanaceae....................................................................................... 31
2.3.3.15 Familia Urticaceae ....................................................................................... 31
3.JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 32
4. OBJETIVOS ................................................................................................................ 35
4.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 35
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 35
SECCIÓN EXPERIMENTAL......................................................................................... 36
5.1 MATERIALES ................................................................................................... 36
5.1.1 Equipos y reactivos ....................................................................................... 36
5.1.2 Material vegetal ................................................................................................ 36
5.2 MÉTODOS ......................................................................................................... 37
5.2.1 Obtención de los extractos crudos ............................................................. 37
5.2.2 Caracterización fitoquímica por cromatografía de capa delgada
(CCD) 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................... 41
6.1 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS ........................................... 43
6.2 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA POR CROMATOGRAFÍA DE
CAPA DELGADA (CCD) .............................................................................................. 44
6.3 FORMATO DEL MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA α-GLUCOSIDASA (α-GLC) ................. 51
6.4 VARIABLES IMPORTANTES EN EL DISEÑO DEL MÉTODO
FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
INHIBITORIA DE LA Α-GLUCOSIDASA (Α-GLC) in vitro.......................... 52
6.4.1 La fuente de la α-Glucosidasa (α-GLC) ....................................................... 53
IV
6.4.2 Selección del sustrato .................................................................................... 54
6.4.3 El pH y la temperatura del ensayo .............................................................. 54
6.4.4 Concentración de la solución buffer ........................................................... 55
6.4.5 La concentración de la α-Glucosidasa (α-GLC) en el ensayo ................ 56
6.4.6 La concentración final de p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-NFGP)
en el ensayo ................................................................................................................... 58
6.4.7 El tiempo de duración del ensayo ................................................................ 59
6.4.8 La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo ................... 60
6.4.9 El perfil de los inhibidores enzimáticos ..................................................... 61
6.5 Etapas del método fotométrico para la evaluación de la actividad
inhibitoria α-glucosidasa (α-GLC) en plantas de la Ecorregión Eafetera
Colombiana (ECC) ........................................................................................................ 62
6.5.1 Ecuaciones para realizar los cálculos de porcentajes de inhibición y
actividad enzimática. .................................................................................................. 64
6.6 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS EN
EL MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN DE LA
ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA α-GLUCOSIDASA (α-GLC) EN
PLANTAS DE LA ECORREGIÓN CAFETERA ..................................................... 66
7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 67
8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 68
9. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 69
V
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características de los tipos de α-Glucosidasa (α-GLC) según la
especificidad por el sustrato (Okuyama et al., 2005). ........................................... 9
Tabla 2. Actividades biológicas relacionadas con la inhibición de la α-
Glucosidasa (α-GLC). ........................................................................................................ 11
Tabla 3. Lista de algunos inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen
botánico. Las especies resaltadas en color verde presentan actividad anti-
alimentaria. ......................................................................................................................... 15
Tabla 4. Inhibidores de las α-Glucosidasa (α-GLC) de origen bacteriano. ...... 16
Tabla 5. Lista de algunos inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen
sintético. ............................................................................................................................. 17
Tabla 6. Ingredientes activos de plaguicidas y bioplaguicidas aprobados por
la EPA (Enviromental Protection Agency) desde 1997 al 2010 ......................... 33
Tabla 7. Nombres científicos de las especies de plantas estudiadas en el
proyecto. ............................................................................................................................ 37
Tabla 8. Sistemas de elución utilizados en la caracterización fitoquímica por
CCD. ..................................................................................................................................... 39
Tabla 9. Patrones, reveladores y criterios de detección de metabolitos
secundarios usados en la caracterización fitoquímica por cromatografía de
capa delgada (CCD). ........................................................................................................ 40
Tabla 10. Características de absorción en luz ultravioleta (360 nm) de los
diferentes tipos de flavonoides (Farnsworth, 1966). ........................................... 41
Tabla 11. Masas de los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y
metanol obtenidas por maceración pasiva................................................................ 43
Tabla 12. Clases de α-Glucosidasas (α-GLC) disponibles comercialmente y sus
características. ................................................................................................................ 53
Tabla 13. Condiciones experimentales de temperatura y pH óptimas para el
ensayo de acuerdo a las recomendaciones establecidas por el fabricante. .. 55
Tabla 14. Concentraciones de α-Glucosidasa (α-GLC) utilizadas en ensayos
actividad inhibitoria en extractos crudos de plantas. ......................................... 57
VI
Tabla 17. Metodología del método fotométrico para la evaluación de la
actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) en plantas de la Ecorregión
Cafetera Colombiana . .................................................................................................... 63
VII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura en 3D de la α-Glucosidasa aislada de Bacillus cereus
(Watanabe et al., 1997). ................................................................................................... 3
Figura 2. Tipos de estructura tridimensional del sitio activo de las glicósido
hidrolasas. Tipo bolsillo (1). Tipo túnel (2). Tipo hendidura (3). (Davies and
Henrissat, 1995). ................................................................................................................ 4
Figura 3. Esquema del sitio activo de la α-Glucosidasa (α-GLC) aislada de
Saccharomyces cerevisiae frente a dos disacáridos conformados por (I)
glucosa y manosa. (II) glucosa y galactosa. (Yao et al., 2003). ........................... 6
Figura 4. Mecanismo de Inversión. Estas enzimas utilizan dos residuos
enzimáticos, normalmente residuos carboxílicos, que actúan como un ácido y
una base respectivamente (Davies and Henrissat, 1995) ...................................... 7
Figura 5. Mecanismo de retención. Estas enzimas actúan mediante un
mecanismo de dos etapas. Una vez más dos residuos se ven involucrados, uno
actúa como nucleófilo y el otro como un ácido o base. En el primer paso el
nucleófilo ataca en centro anómerico, dando como resultado la formación de
una enzima glucosídica intermedia con un carácter ácido provisto por el
carboxilato ácido. En el segundo paso el ahora desprotonado carboxilato
ácido actúa como base y se une a una molécula de agua nucleofílica para
hidrolizar la enzima intermedia, dando el producto hidrolizado (Davies and
Henrissat, 1995). ................................................................................................................ 8
Figura 6. Estructura terciaria de algunas familias de glucósido hidrolasa
(GH) (Davies and Henrissat, 1995). ............................................................................ 10
Figura 7. Estructuras químicas de los inhibidores de las α-Glucosidasas (α-
GLC) de origen bacteriano (Narender et al., 2013). Acarbosa, oligómero de
pseudoazúcar (1). Voglibosa, amina poli-hidroxilada (2). Miglitol,
heterocíclico N-sustituido poli-hidroxilado (3). ..................................................... 12
Figura 8. Estructura química de la Azadiractina (tri-terpenoide) componente
activo de bioplagacidas (Raizada et al., 2001). ........................................................ 14
VIII
Figura 9. Metabolitos secundarios con actividad anti-alimentaria (Simmonds,
2006).................................................................................................................................... 14
Figura 10. Hidrólisis enzimática del p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-
NFGP) por acción de la α-Glucosidasa (α-GLC) liberando unidades de p-
nitrofenolato y a-D-glucosa. Adaptado de (Cihan et al., 2010; Guo et al.,
2010). ................................................................................................................................... 19
Figura 11. Estructuras de resonancia del ión p-nitrofenolato en medio básico
(Adams and Langley, 1998). .......................................................................................... 20
Figura 12. Ecuación general de una reacción catalizada por enzimas (Segel,
1976). ................................................................................................................................... 21
Figura 13. Ecuación de una reacción catalizada por enzimas donde sólo
participa un sustrato (Kargi, 2009). ........................................................................... 21
Figura 14. Relación gráfica de la constante de Michaelis-Menten y la
velocidad máxima (Vm) (Fromm and Hargrove, 2012). ......................................... 22
Figura 15. Expresión gráfica de Lineweaver-Burke (Fromm and Hargrove,
2012) ................................................................................................................................... 23
Figura 16. Etapas desarrolladas durante la ejecución del proyecto. ............... 42
Figura 17. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de n-hexano de plantas de la Ecorregión Cafetera
Colombiana. ........................................................................................................................ 45
Figura 18. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de diclorometano de plantas de la Ecorregión Cafetera
Colombiana. ........................................................................................................................ 47
Figura 19. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de metanol de plantas de la Ecorregión Cafetera
Colombiana ......................................................................................................................... 49
Figura 20. Actividad enzimática de la polifenol oxidasa en función de la
concentración de la solución buffer pH 5 (Cestari et al., 2002)...................... 56
Figura 21. Distribución de los tipos de muestras en la microplaca de 96
pozos. En la tabla se exponen los tipos de muestra estudiados en el
proyecto. ............................................................................................................................ 62
IX
Figura 22. Caracterización de cumarinas en extractos de metanol.
(Revelador: KOH al 5%, observar en luz ultravioleta). ....................................... 112
X
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Metodología de la obtención de los extractos crudos de n-hexano,
diclorometano y metanol (Niño et al., 2007). ......................................................... 90
Anexo 2. Procedimiento de la caracterización fitoquímica de los extractos
crudos por cromatografía de capa delgada (Wagner and Bladt, 1996). .......... 91
Anexo 3. Resultados de la caracterización fitoquímica de los extractos
crudos den-hexano, diclorometano y metanol por CCD. ...................................... 92
Anexo 4. Cálculo de la relación señal ruido (Skoog et al., 2008) ..................... 110
Anexo 5. Extracción de la acarbosa a partir de pastillas de Glucobay® 100
mg de Bayer (Cherkaoui et al., 1998). .......................................................................111
Anexo 6. Cálculo de los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos
secundarios en los extractos vegetales evaluados. ............................................ 112
1
1. INTRODUCCIÓN
El hombre ha dependido de la naturaleza desde el inicio de la humanidad
(Mukhtar et al., 2008) con el propósito de suplir sus necesidades básicas
como la alimentación de él y sus animales; de seguridad y protección, como la
obtención de fertilizantes, agentes para el control de plagas, medicinas,
refugio, vestimenta; de confort como condimentos, cosméticos y fragancias
(Gurib-Fakim, 2006; Powell, 2009).
Las plantas han formado la base de sofisticados sistemas de medicina
tradicional en diferentes culturas del mundo desde hace miles de años y
seguirán proporcionando a la humanidad nuevos compuestos con propiedades
terapéuticas. Actualmente, el conocimiento empírico de las propiedades de
las plantas medicinales está siendo utilizado como guía de los químicos en la
búsqueda de diferentes clases de fitocompuestos con interés farmacológico
(Vitalini et al., 2009).
Los metabolitos secundarios de plantas y de origen microbiano, están entre
los compuestos farmacéuticos más conocidos por la sociedad científica
(Carlson et al., 2008; Zhang and Tang, 2008) evidenciando actividades
biológicas específicas (Feher and Schmidt, 2002) y eficaces en el
tratamiento contra el cáncer, diferentes tipos de infecciones, inflamación,
hipercolesterolemia, el rechazo de tejidos en el trasplante de órganos,
entre otros (Ojima, 2008); además de biocompuestos que pueden ser usados
como ingredientes activos en plaguicidas (Kent, 2012).
Dada la importancia de las enzimas en la salud humana, el estudio de los
mecanismos enzimáticos han proporcionado una interfaz entre la química
orgánica, el descubrimiento de fármacos (Khosla, 2000) y aplicaciones en el
campo de la biotecnología; las enzimas son consideradas como marcadores de
importancia farmacológica (Carlson et al., 2008) en el desarrollo de nuevos
2
agentes terapéuticos (Komatsu et al., 2013) y métodos para el control de
plagas (Nimpiboon et al., 2011).
El estudio de la actividad de inhibición de la α-glucosidasa está asociada con
las siguientes actividades biológicas: anti-alimentaria en animales
herbívoros, anti-hiperglicemica (Raju et al., 2010), anti-infecciosa, anti-
metásica, anti-viral (VIH), efectos reguladores del crecimiento en las
plantas (Wrodnigg et al., 2006) y desarrollo de enfermedades por
almacenamiento excesivo en los lisosomas (Sawkar et al., 2006).
Conociendo la riqueza de flora de la Ecorregión Cafetera Colombiana , la
cual es fuente de metabolitos secundarios con actividades biológicas
comprobadas (Niño et al., 2002; Niño et al., 2003) realizadas en estudios
previos y a la necesidad de encontrar fito-compuestos con potencialidad
para ser utilizados como inhibidores de esta glucósido hidrolasa (GH), se
propone el método fotométrico para evaluar la actividad inhibitoria de la α-
Glucosidasa (α-GLC) en extractos vegetales pertenecientes a la Ecorregión
Cafetera Colombiana. Este estudio ampliará el conocimiento de la flora de
esta región y determinará los usos potenciales de la misma.
3
2. MARCO TEÓRICO
2.1 HIDROLASAS
2.1.1 Aspectos Básicos
Las hidrolasas son una clase de enzimas que catalizan las reacciones de
hidrólisis de diferentes sustratos como ésteres de ácidos carboxílicos y de
ácidos fosfóricos, éteres, péptidos y carbohidratos utilizando agua en el
proceso (Sacher et al., 2009). Las hidrolasas son importantes en la industria
química, farmacéutica y de alimentos (Balogh et al., 2004).
Las glicósido hidrolasas (GH) son una subclase de las hidrolasas, que actúan
sobre los enlaces glicosídicos (α y β) de di, oligo y polisacáridos con el fin de
obtener unidades de monosacáridos bajo dos mecanismos: inversión o
retención (Davies and Henrissat, 1995). Las GH están involucradas en
diferentes procesos biológicos como la degradación de la biomasa y el
reconocimiento viral (Kuntz et al., 2008). Las α-Glucosidasas (α-GLC) (figura
1) pertenecen a esta subclase de enzimas (Giannesi et al., 2006).
Figura 1. Estructura en 3D de la α-Glucosidasa aislada de Bacillus cereus
(Watanabe et al., 1997).
4
Las glicósido hidrolasas (GH) presentan tres clases de estructura
tridimensional del sitio activo: bolsillo, túnel y hendidura (Davies and
Henrissat, 1995) como se presenta en la figura 2.
Figura 2. Tipos de estructura tridimensional del sitio activo de las glicósido
hidrolasas. Tipo bolsillo (1). Tipo túnel (2). Tipo hendidura (3). (Davies and
Henrissat, 1995).
5
2.1.2 Distribución y función de las α-Glucosidasas (α-GLC) en los
seres vivos
Las α-Glucosidasas (α-GLC) están presentes en una amplia gama de seres
vivos como microorganismos, hongos, plantas y animales (Yamamoto et al.,
2004). La especificidad por el sustrato y sus propiedades dependen en gran
medida de la fuente donde ella haya sido obtenida (Kim et al., 2008).
En humanos, las α-Glucosidasas (α-GLC) está presente en dos isoformas: EC
3.2.1.3 y EC 3.2.1.20, ambas codificadas por el gen GAA el cual se encuentra
en el cromosoma 17q25. Se sintetiza como un precursor de 110 kDa (números
de aminoácidos: 2-952, 29-952 y 68-952); su carácter es ácido (Yoshimizu
et al., 2008). La función de estas enzimas es hidrolizar enlaces α 1,4 y 1,6 de
oligo y disacáridos liberando como producto de su acción unidades de α-D-
glucosa (Moreland et al., 2012; Zeng et al., 2012).
La isoforma EC 3.2.1.3 de la α-Glucosidasa (α-GLC) está presente en todas
las células del organismo realizando funciones propias de catabolismo, como
la biosíntesis de glicoconjugados en los lisosomas (Kakavanos et al., 2006);
mientras que la isoforma EC 3.2.1.20 está presente en las vellosidades del
intestino delgado realizando funciones anabólicas, como la degradación de
carbohidratos en la etapa final de la digestión; es una de las cuatro enzimas
encargadas de la degradación completa del almidón (Łysek et al., 2006;
Ferreira et al., 2010).
En plantas, las α-Glucosidasas (α-GLC) se encargan de la degradación del
almidón presente en las semillas en germinación; actúa de manera sinérgica
junto con la α-amilasa en este proceso (Nakai et al., 2007).
En insectos, las α-Glucosidasas (α-GLC) estan presentes en el tubo digestivo,
secreciones salivares y glándulas hipofaringeas de estos animales, puesto
que se alimentan de celulosa para llevar a cabo la digestión y sobrevivir;
6
están presentes en una iso-forma, como α-Glucosidasa II (α-GLC II)
(Ghadamyari et al., 2010; Watanabe et al., 2013).
En Bacterias y hongos, la función de las α-Glucosidasas (α-GLC) es esencial
en el proceso de degradación de oligo y disacáridos (Figura 3) (Murray et al.,
2004; Kurakata et al., 2008) y de esta manera obtienen energía para llevar a
cabo sus funciones vitales (Lee et al., 2002).
Figura 3. Esquema del sitio activo de la α-Glucosidasa (α-GLC) aislada de
Saccharomyces cerevisiae frente a dos disacáridos conformados por (I)
glucosa y manosa. (II) glucosa y galactosa. (Yao et al., 2003).
2.1.3 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC)
Las α-Glucosidasas pueden ser clasificadas según el tipo de reacción
hidrolítica que catalicen de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica
(UIB) (Sacher et al., 2009), su especificidad por el sustrato (Okuyama et
al., 2005) y la secuencia de aminoácidos en su estructura primaria
(Henrissat and Bairoch, 1993). A continuación, se describirán cada uno de
estos criterios de clasificación.
7
2.1.3.1 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según la Unión
Internacional de Bioquímica (UIB)
El número de la comisión de enzimas (EC) para la α-Glucosidasa (α-GLC) se
presenta a continuación (Motabar et al., 2009):
2.1.3.1.1 Mecanismos de hidrolisis de las glicósido hidrolasas
Las glicósido hidrolasas realizan su acción enzimática bajo dos mecanismos:
inversión (figura 4) y retención (figura 5).
Figura 4. Mecanismo de Inversión. Estas enzimas utilizan dos residuos
enzimáticos, normalmente residuos carboxílicos, que actúan como un ácido y
una base respectivamente (Davies and Henrissat, 1995)
EC 3. Hidrolasa
EC 3.2. Glucósido hidrolasa
EC 3.2.1.Capaz de hidrolizar enlaces - O y -S glicosídicos
EC 3.2.1.20/3 α-Glucosidasa
OO
H
OO R
O H
H
O O-
10,5 AO
CH2O
R
O O
O H
H
OO
H
++
OO
-
O
OH
O OH
HOR
8
Figura 5. Mecanismo de retención. Estas enzimas actúan mediante un
mecanismo de dos etapas. Una vez más dos residuos se ven involucrados, uno
actúa como nucleófilo y el otro como un ácido o base. En el primer paso el
nucleófilo ataca en centro anómerico, dando como resultado la formación de
una enzima glucosídica intermedia con un carácter ácido provisto por el
carboxilato ácido. En el segundo paso el ahora desprotonado carboxilato
ácido actúa como base y se une a una molécula de agua nucleofílica para
hidrolizar la enzima intermedia, dando el producto hidrolizado (Davies and
Henrissat, 1995).
OO
H
OO R
O O-
5,5 A
++
OCH2
OR
OO
H
O OOO
-
O
O O
O
H
H
OOH
OOH
O O-
+
OCH2
OH
OO
H
O O
+
9
2.1.3.2 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según su
especificidad por el sustrato
Las α-glucosidasas (α-GLC) se pueden clasificar en tres tipos de acuerdo a
su especificidad por el sustrato como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Características de los tipos de α-Glucosidasa (α-GLC) según la
especificidad por el sustrato (Okuyama et al., 2005).
TIPO DE α-GLUCOSIDASA (α-GLC) ESPECIFICIDAD
α-Glucosidasa I
(α-GLC I)
Hidroliza rápidamente sustratos
heterogéneos como aril-glucósidos y
carbohidratos como la sacarosa.
α-Glucosidasa II
(α-GLC II)
Presenta una alta actividad enzimática de sustratos homogéneos como di y
oligosacáridos.
α-Glucosidasa III
(α-GLC III)
Su mayor actividad enzimática es observada
al hidrolizar sustratos homogéneos como
almidón soluble y glucógeno (polisacáridos).
2.1.3.3 Clasificación de las α-Glucosidasas (α-GLC) según la secuencia
de aminoácidos en su estructura primaria
Las glucósido hidrolasas (GH) estan clasificadas en 130 familias (Tagami et
al., 2013) según su secuencia de aminoácidos en la estructura primaria
(Henrissat and Bairoch, 1993); las α-Glucosidasas (α-GLC) estan distribuidas
en las siguientes familias de GH: GH4, GH13, GH31, GH63 y GH97 (Ernst et
al., 2006).
Las familias GH13 y GH31 comprenden el mayor número de α-Glucosidasas,
las cuales se pueden distinguir por su especificidad por el sustrato; la GH31
ha sido la más estudiada en términos de su estructura tridimensional y
reconocimiento de sustratos además, de ser la familia más diversa ya que
10
está conformada por enzimas de los tres dominios de vida (animales, plantas
y microorganismos) las cuales presentan un amplio rango de actividades
hidrolíticas (Ernst et al., 2006).
En la figura 6, se puede observar algunos tipos de estructura terciaria de
las familias de glucósido hidrolasas.
Figura 6. Estructura terciaria de algunas familias de glucósido hidrolasa
(GH) (Davies and Henrissat, 1995).
11
2.1.4 Actividades biológicas asociadas con la inhibición de las α-
Glucosidasas (α-GLC)
El estudio del mecanismo de inhibición de la α-Glucosidasa (α-GLC) es
aplicable en el tratamiento de enfermedades en seres humanos (Ryu et al.,
2009) y en el diseño de nuevo métodos para el control de plagas con el
propósito de proteger los cultivos de importancia agronómica (Ramzi and
Hosseininaveh, 2010). Las actividades biológicas asociadas con la inhibición
de la α-Glucosidasa (α-GLC) se presentan en tabla 2.
Tabla 2. Actividades biológicas relacionadas con la inhibición de la α-
Glucosidasa (α-GLC).
ACTIVIDADES BIOLÓGICAS ASOCIADAS CON LA INHIBICIÓN DE LA α-GLUCOSIDASA (α-GLC)
2.1.4.1
ANTI-ALIMENTARIA
EN ANIMALES HERBÍVOROS
El mecanismo de inhibición de las α-Glucosidasas (α-GLC) en animales herbívoros es el primer paso
para el diseño de un método de control de plagas en plantas de importancia agronómica.
(Nimpiboon et al., 2011; Vatanparast et al., 2012).
2.1.4.2
ANTI-CÁNCER
La capacidad de invasión y migración de las células cancerosas es debido a que los patrones de
glicosilación se encuentran alterados. Las α-Glucosidasas (α-GLC) que participan en este proceso,
constituyen un tratamiento eficaz de esta enfermedad; además reduce la progresión de las
células tumorales en los procesos de metástasis (Sánchez and Cantalejo, 2010)
2.1.4.3
ANTI-HIPERGLICEMICA
Los inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC) retrasan la absorción de carbohidratos; tienen un
papel en el estado pre-diabetico reduciendo la progresión de la diabetes (Liu et al., 2011)
complicaciones vasculares crónicas (Shai et al., 2010) y la obesidad (Huang et al., 2011).
2.1.4.4
ANTI-VIRAL
La inhibición de la α-Glucosidasa (α-GLC) tiene un profundo efecto en la estructura del glicano
(Mehta et al., 1998) alterando los procesos de reconocimiento célula-célula o célula virus (Ryu et
al., 2009; Moorthy et al., 2011).
2.1.4.5
ALMACENAMIENTO
EXCESIVO DE
GLICOCONJUGADOS
Los inhibidores de la α-Glucosidasa, pueden comportarse como “chaperonas” porque corrigen
anomalías en la estructura de la α-Glucosidasa (α-GLC), recuperando su estructura tridimensional
y pueda ejercer su actividad enzimática (Sawkar et al., 2006).
12
2.1.5 Los inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC)
2.1.5.1 Inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC) con actividad
farmacológica
Existen tres tipos de inhibidores de esta enzima basados en su estructura
química, generalmente hidroxilados: compuestos heterocíclicos N-
sustituidos poli-hidroxilados (i), ciclo-alquenos poli-hidroxilados (ii) y
oligómeros de pseudoazúcares (Kim et al., 2008).
A nivel farmacológico, dentro de los inhibidores naturales de esta enzima,
existen compuestos de origen bacteriano como la acarbosa, el miglitol y la
Voglibosa (hemi-sintético) (Naik and Kokil, 2013); son ingredientes activos
en medicamentos contra la diabetes tipo II (Liu et al., 2013). Las
estructuras químicas de estos inhibidores, se presenta en la figura 7.
Figura 7. Estructuras químicas de los inhibidores de las α-Glucosidasas (α-
GLC) de origen bacteriano (Narender et al., 2013). Acarbosa, oligómero de
pseudoazúcar (1). Voglibosa, amina poli-hidroxilada (2). Miglitol,
heterocíclico N-sustituido poli-hidroxilado (3).
O
OH
OH
OH
O
OOH
OH
OHO
OOH
OH
CH3
OH
OHOH OH
NH
OH
N
OH
OH
OH
OH
OH
Miglitol
OH
OH
OH
OHOH
NH
CH3
CH3
Voglibosa
Acarbosa
13
Actualmente, los medicamentos procedentes de plantas que actúan bajo del
mecanismo de inhibición de las α-Glucosidasas (α-GLC) son muy pocos; los
metabolitos secundarios que son ingredientes activos en dichos
medicamentos, se les han realizado modificaciones hemi-sintéticas como
tri-terpénos que han sido hibridados, la α-amirina, el lupeol y la niacina N-
alílicas/ N-alquílicas (Narender et al., 2013).
2.5.1.2 Inhibidores de las α-Glucosidasas (α-GLC) con actividad anti-
alimentaria
Dentro de los métodos de control de plagas de origen botánico, el único bio-
plaguicida cuyo mecanismo de acción sea la inhibición de enzimas digestivas y
que se usa para proteger los cultivos de importancia agronómica es la
Azadiractina (Celis et al., 2008).
La Azadiractina (figura 8) es un tetra-terpenoide característico de la
familia Meliaceae especialmente del árbol Neem (Azadirachta indica). Este
compuesto se encuentra en la corteza, hojas, frutos y, principalmente, en la
semilla del árbol. Se han identificado alrededor de 18 compuestos, entre los
que se destaca azadiractina, que se encuentra en mayor concentración.
Muestra acción anti-alimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la
oviposición y esterilizante. Actualmente, se pueden encontrar formulaciones
comerciales como Neem Gold, Neemazal, Econeem, Neemark, Neemcure y
Azatin, entre otros (Celis et al., 2008).
Además de los tri-terpenoides, otros metabolitos secundarios tambien
presentan actividad anti-alimentaria como las furanocumarinas,
isoflavonoides y terpenoides (figura 9)(Simmonds, 2006).
14
Figura 8. Estructura química de la Azadiractina (tri-terpenoide) componente
activo de bioplagacidas (Raizada et al., 2001).
Figura 9. Metabolitos secundarios con actividad anti-alimentaria (Simmonds,
2006).
O
O
CH3
CH3
O
AcO
MeO2C OH
O OH
MeO2C
H
OH
O
O
OHH
Azadiractina
O O
H
OCH3
O
Xantotoxina
O
O
H HH
HH
OAcO
H
OCOCHMe2
O
Jodrellin B
OH O
OO
H
H
H
H
Faseolina
15
2.1.5.3 Inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen natural y
de origen sintético reportados en ola literatura
A continuación se presentan en las tablas 3, 4 y 5 algunos los inhibidores de
la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen natural y de origen sintético reportados
en la literatura hasta el momento.
Tabla 3. Lista de algunos inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen
botánico. Las especies resaltadas en color verde presentan actividad anti-
alimentaria.
ESPECIE
FITO-COMPUESTO
O
METABOLITO SECUNDARIO
REFERENCIA
Acer rubrum Galo-taninos (Wan et al., 2012)
Aegle marmelos Fenil-etil-cinamidas (Phuwapraisirisan et
al., 2008)
Aesculus hippocasteneum Terpenoide
(Simmonds, 2006)
Ajuga sp Terpenoide
Ammi majus Furanocumarinas
Azadirachta indica Terpenoide
Citrus bergamia Furanocumarinas
Corchorus olitorius Poli-fenoles (Oboh et al., 2012)
Garcinia nobilis Xantonas (Fouotsa et al., 2012)
Glinus opositifolius Saponina tri-terpénica (Kumar et al., 2013)
Grateloupia elliptica
2,4-di-bromofenol
2,4,6-tri-bromofenol
(Kim et al., 2008)
16
Gypsophila oldhamiana Saponinas tri-terpénicas (Luo et al., 2008)
Hedychium spicatum
(Ham. Ex Smith) Di-terpenos
(Prabhakar Reddy et
al., 2009)
Panax japonicus C. A. Meyer var. Major
Poli-acetilénos (Chan et al., 2010)
Phaseolus vulgaris Isoflavonoide (Simmonds, 2006)
Pinus pinaster
Ácido cafeico
Ácido ferulico
Catequinas Epi-catequinas
Proantocianidinas, Taxifolina
(Naik and Kokil, 2013)
Rhus verniciflua Stokes Flavonoides (Kim et al., 2010)
Salacia hainanensis Chun
et How Tri-terpenos (Huang et al., 2012)
Scutellaria sp
Terpenoides (Simmonds, 2006) Scutellaria woronowii
(Juss)
Tabla 4. Inhibidores de las α-Glucosidasa (α-GLC) de origen bacteriano.
ESPECIE METABOLITO SECUNDARIO REFERENCIA
Actinoplanes sp Acarbosa
(Naik and Kokil, 2013)
Streptomyces
hydroscopicus Voglibosa
Streptomyces sp
Bacillus sp Miglitol
17
Tabla 5. Lista de algunos inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) de origen
sintético.
COMPUESTO REFERENCIA
Análogos N-2-sustituidos-5-
(p-Toluenesulfonylamino)-ftalimida (Bian et al., 2013)
Compuestos derivados de β-acetamido
carbonilos (Tiwari et al., 2008)
Compuestos derivados de andrografólidos
(Xu et al., 2007)
Compuestos derivados de benzopiranos (Wang et al., 2010)
Compuestos derivados de la Cromenona (Shen et al., 2010),
(Raju et al., 2010)
Derivados de N-fenil-carboxamida (Alves et al., 2011)
Derivados de los triazoles (Ferreira et al., 2010)
Derivados N-substituidos: valienamina y
conduramina F-1
(Łysek et al., 2006),
(Cumpstey et al., 2011)
Imino-azúcares de la pirrolidina (Trapero and Llebaria, 2012)
Imino-ciclitoles de cinco miembros (Guerreiro et al., 2013),
(Trapero and Llebaria, 2012)
Prolinas glicosidadas (Pandey et al., 2007)
Sales sulfonio de tioazúcares, neosalaprinol y neoponkoranol
(Xie et al., 2011)
2.1.6 Los métodos para la evaluación de la actividad inhibitoria de la
α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro en extractos vegetales
Existen varios métodos para cuantificar la actividad catalítica de una enzima
como los métodos fotométricos y los métodos fluorimétricos (Rahman et al.,
2005); sin embargo, los métodos fotométricos son los más utilizados para
este propósito (Glatz, 2006).
El método fluorimétrico es mucho más sensible que el método
espectrofotométrico, ya que son más específicos al tener que utilizar dos
18
longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir más interferencias
por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos
compuestos fluorescen al ser expuestos a la luz; por esta razón, no se
recomienda evaluar matrices complejas como los extractos vegetales por el
método fluorimétrico (Glatz, 2006).
Es importante destacar que recientemente, se están desarrollando estudios
para encontrar inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) en extractos
vegetales por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) comparando las señales
en los espectros DOSY de la enzima, la enzima y un inhibidor con actividad
biológica comprobada y de la cual se conoce el mecanismo de acción; y la
enzima junto al extracto crudo (Shang et al., 2012).
El cribado de inhibidores de la α-Glucosidasa (α-GLC) se ha convertido en el
gran atractivo para los científicos a través de RMN debido a su capacidad
única para proporcionar información sobre la aspectos estructurales,
termodinámicos, y cinéticos de la interacción entre los inhibidores y los
residuos de aminoácido de la enzima (Shang et al., 2012).
2.1.6.1 Fundamento del método fotométrico para la evaluación de la
actividad inhibitoria de la α-Glucosidasa (α-G) in vitro
El método por el cual se propone la evaluación de la actividad inhibitoria α-
Glucosidasa (α-GLC) en extractos vegetales, consiste en la hidrolisis
enzimática del sustrato de origen sintético, p-Nitrofenil-α-D-
glucopiranósido (p-NFGP) que por acción de la α-Glucosidasa (α-GLC), libera
unidades de p-nitrofenolato y α-D-glucosa (Cihan et al., 2010; Damsud et al.,
2013) como se presenta en la figura 10.
El ión p-nitrofenolato presenta una coloración amarillo claro que evidencia
que la reacción de hidrólisis enzimática se ha llevado a cabo; sin embargo, en
ocasiones no se observa claramente (Oh and Kang, 2004). Varios autores
19
proponen que para intensificar el color, se debe adicionar una solución básica
(Dingee and Anton, 2010) con el objetivo de generar un ambiente denso en
electrones para que el anión p- nitrofenolato entre en resonancia y se
estabilice (Adams and Langley, 1998) como se muestra en la figura 11,
teniendo en cuenta que toda la concentración sustrato (p-NFGP) ha
reaccionado con la enzima y no se presenten falsos-positivos en los
resultados debido que el sustrato p-NFGP es susceptible de reaccionar
frente a una hidrólisis básica.
Figura 10. Hidrólisis enzimática del p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-
NFGP) por acción de la α-Glucosidasa (α-GLC) liberando unidades de p-
nitrofenolato y a-D-glucosa. Adaptado de (Cihan et al., 2010; Guo et al.,
2010).
O
OHOH
OHOH
OH
N+
O-
O
O
O
OH
OHOH
OH
+ OH H
+
p-Nitrofenil-a-D-glucopiranósido
a-Glucosidasa
a-D-Glucosa
N+
O-
O
O-
Ión p-nitrofenolato
20
Figura 11. Estructuras de resonancia del ión p-nitrofenolato en medio básico
(Adams and Langley, 1998).
2.1.6.2 Sustratos utilizados en el estudio de la actividad enzimática
glucósido hidrolasas (GH)
Los sustratos recomendados para estudiar la actividad catalítica de las
glucósido hidrolasas son los glicosidos de mono y di-nitro-fenoles, debido a
que los compuestos liberados como producto de la hidrólisis enzimática,
presentan compuestos nitro-fenólicos fácilmente detectables por su
coloración (Dingee and Anton, 2010). La estructura química de este tipo de
sustratos son específicas para cada tipo de glucósido hidrolasa estudiada
(Dingee and Anton, 2010); el sustrato indicado para la α-Glucosidasa (α-GLC)
es el p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-NFGP). La aglicona nitro-fenólica
del p-NFGP, imita a una unidad de monosacárido, la cual encaja en el sitio
activo de la α-GLC y no interfiere en el mecanismo catalítico de hidrólisis
enzimática (Dingee and Anton, 2010).
N+
O-
O
O-
N+
O-
O
O
NO
-
O
O-
+
N+
O-
O
O
Ión p-Nitrofenolato
(405 nm)
21
2.2 VARIABLES DE LA CINÉTICA DE UNA ENZIMA
Cualquier reacción catalizada por enzimas puede ser escrita como la
ecuación 1 (Figura 12):
Figura 12. Ecuación general de una reacción catalizada por enzimas (Segel,
1976).
Las reacciones químicas catalizadas por enzimas donde se involucra un solo
sustrato, se describen como la siguiente ecuación 2 (Figura 13); la α-
Glucosidasa (α-GLC) sólo requiere un solo sustrato (Guo et al., 2010).
Figura 13. Ecuación de una reacción catalizada por enzimas donde sólo
participa un sustrato (Kargi, 2009).
Donde E es la enzima, S es el sustrato, ES es el complejo enzima-sustrato y
P es el producto. La reacción enzimática transcurre en dos etapas: en la
primera etapa, la enzima se enlaza al sustrato con el propósito de formar el
complejo enzima sustrato la cual es una reacción reversible; mientras que en
la segunda etapa, el sustrato se ha transformado en producto y la enzima
permanece sin ninguna modificación durante el ciclo catalítico (Kargi, 2009).
Dentro de los parámetros cinéticos que se conocen para definir las
propiedades de las enzimas son la constante de Michaelis Menten y la
velocidad máxima (Vm), las cuales se relacionan gráficamente como se
presenta en la figura 14 (Fromm and Hargrove, 2012).
Sustrato Enzima Producto (Ecuación 1)
E + S ES → E + P←→ (Ecuación 2)
22
Figura 14. Relación gráfica de la constante de Michaelis-Menten y la
velocidad máxima (Vm) (Fromm and Hargrove, 2012).
La constante de Michaelis Menten se define como la concentración de
sustrato a la cual se obtiene la mitad de la velocidad máxima (Vm). El Valor
de Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto
mayor es Km, menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres);
cuanto menor es Km, mayor es la afinidad (predomina la forma ES) (Fromm
and Hargrove, 2012). La velocidad máxima (Vm) se define como la velocidad
cuando todo el enzima se encuentra unido al sustrato, es decir, estima el
número de centros activos del enzima (Fromm and Hargrove, 2012).
De acuerdo a la figura 14, se puede observar que a bajas concentraciones de
sustrato, la velocidad de reacción inicial (1/2 Vm) es proporcional al valor de
Km, la cual es un valor específico de concentración del sustrato donde la
reacción es de primer orden con respecto al sustrato (Rahman et al., 2005).
Si la concentración de sustrato aumenta, la velocidad de reacción se
convierte esencialmente independiente de la concentración de sustrato y se
aproxima una velocidad constante; esto significa que en este rango de
valores la reacción es de orden 0, dado que la enzima se encuentra saturada
(Rahman et al., 2005). Para hallar los valores de Km y V máxima, se puede
utilizar la expresión gráfica de Lineweaver-Burke la cual es útil para
23
proveer información importante acerca de la cinética de las enzimas
(Rahman et al., 2005) como se observa en la figura 15.
Figura 15. Expresión gráfica de Lineweaver-Burke (Fromm and Hargrove,
2012)
2.3 ZONAS DE ESTUDIO
La variación en el relieve, los climas y los suelos de la Ecorregión Cafetera
Colombiana generan una diversidad de ecosistemas o tipos de vegetación
tales como: bosques secos y humedales en los valles, bosques andinos en la
zona cafetera, bosques alto-andino y páramos en las partes altas de las
cordilleras; la ECC es muy diversa en especies de animales y plantas
incluyendo especies endémicas (Guevara et al., 2009).
2.3.1 Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP)
La Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) forma parte de la Estrella
fluvial del Quindío la cual fue establecida, junto con otras fincas en un plan
24
de adquisición realizado por la Corporación Regional del Quindío (CRQ) en
1968 para la protección de cuencas hidrográficas y bosques naturales
(Corporación Regional del Quindío et al., 2002; Nieto and Londoño, 2006). La
RNB-LP se ubica en el Municipio de Filandia, Departamento del Quindío,
tiene 747 hectáreas; 450 hectáreas están sembradas en plantaciones
coníferas (pino pátula y ciprés) que están siendo aprovechadas para dejar en
regeneración y de las cuales quedan 15 hectáreas, mientras que 230
hectáreas corresponden a bosque nativo (Nieto and Londoño, 2006;
Echeverri et al., 2007).
La RNB-LP es el atractivo natural de gran importancia para el municipio de
Filandia, su gran diversidad biológica en cuanto a flora se expresa en 143
especies de árboles y 7 especies de bejucos (Echeverri et al., 2007).
2.3.2 Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU)
El Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) se fundó 1984 por el Concejo
Municipal de Pereira y actualmente, se encuentra a cargo de la Corporación
Autónoma Regional del Risaralda (Galeano and Bernal, 1993).
El PRNU se ubica en el departamento de Risaralda, en la zona de
amortiguación del Parque Nacional Los Nevados en un rango altitudinal entre
1850 y 2600 msnm (Galeano and Bernal, 1993); consta de 3986 hectáreas
localizadas en la vertiente occidental de la Cordillera Central (Guevara,
1999).
La flora del PRNU es relativamente rica, se han encontrado
aproximadamente 598 especies pertenecientes a 113 familias de plantas
superiores (Galeano and Bernal, 1993); El PRNU es considerado un
ecosistema estratégico debido a su gran biodiversidad de especies de
plantas y animales (Guevara, 1999).
25
2.3.3 Familias de plantas de estudio
Este estudio se realizó con 36 especies de plantas recolectadas en la
Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) y el Parque Regional Natural
Ucumarí (PRNU) las cuales se caracterizan por presentar diferentes tipos
de actividades biológicas o por demostrar cierto carácter medicinal. Las
plantas de estudio pertenecen a las siguientes familias botánicas:
Annonaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Clusiaceae,
Costaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Malvaceae,
Melastomataceae, Passifloraceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae. A
continuación, se describirá brevemente su ubicación geográfica en el mundo
y en Colombia, el tipo de metabolitos secundarios presentes en ellos
(Fitoquímica) y su situación en la RNB-LP y el PRNU.
2.3.3.1 Familia Annonaceae
Es un conjunto de plantas muy conocido en medicina popular. Comprende
alrededor de 120 géneros y 2100 especies en el mundo (Trease, 2009). En
Colombia, su conocimiento es escaso y sólo existen 72 especies distribuidas
en 17 géneros (Murillo, 2001); en el PRNU existen dos especies: Guatteria sp
y Rollinia sp (CARDER, 2012 ). La RNB-LP se destaca por la presencia de
especies del género Cynanchum sp y Guatteria sp. Los metabolitos
secundarios ampliamente encontrados en esta familia son los alcaloides del
tipo isoquinolina (Trease, 2009).
26
2.3.3.2 Familia Apocynaceae
Las plantas de la familia Apocynaceae está estrechamente vinculada con la
familia Asclepiadaceae. Comprende 250 géneros y 2000 especies alrededor
del mundo, específicamente en los trópicos y sub-trópicos (Trease, 2009).
En el PRNU hay una especie correspondiente al género Mandevilla sp
(CARDER, 2012 ), mientras que en la RNB-LP se destaca por la presencia de
especies del género Oxypetalum sp. Los metabolitos secundarios reportados
en la familia Apocynaceae son: glucósidos cianogénicos, leucoantocianinas,
saponinas, taninos, cumarinas, ácidos fenólicos, ciclitoles, tri-terpenoides,
alcaloides esteroidales en el género Hollarhena, alcaloides del tipo harmano
en los géneros Amsonia y Aspidosperma (Trease, 2009).
2.3.3.3 Familia Asclepiadaceae
Las plantas de la familia Asclepiadaceae se ubican en zonas tropicales,
comprende 172 géneros y 3000 especies (Jürgens et al., 2008). Estudios
filogenéticos han demostrado que la familia Asclepiadaceae pertenece a la
familia Apocynaceae (Heneidak et al., 2006). En el PRNU únicamente se
encuentra la especie Orthosia stenophylla (CARDER, 2012 ), mientras que la
RNB-LP se encuentran especies del género Blepharodon sp. Los fito-
compuestos de mayor importancia en esta familia son: los alcaloides del
indol, fenantrohidro-indolizidina y del tipo piridina; cardenólidos; glucósidos
cianogénicos, saponinas, taninos y ciclitoles (Trease, 2009).
27
2.3.3.4 Familia Asteraceae
La familia Asteraceae está conformada por 1500 géneros y 23000 especies
con distribución cosmopolita agrupadas en 3 subfamilias y 17 tribus (Zavada
and Lowrey, 2010) constituyendo, la mayor familia de plantas con flores
incluyendo dos grupos monofiléticos de tamaño notablemente desigual
(Gruenstaeudl et al., 2009). En Colombia hay 236 géneros y 1435 especies
(Rangel, 2006); PRNU hay 24 especies de esta familia (CARDER, 2012 )
mientras que la RNB-LP se encuentran plantas del género Clivadium sp,
Tilesia sp y Verbesina sp. Los metabolitos secundarios encontrados en la
familia Asteraceae y sus subfamilias son: flavonoles, flavonas y
especialmente, flavonoides (Emerenciano et al., 2001).
2.3.3.5 Familia Clusiaceae
Las plantas de la familia Clusiaceae se encuentran ampliamente distribuidas
en la zona tropical de Asia, África, Nueva Caledonia y Polinesia (Lavaud et
al., 2012). Esta familia consta de 40 géneros y 1200 especies en el mundo
(Marti et al., 2009). En Colombia existen 20 géneros (Galeano and Bernal,
1993); en el PRNU existen 5 especies (CARDER, 2012 ) mientras que en la
RNB-LP hay una especie del género Clusia sp. Esta familia se caracteriza por
sintetizar compuestos poli-fenólicos (Lavaud et al., 2012).
2.3.3.6 Familia Costaceae
Esta familia se conoce comúnmente como “Jengibre espiral”; es originaria
de África y contiene 4 géneros, de los cuales Costus tiene el mayor número
de especies (Kay et al., 2005) y 130 de ellas están distribuidas en las
28
regiones tropicales . En Colombia hay 35 especies (Salinas et al., 2007).Se
caracteriza por la presencia de saponinas, flavonoides, esteroides y
alcaloides (Britto et al., 2011 ).
2.3.3.7 Familia Euphorbiaceae
La familia Euphorbiaceae cuenta con especies de importancia económica por
estar conformada por plantas productoras de aceites (Ricinus), látex
(Hevea, Mabea, Sapium), almidón (Manihot), madera (Hura, Hyeronima) y
especies ornamentales (Euphorbia plucherrima) . Comprende 300 géneros y
6000 especies alrededor del mundo. En Colombia existen 75 géneros y 438
especies (Rangel, 2006); en el PRNU hay 10 especies (CARDER, 2012 )
mientras que la RNB-LP se caracteriza por especies del género Hyeronima
sp y Croton sp. Los metabolitos secundarios encontrados en esta familia son
antraquinonas, tri-terpenos, ácidos grasos epoxidados, ácidos grasos
insaturados y agentes antitumorales; alcaloides del tropano, indol, quinolina,
piridina y aporfina (Trease, 2009).
2.3.3.8 Familia Lamiaceae
Es una familia de plantas altamente desarrollada. Dada la variabilidad de la
estructura de sus miembros, es difícil establecer un procedimiento para
clasificarlas. Se le atribuyen aproximadamente 220 géneros y 4000
especies en el mundo pero se encuentra mejor representada en la región del
Mediterráneo y Asia. En Colombia, hay unas 110 especies; el género Hyptis
cuenta con 44 especies de hierbas y arbustos; y Salvia con 85 taxones
reconocidos (Fernández, 2010); El PRNU contiene 9 especies (CARDER, 2012
), mientras que la RNB-LP presenta especies del género Aegiphila sp. Los
metabolitos secundarios encontrados normalmente en esta familia son los
29
terpenoides, especialmente los del tipo sesqui, di y tri terpénos; además de
varios tipos de compuestos fenólicos, especialmente ácidos fenólicos, como
el ácido rosmarínico y flavonoides (Wink, 2003).
2.3.3.9 Familia Lauraceae
La familia Lauraceae está conformada por 52 géneros y 3000 especies, la
mayoría se encuentran en regiones tropicales y subtropicales cálidas
(Takaku et al., 2007); en el PRNU existen 6 especies (CARDER, 2012 ),
mientras que en la RNB-LP hay especies del género Aniba sp, Ocotea sp y
Persea sp. Los fito-compuestos que se encuentran en esta familia son
alcaloides de la aporfina y bencil-isoquinolina, lignanos del tipo furofurano y
di-hidro-benzo-furanos (Coy and Cuca, 2008); además de neo-lignanos biciclo
[3.2.1] octánicos (Coy et al., 2009), aceites volátiles, aceites fijos y
flavonoides glucosidados (Trease, 2009).
2.3.3.10 Familia Malvaceae
Las plantas de la familia Malvaceae comprende 250 géneros y 4230 especies
que están distribuidas en todo el mundo. Particularmente, son muy
abundantes en las zonas tropicales de Sur (Oliveira da Silva et al., 2010) . En
Colombia hay 140 especies (Galeano and Bernal, 1993); en el PRNU existen 2
especies: Pavonia pseudotyphalaea Linden & planchon y Sida rhombifolia L
(CARDER, 2012 ). Los metabolitos secundarios encontrados en esta familia
son ácidos polifenólicos, flavonoides y antocianinas (Chen et al., 2003).
30
2.3.3.11 Familia Melastomataceae
Esta familia es una de las más abundantes y biodiversas en los trópicos, pero
sus relaciones intrafamiliares y la evolución morfológica son poco conocidas.
Comprende entre 150 - 166 géneros y 4570 especies (Clausing and Renner,
2001). En Colombia existen 68 géneros y 974 especies (Rangel, 2006); en el
PRNU existen 31 especies (Galeano and Bernal, 1993). La fitoquímica de la
familia Melastomataceae es poco conocida; sin embargo, los metabolitos
secundarios encontrados comúnmente son los taninos hidrolizables y
condensados (Yoshida et al., 2008).
2.3.3.12 Familia Passifloraceae
Las plantas de la familia Passifloraceae son muy conocidas en los bosques
tropicales de América del sur (Matsui et al., 2010). Comprende 12 géneros y
600 especies (Trease, 2009) alrededor del planeta. En Colombia hay 2
géneros (Galeano and Bernal, 1993) y 167 especies, siendo el género
Passiflora el más importante con 162 especies (Pérez et al., 2007); en el
PRNU existen 7 especies (CARDER, 2012 ) y en la RNB-LP hay especies del
género Passiflora sp. Los fito-constituyentes de esta familia son:
flavonoides, trazas de glucósidos cianogénicos, aceites volátiles y alcaloides
del tipo harmano (Trease, 2009)
2.3.3.13 Familia Piperaceae
La familia Piperaceae es fuente de muchos fito-compuestos biológicamente
activos, con un gran potencial en medicina y agricultura (Scott et al., 2005);
esta familia está conformada por 4000 especies (López et al., 2010).
31
Colombia posee 7 géneros y 604 especies (Rangel, 2006); el PRNU tiene 23
especies (CARDER, 2012 ). Los metabolitos secundarios encontrados en esta
familia son: ésteres y éteres fenólicos, alcaloides del tipo pirrolidina,
aceites volátiles y lignanos (Trease, 2009).
2.3.3.14 Familia Solanaceae
Las plantas de la familia Solanaceae son de gran importancia económica en
las industrias farmacéutica y de alimentos. Comprende alrededor de 96
géneros y 3000 especies. En Colombia hay 42 géneros y 402 especies
(Rangel, 2006); el PRNU existen 39 especies (CARDER, 2012 ) y en la RNB-
LP hay especies del género Solanum sp. Las plantas de esta familia producen
una amplia variedad de metabolitos segundarios como alcaloides del tropano,
piridina y alcaloides esteroidales, witanolidos, ecdi-esteroides, sesqui-
terpénos, di-terpénos y antraquinonas (Wink, 2003).
2.3.3.15 Familia Urticaceae
Comprende 45 géneros y 550 especies distribuidas en regiones tropicales y
subtropicales alrededor del mundo (Vargas, 2002). En Colombia existen 100
especies (Galeano and Bernal, 1993); en el PRNU 13 especies (CARDER, 2012
). Los metabolitos secundarios reportados en esta familia son: alcaloides
fenantro-quinolizidínicos, antraquinonas, flavonoides y terpenoides (Cai et
al., 2006). Son utilizadas en medicina natural en combinación con otras
especies para el tratamiento de la hiperplasia benigna de la próstata
(Trease, 2009).
32
3.JUSTIFICACIÓN
Varios estudios ampliamente citados, han estimado que los daños económicos
y ambientales causados por especies invasoras en cultivos agrícolas en
Estados Unidos tienen un costo entre 97 US$ - 137 US$ millones y en el
resto del mundo puede tener un estimativo de 1.5 US$ billones de dólares
por año (Abhilash and Singh, 2009); además de que el uso de los pesticidas
es de dos millones de toneladas anuales. En Colombia se usan
aproximadamente 40.000 toneladas anuales por un valor de 23.000 millones
de pesos (Jaramillo et al., 2007).
Las compañías farmacéuticas y grupos de investigación enfocados en el
campo de la biotecnología, están tratando de reformar el paradigma del
cribado aleatorio a un diseño racional que considere el uso de los compuestos
de origen natural, los cuales son un modelo probado para el descubrimiento
y desarrollo de nuevos fármacos, agroquímicos, cosméticos, compuestos
químicos puros, nutracéuticos (McChesney et al., 2007).
Los Botánicos estiman que el número de plantas superiores en el planeta
puede estar entre 300.000 y 320.000 especies; sólo un porcentaje muy
pequeño de estas ha sido investigado por las propiedades de sus fito-
constituyentes; es una fuente que no ha sido explorada y aprovechada lo
suficiente (Powell, 2009).
Esto puede demostrarse con los porcentajes de ingredientes activos en
plaguicidas aprobados por la EPA (Enviromental Protection Agency) desde el
año 1997 al 2010 como se muestra en la tabla 6.
33
Tabla 6. Ingredientes activos de plaguicidas y bioplaguicidas aprobados por
la EPA (Enviromental Protection Agency) desde 1997 al 2010
DESCRIPCIÓN DEL TIPO DE FUENTE
PORCENTAJE
Compuestos sintéticos 78%
Compuestos naturales con modificaciones hemi-sintéticas 15%
Compuestos de origen microbiano 1%
Compuestos de origen natural 6%
Como se observa en la tabla 6, es evidente que el uso de los pesticidas de
origen sintético predomina como un producto de alto impacto para los
agricultores.
Las plantas son fuente de fito-compuestos variables estructuralmente con
un amplio rango de actividades biológicas, que podrían ser útiles para el
desarrollo de una terapia alternativa o adyuvante de muchas enfermedades
(Zhang et al., 2013), pero también es fuente de biocompuestos con
aplicación en el área de la agricultura en la búsqueda de metabolitos con
posible actividad anti-alimentaria (Vatanparast et al., 2012)
La inhibición de la α-Glucosidasa (α-GLC) está asociada a diferentes
actividades biológicas como anti-alimentaria en animales herbívoros
(Vatanparast et al., 2012), anti-cáncer y anti-metásica (Borges de Melo et
al., 2006), anti-hiperglicemica (Ha et al., 2012) y anti-viral (VIH) (Moorthy
et al., 2011); convirtiéndose en objeto de investigación por abarcar distintas
areas a nivel farmacológico y a nivel ambiental.
Teniendo en cuenta la biodiversidad de plantas de la Ecorregión Cafetera
Colombiana (Guevara et al., 2009) y la abundancia de metabolitos
secundarios y fito-compuestos (Niño et al., 2002; Niño et al., 2003), se
propone investigar las condiciones experimentales del método fotométrico
para la evaluación de la actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro
en extractos vegetales con el objetivo de evaluar dichos extractos y
34
encontrar fito-compuestos que puedan convertirse en una posible
alternativa que pueda ser utilizado en un biopreparado para el control de
plagas basado en este mecanismo de inhibición. Este estudio ampliaría el
conocimiento de la flora de la Ecorregión Cafetera Colombiana.
35
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Definir las condiciones experimentales del método fotométrico para la
evaluación de la actividad inhibitoria α-glucosidasa (α-GLC) in vitro en
extractos vegetales.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener los extractos de n-hexano, diclorometano y metanol de 36
especies de plantas seleccionadas de las familias: Annonaceae,
Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Clusiaceae, Costaceae,
Euphorbiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Malvaceae, Melastomataceae,
Passifloraceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae de la Ecorregión
Cafetera Colombiana.
Caracterizar los metabolitos secundarios seleccionados presentes en
los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol por
Cromatografía de Capa Delgada (CCD).
Proponer las condiciones experimentales del método
espectrofotométrico para evaluar la actividad inhibitoria de la α-
Glucosidasa (α-GLC) in vitro en extractos vegetales.
36
SECCIÓN EXPERIMENTAL
5.1 MATERIALES
5.1.1 Equipos y reactivos
Los solventes orgánicos empleados fueron de grado analítico: acetato de
etilo, diclorometano, iso-propanol, n-hexano y metanol analítico, marca
Mallinckrodt; con excepción de los solventes utilizados en la obtención de los
extractos crudos, los cuales fueron de grado comercial, marca Carlo Erba.
En la obtención de los extractos se utilizó un rotaevaporador Heidolph
Laborata 4000 (Alemania).
En la Caracterización Fitoquímica por Cromatografía de Capa Delgada (CCD),
los reactivos empleados para la preparación de los reveladores y patrones
utilizados fueron de las marcas Merck y Sigma-Aldrich. Las cromatoplacas
utilizadas fueron de sílica gel 60 F254 20x20 cm, Merck (Alemania) y una
lámpara ultravioleta Elma LC-30H (Alemania).
5.1.2 Material vegetal
En la tabla 7, se presentan los nombres científicos de las plantas
recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) y el Parque
Regional Natural Ucumari (PRNU) y junto con su voucher de identificación
(Código del Herbario de la Universidad de Antioquia, FJR).
37
5.2 MÉTODOS
5.2.1 Obtención de los extractos crudos
La extracción del material vegetal se realizó mediante maceración pasiva con
los solventes n-hexano, diclorometano y metanol, respectivamente, siguiendo
la metodología descrita por Niño et al., (2007) como se presenta en el anexo
1. La mayoría de los extractos ya habían sido obtenidos por trabajos previos.
Tabla 7. Nombres científicos de las especies de plantas estudiadas en el
proyecto.
Familia Especies N UTP FJR
Annonaceae Guatteria petiolata 198 4052
Apocynaceae Mandevilla veraguensis 200 4054
Asclepiadaceae Blepharodon grandifolium 201 4055
Asteraceae
Calea angosturana 95 4046
Clivadium asperum 191 4045
Clivadium funkise 89 3909
Munnzonia hastifolia 190 4044
Pentacalia americana 96 3916
Clusiaceae Chrysoclamys floribunda 180 4035
Vismia laevis 184 4039
Costaceae Costus sp 187 4029
Euphorbiaceae
Acalypha diversifolia 62 3726
Acalypha macrostachya 196 4050
Alchornea grandis 202 4056
Hyeronima antioquiensis 85 3905
Hyeronima Macrocarpa Müll 104 3925
Mavea montana 92 3912
Lamiaceae Salvia scutellarioides 186 4041
Lauraceae
Ocotea insulares 176 4031
Ocotea paulii 179 4034
Nectandra acutifolia 177 4032
Nectandra lineatifolia 178 4033
38
Malvaceae Pavonea septioides 181 4036
Melastomataceae Miconia sp 73 3739
Tibouchina lepidota 185 4040
Passifloraceae Passiflora danielii 182 4037
Passiflora rubra 183 4038
Piperaceae
Piper calceolarium 194 4048
Piper crassinervium 175 4030
Piper danielli-gonzalezii 197 4051
Solanaceae
Browalia speciosa 171 4025
Deprea glabra 170 4024
Solanum brevifolium 174 4028
Solanum sp 189 4043
Solanum trachycyphum 188 4042
Urticaceae Phenax uliginosus 143 3990
5.2.2 Caracterización fitoquímica por cromatografía de capa delgada
(CCD)
Los extractos crudos plantas poseen una mezcla compleja de fito-
compuestos que proceden de su metabolismo primario y secundario (Trease,
2009) por lo tanto, en la caracterización de los núcleos fitoquímicos, es
importante encontrar un sistema de solventes que permita una buena
separación de los fito-componentes ya que de esto depende su detección.
Los sistemas de solventes utilizados para la elución de los tres tipos
extractos estudiados, fueron encontrados siguiendo la metodología descrita
previamente por Jaramillo, (1987), los cuales se muestran en la tabla 8.
39
Tabla 8. Sistemas de elución utilizados en la caracterización fitoquímica por
CCD.
Extracto Sistema de elución Polaridad del sistema
(P’)
n-Hexano n-Hexano-Acetato de etilo
(77:23) 0.989
Diclorometano Cloroformo -Acetato de etilo-Isopropanol
(82:17:1) 4.382
Metanol Cloroformo-Acetato de etilo- Isopropanol
(90:7:3) 4.392
Con el propósito de caracterizar los metabolitos secundarios presentes en
los extractos (n-hexano, diclorometano y metanol) de las 36 plantas que
estudiaron en este proyecto, se realizó la marcha fitoquímica por
cromatografía de capa delgada (CCD) siguiendo la metodología descrita por
(Wagner and Bladt, 1996) como se muestra en el anexo 2, usando criterio
de detección, la formación de manchas las cuales se compararon con
patrones cuando estas fueron reveladas con un reactivo químico adecuado
para cada tipo de núcleo estudiado.
La presencia o ausencia del fito-compuesto analizado, se determinó
mediante la observación de una coloración o fluorescencia, a la luz del día o
haciendo uso de la lámpara ultravioleta (λ=240 nm y λ=360 nm).
Por ejemplo, para la detección de cumarinas y quinonas se usó como
revelador químico KOH al 5% en etanol absoluto, seguido de la observación
en luz ultravioleta a 360 nm; la 7-hidroxicumarina como patrón de cumarinas
y de antraquinona como patrón de quinonas. Los metabolitos secundarios, los
reveladores, los patrones y los criterios de detección de los fito-
compuestos caracterizados en este proyecto, se presentan en las tablas 9 y
10.
40
Tabla 9. Patrones, reveladores y criterios de detección de metabolitos secundarios usados en la
caracterización fitoquímica por cromatografía de capa delgada (CCD).
Metabolitos secundarios Patrón (300 ppm) Revelador Característica de la mancha Referencia
Alcaloides Papaverina Dragendorff Naranja
(Harborne, 1998) Cumarinas 7-Hidroxicumarina
KOH al 5% en etanol absoluto
(UV 254 - 360 nm)
Azul o blanco fosforescente
Esteroides y/o saponinas
esteroidales
β-Estradiol,
Diosgenina, Hecogenina,
Liebermann-
Burchard
Verde, amarillo o azul
(Farnsworth,
1966)
Esteroles, Di, tri, terpénos
y/o saponinas tri-terpénicas
Colesterol,
Lupeol, Rosado o lila
Esteroles Colesterol,
Estigmasterol, Amarillo pálido o gris
Flavonoides: auronas, catequinas, chalconas,
flavonas, flavonoles,
Flavononas e isoflavonas
Apigenina y
Naringenina,
AlCl3 al 1% en
metanol analítico
(UV 360 nm)
(Ver tabla 10)
Taninos: hidrolizables y/o
compuestos fenólicos; o
taninos condensados
Ácido Gálico y Kaempferol
FeCl3
Negro o azul para taninos
hidrolizables y compuestos fenólicos; café o verde para
taninos condensados (Harborne, 1998)
Quinonas Antraquinona
KOH al 5% en
etanol absoluto (UV 360 nm)
Naranja, amarillo, rojo, vinotinto,
morado y café
Sesquiterpenlactonas Digitoxina Kedde Violeta, morado o vinotinto (Wagner and
Bladt, 1996)
41
Tabla 10. Características de absorción en luz ultravioleta (360 nm) de los
diferentes tipos de flavonoides (Farnsworth, 1966).
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para el análisis de resultados obtenidos en este proyecto, se siguió el esquema que
se muestra en la figura 16, en el cual se observan las etapas que se desarrollaron
teniendo en cuenta los objetivos específicos planteados en este estudio.
RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES USANDO COMO REVELADOR CLORURO DE ALUMINIO AL 1% SEGUIDO DE LA OBSERVACIÓN EN LUZ UN A 360 nm
TIPO DE FLAVONOIDE REGIÓN VISIBLE REGIÓN UV (360 nm)
Auronas Amarillo pálido
Café
Naranja fluorescente
Rosado
Catequinas Incoloro
Amarillo-Blanco
Azul pálido
Incoloro
Chalconas Amarillo Naranja
Amarillo-Naranja
Naranja fluorescente Café
Rosado
Flavonas Amarillo pálido
Verde fluorescente
Amarillo
Café
Flavonoles Amarillo Amarillo o verde fluorescente
Flavononas Incoloro Amarillo o verde fluorescente
Azul-Blanco
Isoflavonas Incoloro Amarillo fluorescente
42
Obtención de
Extractos Vegetales
Caracterización
fitoquímica por
cromatografía de
capa delgada (CCD)
Condiciones experimentales del método
fotométrico para la evaluación de la
actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) en extractos vegetales
n-Hexano
Diclorometano
Metanol
Alcaloides Cumarinas Esteroides Esteroles Flavonoides Quinonas Taninos Saponinas
Abundancia
Relativa de
Metabolitos
secundarios
-Fuente de la α-Glucosidasa -Selección del sustrato (p-Nitrofenil-α-D- glucopiranósido) -pH y temperatura del ensayo -Cofactores -Concentración de la solución buffer -Concentración de la α-Glucosidasa (α-GLC) -Concetratración del sustrato -Tiempo de duración del ensayo -Solubilidad de los reactivos
Características óptimas
de ensayos de tamizaje
en productos naturales
Variables en el
desarrollo del método
Fotométrico para
evaluación de la
Actividad inhibitoria
α-Glucosidasa (α-GLC)
METODOLOGÍA
-Formato del ensayo -Relación señal/ruido
-Tipo de muestra -Actividad inhibitoria (% de inhibición) -Perfil de los inhibidores
Figura 16. Etapas desarrolladas durante la ejecución del proyecto.
43
6.1 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS
A continuación en la tabla 11, se encuentran los valores de las masas de los
extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol obtenidos a través de
maceración pasiva y concentradas a 50°C siguiendo la metodología de Niño et al.,
(2007).
Tabla 11. Masas de los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol
obtenidas por maceración pasiva.
MASAS DE EXTRACTOS CRUDOS OBTENIDOS POR MACERACIÓN PASIVA (g)
NOMBRE CIENTÍFICO n-Hexano Diclorometano Metanol
Guatteria petiolata 2,3142 17,2717 10,1374
Mandevilla veraguensis 7,5838 5,9912 17,6008
Blepharodon grandifolium 8,0466 5,1797 10,9138
Calea angosturana 3,5635 5,8709 8,2776
Clivadium asperum 1,5581 3,5513 6,6557
Clivadium funkise 7,2534 5,4337 10,6985
Munnzonia hastifolia 7,2215 5,5685 8,1138
Pentacalia americana 6,0284 6,2498 7,749
Chrysoclamys floribunda ----- 8,1444 7,2008
Vismia laevis 3,8123 2,8488 7,7866
Costus sp ---- 1,8381 19,0775
Acalypha diversifolia 4,279 5,469 22,178
Acalypha macrostachya 6,2319 5,8346 6,503
Alchornea grandis 2,227 3,159 14,058
Hyeronima antioquiensis 4,8124 4,3338 18,3213
Hyeronima Macrocarpa Müll 21,5953 ---- ----
Mavea montana 8,0815 5,4216 28,9335
Salvia scutellarioides 4,5364 6,7065 15,3539
Ocotea insulares 3,3898 4,1877 6,5223
Ocotea paulii 6,8258 6,6573 20,6937
Nectandra acutifolia 12,2728 14,8267 27,8171
Nectandra lineatifolia 8,9025 12,6264 38,0924
44
Estos extractos crudos se utilizaron en la caracterización fitoquímica por
cromatografía de capa delgada (CCD).
6.2 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA
DELGADA (CCD)
La marcha fitoquímica por CCD determinó los núcleos fitoquímicos presentes en
los extractos de n-hexano, diclorometano y metanol de las plantas evaluadas en
este trabajo recolectadas en las zonas de estudio, la Reserva Natural Bremen-La
Popa (RN-BLP) y el Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) se muestran en el
anexo 3.
En la figuras 17, 18 y 19 se presentan los porcentajes de abundancia relativa de
metabolitos secundarios en los extractos vegetales de n-hexano, diclorometano y
metanol estudiados respectivamente en este proyecto.
Pavonea septioides 3,3173 3,3879 7,0045
Miconia sp ---- ---- ----
Tibouchina lepidota 2,984 3,7096 12,427
Passiflora danielii 2,1085 0,9999 12,7491
Passiflora rubra 2,3365 1,7581 19,2893
Piper calceolarium 5,254 10,2006 12,2128
Piper crassinervium 14,2375 36,9265 25,9078
Piper danielli-gonzalezii 4,8979 13,1173 11,5188
Browalia speciosa 3,6596 4,409 24,7426
Deprea glabra 1,0034 ---- ----
Solanum brevifolium 4,1119 6,7074 20,6981
Solanum sp 3,1360 3,5578 13,3046
Solanum trachycyphum 12,987 6,720 11,695
Phenax uliginosus 1.8973 6,9708 35,2439
45
Figura 17. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de n-hexano de plantas de la Ecorregión Cafetera Colombiana.
Con relación a los resultados presentados en la figura 17, se pueden destacar los
siguientes aspectos:
La única especie que presentó alcaloides en el extracto de n-hexano fue
Ocotea Paulii (Lauraceae). Existen reportes en la literatura de la presencia
de alcaloides del tipo bencil-iso-quinolina en especies del género Ocotea
(Coy and Cuca, 2009).
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
2,78
22,22
52,78
88,89 91,67
11,11
30,56
47,22
33,33 27,78
97,22
2,78
97,22
0,00
ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN
EXTRACTOS VEGETALES DE n-HEXANO
46
La presencia de esteroles, esteroides; di, tri, terpénos y saponinas
(esteroidales y tri-terpénicas) se evidenciaron de manera predominante en
todas las especies de plantas estudiadas; esto tiene concordancia con los
estudios realizados por (Zhou et al., 2008) indicando que los esteroles y
compuestos relacionados constituyen el 80% de las partes vegetativas de las
plantas, son insolubles en agua y se pueden extraer con solventes como n-
hexano y diclorometano. Esto explica la razón por la cual estos fito-
compuestos presentan altos porcentajes de abundancia relativa en este
trabajo.
Dentro de las especies de plantas estudiadas en este tipo de extracto,
Vismia laevis (Clusiaceae UTP 184, FJR 4039) se destacó por la presencia de
varios tipo de flavonoides a diferencia de las especies Guatteria petiolata
(UTP 198, FJR 4052), Clivadium asperum (UTP 191, FJR 4045), Pentacalia sp
(UTP 96 , FJR 3916), Alchornea grandis (UTP 202, FJR 4056), Ocotea
insulares (UTP 176, FJR 4031), Tibouchina lepidota (UTP 185, FJR 4040),
Passiflora rubra (UTP 183, FJR 4038), Passiflora danielli-gonzalezii (UTP
197, FJR 4051), Piper calceolarium (UTP 194, FJR 4048), Piper
crassinervium (UTP 175, FJR 4030) y Piper danielii-gonzalezii (UTP 197,
FJR 4051) cuya presencia de flavonoides fue nula.
Todas las especies de plantas estudiadas en este proyecto evidenciaron la
presencia de quinonas en gran proporción en los tres tipos de extractos
estudiados. El resultado anterior correlaciona los estudios de (Harborne,
1998) probando que las quinonas se distribuyen de manera cosmopolita en las
plantas superiores.
La única especie estudiada en este proyecto que evidenció la presencia de
sesquiterpenlactonas fue Vismia laevis (Clusiaceae UTP 184, FJR 4039).
Existen reportes de lactonas en plantas de la familia Clusiaceae (Guimarães
et al., 2013).
La presencia de taninos condensados fue predominante en la mayoría de los
extractos de n-hexano más no de taninos hidrolizables. Esto puede deberse
47
a la polaridad de este tipo de metabolitos, los taninos hidrolizables son de
naturaleza polar por lo tanto, no se detectaron en este tipo de extracto.
A continuación, se presentan los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos
secundarios en los extractos vegetales de diclorometano.
Figura 18. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de diclorometano de plantas de la Ecorregión Cafetera
Colombiana.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
2,78
25,11
61,11
100,00
58,33
16,67 16,67
50,00
36,11
25,00
100,00
0,00
97,22
27,78
ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN
EXTRACTOS VEGETALES DE DICLOROMETANO
48
De la figura 18 se destacan los siguientes aspectos:
El extracto vegetal de diclorometano Phenax uliginosus (Urticaceae UTP
143, FJR 3990) no mostró la abundante presencia de los metabolitos
secundarios, como cumarinas, alcaloides, flavonoides, quinonas; los únicos
metabolitos que se evidenciaron en esta especie fueron di y tri-terpénos y
esteroles.
El contenido de quinonas y cumarinas de este tipo de extractos comparados
con los extractos de n-hexano, no evidenciaron grandes diferencias en los
porcentajes de estos dos tipos de metabolitos secundarios evaluados.
Según la marcha fitoquímica de los extractos vegetales de diclorometano al
igual que en los extractos vegetales de n-hexano hubo presencia de
esteroles, esteroides y saponinas esteroidales, di-tri-terpénos y saponinas
tri-terpénicas. La especie Piper danielii-gonzalezii (Piperaceae UTP 197,
FJR 4051) evidenció la posible presencia de tri-terpénos y/o saponinas tri-
terpénicas. Actualmente, existen reportes de actividad anti-secretora, anti-
inflamatoria y anti-Helicobacter pylori en extractos vegetales del género
Piper (Quílez et al., 2010).
Cerca del 97% de la plantas de los extractos de diclorometano presentaron
taninos condensados y sólo un porcentaje muy pequeño evidenció la
presencia de taninos hidrolizables y/o compuestos fenólicos
correspondiente al 21,78 %. La especie Piper danelli-gonzalezii (Piperaceae
UTP 197, FJR 4051) se destacó por presentar taninos hidrolizables y
compuestos fenólicos.
El extracto vegetal de la especie Ocotea Paulii (Lauraceae UTP 179, FJR
4034) fue el único que presentó alcaloides en los extractos vegetales de
diclorometano caracterizados. Las especies del género Ocotea se
caracterizan por presentar actividad anti-plaquetaria y anti-trombótica
(Ballabeni et al., 2007).
49
0,000
20,000
40,000
60,000
80,000
100,000
11,111
47,222
100,000
5,556 11,111
22,222
11,111
94,444
77,778 75,000
100,000
0,000 5,556
86,111
ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN
EXTRACTOS VEGETALES DE METANOL
A continuación se presentan los porcentajes de abundancia relativa en extractos
vegetales de metanol en la figura 19.
Figura 19. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de metanol de plantas de la Ecorregión Cafetera Colombiana
Con base a la figura 19, se destacan los siguientes aspectos:
50
Los extractos vegetales de las especies (Melastomataceae Tibouchina
lepidota, UTP 185), y los miembros de la familia Solanaceae (Solanum
trachycyphum, UTP 189) y (Solanum sp, UTP 188) evidenciaron la posible
presencia de alcaloides en los extractos de metanol. Actualmente, no
existen reportes sobre la presencia de alcaloides en plantas de la familia
Melastomataceae. Las plantas de la familia Solanaceae contienen un gran
variedad de alcaloides tales como: alcaloides del tropano, proto-alcaloides;
alcaloides del tipo indol, iso-quinolina, purina, pirazol, piridina, pirrolidina,
quinazolidina, alcaloides esteroidales y gluco-alcaloides (Trease, 2009); las
especies del género Solanum se caracterizan por su alto contenido de
alcaloides esteroidales y del tropano (Eltayeb et al., 1997; Trease, 2009).
Los extractos que evidenciaron la mayor abundancia de Cumarinas fueron los
extractos de n-hexano 25,11% y metanol 47,11%. Dentro de las familias de
que manifestaron la presencia de cumarinas se encuentran la familia
Annonaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Clusiaceae, Costaceae,
Euphorbiaceae, Lauraceae, Melastomataceae, Piperaceae y Solanaceae.
Existen reportes de extractos crudos con gran abundancia de cumarinas en
las familias antes mencionadas y además han sido evaluadas contra
Staphylococcus aureus (Yasunaka et al., 2005).
Según la marcha fitoquímica, los extractos crudos de diclorometano (figura
18) y los extractos de metanol (figura 19) no evidencian la presencia de
Sesquiterpenlactonas.
Los extractos vegetales de las familias Annonaceae, Asteraceae y
Euphorbiaceae presentaron un amplio contenido de taninos hidrolizables y/o
compuestos fenólicos en contraste de los extractos vegetales de n-hexano.
Los compuestos fenólicos de origen vegetal son conocidos por su papel en la
calidad y seguridad alimentaria, puesto que contribuyen de manera
significativa al gusto, sabor, color y estabilidad de los alimentos. A su vez
que, se reconocen cada vez más como factores importantes en la salud a
largo plazo, lo que ayuda a reducir el riesgo de enfermedades crónicas
(Arapitsas, 2012).
51
Los extractos vegetales que presentaron mayor contenido de flavonoides
fueron los extractos de metanol. Dentro de las familias de plantas de
estudio, las siguientes presentan una abundancia significativa de
flavonoides: Annonaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Lauraceae y
Solanaceae. La importancia de estos metabolitos radica en que ayudan a
contrarrestar el efecto de los radicales libres que causan stress oxidativo
(Cook and Samman, 1996).
6.3 FORMATO DEL MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN DE
LA ACTIVIDAD INHIBITORIA α-GLUCOSIDASA (α-GLC)
Los aspectos importantes que se tendrán en cuenta en el diseño del método
fotométrico atendiendo la metodología propuesta por Rahman et al., (2005).
Dentro de los aspectos que se deben tener en cuenta para el diseño del método es
El formato del ensayo.
Un ensayo primario es un trabajo exploratorio donde se requiere evaluar muchos y
diferentes objetos de estudio, por esta razón se recomienda usar un equipo que
permita analizar muchas muestras como los lectores de microplaca.
Las ventajas de utilizar un espectrofotómetro con lector de microplacas (Biotek,
2012; vintessential, 2013):
El volumen de la muestra oscila entre 50 - 200 µL
El número de pozos en las microplacas, permite distribuir del número de
muestras como lo requiera el ensayo y puede leer todos las absorbancias de
dichas muestras en el mismo periodo en que transcurra la reacción. El
formato más común en los centros de investigación es la microplaca de 96
pozos además de que permite al menos leer tres longitudes de onda en un
sólo ensayo.
Las muestras no requieren dilución.
52
Se pueden ensayos de cuantificación de ADN y ARN, ensayos de proteínas,
ensayos de enzimas, ensayos de cinética, ensayos inmunológicos, ensayos de
proliferación y citotoxicidad de células, ensayos de Apoptosis y ensayos de
GPCR.
Para los ensayos primarios de la actividad inhibitoria α-Glucosidasa in vitro, se
recomienda el uso de microplacas de fondo plano fabricadas en poliestireno
transparente (Liu et al., 2011).
6.4 VARIABLES IMPORTANTES EN EL DISEÑO DEL MÉTODO
FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA
DE LA α-GLUCOSIDASA (α-GLC) in vitro
Las variables que se deben tener en cuenta para desarrollo del método
fotométrico se muestran a continuación siguiendo la metodología de (Rahman et al.,
2005):
La fuente de la α-Glucosidasa (α-GLC) y selección del sustrato.
El pH y la temperatura del ensayo.
La concentración final de la α-Glucosidasa (α-GLC) en el ensayo.
La concentración final del p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-NFGP) en el
ensayo.
El tiempo de duración del ensayo.
La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo.
Perfil de los inhibidores enzimáticos.
A continuación se describirán las variables del método fotométrico para evaluar la
actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro siguiendo la metodología
descrita por Rahman et al., (2005).
53
6.4.1 La fuente de la α-Glucosidasa (α-GLC)
Una de las consideraciones importantes para el desarrollo del método fotométrico
para evaluar la actividad enzimática, es la selección de una fuente viable de la
enzima (Rahman et al., 2005). La α-Glucosidasa puede ser aislada de diferentes
organismos (Yamamoto et al., 2004); sin embargo, no siempre comparten las
mismas características como su especificidad por el sustrato y condiciones de
experimentación (Ota et al., 2009). En la tabla 12, se presentan las diferentes
clases de α-Glucosidasas (α-GLC) disponibles comercialmente.
Tabla 12. Clases de α-Glucosidasas (α-GLC) disponibles comercialmente y sus
características.
Organismo Número
EC
Especificidad
por el
sustrato
Familia
de
glucósido
hidrolasa
pH
óptimo
de
trabajo
Temperatura
(°C) Fabricante Referencia
Aspergillus niger
3.2.1.20/3
II
31
4.5 40
Sigma-Aldrich
Megazyme
(Kim et al., 2005),
(Tagami et
al., 2013) Bacillus
stearothermophilus
3.2.1.20 I 13 6.8 37
Candida
tsukubaensis
3.2.1.20 II 31 2.4-4.8 55
Sigma-
Aldrich
(Henrissat
and
Bairoch, 1993),
(Kinsella et
al., 1991)
Saccharomyces
cerevisiae
3.2.1.20
I 13 6.8 37 (Kim et al.,
2005)
Oryza sativa III 31 4 37 (Nakai et
al., 2007)
Rhizopus sp.
-- 15 6 37 Merkmillipore
(Chen et
al., 2012)
54
Maltasa de
levadura (Saccharomyces
cerevisiae)
I 13 6.4-6.8 40 Megazyme
(Frandsen
et al.,
2002)
El objetivo principal de este proyecto al obtener las variables de esta metodología
es la búsqueda de compuestos que puedan ser usados como posibles inhibidores de
las enzimas hidrolíticas en los insectos y diseñar un biopreparado. Por lo general,
estos organismos presentan alrededor de 5 enzimas para degradar la celulosa y el
almidón de las plantas; entre ellas, la α-Glucosidasa II (α-GLC II) (Watanabe et al.,
1997); por lo tanto las enzimas aisladas de Aspergillus niger y Candida
tsukubaensis. Estas enzimas deben ser almacenadas entre 0-4°C.
6.4.2 Selección del sustrato
Como se mencionó anteriormente, los sustratos recomendados para estudiar la
actividad catalítica de las glucósido hidrolasas, son glicósidos de mono y di-nitro-
fenoles debido a su fácil detección por espectrofotometría UV-Visible; en el
diseño del método fotométrico para la evaluación de la actividad inhibitoria de la
α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro, el sustrato recomendado es el p-Nitrofenil-α-D-
glucopiranósido (p-NFGP) (Cihan et al., 2010).
Es muy importante tener en cuenta que p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido es
susceptible de hidrolisis básica, además de que debe ser conservado a una
temperatura de -20°C.
6.4.3 El pH y la temperatura del ensayo
El pH y la temperatura del método fotométrico para la evaluación de la actividad
inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro, están en función de las condiciones de
55
pH óptimo y temperatura donde sea más estable y se evidencie su máxima
actividad enzimática (Rahman et al., 2005). La Glucosidasa tipo II (α-GLC II) se
obtendrá comercialmente por lo tanto, el ensayo se llevará a cabo de acuerdo a las
condiciones de pH y temperatura óptimas establecidas por el fabricante como se
muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Condiciones experimentales de temperatura y pH óptimas para el ensayo
de acuerdo a las recomendaciones establecidas por el fabricante.
Fuente de la
α-Glucosidasa II
(α-GLC II)
EC 3.2.1.20
pH óptimo de
trabajo Temperatura Fabricante
Aspergillus niger 4.5 40
Sigma Aldrich
Candida tsukubaensis 4.8 55
6.4.4 Concentración de la solución buffer
Como se expuso anteriormente, el pH óptimo de trabajo de la α-Glucosidasa tipo II
(α-GLC II) es 4.8. sin embargo, la actividad enzimática es dependiente de la
concentración salina de la solución buffer (Rahman et al., 2005). Para cumplir dicha
condición, es importante usar la concentración adecuada de sal y del ácido débil
con el objeto de que la reacción de hidrólisis catalizada por acción de la α-
Glucosidasa (α-GLC) se realice exitosamente.
56
Figura 20. Actividad enzimática de la polifenol oxidasa en función de la
concentración de la solución buffer pH 5 (Cestari et al., 2002).
De igual manera que los ensayos realizados por (Cestari et al., 2002) (figura 20),
se propone evaluar la α-Glucosidasa tipo I (α-GLC) (pH óptimo=6.8) a diferentes
concentraciones de la solución buffer fosfato como son 20, 40, 60, 80, 160 y 200
mM como lo sugiere (Guo et al., 2010) frente a la actividad enzimática. Se debe
tener en cuenta la relación señal/ruido.
6.4.5 La concentración de la α-Glucosidasa (α-GLC) en el ensayo
La concentración final de α-Glucosidasa (α-GLC) es una variable importante en el
desarrollo del ensayo de evaluación de actividad inhibitoria, el cual debe ser un
valor pequeño; sin embargo, debe generar un valor de la señal alto y de esta
manera el cociente obtenido de la relación señal/ruido del ensayo también lo será
(Rahman et al., 2005).
Según reportes de la literatura, las concentraciones de α-Glucosidasa (α-GLC) del
método fotométrico para la evaluación de la actividad inhibitoria de la α-
57
Glucosidasa (α-GLC) in vitro en extractos vegetales se muestran a continuación en
la tabla 14.
Tabla 14. Concentraciones de α-Glucosidasa (α-GLC) utilizadas en ensayos
actividad inhibitoria en extractos crudos de plantas.
Fuente de la
α-Glucosidasa I
(α-GLC I) usada
en el ensayo de
actividad inhibitoria
Concentración inicial
(U/mL)
Tipo de
extracto crudo
evaluado
Referencia
Bacillus
stearothermophilus 0.5 U/mL Etanol (Kim et al., 2011)
Saccharomyces
cerevisiae
0.1 U/mL
Etanol-Agua
(8:2)
(Lordan et al.,
2013)
0.6 U/mL
Etanol-Agua
(5:5)
(Rubilar et al.,
2011)
0.6 U/mL Acetona (Shai et al., 2010)
1 U/mL Etanol (Wang et al., 2012)
0.1 U/mL
Fracciones obtenidas de
un extracto
crudo de
n-Hexano-Acetato de etilo
(7:3)
(Damsud et al., 2013)
Dadas las concentraciones de α-Glucosidasas (α-GLC) utilizadas en las metodologías
para la evaluación de la actividad inhibitoria (α-GLC) en los extractos vegetales, se
propone evaluar en el rango de concentraciones desde 0,2 U/mL a 1 U/mL de α-
Glucosidasa tipo II (α-GLC II) a las condiciones de temperatura y pH óptimas
recomendadas por el fabricante con las diferentes concentraciones de sustrato
58
con el objeto de hallar la relación existente entre la actividad enzimática de la α-
Glucosidasa tipo I (α-GLC I) y la concentración de sustrato en la cual se debe
encontrar una relación proporcional; al aumentar la concentración de enzima, la
velocidad enzimática también se incrementará (una respuesta lineal) en condiciones
de saturación del sustrato. De acuerdo con los valores obtenidos se seleccionará
aquella concentración de enzima que presente la mejor relación señal/ruido (Guo et
al., 2010).
6.4.6 La concentración final de p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-NFGP)
en el ensayo
En las reacciones enzimáticas donde se catalice un solo sustrato, este debe
presentar una alta afinidad de interacción con la enzima; es decir, un valor de Km
bajo lo que permitiría el uso de bajas cantidades de sustrato en el ensayo, así como
proporcionar sensibilidad al ensayo para detectar los inhibidores que compiten con
el sustrato por el sitio activo de la enzima. Además la reacción enzimática
procederá de manera más rápida; en estudios fisiológicos tienen mayor relevancia
aquellos donde el valor de Km sea bajo (Rahman et al., 2005).
La constante Km de la α-Glucosidasa tipo II (α-GLC II) puede ser determinada
experimentalmente usando como sustrato p-Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-
NFGP), evaluando la relación lineal que existe entre el sustrato y la velocidad
inicial de la reacción (1/2 Vm) (Rahman et al., 2005) como se muestra en las
figuras 14 y 15.
En el método fotométrico para la evaluación de la actividad inhibitoria de la α-
Glucosidasa (α-GLC) in vitro, se recomienda escoger como concentración de p-
Nitrofenil-α-D-glucopiranósido (p-NFGP) un valor que incluya el valor de Km; al
usar un valor por debajo de este, el valor de la relación señal/ruido disminuirá;
aquellas concentraciones por encima del valor de Km, incrementará el valor de la
relación señal/ruido, pero hará que el ensayo no sea tan sensible cuando se
requiera detectar el perfil de los inhibidores enzimáticos.
59
Por consiguiente se debe encontrar el equilibrio entre la relación señal/ruido y la
sensibilidad del ensayo (Rahman et al., 2005). Esto tiene correlación con los
estudios realizados por (Motabar et al., 2009) donde se evaluaron diferentes
concentraciones de un sustrato fluorogenico, 4-metil-umbelliferil-α-D-
glucopiranósido (4-MUGP) frente a la α-Glucosidasa (α-GLC) y se encontró que el
valor de Km fue de 76 µM; decidieron aumentar cuatro unidades el valor de Km
para saturar la enzima por ende, la concentración escogida para el sustrato 4-
MUGP fue de 80µM.
6.4.7 El tiempo de duración del ensayo
El tiempo de incubación es uno de los factores que habitualmente se investiga
cuando se desarrolla un método para la determinación de una alguna actividad
enzimática. Normalmente la reacción enzimática se incrementa de manera lineal
con el tiempo de incubación hasta un determinado momento en el que se pierde la
linealidad, lo que puede ocurrir debido a que la concentración de sustrato es un
factor limitante o debido a la inhibición por los productos de la reacción
enzimática.
De acuerdo con los reportes de la literatura, el tiempo durante el que la reacción
es lineal varía enormemente dependiendo de la enzima que se trate (García et al.,
2003)
La incubación de un ensayo enzimático debe llevarse a cabo con base a la velocidad
inicial, donde la reacción es de primer orden con respecto a la concentración de
sustrato y tiene un comportamiento lineal normalmente el tiempo de reacción varia
de 30 a 60 minutos (Rahman et al., 2005).
En estudios realizados de la actividad inhibitoria de la α-Glucosidasa (α-GLC) en
extractos de plantas, normalmente se encuentran dos periodos de tiempo: un
periodo de incubación en el cual la α-Glucosidasa (α-GLC) se activa y un tiempo de
60
reacción donde realiza la actividad de la hidrólisis enzimática del sustrato p-
Nitrofenil-α-D-glucásido (p-NFGP).
Experimentalmente, se ha determinado que un periodo de incubación para la α-
Glucosidasa (α-GLC) en un periodo de 40 minutos donde el tiempo de reacción se
comporta de manera lineal frente a la actividad enzimática; se considera que 10
minutos de tiempo de incubación y 10 minutos de tiempo de reacción, generan una
buena relación de señal/ruido (Motabar et al., 2009).
6.4.8 La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo
En los ensayos de actividad inhibitoria de la α-Glucosidasa (α-GLC), la enzima, el
sustrato y los extractos a evaluar la actividad se disuelven en la misma solución
buffer con el pH óptimo de la enzima con el objetivo de evitar cambios abruptos
que puedan afectar la estructura terciaria de la enzima (Staniszewski, 2009).
La solubilidad es un factor importante dado que en la medida en que los fito-
compuestos presentes en los extractos crudos se encuentren en solución aumenta
la probabilidad de que la α-Glucosidasa (α-GLC) actué frente estos metabolitos y
conviertan en posibles inhibidores de la enzima .
Según los estudios realizados por (Nurok et al., 1999) demuestran que los
disolventes hidrofílicos, como el metanol pueden distorsionar la forma en que el
agua se asocia con la enzima y puede afectar negativamente la actividad
enzimática, por lo tanto, no es recomendable solubilizar los extractos crudos de
plantas de n-hexano, diclorometano y metanol considerados en este proyecto en
sus respectivos solventes dado que puede afectar la medición de la actividad
enzimática y de inhibición de la α-Glucosidasa (α-GLC).
Existen reportes en la literatura de la evaluación de la actividad inhibitoria α-
Glucosidasa (α-GLC) en extractos de plantas In Vitro por fotometría como
extractos crudos de etanol (Kim et al., 2011), acetona (Deutschländer et al., 2011),
metanol y diclorometano (Ranga Rao et al., 2009); y n-hexano (Rao et al., 2007)
61
usando como solvente, una solución tampón de buffer fosfato, cuyo rango de viraje
en la escala de pH es de 6.3 – 7, próximos al pH óptimo de la α-Glucosidasa (α-
GLC).
6.4.9 El perfil de los inhibidores enzimáticos
La inhibición enzimática es de gran importancia fisiológica, ya que a veces la
inhibición de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones
metabólicas puede inhibir por completo a todo el proceso metabólico involucrado y
ejercer en esa forma un efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo. La
importancia que este fenómeno tiene lugar en farmacología y toxicología así como
también, en el desarrollo de herbicidas e insecticidas. De ahí que el estudio del
mecanismo de acción de los inhibidores se haya constituido en una de las más
exploradas de la enzimología práctica.
Es importante comprender el mecanismo por el cual los extractos vegetales
inhiben la enzima; la α-Glucosidasa (α-GLC) exhibe cinética de Michaelis-Menten y
por lo tanto, la descripción de su mecanismo de inhibición puede ser estudiado por
gráficas de dobles recíprocos (Kumar et al., 2013).
Como se mencionó anteriormente, la acarbosa es un inhibidor de la α-Glucosidasa
(α-GLC) cuyo mecanismo de inhibición es competitivo y se recomienda ser utilizado
para hallar el valor del IC50 con el objetivo de discriminar los extractos crudos con
actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) (Hasegawa et al., 2008), además de ser
el control positivo para el ensayo del método fotométrico; la acarbosa se
comercializa con el nombre de Glucobay® (Bayer, 100 mg) y puede ser extraída de
las tabletas como se describe en anexo 5 siguiendo la metodología descrita por
(Cherkaoui et al., 1998).
62
6.5 Etapas del método fotométrico para la evaluación de la actividad
inhibitoria α-glucosidasa (α-GLC) en plantas de la Ecorregión Eafetera
Colombiana (ECC)
La primera etapa del método inicia con la distribución de los diferentes tipos de
muestras en la microplaca de 96 pozos como se muestra en la figura 21.
.
Figura 21. Distribución de los tipos de muestras en la microplaca de 96 pozos. En la
tabla se exponen los tipos de muestra estudiados en el proyecto
Control negativo Patrones del extracto II
Control positivo Control del extracto II
Blanco fotométrico Patrones del extracto III
Pozos vacíos Control del extracto III
Patrones del extracto I Patrones del extracto IV
Control del extracto I Control del extracto IV
Control del sustrato
63
La metodología del método se presenta en la tabla 17.
Tabla 17. Metodología del método fotométrico para la evaluación de la actividad
inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) en plantas de la Ecorregión Cafetera Colombiana .
(-) No requieren del reactivo
(+) Requieren del reactivo.
METODOLOGÍA PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA α-GLUCOSIDASA (α-GLC) EN
PLANTAS DE LA ECORREGIÓN CAFETERA COLOMBIANA
TIPOS DE MUESTRAS
REACTIVOS
Control
negativo
Control
positivo
Mezcla reaccionante
α-Glucosidasa
(α-GLC)
Blanco
fotométrico
Blanco del
extracto
Control
del
sustrato
α-GLC + + + - - - Solución de extracto a
evaluar la actividad
inhibitoria - - + - - -
Acarbosa - + - - - - Buffer Fosfato
(pH=6.8) + + - + + + Periodo de activación de la α-Glucosidasa (α-GLC) a las condiciones de pH y temperatura óptimas por 10
minutos. Monitorear la reacción cada minuto
p-NFGP + - Periodo de reacción enzimática de la α-Glucosidasa (α-GLC) a las condiciones de pH y temperatura óptimas por
10 minutos. Monitorear la reacción cada minuto
Solución básica
(Detiene la reacción enzimática)
+
Medir espectrofotométricamente a 405nm
64
Se debe tener en cuenta en el momento de calcular los volúmenes de las muestras
que serán adicionadas a los pozos:
Las concentraciones iniciales y finales de las soluciones en la microplaca en
el momento de realizar los cálculos.
La concentración final no tiene en cuenta el volumen de la solución que
detiene la reacción enzimática.
La capacidad máxima de los pozos (300 µL).
Aquellas muestras que no requieran de la adición de algún volumen de los
reactivos, se reemplazará por un volumen de solución buffer fosfato
(pH=6.8). Por ejemplo, el control negativo contiene la enzima y el sustrato en
contraste del control positivo que contiene adicionalmente la acarbosa; en
ese caso, el volumen de acarbosa en el control negativo debe ser
reemplazado por volumen equivalente de solución buffer fosfato (pH=6.8).
6.5.1 Ecuaciones para realizar los cálculos de porcentajes de inhibición y
actividad enzimática.
Porcentajes de inhibición de acuerdo a los trabajos realizados por (Shai et
al., 2010).
65
Velocidad enzimática en función de la actividad enzimática de acuerdos
a los estudios realizados por (Watanabe et al., 2013)
i i a nzim i a (
)
i a m n a m z a a i nan
Dónde:
Coeficiente de extinción molar (ε) del p-Nitrofenol= 18200 mol. L-1. cm-1
Distancia recorrida por la luz (d).
66
6.6 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS EN EL
MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
INHIBITORIA DE LA α-GLUCOSIDASA (α-GLC) EN PLANTAS DE LA
ECORREGIÓN CAFETERA
Evaluar la actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro de los
extractos vegetales de cinco concentraciones iniciales: 30 ppm, 100 ppm,
300 ppm, 1000 ppm y 3000 ppm como se sugiere en la metodología de
(Orhan et al., 2013).
Determinar el IC50 como criterio de inhibición frente a la α-Glucosidasa
(Alexander et al., 1999), como base el IC50 de la acarbosa (30 ppm, 100 ppm,
300 ppm, 1000 ppm y 3000 ppm), la cual es un inhibidor de las α-
Glucosidasas (α- GLC) y de las α-amilasas (α-AML) usando el programa
Graphpad Prism.
Realizar el ensayo por triplicado en dos días diferentes.
Los valores de los datos se expresaran como media ± desviación estándar
67
7. CONCLUSIONES
El análisis de la actividad inhibitoria α-Glucosidasa (α-GLC) en muestras
multi-componente como los extractos vegetales, requiere del diseño de
un método altamente sensible debido a la complejidad de la matriz.
Este proyecto plantea las variables requeridas para desarrollar el
método fotométrico para la evaluación de la actividad inhibitoria α-
Glucosidasa (α-GLC) y que este pueda ser adaptado a diversas
investigaciones.
68
8. RECOMENDACIONES
Continuar con la aplicación y ejecución del método fotométrico para la
evaluación de la actividad inhibitoria de la α-Glucosidasa (α-GLC) in vitro
en extractos vegetales, puesto que contribuye al conocimiento de flora
de nuestra región, además de que las actividades biológicas asociadas
con la inhibición de la α-Glucosidasa (α-GLC) como la actividad anti-
alimentaria en animales herbívoros, anti-hiperglicemica y anti-viral están
relacionadas con problemáticas farmacológicas y ambientales a nivel
mundial y nacional como son el control de plagas, la búsqueda de nuevos
compuestos para combatir el VIH y la diabetes.
69
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89
ANEXOS
90
Anexo 1. Metodología de la obtención de los extractos crudos de n-hexano,
diclorometano y metanol (Niño et al., 2007).
Secar el material vegetal en estufa a 50 °C por 48 horas
Moler
Pesar 300g de material vegetal seco y molido
(Someter a extracción por lixiviación durante
48 horas con n-hexano) x3
Filtrar
Extracto de n-hexano Marco vegetal
(Extraer con diclorometano por
lixiviación durante 48 horas) x3
Filtrar
Marco vegetal
Extracto de diclorometano
(Extraer con metanol por
lixiviación durante 48 horas) x3
Extracto de metanol
Eliminar marco vegetal
Concentrar cada extracto en rotaevaporador a 50 °C hasta sequedad
Filtrar
Material vegetal
Almacenar los extractos crudos a -10°C
91
Anexo 2. Procedimiento de la caracterización fitoquímica de los extractos
crudos por cromatografía de capa delgada (Wagner and Bladt, 1996).
Seleccione 5 plantas de estudio aleatoriamente y buscar las
mismas en cada tipo de extracto: n-hexano, diclorometano y
metanol y preparar una soluciones madre de 10000 ppm a
partir de sus extractos crudos
Encontrar el sistema de adecuado para cada tipo de
extracto
Sembrar los extractos en cromatoplacas de sílica gel
60 F254 (5 cm X 10 cm) junto con el patrón del núcleo
fitoquímico que se requiera caracterizar
Eluir las respectivas cromatoplacas con el sistema de
solventes que se encontró para cada tipo de extracto
Mantener el
ambiente libre de
humedad usando
un secador
Revelar las placas (inmersión o spray) usando el
reactivo que permita la detección del núcleo
fitoquímico objeto de investigación
Observar en luz ultravioleta (λ=254 nm
y λ=365 nm) en caso de ser necesario
92
Anexo 3. Resultados de la caracterización fitoquímica de los extractos crudos den-hexano, diclorometano y
metanol por CCD.
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Annonaceae Guatteria
petiolata 198
n-Hexano - +++ ++ - +++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - - ++ + +
Apocynaceae
Mandevila
veraguensis
200
n-Hexano - - - ++ +++
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - +++ ++ + ++
Asclepiadaceae
Blepharodon
grandifolium
201
n-Hexano - - - ++ -
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ + ++
Asteraceae
Calea
angosturana
95
n-Hexano - ++ ++ - ++
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ ++ +
Clivadium
asperum
191
n-Hexano - +++ ++ ++ ++
Diclorometano - - +++ ++ -
Metanol - - +++ ++ +
Clivadium sp
89
n-Hexano - - - ++ ++
Diclorometano - - ++ ++ -
Metanol - ++ ++ + +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
93
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Asteraceae
Munnzonia
hastifolia
190
n-Hexano - - - ++ ++
Diclorometano - - - +++ -
Metanol - - +++ ++ +
Pentacalia sp
96
n-Hexano - - - ++ ++
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ + ++
Clusiaceae
Chrysoclamys
floribunda
180
n-Hexano - + +++ - +++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + + ++ ++
Vismia
laevis
184
n-Hexano - ++ ++ ++ ++
Diclorometano - - +++ ++ ++
Metanol - - ++ ++ ++
Costaceae
Costus sp
187
n-Hexano - ++ - ++ ++
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - + + +
Euphorbiaceae Acalypha
diversifolia 62
n-Hexano - - ++ - ++
Diclorometano - + - ++ -
Metanol - - + ++ +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
94
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIO
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Euphorbiaceae
Acalypha
macrostachya
196
n-Hexano - - ++ ++ +++
Diclorometano - - ++ + -
Metanol - - ++ ++ ++
Alchornea
grandis
202
n-Hexano - - ++ ++ +++
Diclorometano - - +++ ++ -
Metanol - + + + +
Hyeronima sp
85
n-Hexano - - ++ + ++
Diclorometano - - - ++ -
Metanol - + + + +
Hyeronima sp
104
n-Hexano - ++ - ++ ++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + ++ + +
Mavea sp
92
n-Hexano - - ++ + ++
Diclorometano - - ++ ++ -
Metanol - + + + ++
Lamiaceae Salvia
Scutellarioides 186
n-Hexano - - - ++ +++
Diclorometano - - + + -
Metanol - - + + +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
95
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Lauraceae
Ocotea
insulares
176
n-Hexano - - - ++ ++
Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - + - + +
Ocotea
paulii
179
n-Hexano +++ - - ++ ++
Diclorometano +++ - ++ ++ +
Metanol +++ - ++ ++ +
Nectandra
acutifolia
177
n-Hexano - - ++ ++ ++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - ++ +
Nectandra
lineatifolia
178
n-Hexano - - - ++ ++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - ++ +
Malvaceae
Pavonea
septioides
181
n-Hexano - - ++ ++ ++
Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - ++ ++ +
Melastomataceae Miconia sp 73
n-Hexano - - ++ ++ +
Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - - + +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
96
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Melastomataceae
Tibouchina
lepidota
185
n-Hexano - - ++ + ++
Diclorometano - - ++ + ++
Metanol +++ + ++ ++ +
Passifloraceae
Passiflora
danielii
182
n-Hexano - - - ++ +
Diclorometano - - ++
Metanol - - - ++ +
Passiflora
rubra
183
n-Hexano - - - ++ +
Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - - ++ +
Piperaceae
Piper
calceolarium
194
n-Hexano - - - ++ +++
Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - + ++
Piper
crassinervium
175
n-Hexano - - - +++ +++
Diclorometano - - +++ ++ +
Metanol - + ++ + +
Piper danielii-
gonzalezii 197
n-Hexano - + - ++ +
Diclorometano - + + ++ +
Metanol - + ++ + +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
97
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
ALCALOIDES CUMARINAS
ESTEROIDES
Y/O
SAPONINAS
ESTEROIDALES
DI-TRI-TERPÉNOS
Y/O SAPONINAS
TRI-TERPÉNICAS
ESTEROLES
Solanaceae
Browalia
speciosa
171
n-Hexano - - +++ ++ +
Diclorometano - - ++ ++ +
Metanol - - - + +
Deprea
glabra
170
n-Hexano - - + +++ -
Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol - + - + +
Solanum
brevifolium
174
n-Hexano - - ++ ++ -
Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol - + - + ++
Solanum sp
189
n-Hexano - - ++ +++ ++
Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol ++ - - + +
Solanum
trachycyphum
188
n-Hexano - - +++ +++ -
Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol ++ - - + ++
Urticaceae Phenax
Uliginosus 143
n-Hexano - - - ++ +
Diclorometano - - ++ ++ +
Metanol - - - + +
Reveladores Dragendorff KOH al 5% en
Liebermann- Burchard etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Papaverina 7-Hidroxi
β-estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol cumarina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
98
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Annonaceae
Guatteria
petiolata
198
n-Hexano - + + - +
Diclorometano - - + - -
Metanol - - ++ + -
Apocynaceae
Mandevila
veraguensis
200
n-Hexano - - + - +
Diclorometano - - - - -
Metanol - - +++ ++ ++
Asclepiadaceae
Blepharodon
grandifolium
201
n-Hexano - - + - +
Diclorometano - - - - -
Metanol - ++ ++ - -
Asteraceae
Calea
angosturana
95
n-Hexano - - + - +
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + -
Clivadium
asperum
191
n-Hexano - +++ - ++ -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
Clivadium sp 89
n-Hexano - - - + -
Diclorometano - - - - -
Metanol ++ - ++ - -
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
99
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
T
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Asteraceae
Munnzonia
hastifolia
190
n-Hexano - - - + -
Diclorometano - - ++ + -
Metanol ++ - ++ + +
Pentacalia sp
96
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol + - + + +
Clusiaceae
Chrysoclamys
floribunda
180
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - ++ + +
Metanol - - ++ ++ ++
Vismia
laevis
184
n-Hexano +++ +++ +++ +++ -
Diclorometano - - - - -
Metanol ++ - + + -
Costaceae
Costus sp
187
n-Hexano - ++ - ++ -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ - -
Euphorbiaceae Acalypha
diversifolia 62
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - ++ + -
Metanol - - ++ - -
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
100
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Euphorbiaceae
Acalypha
macrostachya
196
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
Alchornea
grandis
202
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - + ++ +
Metanol - - ++ + +
Hyeronima sp
85
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - + - -
Metanol - - + + +
Hyeronima sp
104
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - +++ ++ +
Metanol - - + + +
Mavea sp
92
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - + + +
Lamiaceae Salvia
scutellarioides 186
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - + + +
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
101
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUDARIOS
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Lauraceae
Ocotea
insulares
176
n-Hexano - + + - -
Diclorometano - - ++ + -
Metanol - - ++ + +
Ocotea
paulii
179
n-Hexano - + + - -
Diclorometano ++ ++ ++ ++ +
Metanol - - ++ - +
Nectandra
acutifolia
177
n-Hexano - + + - -
Diclorometano ++ + ++ - +
Metanol - - ++ + +
Nectandra
lineatifolia
178
n-Hexano - + ++ - -
Diclorometano ++ + + - -
Metanol - - ++ + +
Malvaceae
Pavonea
septioides
181
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - + - +
Melastomataceae Miconia sp 73
n-Hexano - - + - -
Diclorometano - - - - -
Metanol ++ ++ ++ + +
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
102
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Melastomataceae
Tibouchina
lepidota
185
n-Hexano - +++ ++ - -
Diclorometano +++ - ++ + ++
Metanol - - + + +
Passifloraceae
Passiflora
danielii
182
n-Hexano - - ++ + +
Diclorometano - - - - -
Metanol - - + + +
Passiflora
rubra
183
n-Hexano - - ++ + +
Diclorometano - - + - -
Metanol - - + + +
Piperaceae
Piper
calceolarium
194
n-Hexano +++ - + ++ +
Diclorometano - - + + -
Metanol + + - - -
Piper
crassinervium
175
n-Hexano ++ ++ +++ ++ +++
Diclorometano - ++ +++ ++ +++
Metanol + + + +++ +
Piper
danielii-
gonzalezii
197
n-Hexano ++ ++ +++ ++ +++
Diclorometano ++ + ++ + +
Metanol + - + + +
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-)Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
103
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
FLAVONOIDES
AURONAS Y/O CATEQUINAS
FLAVONAS Y/O FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Solanaceae
Browalia
speciosa
171
n-Hexano - - + ++ -
Diclorometano - - - - -
Metanol - ++ + +
Deprea
glabra
170
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
Solanum
brevifolium
174
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
Solanum sp
189
n-Hexano - - + - -
Diclorometano ++ ++ +++ - -
Metanol - - + + +
Solanum
trachycyphum
188
n-Hexano - - - ++ +
Diclorometano - - - - -
Metanol - - +++ + +
Urticaceae
Phenax
uliginosus
143
n-Hexano - - - - -
Diclorometano - - - - -
Metanol - - - - -
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
(-) Ausente
(+)Presente
(++)Moderado (+++)Abundante
104
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Annonaceae
Guatteria
petiolata
198
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Apocynaceae
Mandevila
veraguensis
200
n-Hexano +++ - - -
Diclorometano +++ - + +
Metanol +++ - - ++
Asclepiadaceae
Blepharodon
grandifolium
201
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Asteraceae
Calea
angosturana
95
n-Hexano ++ - + -
Diclorometano + - ++ -
Metanol ++ - - ++
Clivadium
asperum
191
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Clivadium sp
89
n-Hexano ++ - + -
Diclorometano ++ - + -
Metanol ++ - - ++
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
105
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Asteraceae
Munnzonia
hastifolia
190
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - + -
Metanol +++ - - ++
Pentacalia sp
96
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
Clusiaceae
Chrysoclamys
floribunda
180
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - -
Vismia
laevis
184
n-Hexano +++ +++ ++ -
Diclorometano +++ - ++ ++
Metanol +++ - - -
Costaceae
Costus sp
187
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - + +
Metanol +++ - - -
Euphorbiaceae
Acalypha
diversifolia
62
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +++
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
106
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Euphorbiaceae
Acalypha
macrostachya
196
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ ++
Metanol +++ - - ++
Alchornea
grandis
202
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ +++
Metanol +++ - - ++
Hyeronima sp
85
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
Hyeronima sp
104
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - +++
Mavea sp
92
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +++
Lamiaceae
Salvia
scutellarioides
186
n-Hexano +++ - + -
Diclorometano +++ - + -
Metanol +++ - - +
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
107
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Lauraceae
Ocotea
insulares
176
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - + -
Ocotea
paulii
179
n-Hexano - - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - + -
Nectandra
acutifolia
177
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - +++
Nectandra
lineatifolia
178
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - +++
Malvaceae
Pavonea
septioides
181
n-Hexano ++ - +++ -
Diclorometano ++ - +++ -
Metanol ++ - - +
Melastomataceae
Miconia sp
73
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ +
Metanol ++ - - +
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
108
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Melastomataceae
Tibouchina
lepidota
185
n-Hexano +++ - +++ -
Diclorometano ++ - +++ -
Metanol +++ - - ++
Passifloraceae
Passiflora
danielii
182
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - -
Passiflora
rubra
183
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
Piperaceae
Piper
calceolarium
194
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Piper
crassinervium
175
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Piper
danielii-
gonzalezii
197
n-Hexano +++ - +++ -
Diclorometano +++ - +++ +++
Metanol ++ - - ++
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
109
Continuación anexo 3:
FAMILIA ESPECIE UTP
Nº
EXTRACTO
(10000 ppm)
METABOLITOS SECUNDARIOS
QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS TANINOS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Solanaceae
Browalia
speciosa
171
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +
Deprea
glabra
170
n-Hexano +++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol +++ - - +
Solanum
brevifolium
174
n-Hexano ++ - ++ -
Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - +
Solanum sp
189
n-Hexano + - ++ -
Diclorometano + - ++ -
Metanol + - - +
Solanum
trachycyphum
188
n-Hexano ++ - +++ -
Diclorometano ++ - +++ -
Metanol ++ - - +
Urticaceae
Phenax
uliginosus
143
n-Hexano + - + -
Diclorometano + - + +
Metanol + - - +
Reveladores KOH al 5% en
etanol absoluto Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina Ácido gálico, Kaempferol
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
110
Anexo 4. Cálculo de la relación señal ruido (Skoog et al., 2008)
(
) √ (
)
Donde:
n es el número de repeticiones del ensayo.
es la media de las absorbancias a 400 nm.
S es la desviación estándar de las absorbancias a 400 nm.
111
Anexo 5. Extracción de la acarbosa a partir de pastillas de Glucobay® 100 mg
de Bayer (Cherkaoui et al., 1998).
Pulverizar finamente cinco
tabletas de Glucobay®
Disolver en 25 mL de agua
desionizada
Sonicar por 15 minutos
Homogenizar en un vortex en
intervalos de 5 minutos
Centrifugar
Sobrenadante Almidón
Realizar tres
veces este
procedimiento
Aforar a 100 mL con
agua desionizada
Filtrar usando una
membrana de 0.2 µm
Concentrar a 40 °C
Almacenar a -10 °C
112
Anexo 6. Cálculo de los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos
secundarios en los extractos vegetales evaluados.
Ejemplo: A continuación se presentan los cromatoplacas donde fueron
sembrados 36 extractos vegetales de metanol, el metabolito que se va a
caracterizar son las cumarinas usando como revelador hidróxido de sodio al 5%
en etanol, seguido de la observación en luz ultravioleta a 360 nm. La presencia
de este tipo de compuestos se caracteriza con la aparición de fluorescencias
blancas y azules como se muestra en la figura 22.
Figura 22. Caracterización de cumarinas en extractos de metanol. (Revelador:
KOH al 5%, observar en luz ultravioleta).
El cálculo del porcentaje de abundancia relativa (%AR) se calcula de siguiente
manera:
