1

Caractérisation de la structure primaire des oligosaccharides et des

peptides/protéines

Travaux dirigés

2

Structure primaire des oligosaccharides et des peptides/protéines

oligosaccharides peptides/protéines

traitements chimiques/enzymatiques

monosaccharides ou oligosaccharides (sous

forme de dérivés)

dérivatisation chromatographie /

spectrométrie de masse

traitements chimiques/enzymatiques acides aminés (sous

forme de dérivés) ou peptides

électrophorèse/ chromatographie /

spectrométrie de masse

2

3

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : structure et représentation des monosaccharides

forme pyranose (cyclisation en 1-5)

forme furanose (cyclisation en 2-5)

β-D-fructofuranoseα-D-fructofuranose

représentation de Fischer

(linéaire)

représentation de Haworth

(cyclique)

Aldoses

****

Cétoses

***

4

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : passage de la représentation linéaire à la représentation cyclique

représentation de Fischer

représentation de Tollens (forme hémicacétale)

3

5

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : passage de la représentation linéaire à la représentation cyclique

anomère α anomère β

les OH à droite en Tollens se retrouvent en dessous du plan du cycle en Haworth

hydroxyle hémiacétalique

6

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : passage de la représentation linéaire à la représentation cyclique

CH2OH : au dessus du plan pour le stéréoisomère D

en-dessous du plan pour le stéréoisomère L

anomère α

anomère α

1

2

3

4

5

6

1

23

4

5

6

4

7

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : formation des liaisons (glyc)osidiques

aldéhyde (aldose) alcool hémiacétal

OH hémiacétalique

cétone (cétose) alcool hémiacétal

OH hémiacétalique

liaison glycosidiquehémiacétal acétal

alcool

acétal

2 alcool

acétal

2

Glc Glc

8

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : sucres réducteurs / non réducteurs

oligosaccharides réducteurs

oligosaccharides non réducteurs

Glc β(1→4) Glc Glc α(1→4) Glc

α-Glc (1→2) β-Fru

OH hémiacétalique : position réductrice

OH hémiacétalique :

position réductrice

Les 2 OH hémiacétaliques sont impliqués dans la liaison osidique

5

9

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : dérivés des monosaccharides

réduction (NaBH4 ou KBH4) : formation des alditols

glucitol ou sorbitol

oxydation :

[ox]

1

6

10

Analyse de la structure primaire des oligo- et poly-saccharides

Rappels : dérivés des monosaccharides

6

TECHNIQUES D’ANALYSE DES OLIGOSACCHARIDES

Dosage, chromatographie liquide, électrophorèse, chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse

11

Dosage des oses neutres

12

Méthode de Tillmans et Philippi

• Milieu acide fort (H2SO4) concentré à chaud (80°C) réaction de déshydratation interne des oses (de plus de 5C) avec cyclisation pour donner le furfural ou un de ses dérivés

• Méthode de dosage colorimétrique : orcinol (lecture DO à 510 nm)

ORCINOL

Formule: C7H8O2Mass molaire : 124.13 g/mol

Dans ces conditions (milieu acide concentré, à chaud), les liaisons glycosidiques sont hydrolysées

7

Dosage des oses neutres

13

réaction de déshydratation/cyclisation des oligossacharides en milieu acide concentré, à chaud

OCHO

H

OH

H

OH

H

OHH OH

H

CHO

H

OH

H

OH

H

OHCH2 OH

H

CHOOHCH2OH

OCHO

H2SO4 conc80°C

furfural

Hydroxy-méthyl-furfural

H2SO4 conc80°C

pentoses

hexoses

Dosage des osamines

14

Méthode d’Elson-Morgan

• Milieu basique à chaud (100°C) • Méthode de dosage colorimétrique :

1. conversion de la glucosamine en dérivé du pyrrole par réaction avec l’acétylacétone en millieu basique (Na2CO3)

2. réaction du dérivé du pyrrole avec la pDMAB (para-diméthylamino-benzaldéhyde) en milieu acide (pDMAB/HCl =réactif d’Ehrlich) qui donne un dérivé de couleur rouge (lecture DO à 510 nm)

• réagit avec la fonction réductrice

Dans ces conditions (milieu basique), pas d’hydrolyse des liaisons glycosidiques

osamine en position réductrice

OH

NH2RO

OOH

OH

CH2OH

OH

OR

NH2

OH

OHCH2OH

OH

OR

NH2

OH

8

Dosage des osamines

15

Méthode d’Elson-Morgan

pDMAB / HCl

réactif d’Ehrlich

osamine en position réductrice

NH2

RO

OH

H O

CH2OH

OH

NH2

RO

OH

H O

CH2OH

OH

CH3

OC

O

NH2

RO

OH

HOH

CH2OH

OH

O

O

CH3

NHRO

CH2

OHOH

OH

O

RO

OH

HOH

CH2OH

OH

O

NH

+

CH3

H

NH

+

RO

CH2

OHOH

OH

O

H

HOH2

OH2

-

-

100°C, pH 9

Acétylacétone/Na2CO3

réaction d’Elson-Morgan

16

Chromatographie sur couche mince

séparation basée sur le caractère polaire ou apolaire des solutés

Phase stationnaire : polaire

Phase mobile : apolaire (solvants organiques)

9

17

Chromatographie sur couche mince

basée sur le caractère polaire ou apolaire des solutés

oligosaccharides : composés polairesla polarité augmente avec le degré de polymérisation : les oligosaccharides de dp

plus élevés (plus polaires) migrent moins que les dp plus faibles (moins polaires)

17

Tém

oin

dp2

Tém

oin

dp4

Tém

oin

dp6

Écha

ntillo

n dp

inco

nnu Phase stationnaire : silice

Solvants (phase mobile) : n-butanol : acide acétique : eau (2:1:1.5)

Révélation : orcinol sulfurique / chauffage

18

Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

séparation basée sur le caractère polaire ou apolaire des solutés

oligosaccharides : composés polairesla polarité augmente avec le degré de

polymérisation : les oligosaccharides de dpplus élevés (plus polaires) migrent moins que les dp plus faibles (moins polaires)

18

Tampon A Tampon B

phase mobile

Pompe A Pompe B

Chambre de mélange

poubelle

phase stationnaire

vanne de sortie

collecteur de fractions

spectromètre de masse (LC-MS)

vanne d’entrée

échantillon

boucle d’injection

détectionUV, IR,

conductivité

colonne

10

19

Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

séparation basée sur le caractère polaire ou apolaire des solutés

oligosaccharides : composés polairesla polarité augmente avec le degré de polymérisation : les oligosaccharides de dp

plus élevés (plus polaires) migrent moins que les dp plus faibles (moins polaires)

19

Phase stationnaire : silice/amino (phase normale)Solvants (phase mobile) :

acétonitrile : eau (gradient d’acétonitrile)

Révélation : indice de réfraction (IR), UV-visible : direct (190 à 195 nm) ou après dérivation, fluorescence après dérivation

FACE : fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis

20

1. Amination réductive = dérivation (pour la détection UV-visible)

1-aminopyrène-3,6,8-trisulfonate

11

FACE : fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis

21

2. Electrophorèse sur gel d’acrylamide à 30%

Tém

oin

dp2

Eche

lle d

e st

anda

rds

(Glu

cide

x)

Echa

ntillo

n dp

inco

nnu

22

Principe de l'analyse de la composition en monosaccharides

hydrolyse acide (H2O/H+)

perméthylation

NaH/CH3-I

remarque : pas d'information sur l'anomérie des C-1

Interprétation :

seule la liaison glycosidique

Gal(1 4)Glc est possible

CPG

hydrolyse des fonctions acétals : liaison(s) osidique(s) + extrémité réductrice

12

23

Hydrolyse des oligosaccharides en mono-saccharides

Hydrolyse acide : TFA 2M/ 100°C ou H2SO4 1M (conditions plus douces pour les monosaccharides acido-sensibles)

Méthanolyse : HCl / MeOH (méthanol chlorhydrique)

24

Détermination de la structure primaire des oligosaccharides

Dérivatisation par les groupements :

1. méthyls (Me)

2. acétyls (Ac)

3. triméthylsilyls (TMS)

4. heptafluorobutyryls

rendre les monosaccharides volatils pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG)

13

25

Détermination de la structure primaire des oligosaccharides

6

NaBD4

Acétates d'alditols

26

Détermination de la structure primaire des oligosaccharides

Identification des alditols perméthylés en CPG

14

27

Ionisation des acides aminés

H3N C H

R

CO O

fonction acide carboxylique (pK α-COOH ~ 2)

fonction amine (pK α-NH2 ~ 9)

Cα asymétrique (sauf Gly)*

chaîne latérale (pKR)

+H3N- CH(R)- COOH +H3N- CH(R)- COO- H2N- CH(R)- COO-

point isoélectrique (acide aminé sous forme zwitterionique):

pHi = ½ (pKα-COOH + pKα-NH2)vers les pH « acides »:

pH < pHivers les pH « basiques »:

pH > pHi

charge globale + charge globale -charge globale 0

28

Ionisation des acides aminés : pouvoir tampon

pK α-COOH

pK α-NH2

pHi

+H3N- CH(R)- COOH +H3N- CH(R)- COO- H2N- CH(R)- COO-

point isoélectrique (acide aminé sous forme zwitterionique):

pHi = ½ (pKα-COOH + pKα-NH2)

15

29

Ionisation des acides aminés : pouvoir tampon

Point isoélectrique :

• des acides aminés acides pHi = ½ (pKα-COOH + pKR)

• des acides aminés basiques pHi = ½ (pKα-NH2 + pKR)

forme zwitterionique

Asp+ Asp+/- Asp+/-- Asp--

30

Ionisation des acides aminés : électrophorèse

quand pH>pHi : l'acide aminé a une charge globale négative migration vers l'électrode positive (anode)

quand pH<pHi : l'acide aminé a une charge globale positive migration vers l'électrode négative (cathode)

quand pH=pHi, l'acide aminé est sous forme zwitterionique (neutre) pas de migration (reste au point de départ)

Dans une solution tampon à pH 6 :

On choisit au mieux le pH du tampon de façon à obtenir une

séparation optimale des différentes espèces

pHi=9.74 pHi=6.02 pHi=2.98

16

31

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

Sodium dodecylsulfate (SDS) Pourcentage d'acrylamide

Gamme de séparation en kDa

7,5 45 - 400

10 22 - 300

12 13 - 200

15 2,5 - 100

migration &

coloration (bleu de

Coomassie)

32

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

Sen

s de

mig

ratio

n

―

+

17

33

Chromatographie sur couche mince

basée sur le caractère polaire ou apolaire des acides aminés

Acides aminés non polaires ou hydrophobes : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, ProAcides aminés neutres (non chargés) mais polaires : Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, TyrAcides aminés acides (chargés - à pH > 3) : Asp, GluAcides aminés basiques (chargés + à pH physiologique) : Lys, Arg, His

34

Chromatographie sur couche mince

basée sur le caractère polaire ou apolaire des acides aminés

Acides aminés non polaires ou hydrophobes : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, ProAcides aminés neutres (non chargés) mais polaires : Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, TyrAcides aminés acides (chargés - à pH > 3) : Asp, GluAcides aminés basiques (chargés + à pH physiologique) : Lys, Arg, His

Phase stationnaire : polaire

Phase mobile : apolaire (solvants organiques)

Rapport frontal (Rf) :

18

35

Chromatographie sur couche mince

basée sur le caractère polaire ou apolaire des acides aminés

Acides aminés non polaires ou hydrophobes : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, ProAcides aminés neutres (non chargés) mais polaires : Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, TyrAcides aminés acides (chargés - à pH > 3) : Asp, GluAcides aminés basiques (chargés + à pH physiologique) : Lys, Arg, His

Solvant : butanol:acide acétique:eau 70:18:12 (v:v:v) Révélateur : ninhydrine

? ?

? = hydrolysat peptidique

D L Y K C I P R V M

36

Chromatographie sur couche mince

Révélation : la plupart des acides aminés n'absorbe pas dans l'UV (sauf Phe, Tyr, Trp) et aucun n'absorbe dans le visible (non colorés)

lumière UV (254 & 360 nm) pour détecter les AAs aromatiques o maximum d'absorption (λmax) de Tyr : 280 nmo maximum d'absorption (λmax) de Phe : 260 nmo maximum d'absorption (λmax) de Trp : 295 nm

réaction chimique destructive qui génère un produit coloré (Ninhydrine)