ABSORPTIONSPHOTOMETRIE

Biophysik Vorlesung

29.01.2015., PTE

Gábor Talián

ENTWURF

• Strahlungen und Wechseleirkungen

• Energieniveaus der Moleküle

• Spektroskopische Methoden, Überblick

• Absorption

STRAHLUNGEN

Ausbreitung der Energie in Raum durch fortschreitende Bewegung von Teilchen oder Wellen

Strahlungsquelle Strahlung bestrahlterKörper

ENERGIE

Teilchen: α-, β-Strahlung

Elektromagnetisch

Mechanisch: Schall

Ionisierend: Teilchenstrahlung, UV, Röntgen, γ-Strahlung

Nonionisierend:LichtRadio-, MikrowellenSchall

isotrop anisotrop

∆� � � ∙∆�

4 ∙ � ∙ �

� �Δ�

����

spezifische Ausstrahlung (M)und Bestahlungsstärke (Eein)

� �Δ�

�� ����

�� ��

Δ�Strahlungsfluss

1m2

Strahlungsflussdichte �� �∆��

∆�

LICHT = ELEKTROMAGNETISCHE WELLE

Doppelnatur: Welle (Ausbreitung) Teilchen (Wehselwirkung)

Lichtquant: E=h·ν

WECHSELWIRKUNGEN

Absorption

Transmission - Durchlässigkeit

Streuung

Reflexion

S0

S3

S2

S1

S0

S3

S2

S1

v0

v1

v2

v3

Aleksander Jabłoński (1898-1980)

S0

S3

S2

S1

S0

S3

S2

S1

S0

S3

S2

S1

v0

v1

v2

v3

S0

S3

S2

S1

v0

v1

v2

v3

• I0 : Einfallende Lichtintensität

• Ia : Absorbierte Lichtintensität

• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität (=Id)

• x: Schichtdicke

Δx

I0 (λ)

I(λ)

I0 (λ)

I1(λ)

Δx1

x

� � � ∙ ∆�

I0 (λ)

I1(λ)

Δx1

∆�~�

∆�~�

∆�~�

∆�� � −� ∙ ∆�� ∙ ��ΔI1

∆�� � �� − ��

�� � �� + ∆�� � �� − � ∙ ∆�� ∙ �� � ���1 − � ∙ ∆���

�∆� � �!"# − �����

�� � ���1 − � ∙ ∆���

Δx1 = Δx2 = Δx3 = Δx4 = Δx5

I0 I1I2

I3I4

I5

�� � ���1 − � ∙ ∆���

� � �� 1 − � ∙ ∆� � �� 1 − � ∙ ∆�� ∙ 1 − � ∙ ∆�� � �� ∙ �1 − � ∙ ∆���

�$ � � 1 − � ∙ ∆�$ = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ∙ 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��)

$

�% = �$ 1 − � ∙ ∆�% = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) $∙ 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��)

%

&' = �()� 1 − � ∙ ∆�( = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ()�

∙ 1 − � ∙ ∆�� = &* ∙ (+ − , ∙ ∆-+) '

&' � �()� 1 − � ∙ ∆�� = �� ∙ (1 − � ∙ ∆��) ()�

∙ 1 − � ∙ ∆�� = &* ∙ (+ − , ∙ ∆-+) '

∆�( = −� ∙ ∆�� ∙ �()� −� ∙ ∆�� =∆�(

�()�= −

1

.Maß der Abnahme

�( � �� ∙ 1 − � ∙ ∆�� (� �� ∙ 1 −

1

.

(

= �� ∙ 1 −1

.

/∙!∙0

= �� ∙ 1 −1

.

! 0∙/

� =�

∆��

1

∆��= . ∙ � � = � ∙ . ∙ �

wenn ∆�� → 0 denn . → ∞ 1 −1

.

!

→ 1

4≈ 0,3679

&' = & = &* ∙ ;),∙-

das Lambert-Beersche Gesetz:

&< � &* ∙ ;),∙- • I0 : Einfallende Lichtintensität

• Ia : Absorbierte Lichtintensität

• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität

• x: Schichtdicke

• µ: Schwächungskoeffizient

&< � &* ∙ =)

--+/=

x1/2: Halbwertsdicke

wenn � � ��/

�? � �� ∙ 2)� �

1

2��

4)0∙/ � 2)

//A/B

�� ∙ � � CD2)

//A/B � �

�

��/∙ ln2

, ∙ -+/= � GH=

• I0 : Einfallende Lichtintensität

• Ia : Absorbierte Lichtintensität

• It : Transmittierte (ausfallende) Lichtintensität

• x: Schichtdicke

• µ: Schwächungskoeffizient

• c: Konzentration (mol/l; mg/ml)

• ε(λ): Extinktionskoeffizient

& � &* ∙ ;),∙-

& � &* ∙ +*)I(J)∙K∙-

molarer Extinktionskoeffizient:

Massenextinktionskoeffizient:

LM$

MNC ∙ OM

MC

MP ∙ OM �

OM$

MP ∙ OM�OM

MP

& � &* ∙ +*)I(J)∙K∙-

&

&*� +*)I(J)∙K∙-

GQ&*

&� I(J) ∙ K ∙ -

Transmittanz

Absorbanz / Extinktion / optische Densität (OD)

• Additiv• Linear proportional mit Konzentration

(in dünnen Lösungen)

Absorptionsspektrum

Frauhofer-Linien der Sonne

Einstrahlphotometer

Zweistrahlphotometer

Küvette

260 280 300 320 340 360 380 4000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Absorp

tio

n

Wellenlänge (nm)

Absorptionsspektrum von Pyren-Aktin

�R� � 0,415�$%% = 0,263T R� = 0,63MC

MP ∙ OMT $%%= 0,0222

LM$

MNC ∙ OM

�R�,(UVV�W��V? = �R� − 0,127 ∙ �$%% = 0,415 − 0,127 ∙ 0,263 = 0,382

OY(?�� =�R�,(UVV

TR� ∙ �=

0,382

0,63MC

MP ∙ OM∙ 1OM

= 0,606MP

MC→ 14,13�

OZ[V�� =�$%%

T $%% ∙ �=

0,263

0,0222LM$

MNC ∙ OM∙ 1OM

= 11,85�

�V = 42.900P

MNC

�.��]4�^DP_P�.L =11,85�

14,13�∙ 100 = 83,86%

A290

A344

ZUSAMMENFASSUNG

• Strahlungen, Strahlungsintensität

• Anregungs-, Vibrations- und Rotationsniveaus von Elektronenenergie in Molekülen

• Spektroskopische Methoden passen sich auf den Energiebereich der Teilchen-Strahlung Wechselwirkung an

• Lichtabsorption in dünnen Lösungen:das Lambert-Beersche Gesetz

• Absorptionskoeffizient, Halbwertsdicke

• Absorbanz, Absorptionsspektrum

• Spektrophotometer

& = &* ∙ +*)I(J)∙K∙-

Danke für Ihre Aufmerksamkeit!