2.1.4 Spectres d’absorption des acides nucléiques

91

ADN double brin (E. coli)@ 25°C

(D’après I. Tinoco, K.Sauer & J.C. Wang, Physical Chemistry: Principles & Applications in Biological Sciences, 3è éd, 1995)

Les spectres d’absorption des acides nucléiques présentent une bande d’absorption maximale autour de 260 nm (transitions π π* dans les purines et pyrimidines) et un signal croissant à λ < 220 nm).

Tous les nucléotides ont leur λmax autour de 260 nm, valeur qui n’est pas affectée par le composant glucidique et le phosphate.

Adénosine-5'-phosphate

-O

N

NN

N

NH2

O

OHOH

CH2OP

O-

ON

NN

N

NH2

O

OHOH

CH2HO

Adénosine

N N

NNH

NH2

Adénine

λmax= 260.5 nmε=13.4 x 103 M-1cm-1 λmax= 259 nm

ε=15.4 x 103 M-1cm-1λmax= 260 nmε=14.9 x 103 M-1cm-1

92

Spectres d’absorption des nucléotides

dAMPdUMP

TMPdGMP

* Dans du 0.01 M phosphate de sodium, pH 7.0dCMP** D’après Biopolymers 1977, 16, 2243-2264

93

(D’après I. Tinoco, K.Sauer & J.C. Wang, Physical Chemistry: Principles & Applications in Biological Sciences, 3è éd, 1995) 94

95

Le tetranucléotide AAAA exhibe une plus faible absorbance par nucléotideen solution aqueuse par rapport à l’adénine, l’adénosine et l’adénosine-5’-phosphate (phénomène d’hypochromismeou d’hypochromicité): λmax= 257 nm

ε259nm=11.3 x 103 M-1cm-1

% hypochromicité

En générale, les polynucléotides et les acides nucléiques absorbent moins que leurs constituants, les nucléotides.

N

NN

N

NH2

O

OHO

HHH

CH2

H

OP

O O

OHO

HHH

CH2

H

OP

O-

O O

OH

HHH

CH2

HO

OP

O-

O O

OHOH

HHH

CH2

H

OP

O-

O

O-

O-N

NN

N

NH2

N

NN

N

NH2

N

NN

N

NH2

%271004.15

3.114.15

100)tidemononucléo(

)otidetétranucle()demonocléoti(

=∗−

=

∗−

=A

AA

(calculée avec ε)

96

L’ADN dans sa forme native (double brin) absorbe moins par nucléotide à 260 nm que la forme dénaturée (chaînes individuelles).

% hyperchromicité:(dénaturation de l’ADN)

ADN double brin @ 25°C

82°C (dénaturé)après hydrolyse enzymatique

(D’après I. Tinoco, K.Sauer & J.C. Wang, Physical Chemistry: Principles & Applications in Biological Sciences, 3è éd, 1995)

100)natif ADN(

)natif ADN()dénaturé ADN(∗

−=

AAA

(D’après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)

Td

2.1.5 Dosage des acides nucléiquesL’absorbance à 260 nm peut être mesurée pour estimer la concentration d’acide nucléique en utilisant une valeur de ε260nm≈ 1x104 M-1cm-1.

Pour des déterminations approximatives de la concentration des acides nucléiques purs, on peut assumer qu’une solution aqueuse contenant 50 µg/ml d’ADN double brin ou 40 µg/ml d’ARN donne une valeur de A260nm = 1.

Dosage très sensible; on peut descendre jusqu’à une concentration massique de 2-3 µg/mL.

Les protéines sont des interférents. Il est donc indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm.

Pour des échantillons d’ADN pur, A260nm/A280nm= 1.8. Un rapport < 1.8 indique la présence de protéines, tandis qu’un rapport > 1.8 indique la présence d’ARN.

97

Nomogramme pour l’estimation des concentrations acides nucléiques et de protéines dans des mélanges

** Selon εprotéine et εacide nucléiquedonnées par Warburg & Christian,Biochem Z 1942, 310, 384.

** b = 1 cm

Protéine (mg/mL)=1.55A280 – 0.76 A260

Acide nucléique (mg/mL)=-0.036A280 + 0.0629A260

98(D’après S.R. Mikkelsen et E. Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

2.2 Principes de la spectrofluorimétrie

La fluorescence moléculaire est un processus d’émission dans lequel des molécules (généralement des polyaromatiques ou hétérocycles) sont excités à l’état S1’ par absorption d’un rayonnement électromagnétique (hυEX). Les espèces reviennent à leur état fondamental en libérant l’excès d’énergie sous forme de photons (hυEM). La durée de vie de fluorescence est de 10-8-10-4 s.

99S1’ et S1 sont des états singulet excités So état fondamental

absorption

dissipation partielle d’énergie

fluorescence

Diagramme de Jablonskides états électroniques

pour la fluorescence

Spectres d’absorption et d’émission

Les photons émis sont de plus faible énergie que les photons d’excitation (et donc de longueur d’onde plus grande ).

La différence d’énergie ou de longueur d’onde (hυEX – hυEM) est appelée « déplacement de Stokes».

Le spectre de fluorescence (situé aux longueurs d’ondeplus élevées) est le reflet approximatif du spectre d’absorption (situé aux longueurs d’onde plus basses).

(D’après D.C. Harris, Exploring Quantitative Analysis, 2è éd., 2001)

100

Spectrofluorimètre

(D’après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)

Les méthodes fluorimétriques sont 10 à 1000 fois plus sensibles que les méthodes d’absorption.

photomultiplicateur

101

Les espèces fluorescentes

La plupart des molécules ne sont pas fluorescentes (ou des fluorophores), car leur structure est telle que la relaxation non rayonnante se produit plus rapidement que l’émission fluorescente.

Les composés qui contiennent des noyaux aromatiques produisent l’émission fluorescente moléculaire la plus intense et donc la plus utilisée. Certains composés carbonylés aliphatiques et alicycliques, ainsi que des structures à nombreux double liens conjugués sont aussi fluorescentes (mais moins nombreux).

La substitution sur un cycle aromatique ainsi qui la rigidité structurale ont un effet sur la fluorescence moléculaire.

Le rendement quantique de fluorescence moléculaire Φ est le rapport entre le nombre de molécules fluorescentes et le nombre total de molécules excitées (où le rapport entre les photons émis et les photons excités). Pour des molécules très fluorescentes, Φ ≈ 1

102

Rendement quantique et durée de vie des acides α-aminés aromatiques*

Acide aminé λex (nm) λem (nm) Φ τ (ns)

Phe 260 282 0.02 6.8

Tyr 275 304 0.14 3.6

Trp 295 353 0.13 3.1

* Solutions aqueuses, pH 7 103

104

Effet de la concentration sur l’intensité de la fluorescence

L’intensité du rayonnement fluorescent F est proportionnel à la puissance du faisceau d’excitation absorbé par le système:

F = K’ (Po - P) (1)

où Po est la puissance du faisceau incident sur la solution et P est la puissance du faisceau qui a traversé une épaisseur b de solution. La constante K’ dépend de F.

Pour relier F à la concentration c des fluorophores, on utilise la loi de Beersous sa forme:

(2)

En combinant (1) et (2), on obtient: F = K’ Po (1-10-εbc) (3)

bc

oPP ε−= 10

105

Pour A = εbc < 0.05, le développement en série de l’exponentielle de l’éqn. 3 donne approximativement

F = 2.3K’εbc Po

Pour Po constant, F = Kc(où K = 2.3K’εbPo)

Le graphique de la fluorescence d’une solution vs. la concentration du fluorophore est donc linéaire aux faibles concentrations.

Lorsque A > 0.05 (concentration de fluorophore plus élevée), la relation cesse d’être linéaire (déviation négative) due au phénomène d’auto-désactivation (des molécules absorbent la fluorescence émise par d’autres).

Courbe d’étalonnage pour ledosage spectrofluorimétrique

du tryptophane

106(D’après Skoog, West & Holler, Chimie analytique, 7è éd. De Boeck, 1997)

Méthodes fluorimétriques pour le dosage de l’ADN

107

Il existe des méthodes fluorimétriques sensibles pour le dosage de l’ADN double brin (forme native) qui sont basées sur l’interaction non-covalentede colorants dans l’ADN dans des solutions aqueuses à pH neutre. Le principe étant que le fluorophore se fixe sur l’ADN et le taux de fixation est directement lié à la quantité d’ADN (i.e. fluorophore émettra une intensité de fluorescence qui est proportionnelle à la quantité d’ADN présente).

(D’après S.R. Mikkelsen et E. Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

Lorsque ces intercalants sont libres en solution, ils exhibent une fluorescence limitée. En se liant à l’ADN, leur fluorescence augmente de beaucoup.

Le bromure d’éthidium (λex = 254 nm) se place entre les bases, se liant mieux à l’ADN qu’à l’ARN. Le DAPI et Hoescht 33258 interagissent sélectivement avec l’ADN.

Avec une concentration Hoescht 33258 de seulement 1 µg/mL, aussi peu que 10 ng d’ADN peut être détecté.

108

2.3 Spectroscopie infrarougeL’énergie du rayonnement infrarouge (λ=0.78-300 µm) est insuffisante pour exciter des transitions électroniques. Ce sont plutôt des transitions vibrationnelles qui sont induites.

Un spectre infrarouge est caractérisé par des pics d’absorption étroits, très rapprochés, qui résultent de transitions entre les différents niveaux quantiques de vibration.

Le nombre de modes de vibration d’une molécule dépend du nombre de liaisons qu’elle contient.

Les pics servent à l’identification des groupements fonctionnels

109(D’après Skoog, West & Holler, Chimie analytique, 7è éd. De Boeck, 1997)

Bandes typiques retrouvées dans les spectres IR des biomolécules

110(D’après van Holde, Johnson & Ho, Principles of Physical Biochemistry, 1998)

Spectres IR et la structure secondaire des protéines

Bande amide I (1600-1700 cm-1)

Hélice-α: 1654 cm-1

Feuillet plissé β: 1624, 1631, 1637, 1675 cm-1

Tours: 1663, 1670, 1683, 1688, 1694 cm-1

Autre structure: 1645 cm-1111

(D’après van Holde, Johnson & Ho, Principles of Physical Biochemistry, 1998)

112(D’après van Holde, Johnson & Ho, Principles of Physical Biochemistry, 1998)