STRUCTURE DES PROTEINES I -...

1

Daniel Vergé 2009-2010

STRUCTURE DES PROTEINES I

2

Acidesnucléiques

carbamyl phos-phate, ribose

Polysac-charides

pyruvate,PEP et malate

Lipides

acides graset glycérol

PrécurseursH2ON2 CO2

osesacidesaminés

Protéines

nucléotides

acideα-cétonique

acétatemalonate

Organites

Cellules

Ensembles supramoléculaires

La diversité du monde vivant repose sur un faible nombre de molécules présentant une structure chimique simple.

- protéines: vingt acides aminés- acides nucléiques: huit nucléotides.

Ces molécules de base sont elles-mêmes formées à partir de précurseurs inorganiques communs (CO2, H2O et N2) qui constituent les "briques" de construction des macromolécules.

3

O H O

Type de liaison ComposéDistance entre

atomes électronégatifs (Å)

N H NN H O

EauAlcoolsAcides carboxyliques

Amines

Urée, amides, peptides

2,82,72,6

3,1

2,9

D’après T. Creighton, Proteins (Freeman 1984) p. 137

Liaisons H: H + 2 atomes électronégatifs

Les interactions faibles intervenant dans la structure et la fonction des molécules biologiques

Interactions électrostatiques

E = q1q2/rD, DH20 = 78 (effet d’écran)

- Interaction entre 2 charges

- Interactions charge-dipôle, dipôle-dipôle

4

δ-

δ-

δ+

Le dipôle et les liaisons hydrogène de la molécule d’eau

Longueur de la liaison hydrogène : 0,177 nmLongueur de la liaison covalente O-H : 0,0965 nm Energie de la liaison hydrogène : 10 à 40 kJ.mole-1Energie de la liaison covalente O-H : 460 kJ.mole-1Temps de demi-vie de la liaison hydrogène : 10-10 à 10-9 sec

A l'état liquide, chaque molécule d'eau forme en moyenne 3,4 liaisons hydrogène avec les molécules voisines

Liaison O-H polarisée

5

L’énergie de la liaison hydrogène est maximale si les 3 atomes (2O et H) sont colinéaires

Structure spatiale de la glace

6

Interactions hydrophobes

Eau

Molécule d’hexane occupant une cavité

Deux molécules d’hexane occupant une seule cavité

L’équilibre est déplacé à droite (ΔS > 0→ ΔG < 0)

7

Interaction lipide-eauAcide gras

Tête hydrophile

Queue hydrophobe

Eau ‘ordonnée’‘Lehninger, Principles of Biochemistry

8

ΔS > 0, ΔG < 0

Lehninger, Principles of Biochemistry

9

Composés amphiphiles

Ex: acide gras

micelle

Bicouche lipidique → membranes biologiques

10

Forces de van der WaalsProfil d’énergie de l’interaction de van der Waals en fonction de la distance r entre les centres des deux atomes. L’énergie est calculée en utilisant l’équation : E = B/r12 - A/r6

(potentiel de Lennard-Jones 6,12). A = 2,75 106 Å12 kcal/mol, B = 1425 Å6 kcal/mol pour l’interaction entre 2 carbones (M. Levitt, J. Mol. Biol.(1974) 82: 393-420).

Rayon de van der Waals

(Å)

C 1,7 0,77H 1,1 0,30 1,5 0,66N 1,5 0,7S 1,8 1,04P 1,9 1,1

½ liaison covalente

(Å)

11

Acides Aminés

Classification:

- Hydrophobes- aliphatiques- aromatiques

- Hydrophiles- non chargés- chargés

- négativement- positivement

20 acides aminés constitutifs des protéines

Nomenclatures:

H2N CH C

C

OH

O

C

C

1

4

3

2

5

H2N CH C

C

OH

O

C

C

γ

β

α

δ

12

Acides aminés non polaires aliphatiques

Thio-éther

13

e

Acides aminés aromatiques

noyau indolephénol

14

Acides aminés polaires non chargés

Alcool primaire Alcool secondaire Thiol

Amide

15

Acides aminés chargésnégativement

Acides aminés chargéspositivement

guanidyle imidazole

16

Acide aminéAb/symbole

pKs

Index d’hydropathie Fréquence

Principales caractéristiques des acides aminés (1)


17

Acide aminéAb/symbole

pKs

Index d’hydropathie Fréquence

Principales caractéristiques des acides aminés (2)


18

Acides aminés modifiés

(élastine)

(reductases)

19

Acides aminés du métabolisme intermédiaire

20

Stéréochimie

21

Relation entre les stéréoisomères de l’alanine et la configuration absolue du L- et D-glycéraldéhyde

22

23

C

COO

H

C

CH3

OHH

NH3+

-

C

COO

H

C

CH3

HHO

NH3

-

+ C

COO

C

CH3

HHO

H

-

NH3+

C

COO

C

CH3

OHH

H

-

NH3+

Cas des acides aminés possédant 2 carbones asymétriques

L-thréonine L-allo-thréonine D-thréonine D -allo-thréonine

Racémisation

H2N C C

R

O-

OH

OH-

H2N C

R

O-C

O-

24

Propriétés ioniques

Forme non chargée zwitterion

charge +1 0 -1

25

K1 = [H+] [AH+-]

[AH2+]

AH2+ AH+- A-

K1 K2

pH = pK1 + log [AH+-]

[AH2+]

K2 = [H+] [A-]

[AH+-]pH = pK2 + log

[A-]

[AH+-]

Point isoélectrique: pH pour lequel la charge globale est nulle:

[AH2+] = [A-] K1K2 =

[H+]2 [A-]

[AH2+]

pHi =(pK1 + pK2)

2[H+]2 = K1K2

26

Titrage: exemple de la Glycine

Point isoélectrique: pHi = (pK1 + pK2)/2

27Point isoélectrique: pHi = (pK1 + pKR)/2

28Point isoélectrique: pHi = (pK2 + pKR)/2

29

Propriétés chimiques

a. Groupements amines :

groupement α-amino-terminal et chaîne latérale de la lysine (ε-NH2)

R-NH2 + HX R-NH-R’ + R’X alkylation, acylation, arylation

R-NH2 + H+ R-NH3+ protonation

- Arylation: FDNB (Fluoro-DiNitroBenzène, réactif de Sanger)

Exemples:

R- NH2 + F

O2N

N O2

C très électrophile

O2N

N O2R- N H

HF

30

Chaînes latérales:

- Asn : glycosylation

- Ser, Thr, Tyr: phosphorylation

- Tyr: iodation

OH + ATP PO

O

O-

O-

+ ADP

OH + ICl OH

I

+ HCl

31

Pont disulfure

Oxydation par l’acide

performique Réduction (DTT)

Alkylation (iodoacétate)

Carboxyméthyl-cystéine

Acide cystéique

Cystéines

32

Propriétés spectroscopiques des acides aminés

Spectre d’absorption ultra-violet des acides aminés aromatiques à pH 6

- Absorption visible-proche UV

- Activité optique : α (pouvoir rotatoire) → spectres de dispersion optique rotatoire (ORD) et dichroïsme circulaire (CD)

33

Propriétés spectroscopiques des acides aminés aromatiques à pH neutres

OH O

H+

Application : titrage des tyrosines

λmax = 275 nm λmax = 294nm

- Fluorescence λém > λex

34

Séparation des acides aminés

Electrophorèse

Chromatographie en couche mince

papier

mélange

Flux du solvant

Composants séparés

Dépôt

Lysine

+ -

Aspartate

(migration àpH neutre)

35

‘Finger-print’ d’un mélange de 9 acides aminés:Le mélange a été soumis à une électrophorèse à pH 6,5 dans la première dimension et à une chromatographie en couche mince (butanol-acide acétique-pyridine-eau) dans la deuxième dimension. Les taches correspondent aux acides aminés: 1, Arg; 2, Lys; 3, His; 4, Cys: 5, Glu; 6, Asp; 7, Pro; 8, Ile.

Séparation bi-dimensionnelle (finger-print)

36

Les molécules chargées positivement se lient aux billes chargées négativement

Exemple: résine échangeuse de cations

Les molécules chargées négativement ne sont pas retenues

Chromatographie d’échange d’ions

37

Chromatographie d’échange d’ions (-SO3-)

38

High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

Chromatographie de partage

Colonnes en acier

Billes de silice + chaînes hydrocarbonées

Haute pression

Phase réverseTampon d’élution de plus en plus hydrophobe

39

PROTEINES

40

Introduction

Définition: polymère linéaire d’acides aminés

- 20 acides aminés- non ramifié- monodispersé- ordre des acides aminés imposé (séquence)

Diversité

- fibreuses- globulaires- membranaires- monomériques/oligomériques

collagène

41

hémoglobineBPTI

nAChRPDH

Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor

Pyruvate déshydrogénase

Récepteur nicotinique de l’Acétylcholine

42

Données sur quelques protéines

MMNombre

de résidusNombre de

chaînes


43

Protéines conjuguées

classe Groupe prosthétique Exemple


44

Rôles

- enzymes

- hormones

- anticorps

- transporteurs

- canaux

- protéines structurales: kératine, fibroïne, cytosquelette...

-....

45

Peptides et protéines

Formation de la liaison peptidique

46

Structure d’un pentapeptide

Ser-Gly-Tyr-Ala-LeuSGYAL

Extrêmité N-terminale Extrêmité C-terminale

47

Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2

Peptides contenant un acide aminé D

dermorphine

peptidoglycane

Modification post-traductionnelle par une racémase

48

Exemple d’un antibiotique peptidique cyclique

Gramicidine S

49

Propriétés ioniques

Définitions:

- peptide- polypeptide- chaîne polypeptidique- protéine

50

Peptides à activité biologique:

- Hormones:

ocytocine vasopressine

Ex 2: thyrotropin releasing hormone (TRH)

Ex 1: post-hypophyse

51

- Peptide de synthèse

- Hormone polypeptidique

Ex: insuline

52

Purification des protéines

Avancement de la purification

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)

Stryer

53

Electrophorèse bidimensionnelle

Séparation des protéines de E. coli:1. Isofocalisation (horizontale)2. SDS-PAGE (verticale)

-

+

pHidécroissant

SDS-PAGE

Isofocalisation

MM

54

MMkDa

100

15

40

La même quantité totale de protéines (10 μg) est déposée dans chaque puits après chaque étape de purification

Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE)

55

A chaque étape:

- Test d’activité (A mesurée en U/mL)

- Dosage de protéines ([P] mesurée en mg/mL)- Mesure du volume total V (en mL) - l’activité totale: AT = A x V- Calcul de la quantité totale de protéines P = [P] x V- L’activité spécifique est alors définie par : AS = AT/P = A/[P]

Paramètres de l’étape de purification:

- rendement de l’étape: rapport des activités totales R = ATf /ATi

- facteur de purification: rapport des activités spécifiques F = ASf /ASi

56

Tableau de purification

Etape PT (mg) AT (u) AS (u/mg)Volume (mL)

Extrait brutPrécipitation fractionnéeChromatographie d’échange d’ionsChromatographie d’exclusion moléculaireChromatographie d’affinité

Ensemble de la purification:

- rendement global: Rg = Π (Ri) = ATn /ATo

- facteur de purification global: Fg = Π (Fi) = ASn /ASo

57

Précipitation Sel (sulfate d’ammonium)

pHi

pH

[sel]

pH

s sSolubilité

Dialyse

Sac de dialyse

Solution concentrée

tampon

avant après

Méthodes de fractionnement

58

Grosses molécules

Petites moléculesBille de polymère

Bille excluant les grosses molécules

Sens du flux

Chromatographie d’exclusion

59

Chromatographie d’échange d’ions

Les molécules chargées positivement se lient aux billes chargées négativement

Exemple: résine échangeuse de cations

Les molécules chargées négativement ne sont pas retenues

CM -CH2-COO-

DEAE -CH2-CH2-NH+-(C2H5)2

60

HPLC

(1) thyroglobulin (669 kd)(2) catalase (232 kd)(3) bovine serum albumin (67 kd)(4) ovalbumin (43 kd)(5) ribonuclease (13.4 kd)

61

Chromatographie d’affinité

62

Caractérisation de la protéine purifiée

Contenu en chaînes polypeptidiques:

- électrophorèse SDS-PAGE- analyse des N-ter

RNA pol

- nombre de chaînes

- masses moléculaires

- stoechiométrie

E. Coli167161

37

70

ββ’

σ

α

α2ββ’σω

63

Détermination de la masse moléculaire

64

65

Détermination de la masse moléculaire par spectrométrie de masse

Spectromètre

MALDI-TOF

Electrosprayionization(ESI)

capillaire échantillon

haute tension

vide

spectromètre

Matrix assisted laser desorption ionizationTime of flight

66

Anhydrase carbonique: ionisation par electrospray:A: Spectre de la protéine; les pics correspondent à des valeurs différentes de la charge z. B: Spectre de déconvolution donnant la masse de la protéine.

Spectre d’une protéine

67

MALDI-TOF Mass Spectrum of Insulin and β -lactoglobulin. A mixture of 5 pmol each of insulin (I) and β-lactoglobulin (L) was ionized by MALDI, which produces predominately singly charged molecular ions from peptides and proteins (I + H+ for insulin and L + H+ for lactoglobulin). However, molecules withmultiple charges as well as small quantities of a singly charged dimer of insulin, (2 I + H)+, also are produced. [After J. T. Watson, Introduction to Mass Spectrometry, 3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p. 282.]

Détermination de la masse moléculaire par spectrométrie de masse

68

Détermination du point isoélectrique

Mélange d’ampholytes

Etablissement d’un gradient de pH

Migration jusqu’au point isoélectrique

69

Point isoélectrique de quelques protéines

Protéine pHi

70

Détermination de la structure primaire

Chaîne polypeptidique isolée

1. Composition en acides aminés

Hydrolyse acide totaleHCl 6N, 110°C, atmosphère inerte

Acides aminés posant problème:Trp, Cys, Asn, Gln

Séparation avant ou après dérivation- chromatographie d’échange d’ions- HPLC

Analyse

Formule brute

71

Composition en acide aminés de 2 protéines

Nombre de résidus par molécule de protéine

aa Cytochrome c Chymoptrypsinogène

72

Séquençage

N-terminal:

- Détermination du résidu N-terminal: FDNB, Chlorure de Dansyl- Séquençage récurrent: méthode d’Edman

SéparationIdentification du PTH-aaRecyclage du peptide

Peptide raccourciPhénylthiocarbamyl

(PTC)-peptide

Anilinothiazolinone Phénylthiohydantoïne(PTH)-aa

peptideTMA


73

74

C-terminal:

- Détermination du résidu C-terminal: Hydrazinolyse NH2-NH2- Séquençage récurrent: Carboxypeptidases

Non spécifique LevureCarboxypeptidase Y

Non spécifique Feuilles de citronnier Carboxypeptidase C

R, K (sauf P en n-1)Pancréas de porc Carboxypeptidase B

Non spécifique (sauf R,K, et P en position n ou n-1)

Pancréas de bœufCarboxypeptidase A

SpécificitéSourceNom

Ex: aldolase, carboxypeptidase A: -Phe-Ile-Leu-Ser-His-Ala-Tyr-COOH

75

Coupure des chaînes polypeptidiques:

C-terminal de E, DStaphylococcus

aureusEndopeptidase

V8

Entre 2 résidus hydrophobesMuqueuse

gastrique bovinePepsine

N-terminal de I, M, F, W, Y, V, sauf si P précède

Bacillusthermoproteolyticus

Thermolysine

C-terminal de A, G, S, V, sauf si P suitPancréas de boeufElastase

C-terminal de F, Y, W, sauf si P suitPancréas de boeufChymotrypsine

C-terminal de R, K, sauf si P suitPancréas de boeufTrypsine

SpécificitéSourceEnzyme

-chimique:

Bromure de cyanogène BrCN

-enzymatiques:

Endoprotéases

-CO-NH-CH-COOH

CH2-CH2-OH

homosérine

H2O

76

Séparation des peptides

77

Caractérisation des ponts disulfure

- Dosage des thiols libres:DTNB, NEM

N-éthylmaléimide (NEM)340 nm

Acide dithionitrobenzoïque (DTNB)412 nm

- Position des thiols libres:Marquage 14C-iodoacétate radioactifHydrolyse ménagée (endopeptidase)Séparation des peptides (HPLC ou cartepeptidique)Repérage des pics ou taches radioactives Analyse

autoradiographie

78

- Méthode générale: Comparaison des ‘finger prints’ des protéines native et réduite(carte peptidique ou HPLC)

- Position des ponts disulfure:

- Exemple de la méthode de la ‘Double diagonale’

Blocage des thiols libres (iodoacétate)Hydrolyse ménagée (endopeptidase)Séparation des peptides (électrophorèse 1ère dimension)Rupture des ponts (acide periodique):R-S-S-R’ R-SO3

- + R’-SO3-

R-S-CH2-COOH R-SO2-CH2-COOHSéparation des peptides (électrophorèse 2ème dimension)Identification des Cys impliquées

79

Résultat

38 acides aminés2R, 1K: 4 peptides après trypsine2M: 3 peptides après BrCN

N-ter: E

N-ter (commence par E)

C-ter (ne finit ni par K ni par R)

se superpose à

permettant de les orienteret

N C

séquence

FDNB, hydrolyse,séparation

Réduction des ponts au besoin

Trypsine

BrCN

80

Autres méthodes de séquençage

Spectrométrie de masse

SM1 SM2 DétecteurCollision

Electrosprayionization

Séparation Clivage

81

Séquençage d’un peptide doublement chargé (m/z = 676,42 Da) par spectrométrie de masse (ESI MS/MS). Les différences de masse entre les ions des séries y et b permettent d’identifier les acides aminés

82

protéine

ADN (gène)D’après la séquence du gène

Applications:- recherche de séquences homologues

Protéines EF-Tu

83Famille des protéines GroEL

- Evolution

84

Synthèse peptidique en phase solide

Principe

bloqué activé bloqué

HN CH C

R1

O

X + H2N CH C

R2

Z

O

Y

HN CH C

R1

O

X HN CH C

R2

Z

O

+ protection des groupements réactifs des chaînes latérales

85

Blocage de la fonction amine

(fluoromethoxy carbonyl)

Ou tBoc : ter-butyloxycarbonyl , (CH3)3C-O-CO-


86

Etape 1:Attachement du résidu C-terminal à un groupe réactif de la résine

Acide aminé protégé

Résine de polystyrène insoluble


87

Etapes 2-4: Addition d’un résidu d’acide aminé

Activation par le DCC de l’acide aminé 2 protégé

Déprotection de la fonction amine par une base organique faible

Formation de la liaison peptidique

Répétition du cycle si nécessaire

Dicyclohexyl-urée


88

Etape 5: Libération du peptide final

Déprotection de la fonction amine (voir réaction 2) et clivage par HF de la liaison à la résine


89

Effet du rendement unitaire sur le rendement global

Nombre de résidus dans le peptide

Rendement global (%) suivant le rendement unitaire:

90

Niveaux d’organisation des protéines


primaire secondaire tertiaire quaternaire

Résidusd’acides aminés

Hélice α Chaîne polypeptidique Assemblage de sous-unités

(ex de l’hémoglobine)

91

Structure Secondaire

L’unité peptidique

Dimensions de la liaison peptidique (en Å)

92

Liaison peptidique

résidu

Plans peptidiques et angles de rotation φ (N-Cα) et ψ (Cα-C) autour du carbone α d’un résidu d’acide aminé

Résonance électronique de la liaison peptidique

93

Position de référence φ = 0, ψ = 0:

Les deux plans peptidiques adjacents sont coplanaires. Cette structure n’est pas permise à cause de la gêne stérique entre l’oxygène de l’α-carbonyle (résidu i) et l’hydrogène de l’α-amine (résidu i+1).

Lehninger, Biochemistry

94

Diagramme de Ramachandran pour l’alanine:

Les régions permises sont hachurées, celles qui ne le sont que partiellement sont claires. Les tirets indiquent une zone permise au prix d’une légère torsion des angles de liaison.

Creighton, Proteins

95

(deg

rés)

(degrés)Lehninger, Biochemistry

Diagramme de Ramachandran de la pyruvate kinase:

Les valeurs de φ et ψ pour tous les acides aminés de l’enzyme, à l’exception de la glycine, ont été reportés sur le diagramme

96

Définition:structure localestructure périodique

Structure secondaire:

Structure secondaire Angle de liaison (degrés) Résidus par tour

Distance entre résidus (en

projection, nm) φ ψ ω

Hélice α droite -57 -47 180 3,6 0,15 Hélice 310 -49 -26 180 3,0 0,20 Feuillet β antiparallèle -139 +135 -178 2,0 0,34 Feuillet β parallèle -119 +113 180 2,0 0,32 Polyproline I -83 +158 0 3,33 0,19 Polyproline II -78 +149 180 3,0 0,31 Polyglycine II -80 +150 180 3,0 0,31

Paramètres des principales structures secondaires

97

Diagramme de Ramachandran de diverses structures secondaires


Hélice αdroite

(degrés)

(deg

rés)

Hélice αgauche

Feuillet βcourbé

Triple hélicede collagène

Feuillet βparallèle

Feuillet βantiparallèle

Hélice αdroite

98

L’hélice α

L’hélice α droite: les plans peptidiques sont parallèles à l’axe de l’hélice, l’angle dièdre entre 2 plans successifs est de 100°.

Les liaisons hydrogène sont parallèles à l’axe de l’hélice

N-ter

C-ter

Lehninger, Biochemistry (2e édition)

99

Représentation en roue(vue de dessus)

Durliat, Biochimie structurale

dipôle


100

Les feuillets β

Etablissement des liaisons H entre brins dans les feuillets βparallèles et antiparallèles.

Représentation du feuillet plissé.

Durliat, Biochimie structurale

101

Représentation schématique de trois chaînes (brins) formant un feuillet β. Les chaînes latérales sont situées alternativement au-dessus et au-dessous du plan du feuillet.

102

Tournant β

Isomères de Proline


103

Probabilités relatives qu’un résidu se trouve dans un type de structure secondaire

Prédiction de structures secondaires

104

Méthodes d’étude des structures secondaires

Dispersion optique rotatoire et dichroïsme circulaire

Spectres de dispersion optique rotatoire (à gauche) et de dichroïsme circulaire (àdroite) d’une chaîne de poly-lysine dans les conformations en héliceα (α) en feuillet β (β) et en ‘pelote statistique’ (désordonnée) (r).

105

Méthodes d’étude des structures tridimensionnelles

Détermination de la structure de la myoglobinea: le diagramme de diffraction est obtenu à partir d’un cristal de la protéineb: calcul de la carte de densité électronique (ici l’hème)c: localisation des atomesd: structure tridimensionnelle Lehninger, Biochemistry

Diffraction des rayons X par les cristaux

106

Résonance Magnétique Nucléaire

Spectre unidimensionnel d’une globine

Déplacement chimique

Spectre bidimensionnel NOE de la globine

Les pics en dehors de la diagonale indiquent des 1H en interaction. Les 2 exemples en A correspondent aux interactions représentées en B.

BA

107

Structure de la chaîne polypeptidique de la globineétablie par RMN


108

Protéines fibreuses

Surenroulement d’hélices

Formation d’une structure ‘coiled-coil’:A: hélice α droiteB: torsion de l’hélice α droiteC: surenroulement de 2 hélices α

Vue axiale montrant la position des chaînes latérales dans les deux hélices: les résidus a et d en interaction sont hydrophobes, les résidus en périphérie peuvent être chargés ou polaires

Périodicité 7 résidus

109

cellules

filament intermédiaire

protofibrille

protofilament

coiled-coil

hélice α

hélice α

coiled-coil

protofilament

protofibrille

Structure d’un cheveu

(kératine)

110

Collagène

Modèles d’une chaîne isolée de la triple hélice de collagène

(séquence Gly-Pro-Hyp)

Triple hélice de collagène(hélice droite)

111

Section transversale: les carbones α des résidus Gly sont situés à l’intérieur de la triple hélice, les noyaux pyrrolidones vers l’extérieur. Les liaisons H entre les hélices sont indiquées en pointillé.

Triple hélice de collagène

112

Localisation des ponts entre les molécules de tropocollagène adjacentes dans la fibre de collagène. La région N-terminales d’une molécule est reliée à la partie C-terminale d’une autre molécule de la rangée voisine

Stries espacées de 64 nm

Structure des fibrilles de collagène

113

Fibroïne de la soie

Chaîne latérale d’Ala Chaîne latérale de Gly

114

Différents modes de représentation des protéines: myoglobine

Protéines globulaires

115

A: Unité βαβ: l’hélice est presque toujours au-dessus du plan du feuillet formé par les deux brins parallèles

B: Feuillet β formant un motif en clégrecque

C: Feuillet β antiparallèle en méandre

D: Faisceau d’hélices antiparallèles

Creighton, Proteins

A

B

C

très rare

jamais observé

D

Structures supersecondaires

116

Ex: Motif de liaison du calcium

Motifs

117

Motifs de liaison à l’ADN

Motif hélice-tournant-héliceL’hélice C-terminale s’insère dans le grand sillon de l’ADN (B)

Leucine-zipper:Deux hélices dimérisent via leur région ‘Leucine-zipper’. Les hélices se fixent symmétriquement dans le grand sillon de l’ADN.

118

Faisceau (botte) tétrahélicoïdal

Exemple de l’hémérythrine. La protéine possède deux atomes de fer.

DomainesMotifs de repliement (plis tertiaires, domaines)

Faisceau d’hélices antiparallèles; Les résidus en interaction sont hydrophobes, les résidus à l’extérieur hydrophiles

Tout α

119

Sandwich β:

Immunoglobuline, domaine VL

Tout β

120

Tonneau β alterné

Retinol binding protein (RBP)

Feuillets β antiparallèles

121

Retinol binding protein (RBP)

122

Tonneau β en clé grecque

Chymoptrypsine

2 domaines β antiparallèles

123

Motif ‘jelly-roll’

124

Turbine β

Feuillet β antiparallèle

Galactose oxydase

Turbine à 7 pales

125

Hélice β à trois feuillets‘single –stranded right-handed β helix’

Pectate lyase de Erwinia chrysanthemi

126

Domaine de liaison des dinucléotides dans les déshydrogénases, composé de deux unités de liaison de nucléotide β-α-β-α-β. Les nucléotides se lient du côté des extrémités C-terminales des brins β.

Module Rossmann

adénine

nicotinamide

Domaines α/β

127

α/β Feuillet parallèle

Domaine 1 de la lactate déshydrogénase

‘3 couches’

128

α/β Feuillet parallèle

Triose phosphate isomérase

‘4 couches’

129

Topologie des connections β:

Diagramme topologique des feuillets β: a) 4 brins: feuillet βantiparallèle (fait partie d’un domaine de l’aspartate transcarbamylase); b) 5 brins: feuillet β parallèle (flavodoxine); c) 8 brins: tonneau antiparallèle (plastocyanine).

130

Domaines α + β

Inhibiteur pancréatique de la trypsine

131

Exemple d’une protéine multi-domaines: la pyruvate kinase

132

Classification

SCOP(Structural Classification Of Proteins)http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop

Tout α α/β

- PDB

- Motif

- Superfamille

- Famille

- Protéine

- Espèce


133

Tout β


134

α + β


135

Classification CATH

Orengo, C.A. et Thornton, J.M. Ann. Rev. Biochem. 74 (2005) 867-900

http://www.cathdb.info/latest/index.html

136

Protéines modulaires

137

Quelques exemples de protéines modulaires

138

Cbl, ubiquitine ligase et protéine multi-adaptatrice (RTK)

Dikic & Giordano Curr. Opin. Cell Biol. (2003) 15:128-135

Exemple de protéine modulaire: Cbl

139

Symétrie cyclique

Ordre 2 Ordre 3

Structure quaternaire: différents types de symétrie


140

Symétrie dihédrale


141

Différents types d’interactions

142

L’hémoglobine

Transition R-T

143

Arrangement des quatre sous-unités α2β2 dans l’hémoglobine

α1

β2β1

α2

144

0000

5100

1108000

α1β1 (α2β2)α1β2 (α2β1)α1α2 β1β2

Oxy-Hb

0121

4400

986900

α1β1 (α2β2)α1β2 (α2β1)α1α2 β1β2

Désoxy-Hb

Ponts salins

Liaisons HContacts de Van der Waals

NbreSous-unités

145

Glutamine synthetase

D6 (2 hexamères C6)

ADP

146

C6R6

Aspartate transcarbamylase

147

Assemblage d’un filament d’actine

Symétrie hélicoïdale

148

Interfaces entre sous-unités dans le filament d’actine

149

Symétrie icosaèdrique

Ordre 5

Ordre 3

Ordre 2

150

Capsides virales

Poliovirus

151

RNA

Protéine

Virus de la mosaïque du tabac

152

Méthodes d’étude de la structure quaternaire

- Electrophorèse en conditions non-dénaturantes/dénaturantes (+/- réducteur)

- Méthodes hydrodynamiques: chromatographie d’exclusion, sédimentation: détermination de la masse moléculaire)

- Pontages avec réactifs bi-fonctionnels + SDS-PAGE

- Microscopie électronique

- Cristallographie

153

Principes de structuration des protéines globulaires:

- Les résidus hydrophobes ont tendance à être enfouis à l’intérieur de la structure. S’ils sont exposés au milieu extérieur, ils interagissent entre eux le plus possible et la région hydrophobe exposée est entourée d’une couche de molécule d’eau ‘ordonnée’ (couche de solvatation).

- Les résidus hydrophiles interagissent facilement avec l’eau à la surface de la protéine. S’ils sont enfouis, ils établissent entre eux des liaisons H.

- Dans la structure, les atomes sont en contact de van der Waals.

154

Dénaturation

% d

énat

uré

155

Dénaturation-renaturation

Expérience d’Anfinsen (ribonucléase)

Etat natifcatalytiquement actif

Etat natif, ponts correctement reformés, actif

Etat dénaturé, ponts S-S réduits, inactif

+ urée et mercaptoéthanol dialyse

156

Chemins du repliement

157

entropie

En

erg

ie

Structure native

Structure dépliée

Po

urc

enta

ge

de

rési

du

s d

ans

la

con

form

atio

n n

ativ

e

158

Structure d’un ‘molten globule’ (A) et d’une structure native (B)(Cytochrome b562)

159

Protéine prion

PrPC PrPSc

160

Protéines membranaires


161

Protéine périphérique

Changement de pH, de force ionique, agent chélatant, ...

DétergentPhospholipase C

Protéine intégrale

GPI-linkedprotein

Protéine-glycane


Caractérisation du type de protéine membranaire

162

Différents types de protéines transmembranaires


163

Diagrammes d’hydropathie:

164

Glycophorine

Modèles d’insertion des protéines dans la membrane

165

bactériorhodopsine

166

Structure de la rhodopsine

167

Structure de la Rhodopsine:

Détails

Palczewski et al. Science (2000) 289 :739-745

168

Structure schématique de la rhodopsine

169

Structures comparées de récepteurs couplés aux Protéines G

Hanson M.A., Stevens R.C. (2009) Structure 17:8-14

170

Répartition des résidus chargés (bleu), Tyr (orange) et Trp(rouge) par rapport à la bicouche lipidique


171

FepA: 22 brins transmembranaires (capture de fer)OmpLA: dimère, 12 brins (phospholipase)Maltoporine: trimère, 16 brins (transporteur de maltose)TolC: trimère, tonneau à 12 brins, 4 de chaque sous-unité (transporteur)α-Hémolysine: tonneau à 14 brins, 2 brins en épingle à cheveu par sous-unité (toxine)

Protéines membranaires en tonneau β


172

Structure proposée pour le transporteur de glucose GLUT1.

(a) Les hélices transmembranaires sont représentées par des séries de lignes obliques de 3 ou 4 résidus, chaque ligne correspondant à un tour d’hélice. 9 des 12 hélices contiennent au moins 3 résidus polaires ou chargés.(b) Représentation en roue d’une hélice montrant la répartition des résidus et la structure amphipatique. (c) Association de plusieurs hélices (ici 4) avec les faces polaires orientées vers l’intérieur, formant un canal bordé par des résidus chargés ou polaires. Lehninger, Principles of Biochemistry

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