TEMA 3

MICROSCOPIO PTICO

COMPUESTO (campo claro)

INSTRUMENTOS BSICOS EN

UN LABORATORIO

MO

LUPA

CONCEPTOS ASOCIADOS AL MO

AN = n x sen

Apertura numrica (AN):

Expresa el dimetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo.

n = ndice de refraccin del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo

(aire n aprox = 1; vidrio o aceite n = 1.51

sen = semi ngulo del cono de luz que entra al objetivo

Rayo de luz

Cono luminoso frente

al objetivo sen

muestra

AN

APERTURA NUMRICA

APERTURA NUMRICA

Resolucin ( R): es la capacidad de un sistema ptico discriminar como entidades distintas dos puntos muy prximos entre si.

R = / 2 AN

R (resolucin, m)

(longitud de onda de la luz empleada) 2 AN (aperturas numricas del objetivo y del condensador

(a) (b)

Comparacin entre la informacin obtenida en las imgenes tomadas con

un microscopio ptico y uno electrnico con una magnificacin

comparable

(a) Fotografa del tejido muscular esqueltico que se impregno en plstico, se corto a 1 m y se fotografi con un microscopio ptico con una lente de

objetivo para aceite de inmersin. (b) Corte adyacente al empleado para la parte a que se corto a 0.025 m y se examino al microscopio electrnico con una magnificacin comparable a la imagen en a. (CORTESA DE DOUGLAS E. KELLY Y M.

A. CAHILL.)

Lmite de resolucin (LR): Menor distancia a la

cul dos puntos A y B pueden ser observados de

manera independiente (separados).

A+B

A B

B A

A+B

LR

LR

Lmite de Resolucin= 0.61 / n x sen

AN

LR= 0.61 / n x sen

Factores que afectan el LR

LR= 0.61 / n x sen

Aumento

Longitud de onda

ndice de refraccin del medio

Apertura numrica

AN

LR depende de:

Concepto inverso al poder de resolucin = un instrumento con gran poder de resolucin

tiene un valor numrico de LR muy pequeo.

- Longitud de onda

- Apertura numrica

(objetivo-aumento)

PODER DE RESOLUCIN (PR)

Se define como el inverso de la mnima distancia

que tiene que haber entre dos puntos A y B, para que

ambos se observen como unidades independientes.

PR = 1/LR

LR, PR, R son conceptos relacionados

LR aprox. 0,1 mm

LR= 0,1- 0,2 m

Conceptos bsicos

x10

MAGNIFICACIN VS RESOLUCIN

a b

c

Magnificacin

vaca

PROFUNDIDAD DE CAMPO (PC)

Profundidad de campo: capacidad de ver enfocados

simultneamente distintos planos de la preparacin

o muestra.

PUNTO FOCAL Y DISTANCIA FOCAL

Punto focal

Distancia focal

Distancia que separa el punto focal del centro ptico de la lente.

Distancia desde la lente frontal del objetivo a la preparacin

enfocada.

Punto donde

confluyen los

rayos luminosos

refractados

despus de

atravesar la lente

Microscopio ptico compuesto

Microscopio ptico compuesto-Tipos

MO binocular de visin mltiple

Partes del Microscopio ptico compuesto

Sistema ptico: Constituido por dos

juegos de lentes

Lentes Objetivas

(primer aumento)

Lentes Oculares

(segundo aumento )

Lente objetiva

Cdigo de color en los objetivos del MO

ESTRUCTURA DE LOS

OBJETIVOS

OBJETIVOS SECOS/OBJETIVOS DE

INMERSIN

Difieren por la naturaleza del medio impuesto entre el cubre objeto de la

muestra y la lente frontal del objetivo.

OBJETIVO SECO: medio (aire, n= 1)

OBJETIVO DE INMERSIN: medio (aceite, n= 1,515, semejante al n del vidrio

del porta y cubre objeto)

Objetivo seco

Objetivo

de

inmersin

Objetivo seco

Objetivo

de

inmersin

El ndice de refraccin de un medio (n), es una medida

para saber cunto se reduce la velocidad de la luz, dentro

del medio transparente en estudio.

n= c/v n= ndice de refraccin

c= velocidad de la luz en el vaci

v= velocidad de la luz en el medio

material transparente

Aceite de cedro 1,515

Lente ocular

Aumento adicional de la imagen proporcionada por la lente objetiva.

Valores inscritos (10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x).

Ocular Periplan. Diseo avanzado

Otras anotaciones:

UW: Ultra wide, oculares con campo de visin

amplio.

H: alto punto focal (observado con lentes)

Plan-comp: oculares que corrigen curvatura de

campo y dan campos planos

Lente ocular

CAMPO DEL MICROSCOPIO: crculo visible que se observa

a travs del ocular (general). Rectangular (hematologa y coprologa)

Sistema de iluminacin

Luz natural

Bombillas de tungsteno y halgenas

Luz artificial

Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz)

Sistema de iluminacin

http://ofershop.com/microscopios/index.htm

Diafragma o Iris con mecanismo para variar la apertura.

Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (70).

CARACTERSTICAS DE LA

IMAGEN-MO CAMPO CLARO

Imagen plana (eje x,y)

Imagen aumentada (hasta 1000 x (2000x)

Imagen invertida

Imagen virtual

http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/

40x

Corte transversal msculo esqueltico

Imagen plana (eje X,Y)

4 5

Y

X

Imagen aumentada

Primer aumento

(Objetivos) Segundo aumento

(Oculares)

AUMENTO TOTAL = Aumento del objetivo x Aumento del ocular x cte (1)

Imagen invertida

Que ocurre en los objetivos del microscopio ?????

El objeto (muestra) est colocado un poco ms all del foco.

La imagen ser real e invertida y cada vez ms grande

cuanto ms cerca este el objeto del foco

http://ofershop.com/microscopios/index.htm

Imagen invertida

Que ocurre en los oculares del microscopio ?????

Lente ocular: Emplea la imagen formada

por el objetivo (imagen intermedia) para

formar una imagen virtual y aumentada

del objeto (muestra).

Imagen invertida

Que ocurre en los oculares del microscopio ?????

Formacin de la imagen virtual

Son imgenes subjetivas que no podrn ser recogidas o proyectadas sobre una

pantalla o pelcula fotogrfica.

Son percibidas gracias a la posibilidad que tiene el globo ocular de seguir por detrs del objeto observado, la proyeccin de rayos divergentes y los hace

confluir en la retina para constituir la imagen virtual.

TERCER SISTEMA DE LENTES

La crnea se comporta como una lente tipo menisco y el cristalino como

una lente biconvexa.

CALIBRACIN DEL MICROSCOPIO

SE REQUIERE

Micrmetro o

retculo ocular

Micrmetro objetivo

Micrmetro ocular

Placa de vidrio

Escala de referencia

Micrmetro objetivo

Portaobjeto

5 10

10 div. pequeas

CALIBRACIN DEL MO http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo2.pdf

Obj. 4x = X m

Obj. 10x = X m

Obj. 40 x = X m

Obj. 100 x = X m

Clculo de aumentos (MO y fotografa)

ESCALA

Clculo de aumentos

3 m

Microscopi invertit

MICROSCOPIO INVERTIDO

Estructura invertida en comparacin con el MO convencional.

Fuente de luz ubicada por encima de la platina.

Principio de funcionamiento y formacin de la imagen, igual que el MO convencional.

Usado en la observacin de

cultivos celulares

(clulas vivas) sin

preparacin previa.

APLICACIONES- microscopio ptico invertido

Alkaline phosphatase activity in a coculture of two intestinal cell lines. Localization

of alkaline phosphatase activity (in red) was identified by cytochemistry in a coculture

of the human intestinal cell lineages Caco-2 and HT29-5M21.

Estudios fisiolgicos 21

22

Usado en estudios FIV (manipulacin

de vulos).

APLICACIONES- microscopio ptico invertido

FIV: Microinyeccin espermtica

FIV: Microinyeccin espermtica Consiste en la introduccin mecnica de un espermatozoide dentro del ovocito

Ejemplo de microscopio invertido: Microscopio confocal

ANALISIS DE IMAGEN

+ Cmara de vdeo

+

Imagen ptica u electrnica

directa de los microscopios (imagen analgica= imagen convencional)

Imagen digitalizada

(imagen de pxel)

Sistema electrnico

Se trabaja sobre la imagen

con programas informticos

Microscopio Ordenadores

ANALISIS DE IMAGEN

Microscopa virtual: amplio uso en

el diagnstico patolgico

Microscopa virtual-Aplicaciones

Uso a distancia de recursos interactivos para el diagnstico

y la investigacin

Docencia (acceso a bases de datos remotas de imgenes

microscpicas)

Reconstruccin 3D a partir de mltiples microgrficas.

Permitir compartir bases de datos de las diversas

instituciones

Microscopa virtual-Ejemplo

MATERIAL COMPLEMENTARIO

Partes del MO. Funcionamiento

Relacin de vdeos

http://www.youtube.com/watch?v=AC_X87DexiY&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=0Tunrrm3OlM&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=KzNsuiqW1LQ&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=L6d3zD2LtSI

http://www.youtube.com/watch?v=-A9tVEsTi9w&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=XbLD2zJDEzs&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=dqdKGjG_nR8&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=KfqQErL64cY&feature=related

TEMA 4

TCNICAS DE PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MO.

APLICACIONES ESPECFICAS DE LA MICROSCOPA PTICA EN

BIOMEDICINA

USO DEL MO COMPUESTO

Observacin de preparaciones temporales -Directamente de la muestra

clnica

-A partir de cultivos

microbianos

Observacin de preparaciones permanentes

- Citoqumica

- Histoqumica

Observacin directa de clulas vivas Cultivos celulares

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas

Espermiograma

6 7

Micosis oportunista

Candidiasis (Candida albicans)

8

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas. Se

realiza un fresco con KOH

Malassezia furfur

Pitiriasis versicolor

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas (Hongos dermatofitos de los gneros: Microsporum, Trichophyton, Epydermophytom)

9

Trichophyton mentagrophytes

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Tincin Gram (Citoqumica)

Bacillus brevis Bacillus anthracis

12 11

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Tincin Hematoxilina-eosina en sangre humana (Citoqumica)

Eje. Tincin de verde malaquita para endosporas bacterianas (Citoqumica)

Endospora

13

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Prueba de Papanicolau (Citoqumica)

15

14

16

Observacin de preparaciones permanentes Eje. Observacin de tejidos (Histoqumica)

Smooth muscle, muscularis externa of colon, H&E, x132 Ovary, medulla containing multiple blood vessels, H&E, x33

Heart, H&E, x130 Epidermis, H&E, x100

18

19 20

17

MICROSCOPIOS PTICOS ESPECIALES

Modifican la manera en

que incide la luz sobre el

espcimen: emplea

condensadores o filtros

1

Modifican la fuente emisora

de luz: cambia la luz

blanca por la luz ultravioleta

o rayos lser (tambin emplean filtros)

2

- Microscopio de campo oscuro.

- Microscopio de polarizacin.

- Microscopio de contraste de fases.

- Microscopio interferencial

o de ptica Kormaski.

- Microscopio de fluorescencia o de

luz ultravioleta.

- Microscopio confocal