SEDIMENTACIJSKE

METODEMETODE

• centrifugiranje– razdvajanje molekula na temelju razlika u taloženju pri povećanoj gravitacijskoj sili

• precipitacija (taloženje)

Sedimentacijske metode

• precipitacija (taloženje)– razdvajanje molekula na osnovi različite topljivosti pri promjeni uvjeta u otopini

Teorijske osnove centrifugiranja

centrifugalno polje (G) = ϖϖϖϖ2rϖϖϖϖ = kutna brzina rotora (radian/s)

r = polumjer rotora (u cm)

preračunato u okretaje u minuti

ili kao višekratnik gravitacijskog polja Zemlje (xg)

ϖπ

2 okret min

-1

=

60G

4 (okret min )-1 2

=π

2

3600

r

RCS 4 (okret min )

(1.11 10 )(okret min )

-1 2

-5 -1 2

=

×

= ×

π2

3600 980

r

r

Podjela centrifugiranja prema namjeni

• analitičko centrifugiranje– mjeri fizikalna svojstva tvari koje sedimentiraju

• koeficijent sedimentacije S– jedinica je Svedberg (S) = 10-13 sec

– omjer brzine sedimentacije (v ; dr/dt) i centrifugalne – omjer brzine sedimentacije (v ; dr/dt) i centrifugalne sile (ω2r)

• preparativno centrifugiranje

rSv2

ω×=r

vS

2ω

=

Podjela centrifugiranja prema brzini

• ultracentrifuguranje– više od 20.000 okretaja/min

• centrifugiranje niske brzine– manje od 10.000 okretaja/min

•centrifugiranje visoke brzine

–10.000 do 20.000 okretaja/min

Diferencijalno centrifugiranje

• uzorak pravilno raspoređen u cijeloj epruveti– nakon centrifugiranja razdvajamo supernatant i talog

• sastav taloga ovisi o brzini i vremenu centrifugiranja– uvijek kontaminiran česticama koje su se nalazile u – uvijek kontaminiran česticama koje su se nalazile u dnu epruvete prije početka centrifugiranja

mala brzina

veća brzina

velikabrzina

najvećabrzina

Zonalno centrifugiranje

• uzorak se nanosi u tankom sloju na vrh epruvete ispunjene gradijentom gustoće

• pod djelovanjem centrifugalne sile čestice sedimentiraju ovisno o svom obliku i gustoći

• centrifugiranje prekidamo prije no što čestice • centrifugiranje prekidamo prije no što čestice stignu do dna epruvete

Izopikničko centrifugiranje

• gradijent obuhvaća cijeli raspon gustoća čestica koje želimo razdvojiti

• uzorak je jednoobrazno raspoređen u epruveti

• gradijent nastaje pod djelovanjem centrifugalne sile na čestice u mediju (npr. CsCl)sile na čestice u mediju (npr. CsCl)

• čestice se zaustavljaju na mjestu gdje je njihova gustoća jednaka gustoći medija

Osnovni tipovi rotora za centrifugiranje

• sa stalnim kutem

– fixed angle

• ljuljajuće košarice

– swinging bucket– swinging bucket

• uspravni

– vertical tube

Centrifuga nije igračka

Precipitacija (taloženje)

• razdvajanje molekula na osnovi različite topljivosti pri promjeni uvjeta u otopini

• usoljavanje (salting in)– povećanje topljivosti proteina dodatkom soli

– talože se pri maloj ionskoj jakosti

• isoljavanje (salting out)• isoljavanje (salting out)– taloženje povišenjem ionske jakosti

• taloženje organskim otapalima

• taloženje selektivnom denaturacijom– temperatura

• afinitetno taloženje– umrežavanje specifičnim reagensima (protutijela, lektini)

Topljivost proteina ovisi o pH medija

Isoljavanje (salting out)

• uklanjanje proteina iz otopine povišenjem koncentracije soli

• razmjerno kompleksna teorija– uređenje molekula vode oko hidrofobnih područja

– kompeticija za slobodne molekule vode

– agregacija i precipitacija proteina– agregacija i precipitacija proteina

hidrofobno područje na

proteinu

molekule vode

Svaki protein se taloži u uskom rasponu koncentracije soli.

Taloženje amonij-sulfatom

• prednosti amonij-sulfata– dobra topljivost (4 mol/l)– prihvatljiva gustoća zasićene otopine (1.235 g/ml)– prihvatljiva cijena– koncentrira proteine u uzorku– stabilizira većinu proteina– stabilizira većinu proteina

• nedostaci amonij-sulfata– neprikladan iznad pH 8

• natrij-citrat

– prisutnost teških metala (ppm) • EDTA u otopini

– potrebno ga je naknadno ukloniti • dijaliza, gel filtracija

Primjer taloženja amonij-sulfatom

raspon %

zasićenja

% istalož.

enzima

% istalož.

proteina

obogaćenje

prvi

pokušaj

0-40

40-60

60-80

80 supern.

4

62

32

2

25

22

32

21

2.8

1.0

Zaključak: enzim se većinom istaložio u rasponu 40-60% Zaključak: enzim se većinom istaložio u rasponu 40-60%

drugi

pokušaj

0-45

45-70

70 supern.

6

90

4

32

38

30

2.4

Zaključak: dobro iskorištenje (prinos); slabije obogaćenje

Treći

pokušaj

0-48

48-65

65 supern.

10

75

15

35

25

40

3.0

Nakon taloženja amonij-sulfatom potrebno je ukloniti višak iona

dijaliza gel-filtracija

Ione amonij-sulfata nije potrebno uklanjati ako nakon taloženja planiramo kromatografiju hidrofobnih interakcija.

Taloženje organskim otapalima

• složena teorija– smanjenje aktivnosti vode– slično izoelektričnom taloženju– hidrofobne interakcije manje važne– veće molekule se talože ranije

• svojstva otapala– moraju se potpuno miješati s vodom– moraju se potpuno miješati s vodom– moraju biti nereaktivna i neotrovna – uglavnom etanol i aceton

• pri niskim temperaturama– efikasnije taloženje– manja denaturacija proteina

• oprez pri izražavanju postotaka– 50 ml H2O + 50 ml aceton = 95 ml

Afinitetno taloženje (imunoprecipitacija)Protein G i protein A

• protein G – 6,5 kD aprotein iz soja Streptococcus• protein A – 40-60 kDa protein iz soja Staphylococcus

• površinski proteini bakterija

• velik afinitet vezanja imunoglobulina (Fc regiju)

Table 1. Relative Affinity of Immobilized Protein A for Various Antibody Species and Subclasses1-4. Note: These conditions may vary somewhat based on the salt concentration of the same sample and/or buffer.

Species/Subclass Protein A Protein G

Human IgG1 High High

Human IgG2 High High

Human IgG3 Mod. High High

Human IgG4 Mod. High High

Rabbit IgG High High

Mouse IgG1 Low High

Mouse IgG2a Moderate High

Mouse IgG2b Mod. High High

Mouse IgG3 High High

Rat IgG1 Low Moderate

Table 2. Recommended Column Volumes for Different Antibody Sources

Antibody SourceRecommended bed volume

per ml starting material

Immune Serum 2 ml

Tissue Culture Supernatant (with 10% fetal bovine serum) 0.2 ml

Tissue Culture Supernatant (serum-free) 0.01 ml

Ascites Fluid 2 ml

Rat IgG2a Low High

Rat IgG2b Low Low

Rat IgG2c High High

Goat IgG Low High