Διαγονιδιακά ζώα

2 pl σε ένα από

τους δύο

προπυρήνες

10-30%

επιβίωση

Ορισμοί:

ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ

ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟ

ΤΥΧΑΙΑ ΕΝΘΕΣΗ

Ορμονική

διέγερση

Διαμόλυνση με μικροέγχυση

40% των

απογόνων έχει

το διαγονίδιο

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗΣ (Ηλεκτροδιάτρηση και λιποσώματα)

Τα κύτταρα δεν παραλαμβάνουν ελεύθερο DNA, εξαιρούνται κάποια βακτήρια

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗΣ (ιικοί φορείς)

Ρετροϊοί μολύνουν μόνο

κύτταρα που διαιρούνται

Λεντιιοί, αδενοϊοί και αδενο-

σχετιζόμενοι ιοί μολύνουν και

κύτταρα που δεν διαιρούνται

Απαιτούνται αλληλουχίες LTR

για ενσωμάτωση και

αλληλουχία Ψ για συσκευασία

ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΩΝ

Εκμετάλλευση των Υποκινητών-

Ενισχυτών

Παράδειγμα:

ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ

ΤΟΞΙΝΩΝ ΓΙΑ

ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗ

ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Χρήση: ΤΟΞΙΝΗ

ΔΙΦΘΕΡΙΤΙΔΑΣ (Α-ΑΛΥΣΙΔΑ)

Κινάση της Θυμιδίνης (TK1)

ΤΥΧΑΙΑ ΕΝΘΕΣΗ: ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΔΟΓΕΝΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ (loss of function

mutation), ΜΕΤΑΒΛΗΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ, ΑΛΛΑΓΗ ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑΣ

Mouse in Red: Red Fluorescent Protein Expression in

Mouse ES Cells, Embryos, and Adult Animals

Kristina Vintersten,1 Claudio Monetti,1 Marina Gertsenstein,1

Puzheng Zhang,1 Lajos Laszlo,2

Steffen Biechele,1 and Andras Nagy1,3*

genesis 40:241–246 (2004)

Μπορεί να επιτευχθεί στοχευμένη ένθεση

ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ

ΚΥΤΤΑΡΩΝ

(ΑΠΌ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ ΒΛΑΣΤΟΚΥΣΤΗΣ)

ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΘΟΥΝ (LIF)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ DNA

ΗΛΕΚΤΡΟΔΙΑΤΡΗΣΗ,

ΡΕΤΡΟΪΟΙ,

ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ

ΕΠΙΛΟΓΗ (G418)

ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ: Στόχευση αλλά μικρό ποσοστό επιτυχίας

Αρχικό ποντίκι: ιδρύτης

Απόγονοι: διαγονιδιακή σειρά

ES (embryonic stem) εμβρυικά

βλαστικά κύτταρα τα οποία είναι

ολοδύναμα

KNOCKOUT ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΓΙΑ ΜΟΝΤΕΛΑ

ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΥΞΗΘΕΙ Η ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΜΕ ΧΡΗΣΗ

ΜΕΓΑΛΩΝ ΑΚΡΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΟΥ

ΜΑΣ ΕΝΔΙΑΦΕΡΕΙ

Συνήθως τα άκρα προκύπτουν από BAC κλώνους

BAC RECOMBINEERING τότε ως και 20%

ΔΥΟ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ (NEO

ΚΑΙ TK)

ΥΠΟΜΟΡΦΙΚΑ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΑ

ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΕΧΕΙ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ 1:1000

http://transgenicmice.ku.dk/pictures/Slide2-505.jpg/

ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

Βακτήρια και ζύμες αλλά δεν

τροποποιούν όπως οι ανώτεροι

οργανισμοί

NCBI » Bookshelf » An Introduction to Genetic

Analysis » Applications of Recombinant DNA

Technology » Recombinant DNA technology in

eukaryotes

ΧΡΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΖΩΩΝ

A central role of KLKs in Netherton Syndrome

NS: Mutations in Spink5 resulting in truncated protein LEKTI => lower number of protein inhibition domains than

the wild-type

Komatsu et al., J Invest Dermatol 118: 436-443, 2002

K R

K R

R

R

K R

SPINK5 (LEKTI)

K R

K R

K R

K

K K

CPs

Death < 24 h

Newborn After few hours

Time (t)

wt Spink5-/-

Hewett DR et al. Hum Mol Genet 14: 335-346, 2005

Yamasaki K et al. Nature Med 13: 975-980, 2007

Descargues P et al. Nature Genet 37: 56-65, 2005

Yang T et al. Genes Dev 18: 2354-2358, 2004

Sales KU et al. Nature Genet 42: 676-683, 2010

FLPase-mouse

3’ arm (4403 bp)

loxP loxP loxP

5’ arm (4288 bp)

FRT FRT En2

SA IRES lacZ pA hBactP neo pA

Klk5

Cre-mouse

Δημιουργία του Klk5-/- ποντικού

wt Klk5-/-

wt Klk5-/- Spink5-/- Spink5-/-/Klk5-/-

Spink5-/- wt Spink5-/-/Klk5-/- wt Klk5-/-

Διάσωση του φαινοτύπου του Netherton

TALEN (transcription activator-like effector

nucleases) Τεχνητές νουκλεάσες που στηρίζονται στις πρωτεΐνες

TAL effectors (Xanthomonas spp)

2011 METHOD OF THE YEAR

https://tale-nt.cac.cornell.edu/tutorials/talentargeterupdated

70% 7%

TAL TALEN

HD

NN

NI

NG

C

G

A

T

Αμινοξύ Βάση DNA

TALEN (transcription activator-like effector

nucleases)

Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82. doi:

10.1093/nar/gkr218. Epub 2011 Apr 14.

Efficient design and assembly of custom

TALEN and other TAL effector-based

constructs for DNA targeting.

Cermak T1, Doyle EL, Christian M, Wang

L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia

NV, Bogdanove AJ, Voytas DF.

CONDITIONAL KNOCKOUT (Ιστοειδική απενεργοποίηση)

Κάποια γονίδια είναι εμβρυικά θανατηφόρα ή

θανατηφόρα αμέσως μετά τη γέννηση του ζώου

http://cre.jax.org/introduction.html

Απαιτείται η ιστοειδική απενεργοποίησή τους

loxP αλληλουχίες

ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΙΣ

ΔΙΠΛΟΣ ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ

Μοντέλο για χρωμοσωμικές αναδιατάξεις

ΕΠΑΓΩΜΕΝΑ KNOCKOUT

ΕΠΑΓΩΜΕΝΑ KNOCKOUT

Ευχαριστώ πολύ!!!!