1

Μοριακή ∆ιαγνωστική

στην Κλινική

Ανοσολογία. ∆ανάη Ειρήνη Τερζάκου (10047), Τµήµα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας.

2

Περιεχόµενα:

Εισαγωγή...................................................................................................................σελ. 4

Μοριακή ∆ιαγνωστική

στηνΑνοσολογία........................................................................................................σελ. 4

Κεφάλαιο 1. PCR.......................................................................................................σελ. 5

• Κεφάλαιο 1.1Αρχή της PCR

• Κεφάλαιο 1.2 Εκκινητές/ Primers

• Κεφάλαιο 1.3 Παραλλαγές της PCR

• Κεφάλαιο 1.3.1 real-time PCR

• Κεφάλαιο 1.3.2 Multiplex PCR

• Κεφάλαιο 1.3.3 RT- PCR

• Κεφάλαιο 1.3.4 Hot-Start PCR

Κεφάλαιο 2. Μicroarrays.........................................................................................σελ. 10

Kεφάλαιο 3. Ιn Situ Hybridization...........................................................................σελ. 11

• Κεφάλαιο 3.1 Μέθοδος FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization).

Kεφάλαιο 4. Sequencing..........................................................................................σελ. 12

• Κεφάλαιο 4.1 Mέθοδος Sanger

• Κεφάλαιο 4.2 Νext Generation Sequencing

• Κεφάλαιο 4.3 Ιon Semiconductor Sequencing

• Κεφάλαιο 4.4 Pyrosequencing

Kεφάλαιο 5. Ηybridization………………………………………………………..σελ 14

• Κεφάλαιο 5.1 Dot Blot

• Κεφάλαιο 5.2 Ανάστροφη Υβριδοποίηση

• Κεφάλαιο 5.3 Southern Blot

• Κεφάλαιο 5.4 Northern Blot

3

Kεφάλαιο 6. c DNA................................................................................................σελ. 18

• Κεφάλαιο 6.1 Αρχή της c DNA βιβλιοθήκης

• Κεφάλαιο 6.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία

Κεφάλαιο 7. Ανάλυση MLPA………….....................................................................σελ.21

• Κεφάλαιο 7.1 Αρχή της MLPA

• Κεφάλαιο 7.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία

Kεφάλαιο 8. Γονιδιωµατική Βιβλιοθήκη..................................................................σελ. 26

• Κεφάλαιο 8.1 Αρχή της Γονιδιωµατικής Βιβλιοθήκης

• Κεφάλαιο 8.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογια

Κεφάλαιο 9. Μοριακές ∆ιαγνωστικές και Βιοπληροφορική......................................σελ 28

Κεφάλαιο 10. SNP διαγνωστική................................................................................σελ. 30

Βιβλιογραφία.

4

Μοριακή ∆ιαγνωστική στην Κλινική

Ανοσολογία. Η µοριακή διαγνωστική αποτελεί πλέον, τη βέβαιη και ασφαλή λύση –σε όσους έχουν

την οικονοµική πολυτέλεια- στη διάγνωση και όχι µόνο πολλών ασθενειών που κάποτε

αποτελούσαν µυστήριο για πολλούς επιστήµονες.

Eισαγωγή.

Όταν οι James Watson και Francis Crick

ανακάλυψαν τη δοµή του DNA, ο

Watson είπε χαρακτηριστηκά ότι

βρήκαν το µυστικό της ζωής, και είχε

δίκιο.

Το DNA αποτελεί την αρχή αλλά και το

τέλος της ζωής, είναι η κινητήριος

δύναµη της αναπαραγωγής, του

πολλαπλασιασµού, της διαφοροποίησης.

Στην αρχή οι επιστήµονες, µε πρώτους

τους βιοχηµικούς, είκαζαν ότι οι

πρωτεϊνες –όντας το µεγαλύτερο και

πολυπλοκότερο µακροµόριο- έφεραν τη

γενετική πληροφορία. Μα ευτελή

«βήµατα» και µικρές ανακαλύψεις µε

κορύφωση την ανακάλυψη των Franklin,

Watson και Crick απέδειξαν ότι το DNA

κρύβει το µυστικό της ζωής.

Άµα αναλογιστεί κανείς, όµως τα

πειράµατα που πραγµατοποιούσαν για

την απόδειξη τούτης της εικασίας, θα

παρατηρούσε ότι αποτελούσαν µια

πρώιµη µορφή της µοριακής

διαγνωστικής, µε πρώτο τον Griffith, ο

οποίος αποµόνωσε αδρά και λεία

στελέχη πνευµονιόκοκκου από νεκρούς

και µη ποντικούς.

Πολλοί ήτο δε εκείνοι που

«εκµεταλλεύτηκαν» τούτα τα

προτερήµατα του DNA και το

µετρέτεψαν σε ένα χρήσιµο διαγνωστικό

εργαλείο.

Μοριακή ∆ιαγνωστική στην Κλινική Ανοσολογία.

Αποτελεί ένα κλειδί που µπορεί να

ανοίξει πολλές πόρτες. Ένα εργαλείο

που µέχρι και σήµερα εξακολουθεί να

διευρύνει τους ορίζοντες πολλών

επιστηµόνων από κάθε τοµέα, µε πρώτο

αυτούς που εκπροσωπούν τον τοµέα της

Kλινικής Ανοσολογίας. Εξελίσσονται

και βελτιστοποιούνται συνεχώς µε την

πάροδο των χρόνων, καθώς είναι πολλά

ακόµα τα ζητήµατα που δεν έχουν

καλυφθεί όπως το υψηλό κόστος τούτων

των µεθόδων.

Ωστόσο, αυτά τα σύχρονα µοριακά τέστ,

αυξάνουν την ικανότητα του επιστήµονα

να ταυτοποιήσει σε σχετικά µικρό

χρονικό διάστηµα τις αιτίες κάποιας

5

µόλυνσης και όχι µόνο. Παράλληλα,

µπορούν όχι µόνο να διαγνώσουν

καποια ασθένεια µα να βοηθήσουν στη

χορήγηση των σωστών φαρµάκων

καθώς και στη βελτιστοποίηση

φαρµάκων.

1. PCR

( Polymerase chain reaction)

Εισαγωγή.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης

(PCR) αποτελεί µια ταχεία και σχετικά

απλή µέθοδος αντιγραφής και

πολλαπλασιασµού συγκεκριµένων

αλληλουχιών DNA, όταν είναι γνωστή

µια ακολουθία 20 ζεύγος βάσεων στα

άκρα των τµηµάτων.

1.1 Aρχή της PCR.

Η µέθοδος τούτη στηρίζεται στην

ικανότητα του θερµοσταθερού ενζύµου

DNA-πολυµεράση να συνθέται

συµπληρωµατική έλικα DNA πάνω σε

εκµαγείο προϋπάρχοντος µονόκλωνου

DNA. Η δράση της πολυµεράσης έχει

κατεύθυνση 5’-->3’ και η έναρξή της

προϋποθέτει την ύπαρξη ενός βραχέο

τµήµατος DNA, που θεωρείται η

περιοχή εκκίνησης της αντιγραφής.

Τούτη περιοχή δηµιουργείται µε την

πρόσδεση µιας βραχείας σειράς

συνθετικών συµπληρωµατικών

ολιγονουκλεοτιδίων γνωστή και ως

εκκινητές ή primers στο 3’-άκρο

καθενός από τα δύο µονόκλωνα

τµήµατα DNA που προκύπτουν από την

αποδιάταξη του αρχικού κλώνου.

6

Όπως περιγράφεται και στο σχήµα η

PCR επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια

συσκευών που φέρονται ως θερµικοί

κυκλοποιητές και η οποίοι επιτυγχάνουν

την αποδιάταξη του DNA µε θέρµανση

του περιβάλλοντος της αντίδρασή µέχρι

τους 94 oC. Εν συνεχεία η θερµοκρασία

µειώνεται –στους 55 oC περίπου- έτσι

ώστε να γίνει ο υβριδισµός των

εκκινητών µε τη συµπληρωµατικής τους

DNA-ακολουθία. Η αύξηση της

θερµοκρασίας στους 72 oC ευνοεί τη

σύνδεση της πολυµεράσης στη θέση που

έχουν υβριδισθεί οι εκκινητές. Τέλος το

ένζυµο, χρησιµοποιώντας τα

τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια,

επιµηκύνει τους εκκινητές συνθέτοντας

µια συµπληρωµατική αλυσίδα DNA στη

προϋπάρχουσα. Η αυτοµατοποιηµένη

και διαδοχική επανάληψη τούτο του

κύκλου έχει ως αποτέλεσµα το

διπλασιασµό των επιθυµητών

αντιγράφων DNA µετά από κάθε κύκλο.

1. [John M.S Bartlett and David Stirling

(Editors) Humana Press Inc. Totowa,

NJ.]

H PCR θεωρείται η εύκολη λύση τόσο

γιατί προσφέρει διάγνωση και ανίχνευση

ενός νοσήµατος όσο γιατι είναι µια

γρήγορη µέθοδος. Μέσω τούτης της

µεθόδου µπορεί να εντοπισθεί ιϊκό

γενετικό υλικό είτε αυτό είναι DNA είτε

είναι RNA. H υψηλή ευαισθησία που

διαθέτει αυτή η τεχνική µπορεί να

διαπιστώσει το ιϊκο γενετικό υλικό λίγο

µετά τη µόλυνση του οργανισµού µε

αυτό και πολλές φορές πρίν την

εµφάνιση συµπτωµάτων της δεδοµένης

ασθένειας.

1.2 Εκκινητές.

Ο σχεδιασµός τους αποτελεί ένα από τα

σηµαντικότερα στοιχεία, καθώς δεν

αρκεί απλώς να είναι συµπληρωµατικοί

7

στα άκρα των δύο αλυδίδων DNA που

αντιγράφεται αλλά ταυτόχρονα δε

πρέπει να εµφανίζουν

συµπληρωµατικότητα µε άλλες θέσεις

των µορίων DNA που περιέχονται στο

δίαλυµα αντίδρασης. Αυτό ισχύει όταν

αντιγράφεται και άλλο τµήµα DNA

παράλληλα, µε αποτέλεσµα να µειωθεί η

αποτελεσµατικότητα της αντιγραφής του

επιθυµητού κλώνου και επιπλέον να

δηµιουργηθούν παραπροϊόντα. Η

ακολουθία βάσεων τους µάλιστα,

καθορίζει και την ακριβή θερµοκρασία

αναδιάταξης

.

1.3 Παραλλαγές της PCR που χρησιµοποιούνται για διάγνωση.

1.3.1 Real Time PCR.

Αποτελεί µια παραλλαγή της µεθόδου και

τελευταία παρουσιάζει ευρεία διάδοση. Κατά

την εφαρµογή της, χρησιµοποιείται κάποια

φθορίζουσα χρωστική µε τέτοιο τρόπο ώστε ο

φθορισµός που εκπέµπεται να είναι ανάλογος

της ποσότητας του παραγόµενου προϊόντος. Ο

θερµικός κυκλοποιητής µετρά τον φθορισµό

που εκπέµπεται από το δίαλυµα της αντίδρασης

κατά τη πραγµατοποίησή της. Συµπερασµατικά

υπολογίζεται η αύξηση της σύνθεσης του

προϊόντος κατά τον χρόνο που παράγεται.

Επίσης από τις τιµές των µετρήσεων είναι

δυνατός υπολογισµός του ακριβούς αριθµού

των αρχικών αντιγράφων του τµήµατος DNA ή

RNA ( σε περίπτωση reverse transcriptase real-

time PCR – κάτι που θα αναλυθεί παρακάτω-).

Με το τρόπο τούτο µπορεί να παραληφθεί η

ηλεκτροφόρηση και σγχρόνως παράγονται

ποσοτικές πληροφορίες για το δείγµα. 2.[Beggs

AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. ]

1.3.1.1 Εφαρµογές στην κλινική Ανοσολογία.

• Αποτελεί ένα αγαπηµένο

«εργαλείο» στη διάγνωση

µολυσµατικών ασθενειών σε

επείγουσες περιπτώσεις, καθώς

είναι µια γρήγορη και ευαίσθητη

µέθοδος. 3. [Department of

Microbiology and Molecular Cell

Biology,]. Μπορεί να θεωρείται

8

µια σχετικά γρήγορη µέθοδος µα

απαιτεί σχετική ακριβή

οργανολογία, µια πολυτέλεια που

δεν έχουν όλα τα ερευνητικά

κέντρα-νοσοκοµεία.

• Επιπροσθέτως µέσω της real-

time PCR καθιστάται δυνατή η

παρακολούθηση της

ανοσολογικής απόκκρισης. Κάτι

τέτοιο µπορεί να βοηθήσει τόσο

στην µεταγενέστερη θεραπεία

του καρκίνου όσο στην

τοποθέτηση του σωστού

αντιγόνου ή στελέχος του για τη

δηµιουργία και την αξιολόγηση

ενός εµβολίου. 4. [Stordeur P -

Monitoring the immune response

using real-time PCR ].

Χαρακτηριστικό παράδειγµα

τούτης της εφαρµογής είναι η

ανάλυση της ανοσολογικής

απόκκρισης κατά το κλωστηρίδιο

του τετάνου.

• Παράλληλα µε τη βοήθεια της

real-time PCR είναι έυκολη η

παρακολούθηση και η ανίχνευση

είτε των ασθενειών είτε του

καρκίνου, λόγω υψηλής

ευαισθησίας. Χαρακτηριστικό

παράδειγµα είναι η ανίχνευση

της οξείας λευχαιµίας. 5. [Bacher

U, Schnittger S, Haferlach C,

Haferlach T].

• Ποσοτικοποίηση m RNA

κυτταροκίνων. Όπως

αναφέρθηκε και παραπάνω η

real-time PCR είναι ιδανική

στον ακριβή υπολογισµό

νουκλεϊκών οξέων. 6. [Patrick

Stordeur, Lionel F Poulin, Ligia

Craciun, Ling Zhou, Liliane

Schandené, Aurore de Lavareille,

Stanislas Goriely, Michel

Goldman ]. Οι κυτταροκίνες

αποτελούν ετερογενή οµάδα

µικροµοριακών πρωτεϊνών, οι

οποίες παράγονται από διάφορα

κύτταρα του οργανισµού

αναστέλλουν είτε διεγείρουν τη

λειτουργία των κυττάρων

δρώντας επ’αυτόν κατά

αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Η

έκκρισή τους είναι ταχεία,

βραχείας διαρκείας και

αυτοπεριοριζόµενη. Γενικά οι

κυτταροκίνες δεν αποθηκεύονται

ενδοκυτταρίως ως

προσχησµατισµένα µόρια. Η

σύνθεσή τους είναι αποτέλεσµα

νέας παροδικής γονιδιακής

µεταγραφής, η οποία

επιτυγχάνεται µέσω ασταθών και

βραχύβιων m RNAs.

9

1.3.2 Multiplex PCR.

Κατά την πολυπλεκτική PCR, έχουµε τη

χρήση δύο ή περισσότερων εκκινητών,

έτσι ώστε να πολλαπλασιάζονται

περισσότερα του ένος τµήµατα DNA σε

µια αντίδραση. Πλεονεκτεί από τις

άλλες καθώς είναι πολύ πιο γρήγορη

καθώς παράγει περισσότερα του ενός

προϊόντα. Παρόλο ταύτα, έχει µειωµένη

ευαισθησία συγκριτικά µε µια απλή PCR

λόγω των περισσότερων εκκινητών

10

καθώς επίσης δεν είναι δυνατή η

βελτιστοποίηση καθώς ο σχεδιασµός

τους αποτελεί µια αρκετά πολύπλοκη

διαδικασία.

1.3.2.1 Εφαρµογές στην κλινική

Ανοσολογία.

Πολλοί είναι εκείνοι που χρησιµοποιούν

την multiplex PCR για διαγνωστικους

σκοπους όπως για τον πολλαπλασιασµό

εξωνιών στη Μυική ∆υστροφία

Duchenne καθώς και στη Μυική

∆υστροφία Becker ή για ταυτοποίηση

µολυσµατικών παθογόνων

µικροοργανισµών.

1.3.3. RT-PCR (reverse transciptase).

Στη καθοµιλουµένη είναι γνωστή και ως

αντίστροφη µεταγραφάση PCR.

Περιλαµβάνει αρχικά την αποµόνωση

RNA από κύτταρα, τη σύνθεση c DNA

µε τη βοήθεια του ενζύµου αντίστροφη

µεταγραφάση και έπειτα την εφαρµογή

της PCR. Με βάση τους εκκινητές που

θα χρησιµοποιηθούν , πολλαπλασιάζεται

η επιθυµητή αλληλουχία RNA,

δηµιουργώντας µόρια DNA που φέρουν

τη γενετική πληροφορία.

1.3.3.1 Εφαρµογές στην κλινικά

Ανοσολογία.

Στις εφαργµογές της RT-PCR

περιλαµβάνεται η κλωνοποίηση µορίων

m RNA. Χρησιµοποιείται κυρίως για τη

διάγνωση RNA ιών. Επίσης

χρησιµοποιείται για τον έλεγχο

έκφρασης γονιδίων όπου ελέγχεται η

παρουσία µορίων m RNA. Ευρεία

εφαρµογή έχει και η σύνθεση

επισηµασµένων µορίων c DNA όπου

µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν

ανιχνευτές για µικροσυστοιχίες. Με τον

τρόπο τούτο, ελέγχεται η έκφραση των

γονιδίων σε διαφοροποιηµένα κύτταρα. .

7. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM,

Kunkel LM ]

1.3.4 Hot-Start PCR.

To κύριο µειονέκτηµα της PCR είναι ότι

πολλές φορές παράγονται µη ειδικά

προϊόντα, λόγω της µη ειδικής σύνδεσης

των εκκινητών σε θέσεις του

υποστρώµατος που δεν υπαρχει πλήρης

συµπληρωµατικότητας. Το πρόβληµα

συνδέεται µε την δράση της

θερµοανθεκτικής DNA πολυµεράσης,

κατά την προετοιµασία της αντίδρασης.

Πιο συγκεκριµένα, καθώς η

προετοιµασία της αντίδρασης

πραγµατοποιείται σε θερµοκρασία

αρκετά χαµηλότερη συγκριτικά µε την

επιθυµητή θερµοκρασία αναδιάταξης,

ευνοείται η πρόσδεση των εκκινητών σε

µη πλήρως συµπληρωµατικά τµήµατα

του υποστρώµατος.

Αν και η δράση της DNA-πολυµεράσης

σε αυτές τις θερµοκρασίες είναι

µειωµένη, είναι και υπαρκτή. Έτσι

συνθέτονται τµήµατα DNA, που είναι

µη ειδικά, αλλά φέρουν πλέον στα άκρα

τους ακολουθίες των εκκινητών. Με την

εκκίνηση του θερµοκυκλοποιητή, τούτα

τα τµήµτατα DNA πολλαπλασιάζονται,

έχοντας σαν αποτέλεσµα τη

συσσώρευση µη ειδικών προϊόντων,

βέβαια για να αποφευχθεί αυό είναι η

προσθήκη της DNA-πολυµεράσης. Η

έναρξη της αντίδρασης

πραγµατοποιείται µε την προσθήκη του

ενζύµου σε ψηλή θερµοκρασία

1.3.4.1 Εφαρµογές της Ηοt-start PCR

στην Κλινική Ανοσολογία.

11

Ένώ είναι µια τεχνική που έχει δείξει

θεαµατικά αποτελέσµατα, αλλά το

εγγενές πρόβληµα είναι η προςθήκη

µικρού όγκου αντιδραστηρίου σε θερµό

δίαλυµα. Αυτό µπορεί να οδηγήσει σε

επιµολύνσεις αλλά και προβλήµατα

επαναληψιµότητας στην αντίδραση. Για

την αποφυγή τούτων των προβληµάτων,

τα τελευταία χρόνια έχουν

κυκλοφορήσει ένζυµα που είναι αδρανή

στις «συγκεκριµένες» θερµοκρασίες και

ενεργοποιούνται στην θερµοκρασία

αποδιάταξης. Είναι µια τεχνική που

µπορεί να χρησιµοποιηθεί όπου και η

απλή PCR. Στην πράξη όµως, λόφω του

ελαφρώς αυξηµένου κόστους

εφαρµόζεται κυρίως στις περιπτώσεις

που το δείγµα του ασθενούς µπορεί να

περιέχει µεγάλη ποικιλία ακολουθιών

DNA και άρα µεγάλη πιθανότητα

εµφάνισης παραπροϊόντων.

2. Microarrays.

Γνωστά και ως µικροσυστοιχίες νουκλεϊκών οξέων. Θεωρείται η πιο εξελιγµένη µορφή

της ανάστροφης υβριδοποίησης. Οι ιχνηθέτες τοποθετούνται τοποθετούνται µε

συγκεκριµένη σειρά σε ένα γύαλινο υπόστρωµα, το οποίο έχει υποστεί την κατάλληλη

διεργασία για να γίνει δυνατή η προσκόλληση του DNA. Η υβριδοποίηση

πραγµατοποιείται µε δίαλυµα που περιέχει επισηµασµένο δείγµα, συνήθως c DNA που

συνθέτεται από m RNA µε τη χρησιµοποίηση ενός ενζύµου αντίστροφης µεταγραφάσης.

Να σηµειωθεί ότι κατά την πραγµατοποίηση της c DNA βιβλιοθήκης πραγµατοποιείται

ταυτόχρονα και η επισήµανση.

12

Eφαρµογές

Oι εφαρµογές των microarrays

ποικίλουν ανάλογα το είδος του

δείγµατος. Συνήθως χρησιµοποιούνται

για τη διάγνωση µεταλλαγµένων

γονιδίων καθώς και τον έλεγχο του m

RNA που παράγεται σε κάποιον

συγκεκριµένο κυτταρικό τύπο. Έχει το

βασικό πλεονέκτηµα ότι είναι δυνατή η

ανάλυση της έκφρασης χιλλιάδων

γονιδίων συγχρόνως. Έχει

χρησιµοποιηθεί για ποικίλες

ανοσολογικές µελέτες όπως στην

ωρίµανση, τον µοριακό µηχανισµό της

αλλεργίας, την ενεργοποίηση και τη

διαφοροποίηση την T- και Β-

λεµφοκυττάρων, την σχέση µεταξύ του

φαινότυπου και της γονιδιακής

έκφρασης. 8. [Zhong Xi Yi Jie He Xue

Bao.]

3. In situ hybridization.

Στις παραπάνω τεχνικές το σύνηθες δείγµα είναι DNA που έχει αποµονωθεί από το αίµα

και τα παράγωγά του. Στη συγκεκριµένη µέθοδο χρησιµοποιείται ιστός που έχει παρθεί

από βιοψία ή παρασκεύασµα µεταφασικών χρωµοσωµάτων. Στη συνέχεια, αφού γίνει η

αποµόνωση του DNA, ακολουθεί υβριδισµός µε τον κατάλληλο ιχνηθέτη και ανίχνευση.

Σα στόχος µπορεί να χρησιµοποιηθεί και το RNA αλλά αυτό προϋποθέτει µια

διαφορετική διαδικασία. Έτσι, αυτή η µέθοδος µας δίνει πληροφορίες τόσο για την

ύπαρξη όσο για τη θέση της επιθυµητής αλληλουχίας στο δείγµα. Παράλληλα µε τη

13

κατάλληλη ζώνωση των χρωµοσωµάτων, µπορεί να ανιχνευθούν οι θέσεις των γονιδίων

σε αυτά. Επίσης είναι δυνατή η ανίχνευση m RNA ή άλλων παθογόνων παραγόντων στα

κύτταρα.

3.1 Μέθοδος FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization).

Η µέθοδος FISH παραλλαγή της

κλασσικής in situ υβριδοποίησης. Η

µόνη διαφορά είναι ότι περιλαµβάνει

την υβριδοποίηση χρωµοσωµάτων µε

ανιχνευτή που έχει σηµανθεί µε

φθορίζουσα ουσία και την έπειτα

µικροσκόπιση του παρασκευάσµατος µε

το κατάλληλο µικροσκόπιο φθορισµού

14

4. Sequencing.

Sequencing είναι η µέθοδος µε την οποία προσδιορίζεται η ακριβή θέση νουκλεοτιδίων

σε ένα µόριο DNA. Σήµερα αποτελεί µια αυτοµατοποιηµένη και γρήγορη τεχνική όπου

µπορούν να διαβασθεί µε λεπτοµέρεια η σειρά των βάσεων (A, T, G, C) σε έναν κλώνο

DNA.

15

4.1 Μέθοδος Sanger.

Γνωστή και ως µέθοδος τερµατισµού µε

διδεοξυριβονουκλεοτίδια. Αποτελούν

δεοξυριβονουκλεοτίδια, από τα οποία

έχει αφαιρεθεί η 3’ υδροξυλοµάδα της

δεοξυριβόζης έτσι ώστε όταν

ενσωµατωθούν σε µια αλυσίδα DNA δεν

είναι δυνατή η περαιτέρω αποµάκρυνσή

τους. Στη συνέχεια πραγµατοποιούνται

µια σειρά από αντιδράσεις όπου

καθιστούν δυνατή την ανάγνωση της

νουκλεοτιδικής αλυσίδας. Τα

αντιδραστήρια είναι τέσσερα και σε

κάθε ένα πρέπει να υπάρχουν

επισηµασµένοι primers,

συµπληρωµατικοί στην αλληλουχία του

ενός άκρου του µορίου DNA,

τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια,

DNA πολυµεράση καθώς και ένα από τα

τέσσερα διδεοξυριβονουκλεοτίδια.

4.1.1 Εφαρµογές στην κλινική

Ανοσολογία.

Με τη συγκεκριµένη µέθοδο οι

επιστήµονες κατάφεραν να

αποκρυπτογραφήσουν οποιαδήποτε

γενετική πληροφορία ανεξαιρέτου τη

βιολογική τους προέλευση. Βέβαια το

δείγµα θα πρέπει να προέρχεται είτε από

κάποιο βακτηριακό κλώνο είτε από

κάποια PCR.

4.2 Νext Generation Sequencing (NGS).

Μια ταχύτερη και ακριβέστερη µέθοδος συγκριτικά µε την Sanger. Παράλληλα τεθήκε

ζήτηµα για το υψηλό κόστος της συγκεκριµένης µεθόδου καθώς αποτελούσε πολυτέλεια

λίγων εργαστηριακών µονάδων καθώς και για το µέγεθος του DNA

16

4.2.1 Ion Semiconductor Sequencing.

Αποτελεί µια µέθοδο που βασίζεται στην

ανίχνευση ιόντων υδρογόνου που

απελευθερώνονται κατά τον

πολυµερισµό του DNA. Έτσι διαβάζει

το DNA την ώρα που συνθέτεται. Σε

µια πλάκα όπου υπάρχει το προς

ανάλυση DNA εκχυλίζεται ένας

µοναδικός τύπος νουκλεοτιδίου. Αν το

εισαγόµενο νουκλεοτίδιο είναι

συµπληρωµατικό προς το πρώτο

νουκλεοτίδιο, ενσωµατώνεται στον

αυξανόµενο συµπληρωµατικό κλώνο.

Αυτό προκαλεί την απελευθέρωση

ιόντων υδρογόνου, ο οποίος πυροδοτεί

έναν εξαιρετικά ευάισθητο αισθητήρα

που ο οποίος στη συνέχεια υποδεικνύει

ότι έγινε η αντιδραση. Θεωρείται µια

γρηγορή και σχετικά οικονοµική

µέθοδος, η οποία µπορεί να αξιοποιηθεί

από πολλά εργαστήρια, αλλα συγκριτικά

µε τις παλαιότερες τεχνικές sequencing

δε προσφέρει κάτι παραπάνω στην

Κλινική Ανοσολογία.

4.2.2 Partial Genome Sequencing.

Πρόκειται για µια µέθοδο που

χρησιµοποιείται αρκετά συχνά για

επιδηµιολογικές έρευνες. Αποτελεί µια

τεχνική sequencing της οποίας η

ακρίβεια αυξάνεται µε όταν αυξάνεται

και το µέγεθος του γονιδιώµατος που

πρέπει να διαβάσει. Ερευνά τις

φυλογενετικές σχέσεις µεταξύ των

µικροοργανισµών.

4.2.3 Pyrosequencing.

Η τεχνική συνίσταται στην προσθήκη

ενός νουκλεοτιδίου παρουσία DNA

πολυµεράσης και των κατάλληλων

διαλυµάτων στο υπό ανάγνωση τµήµα

DNA, στο οποίο έχει συνδεθεί

εκκινητής. Αν το νουκλεοτίδιο

ενσωµατωθεί, εκπέµπεται φθορισµός

από την διάσπαση του πυροφωσφορικού

που ανιχνεύεται. Έχει σηµαντικό

πλεονέκτηµα της αυτοµατοποίησης και

της παράλληλης επεξεργασίας σε

µεγαλύτερο βαθµό.

5. Hybridization. Μια τεχνική µε την οποία είναι δυνατόν να αναγνωριστούν µόρια νουκλεϊκών οξέων µε

συγκεκριµένη αλληλουχία βάσεων που περιέχονται σε ένα µείγµα ετερογενών µορίων το

οποίο αποκαλείται DNA ή RNA στόχος. Αυτό γίνεται χρησιµοποιώντας µόρια

νουκλεϊκών οξέων που φέρουν την επιθυµητή ακολουθία βάσεων και καλούνται

ιχνηθέτες. Αφού πραγµατοποιήθέι επισήµανση του ιχνηθέτη, ακολουθεί αποδιάταξη των

νουκλεϊκών οξέων του δείγµατος και του ιχνηθέτη. Στη συνέχεια το δίαλυµα µε τον

17

ιχνηθέτη αναµειγνύεται µε το δείγµα και επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες έτσι ώστε

να πραγµατοποιηθεί υβριδοποίηση. Τέλος, ανιχνέυονται τα υβριδικά µόρια –αν

υπάρχουν- και εξετάζονται. Οι διασηµότερες εφαρµογές τούτης της τεχνικής είναι µέσω

του Dot Blot, Southern Blot, Nothern Blot και Ιn Situ Hybridization –κάτι που

αναλύθηκε και παραπάνω. Πλέον, δε χρησιµοποιούνται σε µεγάλο βαθµό τούτες οι

τεχνικές καθώς έχουν αντικατασταθεί µε την εφαρµογή της PCR, βέβαια σε ορισµένες

περιπτώσεις θεωρούνται αναντικατάστατες. Το κύριο µειωνέκτηµά τους είναι ο σχετικά

µεγάλος χρόνος για τη διεξαγωγή τους καθώς και το µεγάλο κόστος που απαιτούν.

5.1 Dot Blot.

H επιθυµητή αλληλουία DNA

αποδιατάσσεται και προσδένεται σε ένα

ειδικό φίλτρο. Στη συνέχεια ακολουθεί

υβριδοποίηση µε τον επισηµασµένο

ιχνηθέτη. Με πλύσιµο του φίλτρου,

αποµακρύνεται η περίσσεια του

ιχνηθέτη. Ακολουθεί ανίχνευση για να

διαπιστωθεί αν έχει συνδεθεί ο

ιχνηθέτης µε κάποια συµπληρωµατική

ακολουθία του δείγµατος. Να σηµειωθεί

στο σηµείο αυτό ότι σε τέτοιου είδους

πειράµατα είναι αναγκαία η ύπαρξη ένός

θετικού και ενός αρνητικού µάρτυρα. Ο

πρώτος αποτελείται από ένα δείγµα που

είναι συµπληρωµατικό προς την

αλληλουχία του ιχνηθέτη. Ο αρνητικός

µάρτυρας συνήθως είναι µια κενή θέση,

αλλά προτιµότερο είναι να περιέχει µη

συµπληρωµατικό προς τον ιχνηθέτη

DNA. Θεωρείται η απλούστερη

προσέγγιση του υβριδισµού.

5.1.1 Εφαρµογές στην Κλινική

Ανοσολογία.

Η µέθοδος τούτη χρησιµοποιείται για τη

διάγνωση παθογόνων παραγόντων.

Αποµονώνεται δείγµα από τον ασθενή

και στη συνέχεια ακολουθεί dot blot µε

ιχνηθέτη κάποιο τµήµα γενετικού υλικού

του παθογόνου παράγοντα που προκαλεί

την ίδια συµπτωµατολογία αυτή που

φέρει ο ασθενής.

5.2 Ανάστροφη Υβριδοποίηση

Η συνιθέστερη µέθοδος υβριδοποίησης τα τελευταία χρόνια. Στη προκείµενη περίπτωση,

µη επισηµασµένοι ιχνηθέτες προσκωλλόνται στη µεµβράνη, ενώ επισηµαίνεται το προς

εξέταση νουκλεϊκό οξύ. Στη συνέχεια, µετά την υβριδοποίηση, διαπιστώνεται αν το

DNA στόχος φέρει κάποια ακολουθία βάσεων που είναι συµπληρωµατική µε κάποιον

από τους ιχνηθέτες. Με τούτο τον τρόπο, µε ένα πείραµα ελέγχεται η παρουσία πολλών

ακολουθιών βάσεων στο δείγµα, ενώ µε τις προσεγγίσεις που θα αναλυθούν σε τούτο το

18

κεφάλαιο θα χρειάζονταν περισσότερα του ενός πειραµάτων. Η ανάστροφη

υβριδοποίηση χρησιµοποιεί την ίδια αρχή µε τις µικροσυστοιχίες (microarrays).

5.3 Southern Blot.

Το DNA του ασθενούς

ηλεκτροφορείται, αποδιατάσσεται σε

αλκαλικό διάλυµα και στη συνέχεια

µεταφέρεται σε φίλτρο χρησιµοποιώντας

τη ροή ρυθµιστικού διαλύµατος. Το

ρυθµιστικό διάλυµα κινείται ανοδικά

λόγω των τριχοειδών φαινοµένων. Το

αποτέλεσµα τούτης της αντίδρασης είναι

ο σχηµατισµός ενός κατοπτρικού

αντιγράφου της ηλεκτροφόρησης στο

φίλτρο. Ακολουθεί ο υβριδισµός και η

ανίχνευση, όπως και στο dot blot. Με τη

19

προκείµενη µέθοδο εκτός από τη

συµπληρωµατικότητα του δείγµατος µε

τον ιχνηθέτη, εκτιµάται και το µέγεθος

του µορίου DNA που είναι

συµπληρωµατικό µε τον ιχνηθέτη. Η

εκτίµηση του µεγέθους

πραγµατοποιείται µε σύγκριση µε ένα

µάρτυρα, γνωστού µοριακού βάρους.

Στη πράξη όµως, όταν πρόκειται για

µόρια DNA µεγάλου µεγέθους,

προηγείται πέψη από περιοριστική

ενδονουκλεάση για να διαχωριστούν

στην ηλεκτροφόρηση.

5.4 Northern Blot.

Αποτελεί µια παρόµοια τεχνική µε το

Southern Blot µε την κύρια διαφορά ότι

το νουκλεϊκό οξύ στόχος που

προσδένεται στο φίλτρο είναι RNA. Με

το Northern Blot, µπορεί να µελετηθεί η

έκφραση κάποιου γονιδίου σε

διαφορετικούς ιστούς. Αφού

αποµονωθεί το m RNA από τον κάθε

ιστό, ηλεκτροφορείται –για τον κάθε

ιστό ξεχωριστά- και ακολουθεί

20

υβριδοποίηση µε τον ιχνηθέτη και το

προς εξέταση γονίδιο. Μπορεί να

διαπιστωθεί ο βαθµός έκφρασης αλλά

και το µέγεθος των µορίων m RNA, που

παράγονται. Αυτό συµβαίνει διότι κάθε

µόριο m RNA κωδικοποιεί µια µόνο

πρωτεϊνη. ∆εν υπάρχουν γνωστές

περιπτώσεις, παραγωγής περισσότερων

από τη µία πολυπεπτιδική αλυσίδα από

ένα µόνο µόριο m RNA. Βεβαίως, η

ρύθµιση του κάθε γονιδίου γίνεται

ξεχωριστά, καθώς το κάθε ένα φέρει τον

δικό του υποκινητή.

6. c DNA.

6.1 Αρχή της c DNA βιβλιοθήκης.

Για την κατασκευή µιας c DNA

βιβλιοθήκης, απαιτείται η αποµόνωση

ώριµου m RNA από τα κύτταρα. η

αποµόνωση ώριµου m RNA

πραγµατοποιείται µε αποµόνωση ολικού

RNA. Από το ολικό RNA

αποµονώνονται τα µόρια m RNA,

δεσµευόµενα µε στήλη µε

21

ολιγονουκλεοτίδια δεοξυθυµίνης (oligo-

dT). Μετά τη σύνθεση

συµπληρωµατικών αλυσίδων DNA

(complementary DNA), µε το ένζυµο

αντρίστροφη µεταγραφάση και τον

τελικό σχηµατισµό δίκλωνων µορίων

DNA, αυτά ενσωµατώνονται στον

κατάλληλο φορέα κλωνοποίησης. Μετά

τον µετασχηµατισµό και τον

πολλαπλασιασµό των κυττάρων

σχηµατίζονται κλώνοι, το άνθροισµα

των οποίον συγκροτεί την c DNA

βιβλιοθήκη. Να σηµειωθεί στο σηµείο

αυτό ότι για την κατασκεύη µιας c DNA

βιβλιοθήκης, µπορεί να χρησιµοποιηθεί

οποιοδήποτε κύτταρο-ξενιστής ως

φορέας κλωνοποίησης. Τα συνιθέστερα

είναι τα πλασµίδια, λόγω του ότι τα

µόρια c DNA έχουν κατά κανόνα µικρό

µέγεθος και η κλωνοπίησή τους είναι

απλούστερη στα πλασµίδια. Στη

συνέχεια ανιχνεύεται ο επιθυµητός

κλώνος και κατόπιν πολλαπλασιάζεται

το βακτήριο-ξενιστής που φέρει τον

προκέιµενο κλώνο σε καλλιέργεια, ώστε

να παραχθεί η επιθυµητή ποσότητα του

προϊόντος. Τα µόρια c DNA που

κλωνοποιούνται συνιστούν ολόκληρα

γονίδια, στα οποία δε περιέχονται

εσώνια. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα τη

δυνατότητα παραγωγής της επιθυµητής-

κωδικοποιούσας πρωτεϊνης στα

βακτήρια, καθώς τα βακτήρια δε φέρουν

µηχανισµούς ωρίµανσης. Αυτό βέβαια

δεν ισχύει αν το τελικό προϊόν δέχεται

τροποποιήσεις που δε µπορούν να

πραγµατοποιηθούν στα βακτήρια. Τα

κύτταρα που θα χρησιµοποιηθούν για

την αποµόνωση του m RNA θα πρέπει

να µεταγράφουν το επιθυµητό γονίδιο,

ενώ δεν είναι δυνατή η κλωνοποίηση

τµηµάτων του γενετικού υλικού που δε

µεταγράφονται.

6.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.

Πέρα από την παραγωγή ουσιών, η c

DNA βιβλιοθήκη, µπορεί να επιτελέσει

διαγνωστικούς σκοπούς συνδιαστικά µε

κάποια άλλη µέθοδο όπως τις

µικροσυστοιχίες (microarrays) ή την

αλυσηδωτή αντίδραση της

πολυµεράσης. Πάρα ταύτα, µέσω της

παραγωγής ουσιώνµπορεί να ανιχνεύση

22

τυχόν λανθασµένη έκφραση ενός

γονιδίου.

7. Μultiplex Ligation-Dependent Probe

Amplification

(MLPA)

7.1 Αρχή της MLPA Αποτελεί µια παραλλαγή της Multiplex

PCR- µέθοδος που αναλύθηκαε και

23

παραπάνω- η οποία επιτρέπει στους

ποικίλους στόχους να

πολλαπλασιάζονται από ένα µόνο ζεύγος

εκκινητών. Κάθε ιχνηθέτης, απαρτίζεται

από δύο ολιγονουκλεοτίδια. Ο ένας από

τους δύο ιχνηθέτες, διαθέται την

αλληλουχία που αναγνωρίζεται από τον

εκκινητή, ενώ ο άλλος την αλληλουχία

που αναγνωρίζεται από τον εκκινητή

στο αντίθετο άκρο. Μόνο όταν και οι

δύο ιχνηθέτες υβριδοποιηθούν µε την

αλληλουχία στόχο, µπορούν να δεθούν

σε έναν ολοκληρωµένο ιχνηθέτη. Το

πλεονέκτηµα του να διαχωριστεί ο

ιχνηθέτης σε δύο µονόκλωνα µέρη είναι

ότι µόνο τα νουκλεοτίδια που έχουν

υβριδοποιηθεί και όχι τα ασύνδετα

κοµµάτια θα πολλαπλασιαστούν. Σε

περίπτωση που δε διαχωριστεί ο

ιχνηθέτης, η αλληλουχία του εκκινητή

και στα δύο άκρα, θα πολλαπλασιάσει

τον ιχνηθέτη ανεξαιρέτως τον υβριδισµό

µε την επιθηµυτή αλληλουχία DNA,

έτσι το παραγόµενο προϊον δε θα είναι

όµοιο µε τις επιθυµητές θέσεις στόχους

στο δείγµα του ασθενούς.

Κάθε ολοκληρωµένος ιχνηθέτης, έχει

µοναδικό µέγεθος έτσι ώστε οι κλώνοι

να διαχωριστούν και να ταυτοποιηθούν

µε ηλεκτροφόρηση. Κάθε κλώνος,

εκπέµπει µια φθορίζουσα ουσία η οποία

µπορεί να διαβαστεί µε τον κατάλληλο

sequencer.

Τα τελευταία χρόνια και κυρίως στον κλάδο της Κλινικής Ανοσολογίας, είναι συχνή η

MLPA εξωνίων αλλά πραγµατοποιείται κατά κύριο λόγο συνδιαστικά µε την αλυσιδωτή

αντίδραση πολυµεράσης.

ΜLPA ανάλυση της µυασθενείας Duchenne (DMD)

7.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.

Η συγκεκριµένη µέθοδος έχει πολλές

εφαρµογές στον χώρο της Κλινικής

Ανοσολογίας. 9. [ Schouten JP,

McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg

D, Diepvens F, Pals G (2002). ]Ο κύριος

της ρόλος είναι η ανίχνευση τυχόν

διαγραφών, διπλασιασµού και

µετατόπιση χρωµοσωµικών τµηµάτων,

σε γενετικές παθήσεις καθώς και

δίαφορους πολυµορφισµούς.

24

25

26

8. Γονιδιωµατική Βιβλιοθήκη.

Η γονιδιωµατική βιβλιοθήκη οργανισµού είναι ένα σύνολο βακτηριακών κλώνων που

περιέχουν τµήµατα του γενετικού υλικού ενός οργανισµού, στη µορφή

ανασυνδιασµένου DNA. Στο σύνολό του όλα τα τµήµατα γενετικού υλικού

αποτελούν το γονιδίωµα του οργανισµού.

8.1 Αρχή της γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης.

Σκοπός της παρασκευής µιας

γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης είναι η

εύρεση ενός συγκεκριµένου

βακτηριακού κλώνου που περιέχει

ένα τµήµα DNA που ενδιαφέρει,

ώστε να παραχθεί το DNA σε

µεγάλη ποσότητα ή να παραχθεί η

πρωτεϊνη που πιθανά κωδικοποιεί το

τµήµα DNA σε µεγάλη ποσότητα.

Για την Παρασκευή γονιδιωµατικής

βιβλιοθήκης αποµονώνεται DNA

από τον οργανισµό και πέψη µε µια

περιοριστική ενδονουκλεάση. Τα

τµήµατα που προκύπτουν

σχηµατίζουν ανασυνδιασµένο DNA

µε κατάλληλο φορέα κλωνοποιήσης

και εισάγονται σε βακτήρια. Ο

πολλαπλασιασµός των βακτηρίων

δηµιουργεί κλώνους. Το σύνολο

αυτώ των βακτηριακών κλώνων

αποτελούν τη γονιδιωµατική

βιβλιοθήκη. Στη θεωρία κάθε τµήµα

του γονιδιώµατος υπάρχει σε ένα

τουλάχιστον βακτηριακό κλώνο

στην µορφή ανασυνδιασµένου

πλασµιδίου. Αυτό δεν ισχύει στην

πράξη, καθώς πολλά τµήµατα του

γονιδιώµατος είναι αρκετά µεγάλα

σε µέγεθος, ώστε δεν είναι δυνατή η

εισαγωγή τους σε κάποιο βακτήριο.

Όταν χρησιµοποιείται σαν φορέας

κλωνοποίησης ένα πλασµίδιο τότε το

µέσο µέγεθος των τµηµάτων DNA

του γονιδιώµατος που φέρει ο κάθε

κλώνος είναι περίπου 5.000-10.000

ζεύγη βάσεων.

27

8.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.

Η χρησιµότητα µιας γονιδιωµατικής

βιβλιοθήκης έγκειται στην εύρεση

ενός συγκεκριµένου κλώνου

βακτηρίων, που περιέχει ένα τµήµα

DNA του οργανισµού, το οποίο είναι

επιθυµητό να µελετηθεί ή να

χρησιµοποιηθεί µε κάποιο άλλο

τρόπο.

Για να βρεθεί ο επιθυµητός κλώνος

χρησιµοποιούνται κατ’αρχήν

στέρεες καλλιέργειες, αφού στις

υγρές είναι αδύνατος ο εντοπισµός

συγκεκριµένου βακτηρίου. Τα

βακτήρια απλώνονται στην

επιφάνεια του στερεού θρεπτικού

υλικού και αφού σχηµατίσουν

αποικίες, κάθε αποικία εξετάζεται

για την ύπαρξη του επιθυµητού

τµήµατος DNA.

Ο τρόπος µε τον οποίο θα

αναζητηθεί η προς εξέτασην αποικία

ποικίλει και εξαρτάται από τις

πληροφορίες που είναι γνωστές για

το συγκεκριµένο τµήµα DNA, ή το

προϊόν που κωδικοποιεί, καθώς και

από τις γνώσεις του ερευνητή και τις

τεχνικές δυνατότητες του

εργαστηρίου. Η συνιθέστερη

µέθοδος είναι η υβριδοποίηση µε

επισηµασµένο ιχνηθέτη. Η διακασία

αποµόνωσης του πλασµιδιακού

DNA σε γενικές γραµµές µοιάζει µε

τη µέθοδο αποµόνωσης DNA από

κύτταρα. Καθώς τα πλασµίδια έχουν

σχετικά µικρό µέγεθος και είναι

υπερελικωµένα ακολουθούνται

κάποιες ιδιαίτερες διαδικασίες που

εκµεταλλεύονται αυτά τα

χαρακτηριστικά, ώστε να επιτευχθεί

ο διαχωρισµός από το γονιδίωµα των

βακτηρίων.

Για την παραγωγή πρωτεϊνης που

µπορεί να κωδικοποιείται από το

κλωνοποιηµένο τµήµα DNA, θα

πρέπει στο πλασµίδιο που θα

χρησιµοποιηθεί σαν φορέας

κλωνοποίησης να υπάρχει κάποιος

υποκινητής πριν τη θέση που κόβει η

περιοριστική ενδονουκλεάση. Αυτό

οδηγεί στην µεταγραφή και

µετάφραση του γονιδίου, µε

συνεπακόλουθη παραγωγή

πρωτεϊνης.

28

8.3 Γιατί δε χρησιµοποιείται τόσο συχνα;

Κατα την κλωνοποίηση γονιδίων σε

γονιδιωµατική βιβλιοθήκη, µπορεί

να παρουσιαστούν αρκετά

προβλήµατα. Το πρόβληµα του

µεγάλου µεγέθους των

ευκαρυωτικων γονιδίων λύνεται

µερικώς µε την χρησιµοποίηση

βακτηριοφάγων λ, αλλά υπάρχουν

γονίδια που φτάνουν σε µέγεθος και

τα 10.000 ζεύγη βάσεων.

Αλλό πιθανό πρόβληµα, αποτελεί η

χρησιµοποίηση των περιοριστικών

ενδονουκλεάσων που µπορεί να

κόβουν σε πολλά τµήµατα το

επιθυµητό γονίδιο, ώστε τα τµήµατα

που το αποτελούν να βρίσκονται σε

περισσότερους από έναν κλώνο. Αν

ο σκοπός είναι αποκλειστικά η

µελέτη του γονιδίου, τότε αυτό

µπορεί να µην συνιστά πρόβληµα ,

αλλά σε τέτοιες περιπτώσεις είναι

αδύνατη η παραγωγή της πρωτεϊνης

που κωδικοποιεί. Συνήθως,

χρησιµοποιείται διαφορετική

περιοριστική ενδονουκλεάση, για

την έψη του γονιδιώµατος.

∆υστυχώς στην γονιδιωµατική

βιβλιοθήκη είναι πολύ µεγάλος ο

αριθµός των κλώνων που πρέπει να

ερευνηθούν ώστε να βρεθεί ο

επιθυµητός.

Το κυριότερο µειονέκτηµα της

συγκεκριµένης τεχνικής είναι το

υψηλό κόστος.

29

9. Μοριακές διαγνωστικές και Βιοπληροφορική.

Όλες οι παραπάνω τεχνικές δε θα

οδηγούσαν σε κάποιο λογικό

αποτέλεσµα αν δεν υπήρχαν τα ειδικά

προγράµµατα στα οποία έχει καταγραφεί

και ταξινοµηθει ο τεράστιος αριθµός

παραλλαγών που εµφανίζονται στην

αλληλουχία του γονιδιώµατός µας. Το

διεθνές πρόγραµµα HapMap και η

εταιρεία Perlegen Sciences έχουν

εντοπίσει και ταξινοµήσει περίπου δέκα

εκατοµµύρια ανθρώπινους SNP σε

τέσσερις διαφορετικούς πληθυσµού.

Πολλοί από αυτούς τους

πολυµορφισµούς θεωρείται ότι

συσχετίζονται µε κοινά πολυγονιδιακά

γνωρίσµατα µεταξύ των οποίο και οι

ασθένειες. Θα ήτο αδιανόητο και

πρακτικά αδύνατο να εξεταστεί κάθε

SNP για την πιθανή συσχέτισή του µε

µια ασθένεια. Για το λόγο αυτό, οι

σχετικές µελέτες γίνονται σε επίπεδο

απλότυπων – µια οµάδα αλληλόµορφων

που ανήκουν στο ίδιο χρωµόσωµα. Oι

SNP, που βρίσκονται ο ένας δίπλα στον

άλλο σε ένα χρωµόσωµα, εφόσον δεν

απέχουν πολύ µεταξύ τους, τείνουν να

µην αναδιατάσσονται από τους

διασκελισµούς που λαµβάνουν χώρα

στη µείωση και έτσι να κληρονοµούνται

µαζί.

Οι ερευνητές στο HapMap αναζητούν

στο γονιδίωµα περιοχές µε ανισορροπία

σύνδεσης ( linkage disequilibrium)

δηλαδή συγκεκριµένους συνδιασµούς

αλληλόµορφων η γειτωνικών

πολυµορφικών δείκτες που τείνουν να

συναντώνται µαζί. Στην περίπτωση

παθολογικών αλληλόµορφων η

ανισορροπία σύνδεσης θεωρείται ότι

οφείλεται στο γεγονός πως η

πλειονότητα των ατόµων ενός

πληθυσµού που εµφανίζουν κάποια

ασθένεια προέρχεται από ένα

συγκεκριµένο «πρόγονο-ιδρυτή». Η

κατάσταση αυτή αναφέρεται ως

φαινόµενο του ιδρυτή. Ο ασθενής έχει

κληρονοµήσει το χρωµόσωµα του

προγόνου-ιδρυτή, το οποίο φέρει το

αλληλόµορφο που προκαλεί την

ασθένεια ή προδιαθέτει γι’αυτή. Οι

διασκελισµοί που συνέβησαν στο

γονιδίωµα, µε την πάροδο των γενεών,

δεν ανασυνδύασαν το αλληλόµορφο

αυτό µε τα αλληλόµορφα των

γειτονικών γενετικών τόπων. Κατά

συνέπεια ο απλότυπος του προγόνου-

ιδρυτή στην περιοχή που σχετίζεται µε

την ασθένεια είναι πιο συχνός στους

ασθενείς είναι πιο συχνός στους

ασθενείς από το αναµενόµενο.

30

10. Oι SNP ως διαγνωστικό εργαλείο.

Αφού εντοπιστεί και χαρακτηριστεί το

γονίδιο που ευθύνεται για µια

κληρονοµούµενη διαταραχή ή

προδιαθέτει γι’αυτή, είναι δυνατή η

ανάπτυξη µοριακών τέστ για τη

διάγνωσή της (ή για τη διάγνωση της

προδιάθεσης προς αυτή). Το 1992,

µπορούσαν να διαγνώσουν πάνω από

200 διαταραχές µε την χρήση µεθόδων

που βασίζονται στην ανάλυση του DNA.

Σήµερα, υπάρχουν µοριακά τέστ που

βασίζονται σε πολλές διαφορετικές

τεχνικές για τεχνική που θα επιλεγεί

διάγνωση περισσότερων από 2.000

γενετικών διαταραχών. Η τεχνική που

θα επιλεγεί κάθε φορά εξαρτάται από τα

χαρακτηριστικά της ασθένειας: τον

αριθµό και τον τύπο των µεταλλαγών

που εµπλέκονται, τη συχνότητα τους

στην έθνική οµάδα στην οποία ανήκει ο

ασθενής και τις επιπτώσεις τους στην

πρωτεϊνη που κωδικοποιεί το γονίδιο.

Όµως οι αναλύσεις αυτές είναι

χρονοβόρες και δαπανηρές. Για να

µπορέσουν να αξιοποιήσουν τις

πληροφορίες που τους παρέχει το

Πρόγραµµα του Ανθρώπινου

Γονιδιώµατος, οι ερευνητές χρειάστηκαν

νέες µεθόδους που θα τους επέτρεπαν να

εντοπίζουν µαζικά και γρήγορα τις

παθολογικές µεταλλαγές. Αναπτύχθηκαν

λοιπόν τρείς τεχνικές που µπορεί να

αποδειχθούν πολύτιµα διαγνωστικά

εργαλεία: η ανίχνευση αταίριαστων

ζευγών βάσεων σε µικροσυστοιχίες, η

επέκταση κατά µια βάση και η

αλληλοµορφο- ειδική επέκταση

εκκινητή.

Η ανίχνευση αταίριαστων ζευγών

βάσεων σε µικροσυστοιχίες µπορεί να

χρησιµοποιηθεί για την ταυτόχρονη

γονοτυπική ανάλυση µέχρι και 100.000

µεταλλαγών. Η µέθοδος όµως αυτή δεν

µπορεί να ανιχνεύσει όλες τις

µεταλλαγές διότι βασίζεται στην

απευθείας, υβριδοποίηση του

γονιδιωµατικού DNA του ασθενούς στα

ολιγονουκλεοτίδια µιας

µικροσυστοιχίας. Κατά την

υβριδοποίηση, η σταθερότητα της

πρόσδεσης του DNA του ασθενούς στα

ολιγονουκλεοτίδια της συστοιχίας

εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την

αλληλουχία που περιβάλλει την

πολυµορφική θέση. Σε ορισµένες

περιπτώσεις, η αλληλουχία γύρω από

την πολυµορφική θέση είναι τέτοια ώστε

να καθιστάται αδύνατη η γονοτύπηση

του SNP µε τη µέθοδο αυτή, γεγονός

που αποτελεί σοβαρό µειονέκτηµα.

31

References: 1. [Μethods in Molecular Biology Volume 226. PCR protocols Second Edition.

(2003).John M.S Bartlett and David Stirling (Editors) Humana Press Inc. Totowa,

NJ.]

2. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Detection of 98% of DMD/BMD

gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet. 1990;86:45–8.

[PubMed] ]

3. [Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Eastern Virginia

Medical School, Norfolk, VA 23507, USA. krishnnk@evms.edu-].

4. [Stordeur P - Monitoring the immune response using real-time PCR [PubMed] ].

5. [Bacher U, Schnittger S, Haferlach C, Haferlach T, Molecular diagnostics in acute

leukemias, [PubMed] ] .

6. [Patrick Stordeur, Lionel F Poulin, Ligia Craciun, Ling Zhou, Liliane Schandené,

Aurore de Lavareille, Stanislas Goriely, Michel Goldman - “Cytokine mRNA

quantification by real-time PCR” [J. Immunol. Methods 259 (2002) 55–64].

7. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Detection of 98% of

DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet.

1990;86:45–8. [PubMed] ]

8. [Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao.- Application of DNA microarray technology in

immunological research and its inspiration to researches on raditional Chinese

medicine, [PubMed]]

9. [ Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G

(2002). "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex

ligation-dependent probe amplification".]

10. [Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J- MLPA analysis for the

detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin

gene: potential and pitfalls.]

11. [James D. Watson, Amy A. Caudy, Richard M. Myers, Jan A. Witkowski,

“Ανασυνδιασµένο DNA, Γονίδια και γονιδιώµατα- µια συνοπτική παρουσίαση,

3η έκδοση”.]

32

12. [James D. Watson, Tania A. Baker, Stephen P. Bell, Alexander Gann, Michael

Levine and Richard Losick. Molecular Biology of the Gene. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, ISBN 0-321-22368-3.]

13. .[Arthur M. Lesk, Introduction to Bioinformatics (2002). Oxford University Press

Inc., New York, ISBN (Pbk)0 19 925196 7]

14. [ Kenneth M. Weiss and Anne V. Buchanan. Genetics and the logic of evolution.

John Wiley & Sons Inc (2004), Hoboken, New Jersey. ISBN 0-471-23805-8.]

15. [Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease

emergencies. Krishna NK, Cunnion KM, Department of Microbiology and

Molecular Cell Biology, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, VA 23507,

USA. krishnnk@evms.edu]

16. ["The Pace and Proliferation of Biological Technologies" Robert Carlson.

Biosecurity and Bioterrorism: Biodefense Strategy, Practice, and Science.

September 2003, 1(3): 203-214. doi:10.1089/153871303769201851]

17. [Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain

Reaction". PCR Protocols 226. pp. 3–6]

18. [Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N.

(1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and

restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230]

19. [Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.;

Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase". Science 239]

20. [Cheng, S.; Fockler, C.; Barnes, W. M.; Higuchi, R. (1994). "Effective

Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA"

Proceedings of the National Academy of Sciences 91]

33

21. [ R.L Nussbaum, R.R McInnes, H.F Willard, Ιατρική Γενετική, Thompson &

Thompson.]

22. [Aναστάσιος Ε. Γερµένης, Ιατρική Ανοσολογία, Εκδόσεις Παπαζήση]

23. [E. Zietkiewicz, A. Rafalski, and D. Labuda (1994). "Genome fingerprinting by

simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification".

Genomics 20]

24. [Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988). "Genetic Applications of an Inverse

Polymerase Chain Reaction" Genetics 120]

34