λυρατζοπουλος τεχνικές - ορμόνες - αντισώματα - μελέτη...

Λυρατζόπουλος Εμμανουήλ Βιολόγος 1

ΕΡΓΑΣΙΑ 3η

Θέμα 1

Α. Να γίνει αντιστοίχιση.

α. Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός 1. Διμερή εκκινητών

β. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο 2. Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών

γ. Νεφελομετρία 3. Taqman

δ. IRMA 4. Σκέδαση φωτός

ε. ELISA 5. Tm

Β. Να αναλυθούν οι έννοιες ώστε να αιτιολογούνται οι παραπάνω αντιστοιχίσεις.

Α. Αντιστοιχίσεις

α → 2

β → 1, 3, 5

γ → 2, 4

δ → 2

ε → 2, 4


Β. Ανάλυση τεχνικών

Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός

Φθορισμός (fluorescence):

Αποδιέγερση μορίου (σπανιότερα ιόντος) με εκπομπή φωτονίου 10−8 έως 10−4 s μετά την

απορρόφηση ενός άλλου φωτονίου, ως αποτέλεσμα μετάπτωσης μεταξύ καταστάσεων της ίδιας

πολλαπλότητας spin (η διάρκεια του φθορισμού κυμαίνεται συνήθως από 1-10 nsec).

Τα μήκη κύματος της ακτινοβολίας που εκπέμπεται από μια φθορίζουσα ουσία είναι πάντοτε

μεγαλύτερα από τα μήκη κύματος της διεγείρουσας ακτινοβολίας.

Χρονικά διαχωριζόμενος φθορισμός (time resolved fluorescence TRF):

Τεχνική βασιζόμενη στο ότι ορισμένες ουσίες, κυρίως σύμπλοκα λανθανιδών, διατηρούν τον

φθορισμό τους για χρονικό διάστημα πολύ μεγαλύτερο των 100 μs μετά τη διέγερση, γεγονός που

επιτρέπει τον ευαίσθητο προσδιορισμό τους παρουσία άλλων φθοριζουσών ουσιών, των οποίων η

διάρκεια φθορισμού είναι κατά πολύ συντομότερη.

Το φαινόμενο αξιοποιείται σε ανοσοπροσδιορισμούς μεγάλης ευαισθησίας.

Η τεχνική δίνει περισσότερες πληροφορίες για το μοριακό περιβάλλον της φθορίζουσας ουσίας σε

σχέση με άλλες τεχνικές φθορισμού.

Το όργανο μέτρησης του χρονικά διαχωριζόμενου φθορισμού είναι το ίδιο με τα άλλα

φθορισμόμετρα. Μια ακτίνα διέγερσης με στενό μήκος κύματος κατευθύνεται στο δείγμα και

προκαλεί τη διέγερση του. Η εκπομπή φθορισμού του δείγματος συλλέγεται σε γωνία 90º σε σχέση

με τη διέγερση, για να αποτρέπεται η παρεμβολή της ακτινοβολίας διέγερσης με την ανίχνευση

ασθενούς φθορισμού εκπομπής.

Ο φθορισμός που εκπέμπεται από το δείγμα αναλύεται σε ένα φασματογράφο.

Η βασική διαφορά στη φασματοσκοπία χρονικού διαχωρισμού είναι η αντικατάσταση της συνεχούς

ακτινοβολίας με παλμική και στην ανίχνευση του εκπεμπόμενου φθορισμού. (Εικόνα 1)

[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]


Εικόνα 1: Σχηματική παρουσίαση φθορισμόμετρου. Η διέγερση προκαλείται με παλμική

ακτινοβολία στα 532 nm και ο φθορισμός ανιχνεύεται στις 90 μοίρες.

MASSACHUSETTS INSTITUTE of TECHNOLOGY Department of Chemistry.

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο

Η τεχνική του PCR (Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), επινοήθηκε

από τον Kary Mullis στα μέσα της δεκαετίας του 1980 και έφερε επανάσταση στη μοριακή γενετική.

Στη PCR χρησιμοποιείται μια DNA πολυμεράση για τη σύνθεση μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας

συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο εκκινητές (primers).

Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως καλούπι για τη σύνθεση του

συμπληρωματικού κλώνου. Η αποδιάταξη του DNA (βήμα 1) επιτυγχάνεται με την υψηλή

θερμοκρασία στους 94οC. Η DNA πολυμεράση απαιτεί ένα πρωταρχικό τμήμα το οποίο μπορεί και

επιμηκύνει, γιαυτό προστίθενται δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές σε θερμοκρασίες 30ο-65οC

(βήμα 2). Οι εκκινητές επιλέγονται έτσι ώστε να υβριδοποιούν εκατέρωθεν την αλληλουχία στόχο.

Στη συνέχεια η DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές σε θερμοκρασίες 65ο-75οC (βήμα 3).

Η DNA πολυμεράση προέρχεται από το βακτήριο Thermus aquaticus το οποίο ζει σε θερμοκρασία

75οC, η βέλτιστη θερμοκρασία είναι οι 72οC, ενώ είναι σταθερή και στους 94οC.

[9, 10] (εικόνες 2, 3, 4, 5)


Εικόνα 2: Ο κύκλος της PCR. Το δείγμα αποδιατάσσεται αρχικά και το μείγμα της αντίδρασης

διέρχεται από επανειλημμένους κύκλους υβριδοποίησης εκκινητών, σύνθεσης DNA και

αποδιάταξης. Σε κάθε κύκλο PCR διπλασιάζεται η αλληλουχία στόχος.

Εικόνα 3: Αριθμός δίκλωνων μορίων στόχων. (στον 3Ο κύκλο θα έχουμε 2 επιθυμητά μόρια DNA)


Εικόνα 4: Λειτουργία PCR (παρουσιάζονται πέντε κύκλοι).


Εικόνα 5: Μηχανισμός PCR. [11]

Οι εκκινητές μήκους 18-24 νουκλεοτίδια παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση. Οι εκκινητές πρέπει να

έχουν παραπλήσιες Tm (melting temperature), ώστε να υβριδοποιούνται ικανοποιητικά και οι δύο

στην ίδια θερμοκρασία.

Tm: θερμοκρασία τήξης είναι αυτή στην οποία τα μισά μόρια του εκκινητή ζευγαρώνουν με την

αλληλουχία στόχο, ενώ τα άλλα μισά παραμένουν ελεύθερα. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες το

ποσοστό των μορίων του εκκινητή που υβριδοποιούνται μειώνεται και ενδέχεται να αποτύχει ο

πολλαπλασιασμός του επιθυμητού τμήματος. Σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ο εκκινητής συνδέεται

και σε μη επιθυμητές αλληλουχίες και πιθανόν να προκύψουν και παραπροϊόντα.


Σχεδίαση εκκινητών

Α) οι αλληλουχίες των εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους, ιδιαίτερα το

3΄άκρο δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικό με περισσότερες από 3-4 βάσεις σε οποιαδήποτε

περιοχή του άλλου εκκινητή (ή ακόμα και του ίδιου εκκινητή).

Β) Η GC-περιεκτικότητα πρέπει να είναι μεταξύ 40-60%.

Γ) Να αποφεύγονται οι επαναλήψεις νουκλεοτιδίων.

Δ) Η υπολογισμένη Tm και για τους δύο χρησιμοποιούμενους εκκινητές στην αντίδραση δεν πρέπει

να διαφέρει περισσότερο από 5°C, και η Tm από το προϊόν ενίσχυσης δεν πρέπει να διαφέρει από

τους primers περισσότερο από 10°C.

Ε) Θερμοκρασία επαναδιάταξης συνήθως είναι 5°C κάτω από την υπολογισμένη χαμηλότερη Tm.

Η κλασική PCR αποτελεί μια ευαίσθητη και γρήγορη μέθοδο πολλαπλασιασμού των νουκλεϊκών

οξέων, αλλά απαιτεί ηλεκτροφορητική ανάλυση μετά την αντίδραση και δεν είναι ποσοτική (εκτός

από την χρήση ανταγωνιστικής ή άλλης μεθόδου). [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]

Η PCR πραγματικού χρόνου (Real Time / Q PCR) βασίζεται στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση ενός

φθορίζοντος μορίου αναφοράς (ειδικού ή μη για συγκεκριμένη αλληλουχία) σε κάθε κύκλο της

αντίδρασης PCR. Δεν απαιτείται ανάλυση με ηλεκτροφόρηση.

Η πρώτη σημαντική αύξηση στην ποσότητα του προϊόντος της PCR σχετίζεται με την αρχική

ποσότητα της μήτρας (ποσοτικοποίηση).

Επιτρέπει την αδιάλειπτη παρακολούθηση των προϊόντων της PCR κατά την ενίσχυση μέσω

της μέτρησης του εκπεμπόμενου φθορισμού των προϊόντων σε κάθε κύκλο (σε πραγματικό

χρόνο).

Δεν απαιτείται καμία πειραματική διαδικασία μετά την αντίδραση. Τα προϊόντα του

πολλαπλασιασμού αναλύονται σε πραγματικό χρόνο όπως συντίθενται σε κάθε κύκλο.

Απόλυτη ποσοτικοποίηση σύμφωνα είτε με ένα εσωτερικό μάρτυρα που πολλαπλασιάζεται

μαζί με το στόχο, ή μέσω της χρήσης μιας πρότυπης καμπύλης που σχεδιάζεται μέσω παράλληλου

πολλαπλασιασμού μιας σειράς γνωστών συγκεντρώσεων μιας αλληλουχίας αναφοράς. (εικόνα 6)


1. Ιχνηθέτες υδρόλυσης (TaqMan, Beacons,)

2. Ιχνηθέτες υβριδοποίησης – FRET (HybProbes, Simple Probes)

3. Φθορίζουσες χρωστικές που δεσμεύονται σε δίκλωνο (ds) DNA

(SYBR Green, Eva Green, LC Green). (εικόνες 7,8)

Εικόνα 6: Στοιχεία τεχνικής Real time PCR.


Εικόνα 7: Μέθοδοι ανίχνευσης φθορισμού στη PCR πραγματικού χρόνου.

Πλεονεκτήματα Real-time PCR

1. Δεν επηρεάζεται από ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων

2. Η ενίσχυση παρακολουθείται συνεχώς σε κάθε κύκλο

3. Δεν υφίσταται καμία διαδικασία μετά το τέλος της αντίδρασης, (χαμηλός κίνδυνος

επιμολύνσεων)

4. Πιο σύντομοι κύκλοι (30 λεπτά έως 2 ώρες)

5. Μέτρηση δειγμάτων με μεγάλες διαφορές αρχικού νουκλεϊκού φορτίου

6. Στις περιπτώσεις RTReal time PCR απαιτούνται 1000 φορές λιγότερα μόρια αρχικού RNA

7. Αυξημένη ειδικότητα, ευαισθησία και επαναληψιμότητα

8. Μικρή αύξηση του κόστους σε σχέση με την συμβατική PCR (εκτός του εξοπλισμού)

Μειονεκτήματα Real-time PCR

1. Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό

2. Υψηλό κόστος εξοπλισμού


Εικόνα 8: PCR πραγματικού χρόνου με τη χρήση μοριακού φάρου. [21, 22, 23]


Η τεχνολογία ιχνηθετών τύπου Taqman

Χρησιμοποιούνται ειδικά ολιγονουκλεοτίδια – ιχνηθέτες σημασμένα με ένα φθορίζον μόριο

αναφοράς και ένα μόριο που απορροφά το φθορισμό που εκπέμπει το μόριο αναφοράς (quencher).

Κατά την PCR οι συνθήκες ευνοούν την υβριδοποίηση του ιχνηθέτη με την αλληλουχία-στόχο πριν

από τους εκκινητές και την έναρξη του πολυμερισμού από την πολυμεράσηTaq.

Κατά τον πολυμερισμό η 5'-3' εξωνουκλεολυτική ενεργότητα της πολυμεράσης Taq αποικοδομεί τον

ιχνηθέτη και έτσι η χρωστική αναφοράς απελευθερώνεται από τον ιχνηθέτη και ανιχνεύεται.

Η ένταση του σήματος στο τέλος κάθε κύκλου εξαρτάται από την συγκέντρωση του παραγόμενου

προϊόντος. (εικόνες 9, 10, 11)

πλεονεκτήματα

Η ενίσχυση (πολλαπλασιασμός) μελετάται σε πραγματικό χρόνο.

Δεν απαιτούνται χειρισμοί μετά την PCR ->δυνατότητα χειρισμού πολλών δειγμάτων, μικρή

πιθανότητα επιμόλυνσης.

Δυνατότητα μεγάλης ταχύτητας (ακόμη και 25 λεπτά).

Απαίτηση για μικρές ποσότητες μήτρας ως 1000 φορές λιγότερο σε σχέση με τις κλασικές μεθόδους

(ελάχιστο 6 picogram = ισοδύναμο ενός διπλοειδούς γονιδιώματος).

Η ανάλυση με την καμπύλη τήξης επιβεβαιώνει την ειδικότητα.

Πιο ειδικά, πιο ευαίσθητα και επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Λίγο μόνο πιο ακριβή από τη συμβατική PCR (εκτός από το κόστος εξοπλισμού).

Εφαρμογές της Q-PCR

γονιδιακή έκφραση - μελέτη του προτύπου γονιδιακής έκφρασης (mRNA profiling)

Έλεγχος μεταλλάξεων

Ανάλυση με καμπύλη τήξης, SNPs, Γονοτύπηση

μελέτη του προτύπου έκφρασης μορίων miRNA

Μελέτη προτύπων μεθυλίωσης (επιγενετική)

[24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40]


Εικόνα 9: Ιχνηθέτης Taqman. Ο πράσινος κύκλος είναι το φθορίζον μόριο αναφοράς και ο

κόκκινος ένα μόριο που απορροφά το φθορισμό που εκπέμπει το μόριο αναφοράς (quencher).

Image created by Dan Pierce.

Εικόνα 10: Ο ιχνηθέτης TaqMan συνδέεται στην αλληλουχία στόχο καθώς και οι εκκινητές. Η

Taq polymerase επιμηκύνει τους εκκινητές. Image created by Dan Pierce.

Εικόνα 11: Η χρωστική αναφοράς απελευθερώνεται καθώς η Taq polymerase επιμηκύνει τους

εκκινητές. Μακριά από τη χρωστική απόσβεσης, το φως που εκπέμπεται από τη χρωστική

αναφοράς ανιχνεύεται. Image created by Dan Pierce.


ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ

Η Νεφελομετρία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην ανοσοβιολογία για τον καθορισμό των

επιπέδων πρωτεϊνών στο πλάσμα του αίματος, όπως στη μέτρηση των επιπέδων των

ανοσοσφαιρινών Μ, G, A.

Είναι σημαντικός ο προσδιορισμός των ελεύθερων ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών στο

πολλαπλό μυέλωμα.

Στη τεχνική γίνεται μέτρηση της ποσότητας του φωτός που διέρχεται από ένα δείγμα.

Βασίζεται στην αρχή ότι μικρά σωματίδια σε ένα διάλυμα σκεδάζουν το φως που διέρχεται από

αυτά. Η ποσότητα του φωτός που σκεδάζεται ανιχνεύεται υπό γωνία 30ο ή 90ο συνήθως.

Συγκρίνεται με το σκεδασμό γνωστών ουσιών και η ποσότητα καθορίζεται από μια πρότυπη

καμπύλη.

Με τη νεφελομετρία μπορεί να γίνει ανίχνευση και αντιγόνων και αντισωμάτων, συνήθως

ανιχνεύονται οι ανοσοσφαιρίνες IgM, IgG, and IgA.

Φυσιολογικές τιμές

IgG: 560 to 1800 mg/dL

IgM: 45 to 250 mg/dL

IgA: 100 to 400 mg/dL

Μπορούν να προσδιοριστούν και οι συγκεντρώσεις της αιμοσφαιρίνης, τρανσφερίνης, α1

αντιθρυψίνη, αλβουμίνη και c-reactive protein

Μπορούν να ανιχνευθούν διάφορες ασθένειες όπως: ηπατικές βλάβες, ρευματοειδή αρθρίτιδα,

λευχαιμία, μυέλωμα, χρόνιες λοιμώξεις.

Το νεφελόμετρο μοιάζει με το φασματοφωτόμετρο με τη μόνη διαφορά ότι ο ανιχνευτής του φωτός

που σκεδάζεται βρίσκεται υπό γωνία. (εικόνες 12, 13)

Η ποσότητα του σκεδασμού εξαρτάται από την ποσότητα και το μέγεθος των σωματιδίων στο

διάλυμα. [41, 42, 43, 44, 45, 46]


Εικόνα 12: Σχηματικό διάγραμμα νεφελόμετρου. Μέτρηση του ποσού του φωτός που σκεδάζεται

υπό γωνία προς το προσπίπτον φως, όταν αυτό διέρχεται μέσα από εναιώρημα.

Εικόνα 13: Λειτουργία νεφελόμετρου.


Ανοσομετρικές Μέθοδοι IRMA – ELISA

Τεχνικές

Ραδιοανοσοχημικές (RIA)

Ενζυμοανοσοχημικές (EIA)

Ανοσοχημειοφωταύγεια (CHIA)

Ανοσοφθορισμομετρικές (FIA)

Ανοσομετρικές μέθοδοι (χρήση σημασμένου Ab) –αποτέλεσμα ανάλογο της C

Ανοσοραδιομετρικές (IRMA)

Ανοσοενζυμομετρικές (ELISA)

Ανοσοφωταυγειομετρικές (ICHMA)

Εικόνα 14: Αρχή λειτουργίας τεχνικών RIA, EIA, CHIA, FIA


Εικόνα 15: Αρχή λειτουργίας IRMA

Στη μέθοδο IRMA μονοκλωνικά αντισώματα συνδέονται άμεσα ή έμμεσα σε σωλήνα

πολυστυρενίου.

Κατά τη διάρκεια της πρώτης επώασης, ο ορός του ασθενή επωάζεται με μονοκλωνικό αντίσωμα

επισημασμένο με I125 στο σωλήνα που υπάρχει το συνδεδεμένο αντίσωμα.

Το αντιγόνο συνδέεται στα ακινητοποιημένα αντισώματα και στα ραδιενεργά σημασμένα

αντισώματα. Δημιουργείται μια δομή sandwich.

Το μη συνδεδεμένο ραδιενεργό αντίσωμα απομακρύνεται με πλύση.

Η ένταση της ραδιενέργειας είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του αντιγόνου που εξετάζεται στον

ορό του ασθενή. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης γίνεται με πρότυπη καμπύλη.

[47, 48, 49, 50, 51, 52, 53]


ELISA

Η ένζυμο συνδεδεμένη ανοσολογική ανάλυση (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)

αναπτύχθηκε από τον Peter Perlmann, και την Eva Engvall στο πανεπιστήμιο της Στοκχόλμης. [54,

55, 56, 57]

Η βιοχημική μέθοδος ELISA μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση

αντιγόνων και αντισωμάτων. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντισωμάτων όπως στην

περίπτωση του ιού HIV, στη βιομηχανία τροφίμων και στην τοξικολογία. [58, 59, 60]

Η μέθοδος βασίζεται στην σύνδεση αντιγόνου αντισώματος και διακρίνεται στην ανταγωνιστική και

μη ανταγωνιστική.

Στην ανταγωνιστική μέθοδο το εξεταζόμενο αντιγόνο ανταγωνίζεται με επισημασμένο αντιγόνο για

τη σύνδεση τους σε περιορισμένη ποσότητα του ίδιου αντισώματος. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης

είναι αντιστρόφως ανάλογο με τη συγκέντρωση του μετρούμενου αντιγόνου.

Στη μη ανταγωνιστική χρησιμοποιείται επισημασμένο αντίσωμα. Το αντιγόνο συνδέεται σε ένα μη

επισημασμένο αντίσωμα που είναι καθηλωμένο σε στερεή επιφάνεια και μετά προστίθεται το ίδιο

επισημασμένο αντίσωμα. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι ανάλογο προς τη συγκέντρωση της

ουσίας. (εικόνες 16, 17) [61, 62, 63]

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ELISA

Πιο ευαίσθητη

Μπορεί να αυτοματοποιηθεί

Δεν απαιτεί τόσο εξειδικευμένο προσωπικό

Δίνει αντικειμενικά αποτελέσματα

Δίνει ποσοτικές και όχι ημιποσοτικές μετρήσεις

Μπορούν να ανιχνευτούν και τάξεις των ανοσοσφαιρινών

Ευελιξία

Προσδιορισμό ουσιών από μίγματα


Εικόνα 16: Στάδια της ELISA.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:ELISA_diagram.png


Εικόνα 17: Ανταγωνιστική και μη ανταγωνιστική ELISA.


Βιβλιογραφία

1. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd edition, Kluwer Academic

/ Plenum Publishers, New York (1999).

2. Photochem CAD by J.S. Lindsay, available at http://omcl.ogi.edu.

3. Petrich, J. W., Chang, M.C., McDonald, D.B., and Fleming, R. (1983). On the origin of

nonexponential fluorescence decay in tryptophan and its derivatives, JACS 105, 3824-

3832.

4. Kiefer, D., and Kuhn A. (1999) Hydrophobic forces drive spontaneous membrane

insertion of the bacteriophage Pf3 coat protein without topological control, EMBO J.

18, 6299-6306.

5. Winterfeld, S., Imhof, N., Roos, T., Bär, G., Kuhn, A., and Gerken, U. (2009) Substrate

induced conformational change of the Escherichia coli insertase YidC, Biochemistry 48,

6649-6691.

6. Longworth, J.W. in Time Resolved Fluorescence Spectroscopy in Biochemistry and

Biology, 651 – 687, edited by R.E. Cundall and R.E. Dale, Plenum Press, New York

(1983).

7. Valeur B., and Weber G. (1977), Resolution of the fluorescence excitation spectrum of

indole into the 1La and 1Lb excitation bands, Photochem. Photobiol. 25, 441-444.

8. Th. Förster, “Transfer Mechanisms of Electronic Excitation,” Discussions Faraday Soc.

27, 7 (1959).

9. Mullis K.B. 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci. Am. 262:

56–65.

10. Mullis K. and Faloona F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase

catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 55: 335–350.

11. Lilit Garibyan and Nidhi Avashia. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative

Dermatology (2013) 133.

12. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., et al. 1988. Primer-directed

enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science

239:487–491.

13. Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabaugh G.F., and Erlich H.A. 1988. DNA typing

from single hairs. Nature 332: 543–546.

http://omcl.ogi.edu/


14. Kwok S. and Higuchi R. 1989. Avoiding false positives with PCR (review). Nature 339:

237–238.

15. Longo M.C., Berringer M.S., and Hartley J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to

control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: 125–128.

16. Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR

Protocols 2003; 226. pp. 3-6.

17. Pohl G, Shih IeM. Principle and applications of digital PCR. Expert Rev Mol Diagn. 2004

Jan;4(1):41-7.

18. Chien A., Edgar D.B., and Trela J.M. 1976. Deoxyribonucleic acid polymerase from the

extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bacteriol. 127: 1550–1557.

19. Keohavong P. and Thilly W.G. 1989. Fidelity of DNA polymerases in DNA amplification.

Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 9253–9257.

20. Eckert K.A. and Kunkel T.A. 1990. High fidelity DNA synthesis by the Thermus

aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 18: 3739–3744.

21. Vet J.A. and Marras S.A. 2005. Design and optimization of molecular beacon real-time

polymerase chain reaction assays. Methods Mol. Biol. 288: 273–290.

22. Kramer R. and Tyagi S. 1996. Molecular beacons: Probes that fluoresce upon

hybridization. Nat. Biotechnol. 14: 303–308.

23. Vet J.A.M., Majitha A.R., Marras S.A., Tyagi S., Dube S., Poiesz B.J., and Kramer F.R.

1999. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.

Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 6394–6399.

24. Smith C, Osborn M (2009) Advantages and limitations of quantitative PCR (qPCR)-

based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol 67:6–20.

25. Stahlberg A, Thomsen C, Ruff D et al. (2012) Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs,

and proteins in the same single cell. Clin Chem 58:1682–1691.

26. Valasek MA, Repa JJ (2005). The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 29:151–

159.

27. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008) Twenty-five years of quantitative PCR

for gene expression analysis. BioTechniques 44:619–26.

28. Vogel J, Yee C, Darling J (2012) Molecular biology. In: Bolognia J, Jorizzo J, Rapini R

(eds) Dermatology, 3rd edn. Elsevier: Philadelphia, PA, 65–79.


29. Weier HU, Gray JW (1988) A programmable system to perform the polymerase chain

reaction. DNA 7:441–7.

30. Bustin, S. A. (2002). "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR

(RT-PCR): trends and problems." J of Molec Endocrin 29: 23-39.

31. Lijun Wang, Haitong Gu, Xinxin Lu. A rapid low-cost real-time PCR for the detection of

klebsiella pneumonia carbapenemase genes. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2012; 11:

9.

32. Damodar Paudel, Richard Jarman, Kriengsak Limkittikul, et al. Comparison of real-time

SYBR green dengue assay with real-time taqman RT-PCR dengue assay and the

conventional nested PCR for diagnosis of primary and secondary dengue infection. N

Am J Med Sci. 2011 October; 3(10):478-485.

33. Stephen J. Hadfield, Guy Robinson, Kristin Elwin, et al. Detection and Differentiation of

Cryptosporidium spp. in Human Clinical Samples by Use of Real-Time PCR. J Clin

Microbiol. 2011 March; 49(3): 918-24.

34. P. Lewis White, Carlo Mengoli, Stéphane Bretagne, et al. Evaluation of Aspergillus PCR

Protocols for Testing Serum Specimens. J Clin Microbiol. 2011 November; 49(11):

3842-48

35. Abigail M. Frye, Catherine A. Baker, D. Leif Rustvold, et al. Clinical Impact of a Real-

Time PCR Assay for Rapid Identification of Staphylococcal Bacteremia. J Clin Microbiol.

2012 January; 50(1): 127-33.

36. Tanya A. Halse, Vincent E. Escuyer, Kimberlee A. Musser Evaluation of a Single-Tube

Multiplex Real-Time PCR for Differentiation of Members of the Mycobacterium

tuberculosis Complex in Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 2011 July; 49(7): 2562-67.

37. Chiabchalard R, Wiengeharoen JT, Sukthana Y. Sensitivity and specicificity of PCR for

detection of Toxoplasma Gondii DNA added to laboratyory samples. South east Asian J

Trop.Med.Marech 2005; 36(2): 408-11.

38. N. Pusterla, J.E. Madigan, and C.M. Leutenegger. Real-Time Polymerase Chain

Reaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for Equine Infectious Diseases. J Vet

Intern Med 2006;20:3–12

39. Bustin SA. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription

polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25 169–193.


40. Bustin SA.2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-

PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology 29 23–39.

41. Ashihara Y, Kasahara Y, Nakamura RM. Immunoassays and immunochemistry. In:

McPherson RA, Pincus MR, eds.Henry's Clinical Diagnosis and Management by

Laboratory Methods. 22nd ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2011:chap 44.

42. McPherson RA, Massey HD. Laboratory evaluation of immunoglobulin function and

humoral immunity. In: McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and

Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders;

2011:chap 46.

43. L. Chapon. NEPHELOMETRY AS A METHOD FOR STUDYING THE RELATIONS BETWEEN

POLYPHENOLS AND PROTEINS. J. Inst. Brew., January-February, 1993, Vol. 99, pp. 49-

56.

44. Clinical Immunology and Seriology 3rd Ed., Stevens, pg 127, F.A. Davis Company.

45. C D Deaton, K W Maxwell, R S Smith and R L Creveling. Quality of Commercially

Available Controls in Laser Immunonephelometry Ann Clin Biochem 1980; v. 17, p.178-

182.

46. Keefe CC, Goldman MM, Zhang K, Clarke N, Reitz RE, Welt CK. N Evaluation of the

Hyland Laser Nephelometer PDQ System for the Measurement of

ImmunoglobulinsAnn Clin Biochem 1978; v. 15, p.77-85.

47. R.S. Chapman. IMMUNOASSAYS IN CLINICAL CHEMISTRY PRINCIPLES OF

IMMUNORADIOMETRIC ASSAYS Chapter 6.

48. Bast, R. C., Jr., Feeney, M., Lazarus, H., Nadter, L. M., Colvin, R. B., and Knapp, R. C.

Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest., 68:

1331-1337,1981.

49. Bolton, A. E., and Hunter, W. M. The labeling of proteins to high specific radioactivities

by conjugation to a I25l-containingacylating agent. Application to the

radioimmunoassay with an appendix on the preparation method by J. Rudingerand U.

Ruegg. Biochem.J., 33:529-539, 1973.

50. Del Villano, B. C., Brennan, S., Brock, P., Bucher, C., Liu, V., McCIure, M., Rake, B.,

Space. S., Westrick, B., Schoemaker, H., and Zurawski, V., Jr. Radioimmunometric assay

for a monoclonal antibody-defined tumor marker, CA 19-9. Clin. Chem., 29: 549-

552,1983.


51. Knauf, S., and Urbach, G. I. OCA, ovarian tumor-associated antigen. In: R. B.Herberman

(ed.), Compendium of Assays for Immunodiagnosis of Human Cancer, pp. 537-539.

Amsterdam: Elsevier/North-HollandBiomÃ©dicaPlress, 1979.

52. Rodbard, D. Statistical quality control and routine data processing for

radioimmunoassays and ¡mmunoradiometric assays. Clin. Chem., 20: 1255-1270,1974.

53. Ziola, B. R., Matikainen, M. T., and Salmi, A. Polystyrene balls as the solid phase of a

double antibody radioimmunoassay for human serum albumin. J. Immunol. Methods,

77. 309-317,1977.

54. Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative

assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971;8:871-874.

55. Engvall E. Quantitative enzyme immunoassay (ELISA) in microbiology. Med

Biol1977;55:193-200.

56. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme

conjugates".FEBS Letters 15 (3): 232–236.

57. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Immunochemistry

1969;6:43-52.

58. MedLinePlus. "HIV ELISA/western blot." U.S. National Library of Medicine. Last

accessed April 16,

2007. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003538.htm

59. U. S. Food and Drug Administration. "Food Allergen Partnership." Last accessed April

16, 2007.

http://web.archive.org/web/20080325193553/www.cfsan.fda.gov/~dms/alrgpart.htm

60. Sblattero D, Berti I, Trevisiol C, Marzari R, Tommasini A, Bradbury A, Fasano A, Ventura

A, Not T (2000). "Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative

diagnostic assay for celiac disease". Am. J. Gastroenterol. 95 (5): 1253–7.

61. Lequin R (2005). "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA)". Clin. Chem. 51 (12): 2415–8.

62. Schuurs AHWM, van Weemen BK. Enzyme-immunoassay: a powerful analytical tool

[Review]. J Immunoassay 1980;1:229-249.

63. De La Rica, R.; Stevens, M. M. (2012). "Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye". Nature Nanotechnology.

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003538.htm

http://web.archive.org/web/20080325193553/www.cfsan.fda.gov/~dms/alrgpart.htm


Θέμα 2

Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών: Ιστορικά δεδομένα, αρχή μεθόδων,

εργαστηριακά πρωτόκολλα, διδακτικά σχήματα.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Οι ορμόνες είναι χημικά μόρια που δρουν ως μηνύματα για το συντονισμό της βιοχημικής

δραστηριότητας των κυττάρων και των πολυκύτταρων οργανισμών.

Η λέξη ορμόνη είναι διεθνής και προέρχεται από το Ελληνικό ρήμα «ορμώ».

Όταν οι ορμόνες απελευθερώνονται στο αίμα ασκούν τις βιολογικές τους δράσεις σε κύτταρα

στόχους. Ως χημικά μόρια μπορούν να καταταγούν με βάση τη χημική τους φύση, οπότε

υποδιαιρούνται στις εξής κατηγορίες:

Στεροειδείς ορμόνες. Οι ορμόνες αυτής της κατηγορίας συνθέτονται με μητρική ουσία τη

χοληστερόλη, όπως η αλδοστερόνη, η κορτιζόλη, η τεστοστερόνη, η οιστραδιόλη, η προγεστερόνη

κ.α.

Πεπτίδια και πρωτεΐνες. Είναι ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως, γλυκαγόνη, ινσουλίνη κ.α.

Αμίνες ή παράγωγα αμινοξέων, όπως η αδρεναλίνη και η θυροξίνη.

Ο πρώτος προσδιορισμός ορμόνης πραγματοποιήθηκε το 1960 από τους Yalov και Berson και

αφορούσε την ινσουλίνη η οποία προσδιορίστηκε ραδιοανοσολογικά.

Ο επόμενος προσδιορισμός αφορούσε τη θυροξίνη και έγινε από τον Ekins.

Μέθοδοι ανάλυσης ορμονών

Βιολογικές μέθοδοι

Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques)

HPLC (High performance liquid chromatography)

GC-MS (Gas chromatography-Mass spectrometry)


Οι ορμόνες είναι χημικά μόρια που δρουν ως μηνύματα για το συντονισμό της βιοχημικής

δραστηριότητας των κυττάρων και των πολυκύτταρων οργανισμών.

Η λέξη ορμόνη είναι διεθνής και προέρχεται από το Ελληνικό ρήμα «ορμώ».

Οι ορμόνες:

Παράγονται από ειδικούς ιστούς ή αδένες.

Εκκρίνονται στο αίμα, το οποίο και τις μεταφέρει στα σημεία όπου επενεργούν.

Προκαλούν ορισμένες βιοχημικές τροποποιήσεις στη δραστηριότητα των οργάνων ή των κυττάρων

όπου δρουν (όργανα - στόχοι ή κύτταρα - στόχοι).

Όταν οι ορμόνες απελευθερώνονται στο αίμα ασκούν τις βιολογικές τους δράσεις σε κύτταρα

στόχους, μακριά από τη θέση παραγωγής τους. Αυτή είναι η κλασσική ενδοκρινική δράση.

Σήμερα όμως γνωρίζουμε πως οι ορμόνες δεν είναι αναγκαίο να μεταφερθούν με το αίμα για να

δράσουν. Μπορούν να ασκήσουν τις βιολογικές τους δράσεις κοντά στον τόπο παραγωγής τους και

η δράση αυτή ονομάζεται παρακρινική.

Η Σωματοστατίνη π.χ. που παράγεται από τα δ κύτταρα των νησιδίων του παγκρέατος αναστέλλει

την απελευθέρωση της ινσουλίνης και της γλυκαγόνης από τα β και α κύτταρα των νησιδίων

αντίστοιχα. Οι ορμόνες μπορούν επίσης να δράσουν στα ίδια τα κύτταρα που τις παράγουν και η

δράση αυτή καλείται αυτοκρινική. Η ινσουλίνη π.χ. αναστέλλει την ίδια την έκκρισή της από τα β

κύτταρα των νησιδίων του παγκρέατος, ανεξάρτητα από τις τιμές γλυκόζης στο αίμα.

Μερικές επηρεάζουν μόνο ένα ιστό, άλλες ολόκληρο το σώμα.

•Διαφορετικές ορμόνες ενεργοποιούν διαφορετικούς κυτταρικούς μηχανισμούς

•Δεν αποκρίνονται όλα τα κύτταρα σε κάθε ορμόνη.

•Δύο διαφορετικά κύτταρα μπορούν να αποκριθούν διαφορετικά στην ίδια ορμόνη

•Οι ορμόνες δρουν σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (10-10 - 10-8 M)

Οι ορμόνες επηρεάζουν τις μεταβολικές δραστηριότητες του κυττάρου:

1. Μεταβάλλοντας τη μεμβρανική διαπερατότητα

2. επάγοντας τη παραγωγή πρωτεϊνών ή ρυθμιστικών μορίων στα κύτταρα

3. ενεργοποιώντας ή απενεργοποιώντας ένζυμα στα κύτταρα

4. διεγείροντας τα κύτταρα-στόχους να εκκρίνουν ορμόνες


Κατάταξη των ορμονών.

Οι ορμόνες κατατάσσονται σε κατηγορίες με βάση τον τόπο παραγωγής, τον τρόπο δράσης και τη

φυσιολογική τους λειτουργία.

Ως χημικά μόρια μπορούν επίσης να καταταγούν με βάση τη χημική τους φύση, οπότε

υποδιαιρούνται στις εξής κατηγορίες:

Στεροειδείς ορμόνες. Οι ορμόνες αυτής της κατηγορίας συνθέτονται με μητρική ουσία τη

χοληστερόλη, δεν εναποθηκεύονται, αλλά απελευθερώνονται μόλις συντεθούν. Στην κατηγορία

αυτή ανήκουν οι ορμόνες του φλοιού των επινεφριδίων (σπουδαιότερες είναι η αλδοστερόνη και η

κορτιζόλη), καθώς και οι ορμόνες των γεννητικών αδένων. Οι τελευταίες διαφοροποιούνται

ανάλογα με το φύλο και είναι υπεύθυνες για τη δημιουργία των γαμετικών κυττάρων αλλά και για

την εμφάνιση των δευτερογενών χαρακτηριστικών που παρατηρούνται ανάμεσα στους άνδρες και

τις γυναίκες. Οι κυριότερες ορμόνες των γεννητικών αδένων είναι η τεστοστερόνη (παράγεται στους

όρχεις), η οιστραδιόλη (παράγεται στα ωοθυλάκια) και η προγεστερόνη (παράγεται από το ωχρό

σωμάτιο).

Πεπτίδια και πρωτεΐνες. Είναι ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως, οι οποίες συνθέτονται στη μορφή

πρόδρομων ουσιών (προορμόνες) κα οι οποίες εναποθηκεύονται και αποδίδονται στην κυκλοφορία

του αίματος μετά την διέγερση του ενδοκρινούς αδένα. Π.χ. γλυκαγόνη, ινσουλίνη κ.α.

Αμίνες ή παράγωγα αμινοξέων, όπως η αδρεναλίνη και η θυροξίνη.

Είναι γνωστό ότι οι ορμόνες δρουν μόνο σε ορισμένα όργανα, τα οποία ονομάζονται όργανα -

στόχοι. Έτσι, για παράδειγμα, η οιστραδιόλη, η οποία αποτελεί γυναικεία γεννητική ορμόνη, δρα

στα γυναικεία γεννητικά όργανα, στο μαζικό αδένα και σε ορισμένα κέντρα του εγκεφάλου.

Η αιτία για αυτή την εξειδίκευση είναι στο ότι τα κύτταρα του οργάνου - στόχου περιέχουν

υποδοχείς για την οιστραδιόλη.

Οι ορμονοϋποδοχείς είναι ειδικές πρωτεΐνες που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη ή στο

εσωτερικό του κυττάρου. Κάθε υποδοχέας αναγνωρίζει και συνδέεται με μία μόνο ορμόνη, δηλαδή

η αλληλεπίδραση ορμόνης-υποδοχέα χαρακτηρίζεται από απόλυτη εξειδίκευση.


Η πρόσδεση της ορμόνης στον υποδοχέα προκαλεί μία σημαντική αλλαγή στη δομή της πρωτεΐνης

και μέσω αυτής πυροδοτείται μία σειρά χημικών μεταβολών με τελικό αποτέλεσμα την

ανταπόκριση του κυττάρου - στόχου σε μία συγκεκριμένη ρύθμιση της λειτουργικότητάς του.

Σήμερα γνωρίζουμε δύο διαφορετικούς τρόπους πρωτογενούς δράσης των ορμονών:

Οι στεροειδείς ορμόνες και η θυροξίνη δρουν ενδοκυτταρικά. Ενώνονται στο κυτταρόπλασμα με

τους υποδοχείς τους και μετά εισέρχονται στον κυτταρικό πυρήνα, όπου ρυθμίζουν τη μεταγραφή

συγκεκριμένων γονιδίων.

Οι πεπτιδικές ορμόνες δρουν μέσω υποδοχέων που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων.

Με την αλληλεπίδραση ορμόνης-υποδοχέα ενεργοποιείται το ένζυμο αδενυλική κυκλάση. Με τη

δράση αυτού του ενζύμου παράγεται το κυκλικό AMP (cAMP), το οποίο δρα ενδοκυτταρικά ως

δεύτερο μήνυμα, ενεργοποιώντας μία σειρά ενζύμων που ρυθμίζουν το μεταβολισμό.

(εικόνες 1, 2, 3, 4, 5) [1]

Εικόνα 1: Μηχανισμοί δράσης ορμονών. 1. Είσοδο στον πυρήνα, 2. Σύνδεση στη μεμβράνη.


Εικόνα 2: Δράση στεροειδών ορμονών, σύνδεση με ενδοκυτταρικό υποδοχέα, το σύμπλοκο

ορμόνης υποδοχέα ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων.

Εικόνα 3: Σύνδεση ορμόνης σε μεμβρανικό υποδοχέα και ενεργοποίηση ενζύμων.

Εικόνα 4: Σύνδεση ορμόνης σε μεμβρανικό υποδοχέα


Εικόνα 5: Μεμβρανικός υποδοχέας ινσουλίνης.

Προσδιορισμοί ορμονών

Ο πρώτος προσδιορισμός ορμόνης πραγματοποιήθηκε το 1960 από τους Yalov και Berson και

αφορούσε την ινσουλίνη η οποία προσδιορίστηκε ραδιοανοσολογικά.

Ο επόμενος προσδιορισμός αφορούσε τη θυροξίνη και έγινε από τον Ekins. [2, 3]

Από τότε μέχρι σήμερα αν και δεν έχουν αλλάξει οι βασικές αρχές των μεθόδων, οι μέθοδοι έγιναν

πιο απλές και αυξήθηκε η ευαισθησία τους.

Μέθοδοι ανάλυσης ορμονών

Βιολογικές μέθοδοι

Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques)

HPLC (High performance liquid chromatography)

GC-MS (Gas chromatography-Mass spectrometry)

[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]

Βιολογικές Μέθοδοι

Οι μέθοδοι αυτοί δεν χρησιμοποιούνται ως ρουτίνα. Προσπαθούν να αναπαράγουν τις βιοχημικές

δράσεις των ορμονών, συγκρίνοντας το άγνωστο δείγμα με αυξανόμενες δόσεις καθαρής ορμόνης

που χρησιμοποιείται ως πρότυπο.

Ραδιοανοσολογικές Μέθοδοι

Χρησιμοποιούνται από το 1960 έως σήμερα. Αξιοποίησαν τις αντιγονικές ιδιότητες των πρωτεϊνικών

ορμονών. Εξαιτίας της επισήμανσης των ορμονών με ραδιοϊσότοπα έδωσαν τη δυνατότητα

μέτρησης μικρών ποσοτήτων ορμονών. [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]


Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στον ανταγωνισμό μεταξύ της επισημασμένης ορμόνης με

ραδιοϊσότοπο και της μη επισημασμένης για τη σύνδεση τους σε ένα ειδικό αντίσωμα.

Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της ορμόνης που θέλουμε να μετρήσουμε τόσο λιγότερη

επισημασμένη ορμόνη θα συνδεθεί στο αντίσωμα. Διαχωρίζεται στη συνέχεια η επισημασμένη και η

ελεύθερη ορμόνη και υπολογίζεται η αρχική ποσότητα της ορμόνης σε μετρητή ακτινοβολίας. Ο

υπολογισμός γίνεται με την κατασκευή καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα

με γνωστή συγκέντρωση ορμόνης.

Σε μια RIA (Radio Immunoassay) χρειάζονται:

Η ορμόνη καθαρή (ως αντιγόνο) για τα πρότυπα διαλύματα αλλά και για την παραγωγή

αντισωμάτων.

Αντισώματα που παράγονται σε ζώα μετά από χορήγηση της ορμόνης (εξειδικευμένα για τη

συγκεκριμένη ορμόνη).

Ραδιοϊσότοπα για την επισήμανση της ορμόνης (I125).

Στάδια:

1. Ανάμειξη του δείγματος (ορός ή πλάσμα) με την επισημασμένη ορμόνη και το αντίσωμα.

2. Επώαση.

3. Διαχωρισμός της ελεύθερης από την συνδεδεμένη ορμόνη:

α. καταβύθιση με διπλό αντίσωμα

β. προσρόφηση σε ενεργό άνθρακα

γ. καταβύθιση με θειικό αμμώνιο

δ. ιονανταλλακτικές ρητίνες

ε. αντίσωμα σε στερεή φάση

4. Μέτρηση ακτινοβολίας

5. Καμπύλη αναφοράς και υπολογισμός αποτελεσμάτων. [19-33]


Παραλλαγές των μεθόδων RIA

1. IRMA (Immuno Radiometric Assay), στη μέθοδο αυτή επισημαίνεται το αντίσωμα αντί για

το αντιγόνο.

2. IRMA Sandwich, δύο μονοκλωνικά αντισώματα, ένα σε στερεή φάση και το άλλο

επισημασμένο στο διάλυμα, αντιδρούν με διαφορετικά σημεία του μορίου της ορμόνης και

το παγιδεύουν.

3. Radio Receptor assays, αντί για αντίσωμα χρησιμοποιείται επισημασμένη η πρωτεΐνη

υποδοχέας της ορμόνης.

4. Competitive Binding protein assays, αντί του αντισώματος χρησιμοποιείται η ειδική

δεσμευτική πρωτεΐνη.

Εικόνες 6, 7, 8, 9, 10. [34-40]

Μη ισοτοπικές ανοσολογικές μέθοδοι

Προβλήματα από τη χρήση των ραδιοϊσοτόπων οδήγησαν στην ανάπτυξη μη ισοτοπικών

ανοσολογικών μεθόδων.

1. Για την επισήμανση χρησιμοποιούνται ένζυμα, όπως υπεροξειδάση ή αλκαλική φωσφατάση,

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ή EIA (Enzyme Immunoassay), εικόνα 11 [41, 42]

2. Φθορίζουσες ουσίες (λανθανίδες), όταν διεγερθούν εκπέμπουν φωτόνια με μεγαλύτερο

μήκος κύματος, FIA (Fluoro Immuno Assay)

3. Χημειοφωταύγεια (Chemiluminescence), είναι το φυσικό φαινόμενο παραγωγής φωτεινής

ακτινοβολίας από ένα μόριο που έχει διεγερθεί.

Η αντίδραση: A + B → C* → C + hv, όπου Α, Β αντιδρώντα, C το διεγειρόμενο μόριο.

Η ακτινοβολία μετριέται με ένα φωτόμετρο ή λουμινόμετρο. Η μέθοδος άρχισε να

χρησιμοποιείται από τις αρχές τις δεκαετίας του 80 και συνεχίζονται οι έρευνες για νέα

μόρια χημειοφωταύγειας. Χρησιμοποιούνται οι κυκλικές υδραζίδες και οι εστέρες της

ακριδίνης.


4. HPLC, Υγρή Χρωματογραφία υψηλής πίεσης, High performance liquid chromatography

Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στις διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες των στοιχείων

ενός μείγματος, όπως το μέγεθος, το μοριακό βάρος, το ηλεκτρικό φορτίο κ.α.

Χρησιμοποιείται στον προσδιορισμό κατεχολαμινών και σε συνδυασμό με τη

φασματοσκοπία μάζας στη μέτρηση κορτικοστεροειδών και ενδιάμεσων προϊόντων της

στερεοειδογένεσης. Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας. Χρησιμοποιείται και ως 1ο

στάδιο «καθαρισμού» του δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων

μεταβολισμού, κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς. [43-48]

Εικόνα 6: Επισημασμένα αντισώματα επιτρέπουν την ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-

αντισώματος.

Εικόνα 7: Επισημασμένα αντιγόνα επιτρέπουν την ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-

αντισώματος.


Εικόνα 8: One step competitive assay, το επισημασμένο αντιγόνο και το αντιγόνο του δείγματος

ανταγωνίζονται για περιορισμένη ποσότητα αντισώματος.

Εικόνα 9: Two step competitive format, η συγκέντρωση του αντισώματος στο διάλυμα βρίσκεται

σε περίσσεια σε σχέση με τη συγκέντρωση του αντιγόνου.


Εικόνα 10: Μέθοδος RIA.


Εικόνα 11: Η τεχνική ELISA.

Οι ορμόνες που παράγονται από την υπόφυση, το πάγκρεας και τον παραθυρεοειδή αδένα είναι

πρωτεΐνες. Στις μη πρωτεϊνικές ορμόνες υπάρχουν διακριτές χημικές ομάδες (στεροειδείς) και

διευκολύνεται η ανάλυση τους, ενώ στις πρωτεϊνικές ορμόνες δεν υπάρχει κάτι τέτοιο.

Ενδεικτικά η αυξητική ορμόνη (GH) παράγεται από την υπόφυση και είναι υπεύθυνη για την

ανάπτυξη πολλών ιστών (αποτελείται από 191 αμινοξέα). Η ανάλυση της ορμόνης μπορεί να γίνει με

ραδιοανίχνευση, χρησιμοποιώντας επισημασμένη I125 GH που ανταγωνίζεται την αυξητική ορμόνη

που ελέγχεται για τη σύνδεση σε περιορισμένη ποσότητα πολυκλωνικού GH αντιορού. [49-52]


Ενδεικτικά πρωτόκολλα ανίχνευσης ορμονών

Πρωτόκολλο Α: Glucose suppression of growth hormone

Στα φυσιολογικά άτομα μειώνονται τα επίπεδα της αυξητικής ορμόνης μετά από χορήγηση

γλυκόζης, ενώ στα άτομα με ακρομεγαλία δεν συμβαίνει.

Χορήγηση 100g γλυκόζης και το αίμα αναλύεται μετά από 1 και 2 ώρες και τα επίπεδα πρέπει να

πέσουν στα 2 ng/Ml.

Πρωτόκολλο Β: Exercise test for growth hormone

Η άσκηση αυξάνει την αυξητική ορμόνη. Μετά από 20 λεπτά άσκησης μέτρηση αυξητικής ορμόνης,

αν είναι πάνω από 7 ng/mL, είναι φυσιολογικό.

Πρωτόκολλο Γ: Gonadotropin-releasing hormone for LH, FSH

Η ορμόνη GnRH διεγείρει την απελευθέρωση LH/FSH. Χορηγούνται 100μg GnRH και γίνεται μέτρηση

Tτης LH (ωχρινοτρόπος) η οποία πρέπει να αυξηθεί 3-10 φορές και της FSH (θυλακιοτρόπος) η οποία

πρέπει να αυξηθεί 1,5-3 φορές.

Πρωτόκολλο Δ: TRH test

Χορήγηση 500μg TRH και μέτρηση TSH (θυρεοτροπίνη). Αν αυξηθεί 5-10 φορές η TSH είναι

φυσιολογικά τα ευρήματα, καθόλου αύξηση υποδηλώνει υπερθυρεοειδισμό, ενώ μεγάλη αύξηση

υποθυρεοειδισμό.

Πρωτόκολλο Ε: Clonidine test

Η κλονιδίνη είναι φάρμακο που αναστέλλει την απελευθέρωση κατεχολαμινών φυσιολογικά άλλα

όχι σε άτομα με φαιοχρωμοκύτωμα. Χορήγηση 4,3 μg/Kg κλονιδίνη και μέτρηση μετά από 3 ώρες

την νοραδρεναλίνη.

Πρωτόκολλο ΣΤ: Τεστ κορτιζόλης

Χαμηλή δόση dexamethasone 0,5 mg, σε φυσιολογικά άτομα προκαλεί μείωση κορτιζόλης.

[53-61]


ΣΤΟΧΟΙ ΓΙΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟΥΣ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ-ΟΡΜΟΝΕΣ

Στο τέλος του μαθήματος ο μαθητής να:

1. Να γνωρίζει τις διαφορές μεταξύ εξωκρινών και ενδοκρινών αδένων.

(δραστηριότητα 1)

2. Να γνωρίζει τη φύση των ορμονών και τους τρόπους δράσης τους.

(δραστηριότητα 2)

3. Να περιγράφει τους τρόπους δράσης των ορμονών. (δραστηριότητα 2)

4. Να ανακαλύψει τη σύνδεση ανάμεσα στη σωστή λειτουργία του ενδοκρινικού

και την ασθένεια. (δραστηριότητα 3)


ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟΥΣ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ-ΟΡΜΟΝΕΣ

Δραστηριότητα 1η

Εικόνα 1 Εικόνα 2: έξω ακουστικός πόρος – κυψελίδα

Εικόνα 3

Εικόνα 4


α) Σε ποια ή ποιες από τις παραπάνω εικόνες παρατηρείται τη δράση εξωκρινών αδένων και που

ενδοκρινών αδένων.

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

β) Ποιο κριτήριο χρησιμοποιήσατε για να εντοπίστε το είδος του αδένα.

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

γ) Αν στην παρακάτω εικόνα οι κίτρινες σφαίρες και τα μπλε τετράγωνα είναι ορμόνες, πως φτάνουν

στα διάφορά κύτταρα του οργανισμού, πως ονομάζονται τα κύτταρα αυτά και τι τους προκαλούν;

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………



Εικόνα 1

Εικόνα 2


Στις εικόνες 1 και 2 παρατηρείται τους τρόπους δράσης των ορμονών.

α) Σε ποια από τις παραπάνω εικόνες η ορμόνη εισέρχεται στο κύτταρο; Εξηγήστε.

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

β) Που συνδέεται η ορμόνη σε κάθε περίπτωση;

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

γ) Μετά τη σύνδεση της ορμόνης με τον υποδοχέα, πως θα δράσει το σύμπλοκο και με τι ταχύτητα ;

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………


Συνδεθείτε στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: http://www.mayoclinic.com/health/blood-

sugar/MM00641 και παρακολουθήστε το βίντεο.

α) Ποια ορμόνη αναφέρει το βίντεο και σε ποια κατηγορία ορμονών ανήκει;

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

β) Από πού παράγεται η ορμόνη και τι ρυθμίζει;

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

γ) Εξηγήστε τη σχέση της ορμόνης με συγκεκριμένες ασθένειες.

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………


Πρωτόκολλο μέτρησης β χοριακής γοναδοτροπίνης (β-hCG)

Η β χοριακή γοναδοτροπίνη αποτελείται από 145 αμινοξέα και κωδικοποιείται από γονίδια στο

χρωμόσωμα 19. Βρίσκεται στο αίμα και τα ούρα και χρησιμοποιείται ως τεστ εγκυμοσύνης, αλλά και

ως καρκινικός δείκτης.

Τα περισσότερα τεστ χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα, ειδικά για την β υπομονάδα της

χοριακής γοναδοτροπίνης, έτσι αποφεύγονται τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα από τη FSH και LH.

Η μέθοδοι ανοσοανίχνευσης χρησιμοποιούν αντισώματα συνδεδεμένα με ένα ένζυμο ή χρωστική.

Η ανάλυση στο αίμα απαιτεί 2-4 mL και χρησιμοποιείται η χημειοφωταύγεια και επιτρέπει την

ανίχνευση έως 5 mIU/ml.

1. Ορός του αίματος συλλέγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αντιπηκτικό.

2. Φυγοκέντρηση.

3. Διατήρηση του δείγματος για 48 ώρες στους -20οC.

4. Μέτρηση του δείγματος

5. Υπολογισμός συγκέντρωσης με καμπύλη αναφοράς.

Πίνακας συγκεντρώσεων της ορμόνης κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. [62-68]

weeks since LMP last menstrual period mIU/mL

3 5 – 50

4 5 – 426

5 18 – 7,340

6 1,080 – 56,500

7 – 8 7,650 – 229,000


9 – 12 25,700 – 288,000

13 – 16 13,300 – 254,000

17 – 24 4,060 – 165,400

25 – 40 3,640 – 117,000

Non-pregnant females <5.0

Postmenopausal females <9.5



1. Seeley−Stephens−Tate: Anatomy and Physiology, Sixth Edition The McGraw−Hill Companies,

2004.

2. Rosalyn S. Yalow and Solomon A. Berson. IMMUNOLOGICAL SPECIFICITY OF HUMAN INSULIN:

APPLICATION TO IMMUNOASSAY OF INSULIN. J Clin Invest. Dec 1961; 40(12): 2190–2198.

3. R. Ekins, The estimation of thyroxine in human plasma by an electrophoretic technique. Clin

Chim Acta 1960:5, 453.

4. Rubenstein N.M. (1986). In Handbook of Clinical Laboratory management, Aspen Publishers,

Inc, Rockville, Maryland.

5. J.S. Woodhead, Journal of Clinical Immunoassay, 1984, 7, 82.

6. G. Messari, European Clinical Laboratory, 1998, 6.

7. L.J. Kricka, Analytical Chemistry, 1999, 71, 12: 305 R.

8. Grotjan, H.E., and Keel, B.A., in Immunoassay, ed Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K.,

Academic press Inc., New York, 1996, ch. 4, pps.

9. Ashwood, ER, Burtis CA, Tietz Textbook of Clin Chen 3rd Ed: 1563, Wb Saundrers Co. Phila:

1999.

10. Tietz NW (ed): Fundamentals of Clinical chemistry, 3rd ed. W.B. Saundrers Co, Philadelphia

1987.

11. Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem

1988;34:27-33.

12. Larry Kricka: Human Anti-Animal Antibody Intereferences in Immunological Assay. Clin

Chemistry 1999, 45: 7, 942 – 956.

13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for handling and processing

of blood specimens; approved guideline. NCCLS Document H18-A. Wayne (PA): NCCLS; 1990

Dec. 34p.

14. National Committee for Clinical Laboratory Standards. How to define, determine, and utilize

Reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline. Wayne (PA): NCCLS; 1995

June 59p.

15. Rappaport EB, Olander CR, Steffes MW, Kubasik N, Ferry D. Radioimmunoassay of human

somatotropin. Clin Chem. 1979 May;25(5):800-6.


16. Nieves A. Andino. A radioimmunological method of determining prolactin in human blood

plasma. Statistical substantiation of the method and determination of the content of the

hormone in healthy persons of both sexes and in infertile patient. Neuroscience and

Behavioral Physiology. 1982, Volume 12, Issue 6, pp 518-521.

17. Rayah S. Baban, Yahya Y.Farid. Comparison between Serum Prolactin Levels Determined

byVIDAS and RIA Techniques. Iraqi Journal of Medical Sciences 20.

18. Sapin R, Gasser F, Grucker D. Free prolactindeterminations in hyperprolactinemic men with

suspicion of macroprolactinemia. Clin ChimActa 2002; 316(1-2):33-41.

19. Murphy, B.E.P., Pattee, Ci. and Gold, A. clinical evaluation of a new method for the

determination of serum thyroxine. J.Clin.Endocrinol. Metab., 1966;26:247-56.

20. Abraham, G.E. snd Grover, P.K. Covalent linkage of hormonal haptens to protein carriers for

use in radioimmuno assay. In Odell, W.D. and Daughadsy, W.H. editors: Principles of

competitive protein binding assays. Philadelphia, J.B. Lippincott Co., 1971.

21. Rodbsrd, D., Rayford, P.L, Cooper, i.A. snd Ross, G.T. Statistical quality control and routine

data processing for radioimmunossssys (RIA) and immunoradiometric asssys (IRMA). din.

Chem., 1974;20:1255-70.

22. Rodbsrd, D., Bridson, W. and Rayford, P.L Rapid calculation of radioirnmuno assay results. 3.

Lab.dIm. Med., 1969;74:770-81.

23. Garcia, E.J. and Fiori, A. Radioimmunoassay and competitive binding analysis. In text book Of

nuclear medicine: Basic Sciences (Eds. A. Fernando snd.1.C. Harbert): Lea and Febiger

Publishers, 1978; pp. 344360.

24. Hunter, W.M. and Greenwood, P.C. Preparation of 1-131 labeled growth hormone of high

specificsctivity. Nature (London), 1962;194:495-96.

25. Odell, W.D. and Daughadsy, W.H. (eds). Principles of competitive protein binding assays.

Philadelphia,i.B. Lippincott Co., 1971.

26. Rosa, U. Protein radioiodination by an electrolyte technique. Strahlentherapie (Sonderb).,

1965;60:258-61

27. Von Schenck, H., Larason, I. andThorell, 3.1. Improved radioiodinstionofglucagonwith the

lsctoperoxidase method; influence of pH on iodine substitution. Clin.Chim. Acts.,

1976;69:225-30.

28. Thorell, 3.1. and Larsson, I. Lactoperoxidase coupled to polyacrylamide for radioiodinstion of

proteins to high specific activity. Immunochemistry, 1974;11:203-6.


29. Bolton, A.E. and Hunter, W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivities by

conjugation to a 1-12.5 conuining acylating agent Biochem. 3., 1973;133:529-39.

30. Samols, E. and Williams, H.S. Trace labelling of insulin with iodine. Nature, 1961;190:1211-13.

31. Nielson, M.D., iorgensen, M. and Giese, 3. 1-125 labelling of αngiotensin land II. Acts.

Endocrinol., 1971;67:104-16.

32. Desbuquois, B. and Aurbsch, G.D. Use of polyethylene glycol to separate free and antibody-

bound peptide hormones in radioimmunoassay. J.Clin.Endocrinol.Metab., 1971;33:732-3&

33. Heding, L.Ci. A simplified insulin radioimmunoatsay method. In L., Dansta G. Sirchis editors:

Labelled proteins in tracer studies (proceedings of the conference held at Pita, Jan. 1749,

1966.

34. A Al-Shawi, A Dawnay, and J Landon. A novel immunoradiometric assay for human liver

ferritin. J Clin Pathol. Apr 1983; 36(4): 440–444.

35. Miles LE, Hales CN. Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature. 1968 Jul

13;219(5150):186–189.

36. Miles LE. Properties, variants, and applications of the immunoradiometric assay method. Ric

Clin Lab. 1975 Jan-Mar;5(1):59–72.

37. LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ. Protein measurement with the Folin

phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265–275.

38. Marcus DM, Zinberg N. Isolation of ferritin from human mammary and pancreatic carcinomas

by means of antibody immunoadsorbents. Arch Biochem Biophys. 1974 Jun;162(2):493–501.

39. Avrameas S, Ternynck T. The cross-linking of proteins with glutaraldehyde and its use for the

preparation of immunoadsorbents. Immunochemistry. 1969 Jan;6(1):53–66.

40. Dandliker WB, Alonso R, de Saussure VA, Kierszenbaum F, Levison SA, Schapiro HC. The effect

of chaotropic ions on the dissociation of antigen-antibody complexes. Biochemistry. 1967

May;6(5):1460–1467.

41. Voller, A.; Bidwell, D. E.; Bartlett, A. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). A guide

with abstracts of microplate applications. 1979 pp. 125pp.

42. McCarpa, Journal of Bioluminescence and chemiluminescence 1989, 4, 51.

43. Soares CR1, Camargo IM, Morganti L, Gimbo E, Ezequiel de Oliveira J, Legoux R, Ferrara P,

Bartolini P Reversed-phase high-performance liquid chromatography method for the

determination of prolactin in bacterial extracts and in its purified form. J Chromatogr A. 2002

May 10;955(2):229-36.


44. Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C. (2004). "Practical

aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle

packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production

working under current good manufacturing practice". Journal of Chromatography A 1036 (2):

127–133.

45. Lindsay, S. ; Kealey, D. (1987). High performance liquid chromatography. Wiley. from review

Hung, L. B.; Parcher, J. F.; Shores, J. C.; Ward, E. H. (1988). "Theoretical and experimental

foundation for surface-coverage programming in gas–solid chromatography with an

adsorbable carrier gas". J. Am. Chem. Soc. 110 (11): 1090.

46. Snyder, Lloyd R. and Dolan, John W. (2006). High-Performance Gradient Elution: The Practical

Application of the Linear-Solvent-Strength Model. Wiley Interscience.

47. Xiang, Y.; Liu Y. and Lee M.L. (2006). "Ultrahigh pressure liquid chromatography using

elevated temperature". Journal of Chromatography A 1104 (1–2): 198–202.

48. Horváth, Cs.; Preiss B.A. and Lipsky S.R. (1967). "Fast liquid chromatography. Investigation of

operating parameters and the separation of nucleotides on pellicular ion exchangers".

Analytical Chemistry 39 (12): 1422–1428.

49. P Brostedt, M Luthman, L Wide, S Werner, P Roos. Characterization of dimeric forms of

human pituitary growth hormone by bioassay, radioreceptor assay, and radioimmunoassay.

Acta endocrinologica 03/1990; 122(2):241-8.

50. Vieira JG1, Lombardi MT, Nishida SK. Monoclonal antibody-based immunoenzymometric

assay for serum human growth hormone. Braz J Med Biol Res. 1990;23(3-4):293-6.

51. Demers, L.M., Pituitary Function in Tietz Fundamentals in clinical chemistry, 5th Edition, 2001,

39, 822-38 41, 857-75.

52. Greenwood, F.C., Hunter, W.M. and Glover, iS. The preparation of 1-131 labeled human

growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. 3., 1963;89:114-23.

53. Pudek MR. Adrenal hormones. In: Kaplan LA, Pesce AJ, editors. Clinical chemistry: therapy,

analysis, and correlation. St. Louis: CV Mosby, 1989. p.672-81.

54. Whitley RJ, Meikle AW, Watts NB. Endocrinology, part VI: adrenocortical steroids. In: Burtis

CA, Ashwood ER, editors. Textbook of clinical chemistry, 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders,

1994. p.1808-21.

55. Miller J, Crapo L. The biochemical diagnosis of hypercortisolism. Endocrinologist 1994;4(1):7-

16.


56. Morris DJ: The Metabolism and mechanism of action of Aldosferone. Endocrin Rev. 2:234-

247, 1981.

57. Chopra, Li., Nelson, J.C., Solomon, D.H. and Beall, G.N. Production of antibodies specifically

binding triiodothyronin and thyroxine. J.Clin.Endocrinol. Metab., 1971; 32:299-308.

58. Cheung. M.d. snd Slaunwhite, W.R. Use of polyethylene glycol in separating bound from

unbound ligand in radioimmunoassay of thyroxine. Clin.Chem., 1976;22:299-304.

59. Erlsnger. B.F., Borek, F., Beiser, S.M. and Lieberman, S. Steroid-protein conjugates. II.

Preparstion and characterization of conjugates of bovine serum albumin with progesterone,

deoxycorticoaterone and estrone.i.Biol. Chem., 1959;234:1090-94.

60. Erlsnger, B.F., Borek, F., Beiser, SM. snd Liebermsn, S. Steroid-proteinconjugates. L reparation

and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone sandwith

cortisone. J.Biol.Chem., 1957;228:713-27.

61. Dean, P.D., Edey, D. and iohnason, M.W. Preparation of 17 B oestradiol-6-(O-car hoxymethyl)-

oxime-bovine serum albumin conjugates. Steroids, 1971;18:593-99.

62. Kayisli U, Selam B, Guzeloglu-Kayisli O, Demir R, Arici A (2003). "Human chorionic

gonadotropin contributes to maternal immunotolerance and endometrial apoptosis by

regulating Fas-Fas ligand system". J. Immunol. 171 (5): 2305–13.

63. Askling J, Erlandsson G, Kaijser M, Akre O, Ekbom A (December 1999). "Sickness in pregnancy

and sex of child". Lancet 354 (9195): 2053.

64. Michels KB, Xue F, Colditz GA, Willett WC (April 2007). "Induced and spontaneous abortion

and incidence of breast cancer among young women: a prospective cohort study". Arch.

Intern. Med. 167 (8): 814–20.

65. "WHO Reference Reagent Human Chorionic Gonadotrophin (Purified) NIBSC code: 99/688

Instructions for use (Version 3.0, Dated 05/11/2007)".

66. Canfield RE, Ross GT (1976). "A new reference preparation of human chorionic gonadotrophin

and its subunits". Bulletin of the World Health Organization 54 (4): 463–472.

67. Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus, (2006). Henry's Clinical Diagnosis and

Management by Laboratory Methods (21st ed.). Philadelphia: Saunders. ISBN 1-4160-0287-1.

68. Waddell, Rebecca Smith (2006). "FertilityPlus.org". Home Pregnancy Test hCG Levels and FAQ.


Θέμα 3

Αντισώματα: Δομή, είδη, τρόποι εργαστηριακής παρασκευής, χρήσεις τους σε

εργαστηριακές τεχνικές και στη θεραπεία ασθενειών.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Ο όρος αντίσωμα αναφέρθηκε πρώτη φορά από το Γερμανό γιατρό Ehrlich.

Τα αντισώματα είναι γλυκοπρωτείνες που αποτελούνται από μία ή περισσότερες υπομονάδες, κάθε

μία από αυτές αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανά δύο όμοιες: δύο μεγάλες τις

βαριές (H) και δύο μικρές τις ελαφριές (L).

Το αμινοτελικό άκρο των αλυσίδων παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία στην αλληλουχία των αμινοξέων

και ονομάζεται μεταβλητή (V) περιοχή, ενώ το υπόλοιπο τμήμα του αντισώματος είναι σχετικά

σταθερό και ονομάζεται σταθερή περιοχή (C).

Οι πέντε κλάσεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.

Τα αντισώματα χρησιμοποιούνται στη διάγνωση με μεθόδους, όπως ανοσοαποτύπωση και

ανοσοκαθίζηση είναι δύο μέθοδοι όπου χρησιμοποιούνται αντισώματα για τον εντοπισμό

αντιγόνων (κυρίως πρωτεϊνών), στη μέθοδο Western Blot, στην ELISA (enzyme-linked

immunosorbent assay), στην κυτταρομετρία ροής (fluorescence-activated cell scanning), στον

ανοσοφθορισμό και στην ανοσοιστοχημεία.

Χρησιμοποιούνται στη θεραπεία ασθενειών, όπως ανοσοανεπάρκειες, αυτοάνοσες ασθένειες και

διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και στην τυποποίηση ομάδων αίματος, εντοπισμό μιας πιθανής

κύησης, έλεγχο συμβατότητας στις μεταμοσχεύσεις.


Αντισώματα – Δομή – Είδη

Η αναγνώριση των ξένων αντιγόνων είναι ένα βασικό στοιχείο στην ειδική άμυνα. Δύο ξεχωριστά

μόρια εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή: οι ανοσοσφαιρίνες (αντισώματα) και οι υποδοχείς

αντιγόνων των Τ λεμφοκυττάρων (TCRs). Τα μόρια αυτά χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξειδίκευση

και παρουσιάζουν τεράστια ποικιλία. Αυτό προκύπτει από την ανακατάταξη που συμβαίνει στα

γονίδια που τα κωδικοποιούν και οδηγεί σε μεγάλο αριθμό διαφορετικών ανοσοσφαιρινών και

TCRs, ώστε να αναγνωρίζονται πολλά διαφορετικά αντιγόνα.

Οι ανοσοσφαιρίνες είναι ομάδα γλυκοπρωτεινών στον ορό του αίματος και στο υγρό των ιστών σε

όλα τα θηλαστικά. Μια ομάδα λευκών αιμοσφαιρίων τα πρόδρομα Β λεμφοκύτταρα διαθέτουν στην

επιφάνεια τους ειδικά αντισώματα υποδοχείς. Η σύνδεση των αντισωμάτων με το αντιγόνο οδηγεί

στην ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων τα οποία διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα τα

οποία εκκρίνουν μεγάλο αριθμό αντισωμάτων στο αίμα και τη λέμφο.

Ο όρος αντίσωμα αναφέρθηκε πρώτη φορά από το Γερμανό γιατρό Ehrlich. [1, 2]

Η μελέτη των αντισωμάτων και η ανάπτυξη της θεωρίας της χυμικής ανοσίας ξεκίνησε το 1890 από

τον Kitasato Shibasaburō. [3]

Ο Linus Pauling επιβεβαίωσε τη θεωρία κλειδιού κλειδαριάς που είχε προταθεί από τον Ehrlich. [4]

Τα αντισώματα είναι γλυκοπρωτείνες που αποτελούνται από μία ή περισσότερες υπομονάδες, κάθε

μία από αυτές αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανά δύο όμοιες: δύο μεγάλες τις

βαριές (H) και δύο μικρές τις ελαφριές (L).

Το αμινοτελικό άκρο των αλυσίδων παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία στην αλληλουχία των αμινοξέων

και ονομάζεται μεταβλητή (V) περιοχή, ενώ το υπόλοιπο τμήμα του αντισώματος είναι σχετικά

σταθερό και ονομάζεται σταθερή περιοχή (C).

Κάθε ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από μια μεταβλητή VL και μια σταθερή περιοχή CL. Οι βαριές

αλυσίδες έχουν μια μεταβλητή περιοχή VH και τρεις σταθερές CH1, CH2, CH3.

Κάθε βαριά αλυσίδα έχει περίπου διπλάσιο αριθμό αμινοξέων από την ελαφριά αλυσίδα.

http://en.wikipedia.org/wiki/Kitasato_Shibasabur%C5%8D

http://en.wikipedia.org/wiki/Linus_Pauling


Οι πέντε κλάσεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.

Διακρίνονται από τον τύπο της βαριάς αλυσίδας. IgG έχουν γ αλυσίδες, IgM έχουν μ αλυσίδες, IgA

έχουν α αλυσίδες, IgE ε αλυσίδες, and IgD έχουν δ αλυσίδες.

Οι διαφορετικές βαριές αλυσίδες επιτρέπουν στις ανοσοσφαιρίνες να λειτουργούν σε διαφορετικά

στάδια της ανοσοβιολογικής απόκρισης.

Ενώ υπάρχουν πέντε τύποι βαριών αλυσίδων, υπάρχουν μόνο δύο τύποι ελαφριάς αλυσίδας: kappa

(κ) και lambda (λ). Εικόνες 1, 2, 3, 4, 5.

Εικόνα 1: Δομή αντισώματος. [5]


Εικόνα 2: Δομή αντισώματος, διακρίνονται οι ελαφριές και οι βαριές αλυσίδες, οι δισουλφιδικοί

δεσμοί που τις συγκρατούν και το σημείο σύνδεσης του αντιγόνου.

Εικόνα 3: Δράσεις αντισωμάτων, ενεργοποίηση συμπληρώματος, ενίσχυση φαγοκυττάρωσης.


Εικόνα 4: Φυσικοχημικές ιδιότητες των ανοσοσφαιρινών.


Εικόνα 5: Κλάσεις ανοσοσφαιρινών. [6, 7]


IgG

Οι ελαφριές και οι βαριές αλυσίδες συνδέονται με ένα συνδυασμό μη ομοιοπολικών και

ομοιοπολικών δεσμών (δισουλφιδικοί). Κάθε ανοσοσφαιρίνη Ig περιέχει δύο θέσεις σύνδεσης του

αντιγόνου.

Η ανοσοσφαιρίνη IgG, είναι η κυρίαρχη Ig στον ανθρώπινο ορό και αποτελεί το 75%. Παράγεται ως

μέρος της δευτερογενούς ανοσοβιολογικής απόκρισης σε ένα αντιγόνο. Διέρχεται τον ανθρώπινο

πλακούντα και είναι υπεύθυνη για την προστασία του νεογνού στους πρώτους μήνες της ζωής.

Ιδιότητες IgG:

Μοριακό βάρος: 150,000

H-chain type (MW): gamma (53,000)

Συγκέντρωση ορού: 10 έως 16mg/mL

Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 75%

Αποτελείται από τέσσερις υποομάδες IgG1, 2, 3, και 4, ανάλογα με τη συγκέντρωση τους στον ορό.

[8]


IgA

Η IgA υπάρχει σε μονομερή και διμερή μορφή και αποτελεί το 15% των ανοσοσφαιρινών στον ορό

του αίματος. Βρίσκεται στο σάλιο, στα δάκρυα και ο βασικός ρόλος είναι να εμποδίζει την είσοδο

των αντιγόνων στην κυκλοφορία.

Ιδιότητες IgA:

Μοριακό βάρος: 320,000 (secretory)

H-chain type (MW): alpha (55,000)

Συγκέντρωση ορού: 1 to 4mg/mL


IgM

Η IgM υπάρχει ως πενταμερές στα θηλαστικά, κυριαρχεί στην πρωτογενή ανοσοβιολογική

απόκριση. Η ανοσοσφαιρίνη μπορεί να προκαλέσει συγκόλληση κυττάρων μικροοργανισμών, οι

οποίοι στη συνέχεια καταστρέφονται από τις πρωτεΐνες του συμπληρώματος ή τα μακροφάγα.

Είναι η πρώτη ανοσοσφαιρίνη που συνθέτεται από το νεογνό και παίζει ρόλο σε κάποιες

αυτοάνοσες ασθένειες.

Ιδιότητες IgM:


H-chain type (MW): mu (65,000)

Συγκέντρωση ορού: 0.5 to 2mg/mL



IgD και IgE

IgD και IgE βρίσκονται σε μικρές συγκεντρώσεις. IgD βρίσκεται ως μεμβρανικός υποδοχέας

αντιγόνων στα ώριμα Β λεμφοκύτταρα. IgE λειτουργούν έναντι των παρασίτων και είναι υπεύθυνες

στις αλλεργικές αντιδράσεις.

Ιδιότητες IgD:


H-chain type (MW): delta (70,000)

Συγκέντρωση ορού: 0 to 0.4mg/mL

Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 0.2%

Ιδιότητες IgE:


H-chain type (MW): epsilon (73,000)

Συγκέντρωση ορού: 10 to 400ng/mL

Ποσοστό επί του συνόλου των ανοσοσφαιρινών: 0.002%

Ο αριθμός των διαφορετικών αντισωμάτων που μπορούν να παραχθούν είναι πολύ μεγάλος, θα

έπρεπε να υπάρχει και αντίστοιχα μεγάλος αριθμός γονιδίων που θα τα κωδικοποιεί. Στην

πραγματικότητα τα αντισώματα κωδικοποιούνται από μικρό αριθμό γονιδίων τα οποία υφίστανται

διαδικασία σωματικής ανακατάταξης και ανασυνδυασμού κατά το σχηματισμό των Β

λεμφοκυττάρων.

Τα γονίδια για την ελαφρά αλυσίδα κ βρίσκονται στη ζώνη 2p13 του χρωμοσώματος 2, τα γονίδια

για την ελαφρά αλυσίδα λ στη ζώνη 22q11 του χρωμοσώματος 22 και τα γονίδια για τους πέντε

ισοτύπους της βαριάς αλυσίδας στη ζώνη 14q32 του χρωμοσώματος 14.

Εικόνες 6, 7, 8


Η μεταβλητή περιοχή της ελαφριάς αλυσίδας κωδικοποιείται από δύο τμήματα γονιδίων το

μεταβλητό V και το συνδετικό J, ενώ η μεταβλητή της βαριάς αλυσίδας κωδικοποιείται από το

μεταβλητό τμήμα V, το συνδετικό τμήμα J και το τμήμα D.

[9-21]

Εικόνα 6: Γενετική βάση σύνθεσης κ αλυσίδων στον άνθρωπο. [22, 23]


Εικόνα 7: Γονιδιακοί τόποι των ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών. Χρωμόσωμα 14, 38-46 γονίδια

μεταβλητής περιοχής, 27 γονίδια D περιοχής και 6 γονίδια J. Χρωμόσωμα 22, 30 γονίδια

μεταβλητής και 5 γονίδια J. Χρωμόσωμα 2, 34-40 γονίδια μεταβλητής και 5 J.

Εικόνα 8: Σωματικός ανασυνδυασμός γονιδίων ανοσοσφαιρινών.


Εργαστηριακή παρασκευή αντισωμάτων

Το 1976, οι Georges Kohler και Cesar Milstein, στο Cambridge, ανέπτυξαν τεχνική παραγωγής και

απομόνωσης αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένου αντιγόνου.

Ένα επιλεγμένο αντιγόνο χορηγείται με ένεση σε ποντίκι και προκαλεί ανοσολογική αντίδραση με

αποτέλεσμα να αρχίσει η παραγωγή αντισωμάτων από εξειδικευμένα Β-λεμφοκύτταρα. Ύστερα από

δύο εβδομάδες αφαιρείται ο σπλήνας και απομονώνονται τα Β-λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά

συντήκονται με καρκινικά κύτταρα (μυέλωμα, καρκινικά κύτταρα Β λεμφοκυττάρων) και παράγονται

τα υβριδώματα που παράγουν μονοκλωνικά αντισώματα. Η σύντηξη γινόταν με αναλογία 1 κύτταρο

μυελώματος και 10 Β λεμφοκύτταρα. Τα υβριδώματα μπορούν να φυλάσσονται για μεγάλα χρονικά

διαστήματα στην κατάψυξη (-80 °C) και να παράγουν οποιαδήποτε στιγμή το συγκεκριμένο

μονοκλωνικά αντίσωμα σε μεγάλες ποσότητες. [24] Εικόνα 9


Εικόνα 9: Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. [25]


Πολυκλωνικά αντισώματα (Polyclonal Antibodies)

Τα πολυκλωνικά αντισώματα είναι ένα ετερογενές μείγμα αντισωμάτων έναντι διαφορετικών

αντιγονικών καθοριστών του ίδιου αντιγόνου. Τα αντισώματα αυτά παράγονται από διαφορετικούς

κλώνους Β λεμφοκυττάρων. Συνήθως παράγονται σε κουνέλια αλλά και σε άλλα θηλαστικά (αίγες,

αγελάδες, κ.α.)

Μονοκλωνικά αντισώματα (Monoclonal Antibodies)

Τα μονοκλωνικά αντισώματα αναγνωρίζουν έναν αντιγονικό καθοριστή και παράγονται από μια

ομάδα όμοιων Β λεμφοκυττάρων. Εικόνα 12

Συνήθως παράγονται σε ποντικούς και το ανοσογόνο χορηγείται κάθε δύο εβδομάδες για μια

περίοδο δύο μηνών. Η ανοσοαπόκριση του ζώου παρακολουθείται και όταν είναι ικανοποιητική

απομονώνονται Β λεμφοκύτταρα από τον σπλήνα και συντήκονται με αθάνατες κυτταρικές σειρές

(κύτταρα μυελώματος).

Προκύπτουν τα υβριδώματα τα οποία καλλιεργούνται και παράγουν τα επιθυμητά αντισώματα.

Τα αντισώματα καθαρίζονται με χρωματογραφία. Εικόνες 10, 11

Εικόνα 10: Παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων.


Εικόνα 11: Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων.

Εικόνα 12: Σύνδεση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε έναν αντιγονικό καθοριστή


Χρήσεις αντισωμάτων σε εργαστηριακές τεχνικές και στη θεραπεία ασθενειών

Ανοσοαποτύπωση και ανοσοκαθίζηση είναι δύο μέθοδοι όπου χρησιμοποιούνται αντισώματα για

τον εντοπισμό αντιγόνων (κυρίως πρωτεϊνών). Στη μέθοδο Western Blot χρησιμοποιούνται για την

ανίχνευση πρωτεϊνών που διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρεση. [26, 27, 28] Εικόνα 14.

Η ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) είναι μια άλλη εφαρμογή των αντισωμάτων στον

εντοπισμό διαλυτών αντιγόνων. Επιτρέπει τη ταυτόχρονη ανάλυση πολλών δειγμάτων και

χρησιμοποιεί δύο αντισώματα. Το ένα αντίσωμα βρίσκεται συνδεδεμένο σε στερεή φάση (σε

τρυβλίο 96 θέσεων) και θα δεσμεύσει το αντιγόνο και το άλλο αντίσωμα χρησιμοποιείται για να

ανιχνεύσει το ακινητοποιημένο αντιγόνο. [29]

Μια πλατφόρμα με μικροσυστοιχίες από αντισώματα (antibody microarray platform) που

συνδέονται με διαφορετικές πρωτεΐνες και μπορούν να ανιχνεύσουν τη φωσφορυλίωση των

πρωτεϊνών. [30, 31]

Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ (X-ray crystallography) έχει ωφεληθεί από τη χρήση των

αντισωμάτων. [32]

Στην κυτταρομετρία ροής (fluorescence-activated cell scanning “FACScan”) χρησιμοποιούνται

χρωστικές που συνδέονται με αντισώματα. [33, 34]

Αντισώματα χρησιμοποιούνται στον ανοσοφθορισμό και στην ανοσοιστοχημεία. Εξετάζεται η

έκφραση πρωτεϊνών σε συγκεκριμένους ιστούς, ή εντοπισμός πρωτεϊνών μέσα στα κύτταρα με τη

χρήση μικροσκοπίου. [35] Εικόνα 13


Εικόνα 13: Ανοσοφθορισμός ευκαρυωτικού κυτταρικού σκελετού. Μικροινίδια ακτίνης φαίνονται

κόκκινα, οι μικροσωληνίσκοι πράσινοι και οι πυρήνες μπλε.

Εικόνα 14: Μέθοδος Western blot

http://en.wikipedia.org/wiki/File:FluorescentCells.jpg


Ασθένειες

Οι ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες χρησιμοποιούνται θεραπευτικά στις ανοσοσανεπάρκειες, όπως την

αγαμμασφαιρινοπάθεια, το σύνδρομο Wiskott Aldrich.

Χορηγούνται και σε ασθενείς με χαμηλά επίπεδα Β λεμφοκυττάρων και σε άτομα με πολλαπλό

μυέλωμα και χρόνια λεμφοειδή λευχαιμία. [36, 37]

Η ασθένεια Kawasaki είναι μια συστηματική αγγειίτιδα που εμφανίζεται στην παιδική ηλικία. Στην

ασθένεια η χορήγηση ανοσοσφαιρινών μειώνει τις επιπλοκές. [38]

Συνιστάται η χρήση ανοσοσφαιρινών στην ανοσό θρομβοκυτταροπενική πορφύρα. [39]

Το σύνδρομο Guillain-Barré είναι μια οξεία ανοσοπολυνευροπάθεια.

Η χρήση ανοσοσφαιρινών είναι σημαντική όταν εφαρμοστεί τις δύο πρώτες εβδομάδες της

ασθένειας. [40]

Η απορρύθμιση του ανοσοποιητικού σε παιδιά με HIV είναι πολύ σημαντική σε σχέση με τον

ενήλικά. Η χορήγηση Ig σε παιδία με HIV οδήγησε σε μείωση των βακτηριακών λοιμώξεων, ενώ το

ίδιο αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε ενήλικες. [41]

Χρησιμοποιούνται Ig στην απλασία ερυθρών αιμοσφαιρίων, στην πορφύρα μετά τη μετάγγιση,

στην επίκτητη αιμορροφιλία, στην αυτοάνοση αιμορροφιλία, στην αιμολυτική ασθένεια του

νεογνού.

[42, 43, 44, 45, 46]

Η χρήση των ανοσοσφαιρίνων αποδεικνύεται σημαντική και στη νευρολογία, όπως στις χρόνιες

φλεγμονώδεις νευροπάθειες, και στη μυασθένεια Gravis. [47, 48]

Έρευνες έδειξαν σημαντική αύξηση επιβίωσης σε ασθενείς με επιδερμική τοξική νεκρόλυση και

σύνδρομο Stevens-Johnson μετά από χορήγηση Ig. [49]

Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η Ig μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στη ρευματολογία, όπως

στον ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus). [50]

Χρησιμοποιούνται επίσης στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, στην πολλαπλή σκλήρωση και στην

ψωρίαση. [51, 52, 53, 54]


Τα αντισώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικά. Η πιο ενδιαφέρουσα εφαρμογή

τους αφορά τη θεραπεία του καρκίνου. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν στην εξωτερική επιφάνεια

τους μεγάλη ποικιλία αντιγόνων που δεν υπάρχουν στα φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού, και

ονομάζονται καρκινικά αντιγόνα. Έτσι μπορούν να κατασκευαστούν μονοκλωνικά αντισώματα

εναντίον αυτών των αντιγόνων. Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι πολύ ειδικά μόνο για τα

καρκινικά κύτταρα και μπορούν να «γίνουν μεταφορείς» ισχυρών αντικαρκινικών φαρμάκων. Όταν

εισαχθούν στον οργανισμό, βρίσκουν και προσβάλλουν τους καρκίνους-στόχους. Τα αντικαρκινικά

φάρμακα, που είναι συνδεδεμένα με τα αντισώματα, δρουν κατευθείαν στα καρκινικά κύτταρα και

τα καταστρέφουν. Επιτρέπουν έτσι τη θεραπεία με αποφυγή της χειρουργικής επέμβασης και των

δυσάρεστων επιπτώσεων της χημειοθεραπείας.

Χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του λεμφώματος non-Hodgkin's, σε καρκίνους του εντέρου, του

εγκεφάλου και του στήθους. [55, 56]

Δύο αντισώματα τα rituxan και Herceptin έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου.

Το Rituxan είναι ειδικό για το αντιγόνο CD20 που στην επιφάνεια φυσιολογικών και καρκινικών Β

λεμφοκυττάρων και ενδείκνυται για τη θεραπεία του λεμφώματος non-Hodgkin (NHL).

Το άλλο αντίσωμα trastuzumab (herceptin), είναι ειδικό για τον υποδοχέα του ανθρώπινου

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα , HER2. Ο υποδοχέας HER2 υπερεκφράζεται σε 25–30% των

περιπτώσεων του πρωτογενούς καρκίνου του στήθους. [57]

Ο παράγοντας Rhesus η αντιγόνο D, είναι μια πρωτεΐνη στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων

και χαρακτηρίζει τα άτομα ως Rhesus θετικά (Rh+), ενώ αν δεν υπάρχει είναι Rh αρνητικά (Rh–).

Κατά τον τοκετό ερυθρά του εμβρύου μπορούν να μπουν στην κυκλοφορία της μητέρας. Αν η

μητέρα είναι ρέζους αρνητική και το παιδί ρέζους θετικό ενεργοποιείται η άμυνα της μητέρας και

παράγει αντιρέζους αντισώματα και στην επόμενη εγκυμοσύνη θα δημιουργηθεί πρόβλημα

(αιμολυτικά ασθένεια του νεογνού). [58]

Rho(D) ανοσοσφαιρίνες χορηγούνται αμέσως μετά τον τοκετό, ώστε να μην ευαισθητοποιηθεί η

άμυνα της μητέρας. [59]

http://en.wikipedia.org/wiki/Rho(D)_immune_globulin


Για την επιλογή οργάνων συμβατών για μεταμόσχευση. Τα κύτταρα των οργάνων έχουν στην

επιφάνειά τους ειδικά αντιγόνα επιφανείας, που αναγνωρίζονται από ειδικά μονοκλωνικά αντισώ-

ματα. Με τα μονοκλωνικά αντισώματα μπορεί να γίνει έλεγχος των οργάνων δωρητών, για να δια-

πιστωθεί αν ταιριάζουν ανοσολογικά με τα αντίστοιχα των ασθενών. Έτσι, είναι δυνατόν να

αποφευχθεί η απόρριψη και οι μεταμοσχεύσεις να είναι επιτυχείς.

Η ανίχνευση αντισωμάτων είναι μια συχνή διαδικασία στη διαγνωστική, όπως στην περίπτωση του

ιού Epstein-Barr.

Στην κλινική ανοσολογία κυρίως με νεφελομετρία γίνεται εκτίμηση των ανοσοσφαιρινών του

ασθενή. Αυξημένα επίπεδα IgA παρατηρούνται στην κίρρωση του ήπατος από το αλκοόλ, ενώ

αυξημένη IgM δείχνει ιική ηπατίτιδα και η IgG αυξάνεται στην ιική ηπατίτιδα και στην αυτοάνοση

ηπατίτιδα. [60]

Αντισώματα χρησιμοποιούνται για την τυποποίηση των ομάδων αίματος, και στον εντοπισμό μιας

πιθανής κύησης. Αντισώματα ειδικά για τη χοριακή γοναδοτροπίνη χρησιμοποιούνται στα τεστ

κυήσεως.



1. Lindenmann, Jean (1984). "Origin of the Terms 'Antibody' and 'Antigen'". Scand. J.

Immunol. 19 (4): 281–5.

2. Padlan, Eduardo (1994). "Anatomy of the antibody molecule". Mol. Immunol. 31(3):

169–217.

3. AGN (1931). "The Late Baron Shibasaburo Kitasato". Canadian Medical Association

Journal 25 (2): 206.

4. "The Linus Pauling Papers: How Antibodies and Enzymes Work". Archived from the

original on 17 November 2010. Retrieved 5 June 2007.

5. R.W. Burry, Immunocytochemistry, Springer Science+Business Media, LLC 2010.

6. David Male, Jonathan Brostoff, David B Roth, Ivan Roitt, Immunology. Seventh Edition

MOSBY ELSEVIER. 2006, Elsevier Limited.

7. Burton D, Woof JM. Human antibody effector function. Adv Immunol 1992;51:1–84.

8. Robert G. Hamifton: Human lgG Subclass Measurements in the Clinical Laboratory.

CLIN. CHEM. 33/10, 1707-1725 (1987).

9. Arakawa, H. & Buerstedde, J. (2004) Immunoglobulin gene conversion: insights from

bursal B cells and the DT40 cell line. Developmental Dynamics 229, 458–464.

10. Carroll, M.C. (2008) Complement and humoral immunity. Vaccine 26, I28–I33.

11. Hozumi, N. & Tonegawa, S. (1976) Evidence for somatic rearrangement of

immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the USA 73, 3628–3632.

12. Jung, D. & Alt, F.W. (2004) Unraveling V(D)J recombination: insights into gene

regulation. Cell 116, 299–311.

13. Maizels, N. (2005) Immunoglobulin gene diversification. Annual Review of Genetics 39,

23–46.

14. Maki, R., Traunecker, A., Sakano, H., Roeder, W. & Tonegawa, S. (1980) Exon shuffling

generates an immunoglobulin heavy chain gene. Proceedings of the National Academy

of Sciences of the USA 77, 2138–2142.

15. Neuberger, M.S. (2008) Antibody diversification by somatic mutation: from Burnet

onwards. Immunology and Cell Biology 86, 124–132.

16. Padlan, E.A. (1994) Anatomy of the antibody molecule. Molecular Immunology 31,

169–217.


17. Padlan, E.A. (1996) X-ray crystallography of antibodies. Advances in Protein

Chemistry49, 57–133.

18. Peled, J.U., Kuang, F.L., Iglesias-Ussel, M.D., Roa, S., Kalis, S.L., Goodman, M.F. &

Scharff, M.D. (2008) The biochemistry of somatic hypermutation. Annual Review of

Immunology 26, 481–511.

19. Roth, D.B. (2003) Restraining the V(D)J recombinase. Nature Reviews Immunology 3,

656–666.

20. Schroeder, H.W. Jr. & Cavacini, L. (2010) Structure and function of immunoglobulins

.Journal of Allergy and Clinical Immunology 125, S41–S52.

21. Yoo, E.M. & Morrison, S.L. (2005) IgA: an immune glycoprotein. Clinical Immunology

116, 3–10.

22. A. Rabson, I.M. Roitt, P.J. Delves. 2005. Immunology. Published by Blackwell Publishing

Ltd.

23. Cedar, H. & Bergman, Y. (1999) Developmental regulation of immune system gene

rearrangement. Current Opinion in Immunology, 11, 64–9.

24. KohlerGand MilsteinC. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

predefined specificity. Nature 256:495–497.

25. Zola H. (2000) Monoclonal Antibodies: The Basics Oxford. UK: Bios Scientific

Publishers.

26. Bonifacino JS, Dell’Angelica EC, Springer TA. 2001. Immunoprecipitation.

27. Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W, eds. Current

Protocols in Immunology. New York: John Wiley and Sons, Inc. p 8.3.1-8.3.28.

28. Harlow E, Lane D. 1999. Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor

NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

29. Hornbeck P. 1991. Enzyme-linked immunosorbent assay. In: Coligan JE, Kruisbeek AM,

Margulies DH, Shevach EM, Strober W, eds. Current Protocols in Immunology. New

York: John Wiley and Sons, Inc. p 2.1.2-2.1.22.

30. Michaud GA, Salcius M, Zhou F, Bangham R, Bonin J, Guo H, Salcius M, Predki PF,

Schweitzer BI. 2003. Analyzing specificity with whole proteome microarrays. Nature

Biotechnol 21:1509-1512.

31. Nielsen UB, Geierstanger BH. 2004. Multiplexed sandwich assays in microarray format.

J Immun Methods 290:107-120.


32. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, MacKinnon R. 2003. X-ray structure

of a voltage-dependent K 1 channel. Nature 423:33-41.

33. Givan AL. 2001. Flow Cytometry: First Principles. New York: Wiley-Liss, Inc.

34. Brehm-Stecher B, Johnson E (2004). "Single-cell microbiology: tools, technologies, and

applications". Microbiol Mol Biol Rev 68 (3): 538–559.

35. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor NY: Cold

Spring Harbor Laboratory Press.

36. Gamm H, Huber C, Chapel H, Lee M, Ries F, Dicato MA. Intravenous immune globulin

in chronic lymphocytic leukaemia. Clin Exp Immunol. 1994; 97(Suppl 1): 17-20.

37. Lee ML, Gale RP, Yap PL. Use of intravenous immunoglobulin to prevent or treat

infections in persons with immune deficiency. Annu Rev Med. 1997; 48: 93-102.

38. Newburger JW, Takahashi M, Burns JC, Beiser AS, Chung KJ, Duffy CE, et al. The

treatment of Kawasaki syndrome with intravenous gamma globulin. N Engl J Med.

1986; 315(6): 341-7.

39. Imbach P, Barandun S, d'Apuzzo V, Baumgartner C, Hirt A, Morell A, et al. High-dose

intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood.

Lancet. 1981; 1(8232): 1228-31.

40. Elovaara I, Apostolski S, van Doorn P, Gilhus NE, Hietaharju A, Honkaniemi J, et al.

EFNS guidelines for the use of intravenous immunoglobulin in treatment of

neurological diseases: EFNS task force on the use of intravenous immunoglobulin in

treatment of neurological diseases. Eur J Neurol. 2008; 15(9): 893-908.

41. Deener A, Mehra A, Bernstein L, Shliozberg J, Rubinstein A. Intravenous

gammaglobulin treatment in HIV-1 infection. Immunol Allergy Clin North Am. 2008;

28(4): 851-9.

42. Chuhjo T, Nakao S, Matsuda T. Successful treatment of persistent erythroid aplasia

caused by parvovirus B19 infection in a patient with common variable

immunodeficiency with low-dose immunoglobulin. Am J Hematol. 1999; 60(3): 222-4.

43. Ziman A, Klapper E, Pepkowitz S, Smith R, Garratty G, Goldfinger D. A second case of

post-transfusion purpura caused by HPA-5a antibodies: successful treatment with

intravenous immunoglobulin. Vox Sang. 2002; 83(2): 165-6.

44. Provan D, Nokes TJC, Agrawal S, Winer J, Wood P, Group IGDGotIEW Clinical guidelines

for immunoglobulin use. 2nd ed London: Department of Health; 2008.


45. Kurtzberg J, Friedman HS, Chaffee S, Falletta JM, Kinney TR, Kurlander R, et al. Efficacy

of intravenous gamma globulin in autoimmune-mediated pediatric blood dyscrasias.

Am J Med. 1987; 83(4A): 4-9.

46. Alcock GS, Liley H. Immunoglobulin infusion for isoimmune haemolytic jaundice in

neonates. Cochrane Database Syst Rev. 2002(3).

47. Mahdi-Rogers M, Rajabally YA. Overview of the pathogenesis and treatment of chronic

inflammatory demyelinating polyneuropathy with intravenous immunoglobulins.

Biologics. 2010; 4: 45-9.

48. Gajdos P, Chevret S, Toyka K. Intravenous immunoglobulin for myasthenia gravis.

Cochrane Database Syst Rev. 2008(1).

49. Trent JT, Kirsner RS, Romanelli P, Kerdel FA. Analysis of intravenous immunoglobulin

for the treatment of toxic epidermal necrolysis using SCORTEN: The University of

Miami Experience. Arch Dermatol. 2003; 139(1): 39-43.

50. Zandman-Goddard G, Blank M, Shoenfeld Y. Intravenous immunoglobulins in systemic

lupus erythematosus: from the bench to the bedside. Lupus. 2009; 18(10): 884-8.

51. Feldmann M, Maini R (2001). "Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what

have we learned?". Annu Rev Immunol 19 (1): 163–196.

52. Doggrell S (2003). "Is natalizumab a breakthrough in the treatment of multiple

sclerosis?". Expert Opin Pharmacother 4 (6): 999–1001.

53. Krueger G, Langley R, Leonardi C, Yeilding N, Guzzo C, Wang Y, Dooley L, Lebwohl M

(2007). "A human interleukin-12/23 monoclonal antibody for the treatment of

psoriasis". N Engl J Med 356 (6): 580–592.

54. Chan, A.C. & Carter, P.J. (2010) Therapeutic antibodies for autoimmunity and

inflammation. Nature Reviews Immunology 10, 301–316.

55. Plosker G, Figgitt D (2003). "Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin's lymphoma

and chronic lymphocytic leukaemia". Drugs 63 (8): 803–843.

56. Vogel C, Cobleigh M, Tripathy D, Gutheil J, Harris L, Fehrenbacher L, Slamon D, Murphy

M, Novotny W, Burchmore M, Shak S, Stewart S (2001). "First-line Herceptin

monotherapy in metastatic breast cancer". Oncology. 61. Suppl 2 (Suppl. 2): 37–42.

57. Scallon BJ, Snyder LA, AndersonGMet al. (2006) A review of antibody therapeutics and

antibody-related technologies for oncology. Journal of Immunotherapy 29: 351–364.


58. Urbaniak S, Greiss M (2000). "RhD haemolytic disease of the fetus and the newborn".

Blood Rev 14 (1): 44–61.

59. Fung Kee Fung K; Eason E; Crane J; Armson A; De La Ronde S; Farine D; Keenan-Lindsay

L; Leduc L; Reid GJ; Aerde JV; Wilson RD; Davies G; Désilets VA; Summers A; Wyatt P;

Young DC; Maternal-Fetal Medicine Committee; Genetics Committee (2003).

"Prevention of Rh alloimmunization". J Obstet Gynaecol Can 25 (9): 765–73.

60. Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology (4th ed.). Thomson Learning.


Θέμα 4

Πρόσφατα ανακαλύφθηκε ένα ανθρώπινο γονίδιο, στο οποίο ένας πολυμορφισμός του, πιθανόν

εμπλέκεται στη μυωπία. Να γραφεί μια ερευνητική εργασία στην οποία θα αναλυθούν οι τρόποι

και οι μεθοδολογίες που θα επιτρέψουν τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου στον ελληνικό

πληθυσμό.

Α. ΤΙΤΛΟΣ:

Μελέτη των μεταλλάξεων των γονιδίων ZNF644 και SCO2 που εμπλέκονται στην εμφάνιση της

μυωπίας στον ελληνικό πληθυσμό.

Β. ΣΤΟΧΟΣ:

Η μυωπία μπορεί να είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης πολλών γονιδίων και περιβάλλοντος ή

πιθανόν να αποτελεί και μονογονιδιακό χαρακτήρα. Μπορεί να ακολουθεί αυτοσωμικό

υπολειπόμενο, αυτοσωμικό επικρατές ή φυλοσύνδετο τύπο κληρονομικότητας.

Στην έρευνα αυτή γίνεται προσπάθεια άμεσης συσχέτισης ενός γονιδίου και της εμφάνισης

μυωπίας. Η έρευνα θα διεξαχθεί σε εφήβους. Η εύρεση της μετάλλαξης που πιθανόν θα

προδιαθέτει για την εμφάνιση μυωπίας θα συνδεθεί με συμβουλές στους εφήβους για τον τρόπο

μελέτης ή διατροφής, με στόχο την καθυστέρηση ή την αναβολή της εμφάνισης της διαταραχής.


Γ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ:

Η μυωπία αποτελεί μια σύνθετη διαταραχή η οποία προκαλείται από την αλληλεπίδραση γενετικών

και περιβαλλοντικών παραγόντων. Οι μικροδορυφόροι και οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου

(SNP) αποτελούν σημαντικά εργαλεία στη χαρτογράφηση γονιδίων.

Η μυωπία αποτελεί κοινή ασθένεια και τα ποσοστά στην Αμερική και Δυτικά Ευρώπη είναι περίπου

27%, ενώ φτάνουν το 90% σε περιοχές της Ασίας.

Η σοβαρή μυωπία μπορεί να οδηγήσει σε εκφυλισμό του αμφιβληστροειδή και γλαύκωμα,

διαταραχές που δημιουργούν πρόβλημα στην οικονομία και το σύστημα υγείας μιας χώρας.

Η ασθένεια οφείλεται στην αύξηση του οφθαλμικού βολβού, η οποία δεν είναι ξεκάθαρο από τι

προκαλείται.

Έχουν αναγνωριστεί 18 γενετικές θέσεις σε 15 διαφορετικά χρωμοσώματα οι οποίες πιθανόν να

σχετίζονται με την μυωπία. Η διαταραχή δεν οφείλεται πιθανόν σε βλάβη στη στερεοδιάταξη

κάποιων πρωτεϊνών αλλά σε βλάβη στον έλεγχο αυτών των πρωτεϊνών. [1,2]


Δ. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

1. Σημερινή γνώση στο θέμα

Η μυωπία αποτελεί την πιο κοινή διαταραχή της όρασης στον ανθρώπινο πληθυσμό. [3]

Η μυωπία σε μεγάλο βαθμό μπορεί να οδηγήσει στη τύφλωση. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ασθένεια

αυτή έχει γενετική προδιάθεση. [4]

Αποτελεί μια σύνθετη διαταραχή η οποία προκαλείται από την αλληλεπίδραση γενετικών και

περιβαλλοντικών παραγόντων. Οι μικροδορυφόροι και οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNP)

αποτελούν σημαντικά εργαλεία στη χαρτογράφηση γονιδίων.

Τα ποσοστά της ασθένειας στην Αμερική και Δυτικά Ευρώπη είναι περίπου 27%, ενώ φτάνουν το

90% σε περιοχές της Ασίας. [5-9]

Η σοβαρή μυωπία μπορεί να οδηγήσει σε εκφυλισμό του αμφιβληστροειδή και γλαύκωμα,

διαταραχές που δημιουργούν πρόβλημα στην οικονομία και το σύστημα υγείας μιας χώρας.

Η ασθένεια προκαλείται από αύξηση του οφθαλμικού βολβού, η οποία δεν είναι ξεκάθαρο από τι

προκαλείται. [10]

Στον πίνακα 1 αναφέρονται συνοπτικά οι γενετικοί τόποι που σχετίζονται με τη μυωπία. [11-20]


Locus OMIM Κυτταρογενετική

θέση Myopia severity: age of onset

MYP1 310460 Xq28 High: −6.75 to −11.25 D

Early: 1.5–5 years

MYP2 160700 18p11.31 High: −6 to −21 D

Early: 6.8 years (average)

MYP3 603221 12q21–q23 High: −6.25 to −15 D


MYP4 608367 7q36 High: −13.05 D (average)

MYP5 608474 17q21–q22 High: −5.5 to −50 D


MYP6 608908 22q12 Mild-moderate: −1.00D or lower

MYP7 609256 11p13 −12.12 to +7.25 D

MYP8 609257 3q26 −12.12 to +7.25 D

MYP9 609258 4q12 −12.12 to +7.25 D

MYP10 609259 8p23 −12.12 to +7.25 D

MYP11 609994 4q22–q27 High: −5 to −20 D

Early: before school age

MYP12 609995 2q37.1 High: −7.25 to −27 D

Early: before 12 years

MYP13 HGNC:32582 Xq23–q25 High: −6 to −20 D

Early: before school age

MYP14 610320 1p36

Πίνακας 1: Γενετικοί τόποι που σχετίζονται με τη μυωπία.

(D, diopters; HUGO, Human Genome Organization; MYP, myopia locus; p, short arm of a chromosome; q, long arm of a

chromosome. OMIM, online Mendelian Inheritance in Man

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM). HGNC- HUGO Gene Nomenclature Committee

(http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes


Εικόνα 1: Μυωπία ως σύμπτωμα συνδρόμου ή ως μονογονιδιακός χαρακτήρας. Το εμβαδόν των

ορθογωνίων δείχνει τη συχνότητα των συνδρόμων ή τις διάφορες μορφές μυωπίας. Το σχετικό

πάχος στα βέλη αντικατοπτρίζει τη συνεισφορά των γενετικών ή των περιβαλλοντικών

παραγόντων.

[21]


Η μυωπία συνήθως αποτελεί σύμπτωμα διαφόρων συνδρόμων, όπως το σύνδρομο Marfan

(μονογονιδιακό), το σύνδρομο Down (χρωμοσωμικό), υπάρχουν όμως περιπτώσεις που ακολουθεί

Μεντελική κληρονομικότητα. [22, 23] εικόνα 1

Η διαταραχή οφείλεται στην αύξηση του οφθαλμικού βολβού. [24, 25]

Η παθογένεση της ασθένειας παραμένει αδιευκρίνιστη, πέρα από τους περιβαλλοντικούς

παράγοντες (συνθήκες εργασίας, επίπεδο μόρφωσης και οικονομική κατάσταση) και γενετικοί

παράγοντες εμπλέκονται. [26-31]

Πρόσφατα βρέθηκαν έξι μεταλλάξεις στο γονίδιο ZNF644, που σχετίζεται με τη μυωπία. [32]

Επίσης μεταλλάξεις σε γονίδιο που ρυθμίζει το μεταβολισμό του χαλκού και τα επίπεδα οξυγόνου

στους ιστούς των ματιών βρέθηκαν να οδηγούν σε σοβαρή μυωπία. [33]

Αναλύσεις σε ασθενείς με μυωπία βρέθηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο SCO2, αλλά απουσίαζαν σε

φυσιολογικά άτομα. Το γονίδιο συμμετέχει στο μεταβολισμό του χαλκού που συμμετέχει στη

ρύθμιση οξυγόνου, το οποίο επηρεάζει την ανάπτυξη και τη λειτουργία του ματιού.

2. Ανάπτυξη της μεθοδολογίας του προγράμματος

Οι μεταλλάξεις αποτελούν την πηγή της γενετικής ποικιλομορφίας. Αν η συχνότητα μιας

διαφορετικής αλληλουχίας DNA είναι πάνω από 1% ονομάζεται πολυμορφισμός. Όλοι οι

πολυμορφισμοί δεν έχουν φαινοτυπικό αποτέλεσμα, ούτε οδηγούν αναγκαστικά σε γενετική

ασθένεια.

Δύο τύποι γενετικών δεικτών χρησιμοποιούνται στη χαρτογράφηση γονιδίων σύνθετων ασθενειών:

οι μικροδορυφόροι και οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (microsatellites και single nucleotide

polymorphisms SNPs). Η βάση δεδομένων των dbSNP και το National Centre for Biotechnology

Information NCBI παρέχουν πληροφορίες για τη γενετική ποικιλομορφία στον άνθρωπο και σε

άλλους οργανισμούς.

Οι μικροδορυφόροι ονομάζονται και μικρές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (short tandem

repeats, συνήθως δύο, τρία, ή τέσσερα νουκλεοτίδια). Ο αριθμός των επαναλήψεων διαφέρει.

[34-41]


Οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου ή SNP είναι αλληλουχίες DNA που διαφέρουν σε μια βάση.

Περίπου 99.9% των αλληλουχιών DNA δύο τυχαίων ατόμων είναι ίδιες και διαφέρουν στο 0.1%, εκ

του οποίου το 80% είναι SNPs.

Αν και βρίσκονται τυχαία στο γονιδίωμα κατά μέσο όρο κάθε 5000-10000 ζεύγη βάσεων μπορούν να

εντοπιστούν. [42]

Έχουν αναπτυχθεί πολλές μέθοδοι γενοτύπισης που βασίζονται στα SNPs και επιτρέπουν τη

χαρτογράφηση γονιδίων που σχετίζονται με σύνθετες ασθένειες του ματιού. [43]

Αν οι πολυμορφισμοί εντοπίζονται σε εξώνια ονομάζονται κωδικά SNPs, ενώ αν δεν εκφράζονται σε

επίπεδο πρωτεϊνών μη κωδικά SNPs.

Παραμετρική ανάλυση σύνδεσης.

Αν το γονίδιο της ασθένειας και ο γενετικός δείκτης βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα, τα

αλληλόμορφα της ασθένειας και του γενετικού δείκτη κληρονομούνται ανεξάρτητα, υπακούοντας

στο δεύτερο νόμο του Mendel.

Αν βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα αλλά σε απόσταση μπορούν πάλι να μεταβιβαστούν ανεξάρτητα

λόγω του επιχιασμού κατά τη διάρκεια της μείωσης.

Αν βρίσκονται πολύ κοντά τότε πιθανόν συγκληρονομούνται.

Η ανάλυση σύνδεσης εξετάζει αν υπάρχει σημαντική πιθανότητα συγκληρονόμησης του γενετικού

δείκτη και του υποθετικού αλληλόμορφου της ασθένειας.

Η σύνδεση του δείκτη και του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου υπολογίζεται με τον λογάριθμο

‘logarithm of the odds’ (LOD) score, που παρέχει στατιστική εκτίμηση της συγκληρονόμησης του

δείκτη και της μετάλλαξης.

LOD score 3 (an odds ratio of 1000 : 1) σημαίνει ότι υπάρχει σύνδεση. [44]

Τα τελευταία χρόνια πολλοί γενετικοί τόποι που σχετίζονται με ασθένειες του ματιού έχουν

χαρτογραφηθεί με ανάλυσης σύνδεσης.

Οι ασθένειες είναι μονογονιδιακές, πολυγονιδιακές ή αποτελούν συμπτώματα συνδρόμων, όπως το

σύνδρομο Stickler ή Marfan. [45, 46]

Ακολουθούν υπολειπόμενο ή επικρατές αυτοσωμικό, ή φυλοσύνδετο τύπο κληρονομικότητας.

Μεγάλης κλίμακας ανάλυση του γονιδιώματος με 400 – 800 μικροδορυφόρους μπορεί να

αποκαλύψει τη γενετική προδιάθεση της ασθένειας. Είναι όμως χρονοβόρα και δαπανηρή.


Ο πρώτος γενετικός τόπος που χαρτογραφήθηκε είναι ο MYP1 στο Xq28 το 1990 και θεωρείται

υπεύθυνος για παθολογική μυωπία που σχετίζεται με αμβλυωπία και δευτερονωπία. [28]

Στη συνέχεια εντοπίστηκαν 18p11, 12q21-23, 7q36, 17q21-22, 4q22-27, 2q37, Xq23-25, 10q21.2,

22q12 και 1q36. Τα σύμβολα ‘p’ και ‘q’ είναι ο μικρός και ο μεγάλος βραχίονας του χρωμοσώματος.

Πρόσφατα βρέθηκαν δύο γονίδια που σχετίζονται με τη μυωπία σε έρευνα στην Κίνα: τον

παράγοντα αύξησης των ηπατοκυττάρων (HGF) και το γονίδιο της μυοκιλίνης (myocilin MYOC).

[47, 48]

Η μετάλλαξη A672G in zinc finger protein 644 isoform 1 (ZNF644) βρέθηκε σε άτομα με υψηλή

μυωπία. Στη συνέχεια εντοπίστηκαν άλλες 5 μεταλλάξεις στο εξώνιο του γονιδίου ZNF644 (I587V,

R680G, C699Y, 3′UTR+12 C>G, and 3′UTR+592 G>A) σε 11 διαφορετικούς ασθενείς.

Όλες αυτές οι μεταλλάξεις απουσίαζαν σε φυσιολογικά άτομα.

Το γονίδιο εκφράζεται στον ανθρώπινο αμφιβληστροειδή και πιθανολογείται ότι αποτελεί

μεταγραφικό παράγοντα που ελέγχει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του

ματιού. Οι μεταλλάξεις προκαλούν επιμήκυνση του οφθαλμικού βολβού.

Το γονίδιο ZNF644 (και το γονίδιο SCO2),πιθανόν να οδηγεί μονογονιδιακά στην ανάπτυξη μυωπίας.

[32, 33]

Στην παρούσα μελέτη 200 μαθητές επιλέγονται, εκ των οποίων οι 100 φυσιολογικοί.

Οι μαθητές ελέγχονται αρχικά από οφθαλμίατρο με πλήρη κλινική εξέταση πριν το γενετικό έλεγχο.

Στη συνέχεια γίνεται προσπάθεια εντοπισμού των μεταλλάξεων του γονιδίου ZNF644, στους

μαθητές με μυωπία αλλά και σε αυτούς που λειτουργούν ως control.


3. Σκοπιμότητα, σημασία και συμβολή του προγράμματος

Η παρούσα μελέτη θα επιβεβαιώσει πιθανόν τη σχέση της υψηλής μυωπίας με μεταλλάξεις

συγκεκριμένων γονιδίων. Ο εντοπισμός των μεταλλάξεων θα πρέπει να συνοδεύεται με

παρακολούθηση του ατόμου για την εμφάνιση μυωπίας.

Η ύπαρξη μετάλλαξης θα ερμηνεύεται ως προδιάθεση και στα άτομα αυτά θα δίνονται συμβουλές

για τον τρόπο μελέτης και χρήσης των υπολογιστών.

Επίσης συμβουλές διατροφικές για την πρόσληψη βιταμινών και μετάλλων και ιδιαίτερα χαλκού, ο

οποίος εμπλέκεται στην εμφάνιση της μυωπίας.


4. Βιβλιογραφία

1. Jacobi FK, Pusch CM (2010). "A decade in search of myopia genes". Frontiers in

bioscience : a journal and virtual library 15: 359–372.

2. Verhoeven VJ, Hysi PG, Wojciechowski R, Fan Q, Guggenheim JA, Höhn R, MacGregor

S, Hewitt AW, Nag A, Cheng CY, Yonova-Doing E, Zhou X, Ikram MK, Buitendijk GH,

McMahon G, Kemp JP, Pourcain BS, Simpson CL, Mäkelä KM, Lehtimäki T, Kähönen M,

Paterson AD, Hosseini SM, Wong HS, Xu L, Jonas JB, Pärssinen O, Wedenoja J, Yip SP,

Ho DW, Pang CP, Chen LJ, Burdon KP, Craig JE, Klein BE, Klein R, Haller T, Metspalu A,

Khor CC, Tai ES, Aung T, Vithana E, Tay WT, Barathi VA, Chen P, Li R, Liao J, Zheng Y,

Ong RT, Döring A, Evans DM, Timpson NJ, Verkerk AJ, Meitinger T, Raitakari O,

Hawthorne F, Spector TD, Karssen LC, Pirastu M, Murgia F, Ang W, Mishra A,

Montgomery GW, Pennell CE, Cumberland PM, Cotlarciuc I, Mitchell P, Wang JJ,

Schache M, Janmahasatian S, Janmahasathian S, Igo RP, Lass JH, Chew E, Iyengar SK,

Gorgels TG, Rudan I, Hayward C, Wright AF, Polasek O, Vatavuk Z, Wilson JF, Fleck B,

Zeller T, Mirshahi A, Müller C, Uitterlinden AG, Rivadeneira F, Vingerling JR, Hofman A,

Oostra BA, Amin N, Bergen AA, Teo YY, Rahi JS, Vitart V, Williams C, Baird PN, Wong

TY, Oexle K, Pfeiffer N, Mackey DA, Young TL, van Duijn CM, Saw SM, Bailey-Wilson JE,

Stambolian D, Klaver CC, Hammond CJ (2013). "Genome-wide meta-analyses of

multiancestry cohorts identify multiple new susceptibility loci for refractive error and

myopia". Nature Genetics45 (3): 314–318.

3. Vitale S, Ellwein L, Cotch MF, et al. Prevalence of refractive error in the United States,

1999-2004. Arch Ophthalmol. 2008 Aug;126(8):1111–1119.

4. Young TL, Metlapally R, Shay A. Complex trait genetics of refractive error. Archives of

Ophthalmology. 2007;125(1):38–48.

5. Wang Q, Klein BE, Klein R, Moss SE. Refractive status in the Beaver Dam Eye

Study. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:4344–4347.

6. Munoz B, West SK, Rodriguez J, Sanchez R, Broman AT, Snyder R, Klein R. Blindness,

visual impairment and the problem of uncorrected refractive error in a Mexican-

American population: Proyecto VER. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 608–614.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3740568




7. Kempen JH, Mitchell P, Lee KE, Tielsch JM, Broman AT, Taylor HR, Ikram MK, Congdon

NG, O’Colmain BJ. The prevalence of refractive errors among adults in the United

States, Western Europe, and Australia. Arch Ophthalmol 2004; 122: 495–505.

8. Lam CS, Goldschmidt E, Edwards MH. Prevalence of myopia in local and international

schools in Hong Kong. Optom Vis Sci 2004;81: 317–322.

9. Woo WW, Lim KA, Yang H, Lim XY, Liew F, Lee YS, Saw SM. Refractive errors in medical

students in Singapore. Singapore Med J2004; 45: 470–474.

10. Wildsoet CF. Structural correlates of myopia. In: RosenfieldM, GillmartinB,

eds. Myopia & Nearwork. Oxford: Butterworth Heinemann, 1998. p 31–56.

11. DM Hornbeak TL Young. Myopia Genetics: A Review of Current Research and Emerging

Trends. Curr Opin Ophthalmol. 2009 Sep; 20(5): 356–362.

12. Young TL, Ronan S, Alvear A, Wildenberg SC, Oetting WS, Atwood L, Wilkin D, King RA.

A second locus for familial high myopia on chromosome 12q. American Journal of

Human Genetics. 1998;63:1419–1424.

13. Nürnberg G, Jacobi FK, Broghammer M, et al. Refinement of the MYP3 locus on

human chromosome 12 in a German family with Mendelian autosomal dominant high-

grade myopia by SNP array mapping. Int J Mol Med. 2008 Apr;21(4):429–438.

14. Paluru PC, Nallasamy S, Devoto M, Rappaport EF, Young TL. Identification of a novel

locus on chromosome 2q for autosomal dominant high-grade myopia. Investigative

Ophthalmology and Visual Science. 2005;46(7):2300–2307.

15. Chen CY, Stankovich J, Scurrah KJ, et al. Linkage replication of the MYP12 locus in

common myopia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007 Oct;48(10):4433–4439.

16. Lam CY, Tam PO, Fan DS, et al. A genome-wide scan maps a novel high myopia locus to

5p15. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Sep;49(9):3768–3778.

17. Ciner E, Wojciechowski R, Ibay G, et al. Genomewide scan of ocular refraction in

African-American families shows significant linkage to chromosome 7p15. Genet

Epidemiol. 2008 Jul;32(5):454–463. Ciner E, Ibay G, Wojciechowski R, et al. Genome-

wide scan of African-American and white families for linkage to myopia. Am J

Ophthalmol. 2009 Mar;147(3):512–517.

18. Yang Z, Xiao X, Li S, Zhang Q. Clinical and linkage study on a consanguineous Chinese

family with autosomal recessive high myopia. Mol Vis. 2009;15:312–318


19. Li Y-J, Guggenheim JA, Bulusu A, Metlapally R, Abbott D, Malecaze F, Calvas P,

Rosenberg T, Paget S, Creer RC, Kirov G, Owen MJ, Zhao B, White T, Mackey D, Young

TL. An international collaborative family-based whole genome linkage scan for high-

grade myopia. Investigative Ophthalmology Visual Science. 2009 Mar 25;

20. Wojciechowski RJ, Stambolian D, Ciner EB, et al. Genomewide linkage scans for ocular

refraction and meta-analysis of four populations in the Myopia Family Study. Invest

Ophthalmol Vis Sci. 2009 Jan 17;

21. Clinical and Experimental Optometry. Volume 91, Issue 1, pages 4-22, 17 JUL 2007.

22. Curtin BJ. The Myopias: Basic Science and Clinical Management. New York: Harper &

Row, 1985.

23. Goss DA, Hampton MJ, Wickham MG. Selected review on genetic factors in myopia. J

Am Optom Assoc 1988; 59: 875–884.

24. Dirani M, Chamberlain M, Shekar SN, Islam AF, Garoufalis P, Chen CY, Guymer

RH, Baird PN. Heritability of refractive error and ocular biometrics: the Genes in

Myopia (GEM) twin study. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47: 4756–4761.

25. Sorsby A, Leary GA. A longitudinal study of refraction and its components during

growth. Spec Rep Ser Med Res Counc (GB)1969; 309: 1–41.

26. Dirani M, Shekar SN, Baird PN (2008) The role of educational attainment in refraction:

the Genes in Myopia (GEM) twin study. Invest Ophthalmol Vis Sci 49: 534–538.

27. Lopes MC, Andrew T, Carbonaro F, Spector TD, Hammond CJ (2009) Estimating

heritability and shared environmental effects for refractive error in twin and family

studies. Invest Ophthalmol Vis Sci 50: 126–131.

28. Schwartz M, Haim M, Skarsholm D (1990) X-linked myopia: Bornholm eye disease.

Linkage to DNA markers on the distal part of Xq. Clin Genet 38: 281–286.

29. Young TL, Ronan SM, Drahozal LA, Wildenberg SC, Alvear AB, et al. (1998) Evidence

that a locus for familial high myopia maps to chromosome 18p. Am J Hum Genet 63:

109–119.

30. Nakanishi H, Yamada R, Gotoh N, Hayashi H, Yamashiro K, et al. (2009) A genome-wide

association analysis identified a novel susceptible locus for pathological myopia at

11q24.1.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cxo.2008.91.issue-1/issuetoc


31. Andrew T, Maniatis N, Carbonaro F, Liew SH, Lau W, et al. (2008) Identification and

replication of three novel myopia common susceptibility gene loci on chromosome

3q26 using linkage and linkage disequilibrium mapping.

32. Shi Y, Li Y, Zhang D, Zhang H, Li Y, et al. (2011) Exome Sequencing

IdentifiesZNF644 Mutations in High Myopia. PLoS Genet 7(6).

33. Khanh-Nhat Tran-Viet, Caldwell Powell, Veluchamy A. Barathi, Thomas Klemm,

Sebastian Maurer-Stroh, Vachiranee Limviphuvadh, Vincent Soler, Candice Ho, Tammy

Yanovitch, Georg Schneider, Yi-Ju Li, Erica Nading, Ravikanth Metlapally, Seang-Mei

Saw, Liang Goh, Steve Rozen, Terri L. Young. Mutations in SCO2 Are Associated with

Autosomal-Dominant High-Grade Myopia. The American Journal of Human Genetics,

2013; 92 (5): 820.

34. Klein AP, Duggal P, Lee KE, Klein R, Bailey-Wilson JE, Klein BE. Confirmation of linkage

to ocular refraction on chromosome 22q and identification of a novel linkage region

on 1q. Arch Ophthalmol 2007; 125: 80–85.

35. Hammond CJ, Andrew T, Tat Mak Y, Spector TD. A susceptibility locus for myopia in

the normal population is linked to the PAX6 gene region on chromosome 11: a

genomewide scan of dizygotic twins. Am J Hum Genet 2004; 75: 294–304.

36. Stambolian D, Ciner EB, Reider LC, Moy C, Dana D, Owens R, Schlifka M, Holmes T, Ibay

G, Bailey-Wilson JE. Genome-wide scan for myopia in the Old Order Amish. Am J

Ophthalmol 2005; 140: 469–476.

37. Zhang Q, Guo X, Xiao X, Jia X, Li S, Hejtmancik JF. A new locus for autosomal dominant

high myopia maps to 4q22-q27 between D4S1578 and D4S1612. Mol Vis 2005; 11:

554–560.

38. Paluru PC, Nallasamy S, Devoto M, Rappaport EF, Young TL. Identification of a novel

locus on 2q for autosomal dominant high-grade myopia. Invest Ophthalmol Vis Sci

2005; 46: 2300–2307.

39. Zhang Q, Guo X, Xiao X, Jia X, Li S, Hejtmancik JF. Novel locus for X linked recessive

high myopia maps to Xq23-q25 but outside MYP1. J Med Genet 2006; 43: e20.

40. Zhang Q, Li S, Xiao X, Jia X, Guo X. Confirmation of a genetic locus for X-linked

recessive high myopia outside MYP1. J Hum Genet 2007; 52: 469–472.


41. Wojciechowski R, Moy C, Ciner E, Ibay G, Reider L, Bailey-Wilson JE, Stambolian D.

Genomewide scan in Ashkenazi Jewish families demonstrates evidence of linkage of

ocular refraction to a QTL on chromos ome 1p36. Hum Genet 2006; 119: 389–399.

42. Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berno A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N,

Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein L, Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E, Robinson

E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilburn D, Rioux J, Nusbaum C, Rozen S, Hudson

TJ, Lander ES, et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-

nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 1998; 280: 1077–1082.

43. Syvanen AC. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms.

Nat Rev Genet 2001; 2: 930–942.

44. Lander ES, Schork NJ. Genetic dissection of complex traits. Science 1994; 265: 2037–

2048.

45. O’Brien DA, Phillips AJ. Stickler syndrome. Clin Exp Optom 2000; 83: 330–332. Byers

PH.

46. Determination of the molecular basis of Marfan syndrome: a growth industry. J Clin

Invest 2004; 114: 161–163.

47. Han W, Yap MK, Wang J, Yip SP. Family-based association analysis of hepatocyte

growth factor (HGF) gene polymorphisms in high myopia. Invest Ophthalmol Vis Sci

2006; 47: 2291–2299.

48. Τang WC, Yip SP, Lo KK, Ng PW, Choi PS, Lee SY, Yap MK. Linkage and association of

myocilin (MYOC) polymorphisms with high myopia in a Chinese population. Mol Vis

2007; 13: 534–544.

49. Natalia V. Ivanova, Jeremy R. deWaard, Mehrdad Hajibabaei, and Paul D.N. Hebert.

Protocols for High-Volume DNA Barcode Analysis. DNA Working Group Consortium for

the Barcode of Life. Biodiversity Institute of Ontario.


Ε. ΧΡΟΝΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ

Χρονοδιάγραμμα έργου

Στην παρούσα μελέτη απαιτείται αρχικά η άδεια από το Υπουργείο Παιδείας για την αιμοληψία και

την οφθαλμολογική εξέταση 200 μαθητών.

Δύο μεταπτυχιακοί φοιτητές συλλέγουν πληροφορίες με τη μορφή ερωτηματολογίου από τους

μαθητές. Πληροφορίες σχετικά με τη διατροφή, τη χρήση υπολογιστή, τις ώρες μελέτης και την

εμφάνιση μυωπίας σε μέλη της οικογένειας τους.

Στη συνέχεια οι μαθητές εξετάζονται οφθαλμολογικά, και τέλος γίνεται η αιμοληψία.

Τα δείγματα θα αναλυθούν σε ένα πανεπιστημιακό εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας.

Χρησιμοποιούνται τεχνικές όπως η απομόνωση DNA, PCR, και ηλεκτροφόρεση.

Στο τέλος γίνεται στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και εξαγωγή συμπερασμάτων.

Μετά την ολοκλήρωση της έρευνας τα αποτελέσματα θα δημοσιευτούν σε επιστημονικό περιοδικό

και θα γίνει ανακοίνωση τους σε συνέδριο.

Η συνολική χρονική διάρκεια εκτιμάται στον ένα χρόνο.

ΣΤ. ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΡΟΫΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ

1. Δαπάνες για την αμοιβή προσωπικού:

4000 ευρώ θα είναι η αμοιβή του οφθαλμολογικού κέντρου (200 μαθητές Χ 20€) και 9600 ευρώ η

αμοιβή των μεταπτυχιακών φοιτητών (2 Χ 400 Χ 12 μήνες).

2. Κεφαλαιουχικός εξοπλισμός:

Το Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας είναι πλήρως εξοπλισμένο και καλύπτει όλο τον κεφαλαιουχικό

(διαθέτει PCR, Gel Image Analysis System, συσκευές οριζόντιας και κάθετης ηλεκτροφόρησης)

εξοπλισμό και δεν θα επιβαρύνει το πρόγραμμα.

3. Αναλώσιμο υλικό:

Το υπόλοιπο μέρος του προϋπολογισμού, που ανέρχεται στο ποσό των 1720 ευρώ, θα

διατεθεί για την προμήθεια αναλώσιμων υλικών.

Στα αναλώσιμα συγκαταλέγονται:

DNA Isolation Kit for Mammalian Blood, Roche, 1 kit for up to 25 purifications of 10 ml samples,

€ 200 Χ 8 = 1600 €.


Το γονιδιωματικό DNA των μαθητών θα απομονωθεί από περιφερικό αίμα με το παραπάνω Kit.

Τα δείγματα στη συνέχεια θα αναλυθούν με PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης).

Χρειάζονται Taq & buffer, (New England Biolabs), dNTPS (New England Biolabs), Primers στον πίνακα

2, Trehalose Sigma Trehalose, Tips Corning (Fisher) filter tips, Eppendorf, Strip caps ABGene.

Κόστος 0,25 € ανά δείγμα, συνεπώς 200 Χ 0,25 € = 50 €.

Αντιδραστήρια της ηλεκτροφόρησης (ΤΑΕ buffer, αγαρόζη και βρωμιούχο αιθίδιο), 0,35 € ανά

δείγμα, συνολικά 200 Χ 0,35 € = 70 €. [49]

4. Μετακινήσεις: Για την κατοχύρωση των αποτελεσμάτων του προγράμματος είναι αναγκαία η

παρουσίαση των αποτελεσμάτων σε συνέδρια. Για τον λόγω αυτό απαιτείται μια ελάχιστη δαπάνη

των 500 ευρώ.

Τα δεδομένα αυτής της μελέτης θα αναλυθούν στατιστικά.

Προαιρετικά μπορεί να γίνει έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου σε ανθρώπινο ιστό. Απομονώνεται

το mRNA από τον ιστό και εφαρμόζεται RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ως control

χρησιμοποιείται το γονίδιο glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).

Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται οι primers.


Primers for Sequencing Analysis of ZNF644 Exons

Exon Forward primer Reverse primer

Exon 1 CGCTGCCCTCGTTTGTCT CTTCCGCCACCCTCAGTC

Exon 2 GGGGCACTTAGCAATAGT ACTCCCATCAAATCAACTG

Exon 3-1 TGTTTGTGTTCTTTCATTCT GCTGTCCAGTGGTTAATG

Exon 3-2 ATGCTGGTGCTCCTACTG TCCCGTTACTGTATTGACA

Exon 3-3 CTGCTTCAGTTGGTTGTGAC AGGCATCCACAGATTCTAAGT

Exon 3-4 GTGAAGCCTGAATCAACTG ATTTCCTCCATCAACTTCTGT

Exon 3-5 ACCAGGAGAGAAGACAGAAG CTACCAAATGAATCAACACAT

Exon 3-6 CCCTATGGTCACTTCTGATA TTTTGAAATGCACAGGATAT

Exon 3-7 CAAGCAGCAAAAGAAAAGTC ATCTCATGCAAAAAGTTGTTA

Exon 3-8 AAGAGCAAAGTGGAAGGTC CACCACAGAGCTGACAAGT

Exon 4 TTTTAGGGTGGTCAGTTTAT TAACCAATCTGTGCTCTGT

Exon 5 GGGAATAGGGAAATGAATG CAGGCTGCTCTTGAACTC

Exon 6-1 TGAATTGGGAGTTTTGATGT CCCATTTTCCTGCTTTAGTA

Exon 6-2 TGCCTCCATTACAGAAACTTC TGCCCTATTTGAGTGAACAG

Exon 6-3 CCCCACAAGACTTGCATAGA CCTGTCCTGTAAGCATGTCA

Exon 6-4 ACTCCAGTTGCATTTCTCAGA CCAAGACACCTGCACCATAT

Πίνακας 2: Primers για το γονίδιο ZNF644

Table S2. Primers for gene expression by RT-PCR

Gene name Gene id Primer sequences Product length

ZNF644 NM_201269 Forward: CGTTCAGAAATGCGTTCTTCC 255

Reverse: TGTCGTTGTAAGTGCTTAATCC

GAPDH NM_002046 Forward: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 226

Reverse: GAAGATGGTGATGGGATTTC

Πίνακας 3: Primers για RT-PCR

λυρατζοπουλος τεχνικές - ορμόνες - αντισώματα - μελέτη...

Science

Transcript of λυρατζοπουλος τεχνικές - ορμόνες - αντισώματα - μελέτη...