Post on 24-Dec-2018
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
NAJLA ELIAS FARAGE
EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO Nrf2 E NF-κB E
ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS
CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE
NITERÓI – RJ
2016
ii
NAJLA ELIAS FARAGE
EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO NRF2 E NF-ΚB E
ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS
CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE
Tese submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense
como parte dos requisitos necessários
à obtenção do Grau de Doutora. Área
de Concentração: Ciências Médicas
Orientadora: Profª. Drª Denise Mafra
Co-orientador: Prof. Dra Milena Barcza Stockler-Pinto
NITERÓI – RJ
2016
iii
Farage, Najla Elias
Expressão dos fatores transcricionais Nrf2 e Nf-κB
e associação com estado nutricional em pacientes renais
crônicos em hemodialise/ Najla Elias Farage. – Niterói:
[s.n.], 2016
92f
Orientador: Denise Mafra
Co-Orientador: Milena B Stockler-Pinto
Tese (Pós-Graduação em Ciências Médicas)
– Universidade Federal Fluminense, 2016.
1. Ciências Médicas. 2. Doença Renal Crônica. 3.
desnutrição. 4. Inflamação.
iv
NAJLA ELIAS FARAGE
EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO NRF2 E NF-ΚB E
ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS
CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE
Tese submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense
como parte dos requisitos necessários
à obtenção do Grau de Doutora. Área
de Concentração: Ciências Médicas
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Profª. Drª Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães
Universidade Federal Fluminense-UFF
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Perez Gomes
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Julio Beltrame Daleprane
Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERJ
_____________________________________________________________________
Profa. Dra. Julie Calixto Lobo
Universidade Federal Fluminense-UFF
_____________________________________________________________________
Profa. Dra. Vivian Warlich
Universidade Federal Fluminense-UFF
NITERÓI – RJ
2016
v
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a todos os pacientes que sempre estiveram dispostos a contribuir
para a melhoria do seu tratamento e qualidade de vida durante todo o período do estudo.
As minhas orientadoras, Drª Denise Mafra, Drª Milena Stockler-Pinto.
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar as minhas orientadoras Denise e Milena que sempre
acreditaram no meu potencial e não medem esforços na ajuda, e a parceira de bancada
MSc Cinthia Costa.
A Viviane Leal sempre presente nas revisões e críticas, enriquecendo o trabalho.
A minha família, especialmente meu filho, pela paciência durante esse período.
Aos diretores e funcionários da Clínica Renalcor que sempre incentivaram meu
crescimento profissional.
vii
Resumo
Pacientes renais crônicos, principalmente os que estão em diálise, possuem alta
prevalência da chamada síndrome protein energy wasting e, dentre os fatores de risco
destacam-se a inflamação e o estresse oxidativo. A ativação do Fator Nuclear- kappa B
(NF-κB) está associada com a síntese de citocinas inflamatórias e, recentemente neste
cenário, em contraste ao NF-κB, o sistema fator nuclear eritróide 2-relacionado ao fator
2-Kelch-like ECH proteína 1 (Nrf2-Keap1) tem surgido como importante mecanismo de
defesa contra o estresse oxidativo e inflamação, promovendo a síntese de enzimas
antioxidantes. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos
fatores de transcrição, NF-κB e Nfr2, em pacientes renais crônicos em hemodiálise
(HD) e verificar possíveis associações com estado nutricional. Foram avaliados 83
pacientes em HD (47 homens, 52,3 ± 14,4 (22-84) anos, 24,7 ± 3,9 Kg/m2
e 6,2 ± 3,8
anos em tratamento dialítico). Após a coleta de sangue as células mononucleares foram
isoladas (PMBC) a expressão de NF-κB e Nfr2 foi analisada pela Reação em cadeia de
polimerase em tempo real. A análise da concentração plasmática de proteína C reativa
ultrassensível foi realizada por ELISA. O estado nutricional foi avaliado por
antropometria (% gordura corporal e Índice de Massa Corporal - IMC), pela estimativa
de massa muscular (índice de creatinina - IC) e avaliação Subjetiva Global (ASG) de 7
pontos. De acordo com o IMC, 49,4% dos pacientes apresentaram sobrepeso ou
obesidade e apenas um paciente apresentou baixo peso (IMC< 18,5 Kg/m2). De acordo
com os níveis de proteína C reativa, 47,6% apresentaram inflamação (> 3mg/dL) e 62%
apresentou baixos valores de IC (<22mg/Kg/d). A expressão do NF-κB foi
positivamente correlacionada com a idade (r =0,33, p=0,02) e negativamente com o IC
(r= -0,54, p=0,0001), albumina (r= -0,32, p= 0,02) e % GC (r = -0,61, p= 0,001). De
acordo com a ASG, os pacientes desnutridos apresentaram maiores valores da expressão
de NF-κB (1,7 ± 0.9, p=0,03), quando comparados com os eutróficos (1,11 ± 0.6). A
expressão de Nrf2 não se correlacionou com os parâmetros antropométricos. Os dados
parecem mostrar que a ativação do NF-κB contribui para a perda de massa muscular e
desnutrição nos pacientes em HD, entretanto, estudos que avaliem melhor essa relação
são necessários.
Palavras chave: Doença renal crônica, inflamação, estresse oxidativo, estado
nutricional.
viii
Abstract
Protein energy wasting (PEW) is a common outcome in chronic kidney disease
patients undergoing hemodialysis (HD) and oxidative stress and inflammation are
common risk factors to PEW. Nuclear transcription factors are involved in these
processes as Fator Nuclear-kappa B (NF-κB) which plays important role in coordinate
expression of inflammatory genes and in contrast, the transcription nuclear E2-related
factor 2 (Nrf2) operates in the genes promoter region coding for detoxifying enzymes
stage II or antioxidant enzymes. The aim of this study was to evaluate the NF-kB and
Nrf2 expression in patients undergoing HD and the association with nutritional status.
Eighty three HD patients (47 men, 52.2 ± 14.4 (22-84) years, 24.7 ± 3.8 Kg/m2
and
dialysis vintage 6.2 ± 3.8 years) were enrolled in this study. Blood samples were
collected and peripheral blood mononuclear cells were isolated, and analyses of real
time polymerase chain reaction was performed to evaluate the Nrf2 and NF-kB mRNA
expression levels. The C-reactive protein (CRP) plasma levels were analyzed by
ELISA. Nutritional status was assessed by anthropometry (% body fat and body mass
index - BMI), estimation of muscle mass (creatinine index - CI) and subjective global
assessment (SGA- 7-point scale version). According to BMI, 49.4% of patients were
overweight or obese and only one patient had low weight (BMI <18.5 kg/m2).
According to C-reactive protein levels, 47.6% had inflammation (> 3 mg/dL) and 62%
had low CI values (<22mg/Kg/d). The expression of NF-κB was positively correlated
with age (r = 0.33, p = 0.02), and negatively with CI (r = -0.54, p = 0.0001), albumin (r
= - 0.32, p = 0.02) and % body fat (r = -0.61, p = 0.001). According to SGA,
malnourished patients showed higher values of NF-κB expression (1.7 ± 0.9, p = 0.03)
compared to eutrophic patients (1.11 ± 0.6). Nrf2 eas not correlated with nutritional
status. In conclusion, the activation of NF-κB seems contribute to muscle loss and
malnutrition in HD patients, however the mechanisms that lead to this mechanism
remain unknown.
Key Words: chronic kidney disease, inflammation, oxidative stress, nutritional status.
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1. Características antropométricas dos pacientes estudados 53
Tabela 2. Parâmetros Bioquímicos dos pacientes estudados 54
Tabela 3. Atividades das enzimas antioxidantes, marcadores inflamatórios e
expressão dos fatores de transcrição
55
x
Lista de Quadros
Quadro 1. Classificação dos estágios da DRC 19
Quadro 2. Enzimas reguladas pelo Nrf 2 33
Quadro 3. Estado nutricional de adultos segundo o índice de massa corporal (IMC) 45
Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal 46
Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal 47
xi
Lista de Figuras
Figura 1. Causas da Inflamação na DRC avançada 23
Figura 2. Ativação de NF-kB e translocação para o núcleo 24
Figura 3. Regiões do Nrf2 29
Figura 4. Sistema de ubiquitinação do Nrf2 e degradação a proteossoma 31
Figura 5. Nrf2, Estresse Oxidativo 33
Figura 6. Etiolgia da Sarcopenia uremica 38
Figura 7. Modelo Conceitual para etiologiae consequências da Protein Energy
Wasting na doença renal Crõnica
39
Figura 8.
Figura 9 .
Associação entre a expressão de NF-kB e valores de ìndice de creatinina
nos pacientes em hemodiálise
Comparação da Expressão do NF-κB entre pacientes desnutridos e
eutróficos segundo ASG.
56
57
xii
SUMÁRIO
1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ..................................................... 16
2.0 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 18
2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA ................................................................... 18
2.2 EPIDEMIOLOGIA ..................................................................................... 19
2.3 ESTRESSE OXIDATIVO.......................................................................... 20
2.4 NF-kb E DOENÇA RENAL CRÔNICA.................................................... 23
2.5 SISTEMA KEAP-1 E NRF2....................................................................... 28
2.6 DOENÇA RENAL CRÔNICA E NRF2.................................................... 35
2.7 ESTADO NUTRICIONAL E DRC............................................................. 36
3.0 OBJETIVOS .............................................................................................. 42
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 42
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 42
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 43
4.1 CASUÍSTICA ............................................................................................. 43
4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ........................................... 43
4.3 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................. 44
4.4 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL......................................... 44
4.5 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ...................................................................... 48
4.5.1 Coleta de Sangue .............................................................................. 48
4.5.2 Análise de parâmetros bioquímicos de rotina............................... 48
4.5.3 Marcadores de estresse oxidativo e inflamação............................ 49
4.5.4 Isolamento de células monocleares.................................................. 50
4.5.5 Análise de PCR Real Time............................................................... 51
5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................... 51
6.0
6,1
6,2
RESULTADOS...........................................................................................
CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES..................................................
FATORES TRANSCRICIONAIS,MARCADORES DE INFLAMAÇÃO
E ESTRESSE OXIDATIVO ................................................
52
52
54
7.0 DISCUSSÃO .............................................................................................. 58
8.0 CONCLUSÕES ......................................................................................... 64
9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 65
10.0 ANEXOS .................................................................................................... 76
xiii
10.1 ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA 76
10.2 ANEXO 2: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO 77
10.3 ANEXO 3: AVALIAÇÃO SUBJETIVA GLOBAL – 7 PONTOS............. 78
10.4 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO................................................. 79
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASG Avvaliação Subjetiva Global
bZIP basic region leucine zipper
CB Circunferência do braço
CC Circunferência da cintura
CMB Circunferência muscular do braço
DCB Dobra cutânea biciptal
DCSE Dobra cutânea subescapular
ERA Elementos de resposta antioxidante
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
ELISA Reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas
FAV Fístula arteriovenosa
GC Gordura corporal
GCL Glutamato cisteína ligase
GSH-Px Glutationa peroxidase
GST Glutationa-S-transferase
HAS Hipertensão arterial sistêmica
HO-1 Heme oxigenase-1
ICAM-1 Moléculas de adesão intracelular 1
IC – Índice de creatinina
IL Interleucina IkB- proteina IkB
Ikk – proteina Ik Kinase
IMC Índice de massa corporal
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
KDIGO Kidney Disease Improving Global Outcomes
KDOQI Kidney Disease Outcome Quality Initiative
Kt/Vsp Dose de diálise single pool
Mafs Fibrosarcoma musculoaponeurótico
MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos-1
MDA Malondialdeído
MIA Malnutrition-inflammation-atherosclerosis
xv
MMP-9 Metaloproteinase de matriz 9
mRNA RNA mensageiro
NFkB fator nuclear kB
NKF National Kidney Foundation
NQO1 NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1
Nrf2 Fator nuclear eritróide 2-
Nrf2 Keap1 –Fator nuclear eritroide relacionado ao fator 2-Kelch-like ECH proteína 1
OMS Organização Mundial de Saúde
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PCR Reação em cadeia de polimerase
PRX I Peroxirredoxinas I
PTH Paratormônio
SatFe Saturação de transferrina
SOD Superóxido dismutase
SRATB Substância reativas ao ácido tiobarbitúrico
TAC Taxa albumina-creatinina
TBA Ácido tiobarbitúrico
TEA Taxa de excreção de albumina
TFG Taxa de filtração glomerular
TNF-α Fator de necrose tumoral – alfa
VCAM-1 Moléculas de adesão das células vasculares 1
1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A Doença Renal Crônica (DRC) possui prevalência crescente na população,
sendo considerada um problema de saúde pública, pois estima-se que 10% brasileiros
apresentem a doença. A DRC é baseada na diminuição progressiva da função renal e,
pode ser classificada em cinco estágios de acordo com a taxa de filtração glomerular
(TFG). Geralmente, somente no estágio 5 a terapia renal substitutiva deve ser instituída,
configurando-se como opções de tratamento a hemodiálise (HD), a diálise peritoneal ou
o transplante renal (Sesso et al. 2010).
A sobrevida dos pacientes em HD aumentou nos últimos anos devido ao avanço
tecnológico do procedimento de diálise. Apesar da HD prolongar a sobrevida dos
pacientes com DRC, ela não altera o desenvolvimento natural da doença renal
subjacente, nem supre por completo a função renal, além de estar relacionada a diversas
alterações sistêmicas, metabólicas e hormonais, como a desnutrição, inflamação crônica
e o estresse oxidativo (Fouque et al., 2008; Zanetti et al., 2011; Wang & Bennett, 2012).
O estresse oxidativo e a inflamação constituem importantes fatores etiológicos
na aterogênese e são características comuns de pacientes com DRC em diferentes
estágios da doença (Freigang et al., 2011; Lobo et al., 2011). Fatores de transcrição
nucleares como o fator nuclear-kappa B (NF-κB) e o fator nuclear eritróide 2-
relacionado ao fator 2-Kelch-like ECH proteína 1 (Nrf2-Keap1) estão envolvidos nesses
processos (Kim et al., 2010).
17
O fator de transcrição NF-κB desempenha papel importante na regulação
coordenada de genes inflamatórios em pacientes com DRC, apresentando papel
patogênico na mediação da inflamação crônica nesses pacientes (Rangan et al., 2009;
Kim et al., 2010). Em contraste com o NF-κB, o sistema Keap1-Nrf2 tem surgido como
importante mecanismo de defesa endógena, sendo fundamental para a resposta anti-
inflamatória e no combate ao estresse oxidativo e, portanto, pode contribuir para a
melhoria de muitas doenças, incluindo a DRC (Pedruzzi et al., 2012; Ruiz et al., 2013).
O aumento do estresse oxidativo e do processo inflamatório tem sido
considerados importantes fatores de risco para desnutrição e complicações
cardiovasculares já bem estabelecidos na literatura. Assim, a DRC apresenta como
maiores causas de complicações, as alterações do estado nutricional, com prevalência da
desnutrição em torno de 20 a 70%. Nesse sentido, a modulação destes fatores constitui
importante alvo a ser alcançado e para isso, a análise da expressão de fatores
transcricionais como NF-κB e o Nrf2 deve ser avaliada .
18
2.0 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA (DRC)
A perda progressiva e irreversível das funções renais caracteriza a DRC.
Segundo a National Kidney Foundation (NKF-KDIGO, 2013), em seu documento
Kidney Disease Improving Global Outcomes (K/DIGO) a DRC é definida como
anormalidades da estrutura ou função renal, presentes por > 3 meses, com implicações
para a saúde. A classificação da DRC é baseada em sua causa, na TFG e na
albuminúria. De acordo com a TFG, a progressão da DRC é dividida em 5 categorias
(Quadro 1). As categorias de G1 a G4 correspondem ao tratamento conservador e na
categoria G5, o paciente é direcionado à diálise (NKF-KDIGO, 2013).
Na HD, o sangue obtido do acesso vascular é impulsionado por uma bomba para
um sistema de circulação extracorpórea onde se encontra um filtro (dialisador). No
dialisador ocorrem as trocas entre o sangue e a solução de diálise (dialisato), através de
uma membrana semipermeável. Neste processo, a remoção de solutos do plasma é
realizada por difusão, baseada no gradiente de concentração do soluto entre o sangue e o
dialisato, embora também ocorra a difusão de substâncias do dialisato para o
compartimento sanguíneo (p.ex., bicarbonato). A HD tradicional normalmente é
realizada 3 vezes por semana, por 4 horas, com fluxo de sangue de 250-300 mL/min e
fluxo de dialisado de 500 mL/min (Gonçalves et al., 2013).
19
Quadro 1. Classificação dos Estágios da DRC
TFG: taxa de filtração glomerular.
Fonte: NKF-KDOQI, 2012
2.2 EPIDEMIOLOGIA
A DRC está associada a taxas elevadas de morbimortalidade, redução da
qualidade de vida e elevação de custo para o sistema de saúde (Ronksley et al., 2012) e
recebe cada vez mais atenção da comunidade científica internacional, já que sua elevada
prevalência vem sendo demonstrada em estudos recentes. Particularmente significante
foi a análise transversal do National Health and Nutrition Examination Survey
(NHANES), conduzida entre 1999 e 2004, que envolveu uma amostra representativa da
população de adultos não institucionalizados dos EUA, com 20 anos de idade ou mais
(n = 13.233), que baseado na presença de albuminúria persistente (> 30 mg/g) e
diminuição na TFG estimada usando a equação abreviada do estudo Modification of
Diet in Renal Disease (MDRD), revelou que aproximadamente 13% da população
adulta dos EUA tem DRC nos estágios 1 a 4 (NHANES, 2004).
No Brasil, de acordo com o censo de diálise de 2013, o número estimado de
pacientes em tratamento dialítico era 100.397 (SBN, 2013). Enquanto o número de
20
brasileiros nos diferentes estágios pré-diálise da DRC não é conhecido com exatidão, a
análise dos dados laboratoriais de adultos utilizando a nova definição de DRC revelou
que 2,3% dos indivíduos avaliados tinham TFG<45mL/min/1,73m2 ou DRC nos
estágios 3B, 4 e 5. Extrapolando-se esses resultados para a população adulta brasileira,
sugere-se que cerca de 2,9 milhões de brasileiros teriam um terço ou menos da TFG dos
indivíduos saudáveis (Fernandes et al., 2010).
Mesmo diante dos avanços tecnológicos observados ao longo das últimas
décadas, a HD ainda está associada a diversas complicações agudas e crônicas, bem
como a altas taxas de hospitalização e mortalidade (Salomão et al., 2002; Riella et al.,
2008). A diálise é capaz de prolongar a sobrevida dos pacientes com DRC, porém não
altera o desenvolvimento natural da doença renal subjacente e não substitui
completamente todas as funções renais (Smeltzer & Bare, 2005). Além disso, devido ao
contato do sangue com a superfície do dialisador, o que resulta no acúmulo de
proteínas modificadas e produtos da peroxidação lipídica, a HD está relacionada a
diversas alterações sistêmicas, metabólicas e hormonais, dentre as quais estão a
inflamação crônica e o estresse oxidativo (Fouque et al., 2008; Lee et al., 2011; Zanetti
et al., 2011).O estresse oxidativo na DRC prevalece devido a presença de vários
fatores, dentre eles, as comorbidades, a bioincompatiblidade das membranas, as
dislipidemias , enquanto que o sistema antioxidante se encontra deficiente.
2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E INFLAMAÇÃO
Espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) são
constantemente produzidas em organismos aeróbios como subprodutos do metabolismo
de oxigênio normal e incluem radicais livres como o ânion superóxido (O2-), radical
hidroxila (OH), oxigênio singlete e radical peróxido de hidrogênio (H2O2) (Jung e
21
Kwak, 2010). Em pequenas concentrações, as EROs servem como sinalizador celular,
contribuindo para importantes funções celulares, como a proliferação, diferenciação e
sobrevivência celular. No entanto, concentrações elevadas podem levar à morte celular
por danificar macromoléculas celulares como DNA, proteínas e lipídios. Como
mecanismo de proteção, as células desenvolveram um sistema de defesa antioxidante,
porém, a produção excessiva de EROs pode levar ao desequilíbrio redox celular. Este
desequilíbrio entre EROs e capacidade antioxidante celular, como resultado do aumento
da geração de EROs e/ou disfunção do sistema antioxidante leva à condição de estresse
oxidativo (Steinbrenner e Sies, 2009; Junge Kwak, 2010; Mari et al., 2010; Singh et al.,
2010).
O estresse oxidativo é observado em diferentes doenças tais como Diabetes
mellitus, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e insuficiência cardíaca congestiva, as
quais podem contribuir para o aparecimento ou agravamento da DRC (Appendino et al.,
2011). Todavia, a própria DRC é também fonte importante de estresse oxidativo,
condicionando aumento significativo do risco de ocorrência de doença cardiovascular
nos pacientes com doença renal crônica (Himmelfarb et al., 2003; Teixeira, 2010). O
estado urêmico em que se encontram os pacientes nas categorias mais avançados de
DRC leva à superprodução de EROs, tal como o ânion superóxido e os aldeídos
reativos; ao aumento da quantidade de proteínas com grupos tiol oxidados; aumento dos
produtos resultantes da peroxidação lipídica e consequente aparecimento de anticorpos
anti-LDL oxidada (oxLDL); proteína C reativa e citocinas .Além disso, a HD também é
fator que induz ao estresse oxidativo, pois remove vitaminas hidrossolúveis,
prejudicando assim a defesa antioxidante; diminui ainda mais a quantidade de proteínas
plasmáticas com grupos tiol reduzidos e de glutationa peroxidase, e aumenta a formação
22
de EROs por expor os leucócitos às membranas de HD (Himmelfarb et al., 2003;
Teixeira, 2010).
No rim comprometido, o aumento da produção de EROs é impulsionado
principalmente pela ativação de enzimas produtoras de EROs, incluindo isoformas de
NAD(P)H-oxidase (NOX), ciclooxigenase-2, lipoxigenase, desacopladora óxido nítrico
sintase (NOS), disfunção mitocondrial e estresse do retículo endoplasmático (Ruiz et
al., 2013).
Apesar das EROs serem a forma biológica, sua baixa concentração e vida muita
curta, os torna inviável como marcador de estresse oxidativo. Desta forma, outras
moléculas podem ser usadas para esse fim, por serem produtos finais da oxidação, uma
vez que correspondem ao resultado da ação do estresse oxidativo sobre biomoléculas
importantes, como proteínas, lípidios, carboidrato e DNA (Teixeira, 2010; Fassett et al.,
2011). Dentre esses biomarcadores, podemos citar: malondialdeído (MDA), 8- hidroxi-
2'-deoxiguanosina, isoprostanos-F2, LDL oxidadas, proteínas carboniladas, produtos
finais de glicação avançada; entre outros, os quais se encontram aumentados no paciente
com DRC (Oberg et al., 2004; Dincer et al., 2008; Fassett et al., 2011, Lee et al., 2011).
Além disso, atividades das enzimas antioxidantes tais como superóxido dismutase,
glutationa peroxidase e catalase também podem ser destinadas para se avaliar o estresse
oxidativo (Fassett et al., 2011).
Além do estresse oxidativo, outra condição encontrada na DRC e que, por sua
vez, também está relacionada à diminuição da função renal é a inflamação (Shankar et
al., 2011), que também está implicada em diferentes doenças, e apresenta estreita
relação com o estresse oxidativo, de tal forma que este pode provocar inflamação e
vice-versa. O estresse oxidativo contribui diretamente para o desenvolvimento de
23
inflamação de fase aguda e, pacientes com níveis mais altos de inflamação têm níveis
mais elevados de biomarcadores de estresse oxidativo (Himmelfarb, 2004). O estresse
oxidativo provoca inflamação por vários mecanismos, incluindo ativação do fator de
transcrição kappa B (NF-B), o que leva ao recrutamento e ativação de células imunes.
A inflamação, por sua vez, provoca o estresse oxidativo através da produção de espécies
reativas de oxigênio, nitrogênio e halógenos por ativar leucócitos e células residentes.
(Figura 1). Juntos, esses eventos promovem o dano tecidual por causar apoptose,
necrose e fibrose (Aminzadeh et al., 2013).
Figura 1. Causas de Inflamação na DRC avançada (Adaptado de
Ikizler, 2008).
2.4 NF-kB E DOENÇA RENAL CRÔNICA
NF-кB é um complexo proteico composto por homo ou heterodímeros de um
grupo de cinco genes a saber: p65 (RelA), RelB, c-Rel, NF-кB1 (p50 e seu precursor
p105) e NF-кB2 (p52 e seu precursor p100). Proteínas NF-кB exibem homologia
estrutural com a oncopoteína retroviral r-Rel com aproximadamente 300 aminoácidos
chamados Rel homologia domínio (RHD) (Gloire e Piette, 2009). NF-кB é um fator de
24
transcrição redox sensível vital que é ativado por ampla gama de estímulos. Após a
ativação, NF-кB regula a transcrição de inúmeros genes, muitos dos quais estão
associados com inflamação (Antunes e Han, 2009). Quando o fator NF-кB é ativado
pelo estresse oxidativo, várias citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose
tumoral-alfa (TNF-α) e interleucinas (IL)-1β, IL-2, IL-6 e IL-12 são produzidas em
excesso (Himmelfarb, 2004; Kim, et al., 2010).
Na ausência de estímulos, o NF-κB se encontra no citoplasma acoplado à
proteína inibidora IκB. Já na presença de estímulos, tais como estresse oxidativo com
superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROs), citocinas pró-inflamatórias
(TNF-α), mitógenos, e fatores de crescimento de RNA de cadeia dupla, a proteína IκB é
rapidamente fosforilada pela IκB kinase (IKK), o que resulta no desacoplamento do NF-
κB com subsequente translocação dele para o núcleo da célula, onde irá promover suas
ações nos genes alvo, atuando na inflamação, apoptose, proliferação e diferenciação
celular (Figura 1) (Pedruzzi et al., 2012).
Figura 2. Ativação do NF-kB e consequente translocação para o núcleo com produção
de marcadores inflamatórios. Fonte: Adaptado de Pedruzzi et al, 2012.
Desde a sua descoberta em 1986 (Sen e Baltimore, 1986), o NF-kB tem sido
associado as mais variadas doenças, incluindo câncer, aterosclerose, artrite, diabetes,
25
acidente vascular cerebral, e a própria DRC. O NF-кB pode ser rapidamente induzido
em resposta a diversos estímulos extracelulares, sem a necessidade de nova síntese de
proteína ou mRNA (RNA mensageiro), bem como, por ser fator de transcrição que
regula toda rede pró-inflamatória, além dos genes reguladores da apoptose. Nesse
sentido, a modulação de NF-kB acaba sendo vista como importante oportunidade
terapêutica em doenças aonde a inflamação conduz ao mau prognóstico (Rangan et al.,
2009). Além disso, o NF-kB pode ser encontrado em quase todos os tipos de células,
incluindo as do rim, onde de fato, componentes do sistema NF-kB são altamente
expressos em pacientes com DRC, apresentando papel patogênico na mediação da
inflamação crônica nesta doença (Rangan et al., 2009; Kim e Vaziri, 2010; Trinanes et
al., 2012; Bolati et al., 2013). A gravidade da lesão glomerular e tubulointersticial e a
perda da função renal estão diretamente relacionadas à quantidade de células
inflamatórias presentes no interstício (Noronha et al., 2002). Além disso, experimentos
com animais sustentam a hipótese de que o NF-kB tem papel patogênico nos eventos
celulares que fundamentam a progressão da DRC (Sakural et al., 1996; Donadelli et al.,
2000). O reconhecimento de que EROs podem estimular vias inflamatórias de
sinalização vem com importantes consequências clínicas e terapêuticas. O aumento na
produção de EROs e/ou diminuição na capacidade antioxidante, resulta em estresse
oxidativo para a célula, que pode levar à ativação redox sensível e expressão de genes
inflamatórios resultando num estado pró-inflamatório (Chen e Kunsch, 2004). O
estresse oxidativo, através das EROs desencadeia a ativação do NF-кB, que por sua vez,
induz ao aumento da produção de citocinas pró- inflamatórias e de proteínas
plasmáticas de inflamação aguda, como a proteína C reativa; à quimiotaxia; e à
produção de moléculas de adesão celular, colaborando desta forma para a inflamação
(Oberg et al., 2004; Teixeira, 2010; Ruiz et al., 2013).
26
Pacientes com DRC possuem elevados níveis de marcadores inflamatórios que
se agravam após o início do tratamento dialítico (Barreto et al, 2010). Além disso, a
biocompatibilidade de membranas, a contaminação do dialisato por endotoxinas,
infecção do acesso venoso, acidose metabólica, o próprio estresse oxidativo dentre
outros presentes nos pacientes em HD, contribuem ainda mais para a inflamação (Ikizler
et al,2008 e Cheung et al, 2010) (Figura 2)
A DRC avançada está associada à inflamação crônica, como evidenciado pelos
elevados níveis de diversas citocinas pró-inflamatórias como: IL-6, TNF-α e níveis
alterados de Proteína C reativa (Oberg et al., 2004; Shankar et al., 2011; Barros et al.,
2013; Lobo et al., 2013).
A IL-6, é uma proteína de 26 kDa importante na regulação de repostas
inflamatórias e é expressa em diversos tipos de células, includindo
macrófagos/monócitos, adipócitos, células T, células da musculatura lisa, células
endoteliais e fibroblastos. Durante infecção, injúria ou processo imunológico, todos os
tecidos e tipos celulares do corpo expressam IL-6. Esta citocina é considerada crucial na
ativação e proliferação de linfócitos, diferenciação de células B, no recrutamento de
leucócitos, na hematopoiese e na regulação da síntese de proteínas de fase aguda, como
por exemplo a síntese de proteína C reativa (PCR) (Fouque, 2008; Carrero, 2008).
O aumento dos níveis de IL-6 já está bem documentada em pacientes com DRC,
e parece agir diretamente como promotora da aterosclerose por participar ativamente
nos processos de calcificação vascular e disfunção endotelial (Honda et al., 2006;
Dummer et al., 2007; Elewa et al., 2012). Além disso, a IL-6 induz o catabolismo
protéico, a lipólise, o aumento do gasto energético, a resistência a insulina e a supressão
do apetite. Ao mesmo tempo, a IL-6 parece contribuir para a diminuição dos hormônios
27
da tireóide, da adiponectina, e da testosterona, o que também contribui para a PEW
(síndrome chamada ”protein-energy wasting” – PEW, utilizado para definir a redução
tanto da massa magra quando da gordura corporal em pacientes renais) e para a doença
vascular (Fouque, 2008, Carrero, 2007). Na DRC, dentre os biomarcadores de
inflamação, a IL-6 parece estar mais associada a mortalidade, sendo forte preditora de
mau prognóstico (Cheung et al., 2010). Assim como a IL-6, o TNF-α também é uma
citocina pleiotrópica produzida por vários tipos celulares, como: macrófagos,
mastócitos, células linfóides, células endotheliais, células do miocárdio, tecido adiposo,
fibroblastos e tecido neural).
Diante da importância do NF-кB como promotor da resposta inflamatória, via
síntese de citocinas inflamatórias, bem como do extresse oxidativo exacerbado, e essas
complicações terem íntima relação com aumentado risco cardiovascular já bem
estabelecido em pacientes em diálise, novos tratamentos anti-inflamatórios, capazes de
inibir/modular NF-кB, como os antioxidantes, são necessários, de modo a minimizar os
efeitos negativos que a inflamação e o estresse oxidativo podem ocasionar nos pacientes
com DRC. Recentes pesquisas voltadas para esse assunto estão sendo desenvolvidas,
como por exemplo, estudos com o fator nuclear eritróide 2 (Nrf2).
28
2.5 SISTEMA KEAP1-NRF2
Em meados dos anos 90, pesquisadores identificaram a existência de duas
proteínas, o Nrf2 e Keap1, envolvidas na indução da síntese de enzimas antioxidantes,
tais como NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e glutationa-Stransferases
(GSTs) (Talalay et al., 1988; Itoh et al., 1999).
Nrf2, uma proteína contendo 605 aminoácidos, é expressa em ampla gama de
tipos de tecidos e células. Pertence a um subconjunto da família bZIP (basic region
leucine zipper) e é membro da família Cap 'n' Collar de proteínas reguladoras que
também incluem a NF-E2, Nrf1, Nrf3, Bach1 e Bach2 (Motohashi et al., 2002; Kaspar
et al., 2009). A estrutura molecular apresenta seis domínios funcionais chamados
Neh1eNeh6 (homologia Nrf2-ECH). O primeiro domínio conservado, Neh1, é a região
de interação com pequenas Mafs (fibrosarcoma musculoaponeurótico) e ligação ao
DNA como heterodímero (Itoh et al., 1999; Baird e Dinkova-kostova, 2011). Neh2
consiste na região amino terminal da proteína e, assim como o domínio Neh6 é
identificado como regulador negativo de Nrf2 (Itoh et al., 1999; McMahon et al., 2004).
Neh3, por sua vez, consiste da região carboxilo terminal da proteína e está envolvida na
ativação da transcrição de genes Elementos de Resposta Antioxidante (ERA)-
dependente (Itoh et al., 1999; Nioi et al., 2005). Os domínios Neh4 e Neh5 atuam
cooperativamente para ligar outro coativador de transcrição, o CBP [CREB (cAMP
response element-binding protein) (Katoh et al., 2001) (Figura 3).
29
Figura 3. Regiões do Nrf2. Fonte: Adaptado de Boutten et al, 2011.
Em condições basais, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por sua proteína
repressora Keap1, essencial para a rotatividade de Nrf2, funcionando como proteína
adaptadora entre Nrf2 e a região N-terminal de Cullin 3 (Cul3). Isto promove a
degradação proteosomal constante de Nrf2 (Baird e Dinkova-kostova, 2011). Assim, em
situações normais, Nrf2 está inativo devido à sua retenção citoplasmática por Keap1 e
degradação rápida através do sistema de proteassoma – proteínas destinadas à
eliminação, são inicialmente ligadas aos polímeros de ubiquitina e depois são
reconhecidas e degradadas pelo proteassoma 26S (Ravid e Hochstrasser, 2008).
O Nrf2 tem como função permitir a adaptação e a sobrevivência das células
sobre condições de estresse, regulando a expressão de genes de diversas redes de
proteínas com ação citoprotetoras, incluindo as enzimas de detoxicação, anti-
inflamatórias e as de ação antioxidantes, assim como as proteínas com ação reparadora
e de remoção de macromoléculas que possuem ação de deterioração celular. A sua
atividade no equilíbrio do sistema antioxidante celular se deve a sua regulação na
biossíntese da enzima glutationa transferase e na regeneração da NAD(P)H, controlando
também a produção de espécies reativas de oxigênio pela mitocôndria. Portanto, em
condições normais e de equilíbrio, Nrf2 afeta o potencial da membrana mitocondrial, a
oxidação de ácidos graxos e a disponibilidade de substratos para respiração e síntese de
ATP. Assim o Nrf2 possui importante papel em manter a integridade estrutural e
30
funcional da mitocôndria quando o organismo se encontra em condições de estresse
(Kostova e Abramov, 2015).
A proteína Keap1 é composta por 624 aminoácidos e tem três domínios
principais: 1) domínio de dimerização BTB (Broad-Complex, Tramtrack, e Bric à
Brac), 2) uma região intermédia (IVR) rica em cisteínas e 3) uma região com 6
repetições do domínio Kelch, local de ligação entre Keap1 e Nrf2. Keap1 contém vários
resíduos de cisteína reativos que servem como sensores do estado redox intracelular,
dentre os quais, C273 e C288, que, ligados à IVR, são importantes para a repressão de
Nrf2 por Keap1 em condições basais e, sua modificação por indutores pode reduzir a
taxa de ubiquitinação e degradação de Nrf2. O resíduo de cisteína C151, por sua vez,
localizado no domínio BTB é importante para a ligação de Keap1 para Cul3,
trabalhando como sensor de tensão. Cullin 3 (Cul3), uma subunidade do complexo
ligase E3, interage especificamente com Keap1. Keap1 associada com a região
Nterminal de Cul3 promove a ubiquitinação de Nrf2 em cooperação com o complexo
Cul3-Roc1, o qual apresenta o substrato proteico ao proteassoma. Keap1 assim funciona
como proteína adaptadora entre Nrf2 e Cul3 e essa associação promove a degradação
contínua de Nrf2 pelo proteassoma em condições normais (Figura 4)
31
Figura 4. Nrf2 – Sistema de ubiquitinação contínua e degradação a proteossoma.
Fonte: Kostova e Abramov, 2015.
A modificação oxidativa ou covalente de tióis em alguns dos resíduos de cisteína
resulta na dissociação de Nrf2 de Keap1 e translocação para o núcleo (Kim e Vaziri,
2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011). A translocação nuclear de Nrf2 também pode
ocorrer através de fosforilação de alguns de seus resíduos de serina ou treonina por
quinases, tais como a proteína quinase C, fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), e caseína
quinase-2 (Surh, 2008; Kim et al.2010). No núcleo, após heterodimerização com outros
fatores de transcrição as pequenas Maf (fibrosarcoma musculoaponeurótico), o Nrf2 se
liga às sequências regulatórias, denominadas elementos de resposta antioxidante ou
elementos de resposta eletrofílico (ERA ou ERE), localizado na região promotora dos
genes que codificam enzimas desintoxicantes de fase II ou enzimas antioxidantes (Surh,
2008; Kim et al., 2010).
Existem várias substâncias envolvidas na ativação de Nrf2, entre as quais
podemos citar, as EROs e insultos eletrofílicos (Kobayashi e Yamamoto, 2006), óxido
nítrico (Buckley et al., 2003), lipoproteína de baixa densidade oxidada (LDLox) (Ishii et
32
al., 2004), as prostaglandinas (Itoh et al., 2004), entre outros (Kobayashi e Yamamoto,
2005), que atuam provavelmente, inibindo a ubiquitinação de Nrf2.
Embora o principal consenso seja de que o mecanismo de inibição da
ubiquitinação/degradação de Nrf2 mediada por Keap1 ocorra exclusivamente no
citoplasma (Dinkova-kostova et al., 2005; Watai et al., 2007; Kaspar et al., 2009),
estudo recente realizado por Li et al. (2012) demonstrou que essa inibição pode ocorrer
no núcleo, ou seja, ativadores também exercem a sua função a nível nuclear.
Independente do local de ativação, atualmente, o sistema Keap1- Nrf2 tem sido
reconhecido como um dos principais mecanismos de defesa celular contra o estresse
oxidativo e inflamação (Copple et al., 2008; Kim et al., 2010). A proteína repressora
Keap1, essencial para a rotatividade de Nrf2, funciona como proteína adaptadora entre
Nrf2 e a região N-terminal de Cullin 3 (Cul3). Isto promove a degradação proteosomal
constante de Nrf2 (Baird e Dinkova-kostova, 2011). Assim, em situações normais, Nrf2
está inativo devido à sua retenção citoplasmática por Keap1 e degradação rápida através
do sistema de proteassoma – proteínas destinadas à eliminação, são inicialmente ligadas
aos polímeros de ubiquitina e depois são reconhecidas e degradadas pelo proteassoma
26S (Ravid e Hochstrasser, 2008).
A modificação oxidativa ou covalente de tióis em alguns dos resíduos de
cisteína, porém, resulta na dissociação de Nrf2 de Keap1 e sua translocação para o
núcleo celular (Kim e Vaziri, 2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011).
A translocação nuclear de Nrf2 também pode ocorrer através de fosforilação de
alguns de seus resíduos de serina ou treonina por quinases, tais como a proteína quinase
C, fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), e caseína quinase-2 (Surh, 2008; Kim et al., 2010).
No núcleo, após heterodimerização com outros fatores de transcrição, as pequenas Maf
33
(fibrosarcoma musculoaponeurótico), e o Nrf2 se ligam às sequências regulatórias,
denominadas elementos de resposta antioxidante ou elementos de resposta eletrofílico
(ERA ou ERE), localizados na região promotora dos genes que codificam enzimas
desintoxicantes de fase II ou enzimas antioxidantes (Surh, 2008; Kim et al., 2010)
(Figura 5).
Figura 5. Ativação do Nrf2 pelo estresse oxidativo e inibição do NF-kB (Pedruzzi et al. 2014)
A ativação do Nrf2 leva à regulação de uma série de genes antioxidantes e
desintoxicantes (Quadro 2), que pode ser significativo no tratamento de doenças, como
câncer, diabetes, complicações neuro-degenerativas, cardiovasculares e pulmonares,
onde o estresse oxidativo causa desordem no sistema Nrf2 (Zakkar et al., 2009; Cook et
al., 2011; Jiang et al., 2010; Singh et al., 2010)
Quadro 2. Enzimas reguladas pelo Nrf2/ERA
Enzimas Função
NADPH quinona
oxidoredutase (NQO1)
Enzima chave pertencente à família de flavoproteínas homodiméricas,
facilita a excreção quinona catalisando a redução de quinonas para
hidroquinonas através de reação de redução de etapa única de dois
elétrons (Gang et al., 2013).
34
Glutationa S-transferase
(GST)
Compreendem uma família de enzimas multifuncionais que atuam em
rotas de excreção de substâncias, sendo xenobióticas, protegendo as
células contra toxicidade química e estresse, em diferentes tecidos. A
função das enzimas GST tem sido tradicionalmente considerada a
desintoxicação de eletrófilos por conjugação de glutationa (Torres et
al., 2004; Huber et al., 2008; Lu, 2013).
Heme oxigenase-1
(HO-1)
Catalisa a degradação do grupo heme produzindo bileverdina,
monóxido de carbono (CO) e ferro. A expressão dessa enzima é
desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse
(Santos, 2007; Dezoti et al., 2009).
Glutationa peroxidase
(GSH-Px)
Catalisa a redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) e peróxidos
orgânicos para seus correspondentes álcoois às custas da conversão da
glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada (GSSG) (Huber et al.,
2008; Margis et al., 2008; Lu, 2013).
Glutamato cisteína ligase
(GCL)
Catalisa a síntese de glutationa pela formação de γ-glutamil cisteína a
partir de glutamato e cisteína, na presença de ATP. Glicina é então
adicionado a este dipeptídeo pela enzima glutationa sintetase para
rendimento de glutationa (Lu, 2013).
Catalase (CAT) É uma hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a
H2O e O2 (Leite e Sarni, 2003; Barreiros et al. 2006).
Superóxido dismutase
(SOD)
Catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e O2 na
presença do próton H+. Existem 3 formas de SOD: Fe-SOD, CuZn-
SOD e Mn-SOD (Leite e Sarni, 2003).
UDP-
glucuronosiltransferase
Catalisa a conjugação de substâncias exógenos e endógenos com o
ácido glicurônico. Representa importante via que facilita a eliminação
de xenobióticos e endobióticos aos compostos mais solúveis em água
(King et al., 2000).
Tiorredoxina Está envolvida na defesa antioxidante, redução de ribonucleotídeos e
a redução de peroxidases e fatores de transcrição (Nordberg e Arner,
2001).
35
Peroxirredoxinas I
(PRX I)
Também denominada tiorredoxinas peroxidases, são enzimas capazes
de catalisar a remoção de H2O2 e peróxidos orgânicos às custas de
doadores de elétrons tiólicos (Maia, 2003).
2.6 DOENÇA RENAL CRÔNICA E NRF2
Investigar a eficácia de ativadores e/ou moduladores do estresse oxidativo e
inflamação em pacientes com DRC é de fundamental importância, pois há ainda poucas
pesquisas sobre o papel do Nfr2 nos pacientes com DRC (Pedruzzi et al. 2015).
Em modelos animais com DRC, parece que há disfunção desse mecanismo, com
redução da ativação de Nrf2 e consequentemente das enzimas que regula e aumento de
NF-κB e de seus efeitos inflamatórios (Jiang et al., 2010; Kim e Vaziri, 2010). Assim,
parece que a ativação diminuída do sistema Keap1-Nrf2 pode agravar o estresse
oxidativo e a inflamação na DRC.
Jiang et al. (2010) identificaram papel protetor de Nrf2 ao dano renal em ratos
induzidos à nefropatia diabética. No estudo de Kim e Vaziri (2010) ratos com DRC
apresentaram redução na ativação de Nrf2 e enzimas antioxidantes e, em contrapartida,
maior ativação de NF-κB e enzimas associadas à inflamação. Aminzadeh et al. (2013)
também verificaram que ratos induzidos à nefropatia túbulo-intersticial apresentaram
ativação diminuída de Nrf2/enzimas reguladas e aumentada de NFκB/enzimas
reguladas. Em estudo conduzido por Bolati et al. (2013), indoxil sulfato, uma toxina
urêmica que acelera a progressão da DRC, reduziu a expressão de Nrf2 por meio da
ativação de NF-κB in vitro e in vivo.
Em pacientes em HD, Pedruzzi et al. (2015) avaliando a expressão de Nrf2 e
NF-κB, observaram que o aumento da expressão de NF-κB acontecia ao mesmo tempo
36
em que as expressões de Nrf2 e NQO-1 diminuíam. Esses resultados estão de acordo
com achados prévios em animais.
Atualmente pesquisas que reconheçam as alterações no sistema de defesa
antioxidante e mecanismos que possam restabelecer sua recuperação tem sido de
extrema relevância, devido a este ser um fator de proteção aos danos renais causados.
Existem evidências experimentais consideráveis que o Nrf2 possui papel de proteção a
esses danos, portanto intervenções que ativam esse fator poderão ser benéficas a fim de
evitar ou minimizar as complicações durante a DRC (Choi, et al 2014).
Dentre as complicações envolvidas com inflamação nesses pacientes está a
desnutrição, e vale ressaltar que pacientes com DRC desnutridos apresentam elevadas
taxas de mortalidade. Assim, estudos sobre estresse oxidativo, inflamação e suas
consequências como piora do estado nutricional são fundamentais para os pacientes
com DRC.
2.7 ESTADO NUTRICIONAL E DRC
A prevalência da desnutrição energética proteica ou mais recentemente
denominada de Protein Energy Wasting (Fouque et al. 2008) nesses pacientes é elevada
e como já dito, contribui para o aumento da morbimortalidade.
As causas que contribuem para o PEW variam desde a insuficiente ingestão
alimentar devido à redução do apetite, inflamação crônica, acidose metabólica,
múltiplas desordens endócrinas, aumento do gasto energético de repouso e o próprio
tratamento dialítico. Contribuem também fatores como a redução da atividade física,
fraqueza e envelhecimento (Carrero et al., 2013). Adicionalmente, as toxinas urêmicas e
infecções recorrentes colaboram para o quadro inflamatório crônico do paciente com
DRC o qual aceleram a progressão do PEW (Kalantar et al., 2005).
37
Dentre os fatores relacionados à diminuição da ingestão alimentar, citamos:
redução da acuidade do paladar, inflamação crônica, restrições alimentares, regime
múltiplo de medicamentos, uremia e aspectos sócio-econômicos. Dentre os aspectos que
elevam o catabolismo proteico podemos citar: acidose metabólica, resistência à insulina,
inflamação crônica, hiperparatireoidismo secundário e a presença de comorbidades
(Diabetes Melitus, AIDS e outras) (Kovesdy, 2009; Chen, 2013).
O PEW acarreta em redução progressiva de peso corporal podendo ser
identificado com diversos sinais clínicos como baixos valores de IMC (<23kg/m2),
redução de massa livre de gordura, baixa ingestão de proteína e energia, baixos níveis
de albumina e pré-albumina sérica e altas concentrações de citocinas inflamatórias
(Fouque et al., 2008). Todos os agravos dos sinais clínicos do PEW contribuem para
desfavorável prognóstico e qualidade de vida de pacientes com DRC, além do aumento
de incidência de eventos cardiovasculares (Carrero et al., 2007; Lopes et al., 2007;
Fouque et al., 2008). Entre os diversos fatores supracitados que promovem o PEW, a
inflamação parece ser importante elemento da protein-energy wasting. De fato, o PEW
e a inflamação estão inter-relacionadas, uma vez que estudos têm demonstrado que
níveis de IL-6 e PCR são inversamente correlacionados com a massa livre de gordura de
pacientes em HD (Wang et al., 2004). Além disto, elevados níveis da citocina pró-
inflamatória interleucina-1 beta (IL-1ᵦ) estão associados com diminuição de massa livre
de gordura destes pacientes (Johansen et al., 2003). O processo inflamatório contribui
para o catabolismo muscular, pois as citocinas inflamatórias atuam influenciando a
sinalização do Fator de Crescimento Insulino-Símile Tipo 1 (IGF-1) e consequente
aumento nos níveis de glicocorticoides o que ocasiona resistência muscular ao IGF-1
(Hu et al., 2009). Em geral, a sarcopenia também se encontra associada a complexos
fatores, com por exemplo, mediadores que estimulam o sistema ubiquitina proteossoma,
38
inflamação, acidose metabólica, alterações hormonais , e o sedentarismo (Souza et al,
2015). Todo esse processo levará a presença de fraqueza muscular e fadiga que é
comumente relatada por esses indivíduos. A perda de massa magra é multifatorial e está
descrita na Figura 6.
Figura 6: Representação esquemática dos mecanismos etiológicos da sarcopenia
urêmica ( Souza, et al 2015).
Somado a isso, o NF-κB, também contribui para o catabolismo muscular na
DRC, pois estimula promotores específicos que aumentam a ubiquitinação de proteínas
contribuindo desta forma para o catabolismo proteico (Lecker et al., 2003).
Assim, o ambiente urêmico e a inflamação (Caballo et al., 2012) somados ao
tratamento dialítico (Papayianni et al., 2002; El-Korai et al., 2013) contribuem para a
redução de reservas de energia com o desfecho do PEW, que por sua vez aumenta a
incidência de depressão, fragilidade muscular e mortalidade cardiovascular nestes
pacientes (Figura 6) (Carrero et al., 2013; Ikizler et al., 2013).
39
Figura 7. Modelo conceitual para a etiologia e consequências da Protein-Energy
Wasting na doença renal crônica. Adaptado de Ikizler et al., 2013. Legenda: PEW, Protein-Energy Wasting; RI, resistência a insulina; DCV, doença cardiovascular; HPT,
hiperparatireoidismo; GH, hormônio do crescimento.
Embora não exista um protocolo considerado ideal na avaliação nutricional de
pacientes renais crônicos, consideramos que seja essencial o constante
acompanhamento de alterações nutricionais nessa população, para que intervenções
sejam instituídas o mais precocemente possível. Vários parâmetros antropométricos e
bioquímicos se encontram alterados nesses indivíduos devido aos fatores mencionados
acima, e sua associação com parâmetros objeticos e subjetivos se tornam necessários
para o rastreamento mais adequado.
Existem vários métodos objetivos de avaliação do estado nutricional desses
pacientes, métodos de referência, como a absorciometria por duplo feixe de raios X
(DXA), a ressonância magnética e a tomografia computadorizada, ou a antropometria,
que é um método simples, no entanto mais barato e de fácil aplicação, como
circunferência da cintura (CC), percentual de gordura corporal por somatórios das
dobras cutâneas e a impedância biolétrica (BIA) (Kovesdy et al. 2012).
40
Outro instrumento não muito utilizado, mas bastante útil é a estimativa da massa
muscular pela cinética da creatinina, um instrumento confiável e validado para avaliar
massa muscular e estado nutricional em pacientes em tratamento de hemodiálise. Este
índice é baseado no princípio que a creatinina é proporcional a massa magra em
pacientes estáveis que possuem ingestão protéica constante (Desmeules, 2004). De
acordo com esses autores, valores menores que 22mg/kg/dia foram associados com
menor sobrevida de pacientes em HD.
Com relação aos métodos subjetivos, um dos parâmetros muito usados nas
unidades de terapia renal substitutiva é a Avaliação Subjetica Global de 7 pontos (ASG)
e a ASG modificada (ASGm) específica para pacientes em diálise. As duas ASGs foram
baseadas na ASG criada por Detsky et al 1987, para diagnosticar pacientes internados
em hospitais, com prognóstico de complicações devido ao seu estado nutricional
comprometido. Vegine et al. 2011, comparou a sensibilidade da ASG 7 pontos com
métodos objetivos, e verificou que ASG 7 isoladamente foi capaz de detectar maior
numero de pacientes desnutridos, sendo assim considerado método prático e eficaz em
diagnosticar algum grau de desnutrição. Considera-se ideal aplicar a ASG
semestralmente para medidas de controle e monitoramento do estado nutricional nesses
indivíduos, e caso tenha sido detectado algum grau de desnutrição, aplicar
trimestralmente para avaliar a efetividade da conduta nutricional de recuperação.
A ASG de 7 pontos apresenta abrangência suficiente para diagnosticar os
desnutridos e também prevenir que a desnutrição se agrave para níveis mais graves
nesses indivíduos (Detsky et al. 1987).
Jones et al. (2004) compararam em 72 pacientes em hemodiálise a ASG de
Detsky com a ASG de 7 pontos, além de um escore formado por parâmetros objetivos e
subjetivos, e verificaram que o método também teve boa associação com circunferência
41
do braço (CB), circunferência muscular do braço (CMB), creatinina e hemoglobina. A
ASG de 7 pontos teve resultados semelhantes, classificando 71% dos pacientes nas
pontuações 6 e 7 (sem risco e risco leve), e nenhum nas pontuações 1 e 2 (desnutrição
grave). O método também teve associação com CB, CMB e creatinina. A ASG de 7
pontos proporciona melhor discriminação dos diferentes graus de desnutrição entre os
pacientes, por ter maior número de classificações possíveis, e por esse motivo parece ser
bom método a ser utilizado nessa população.
Em estudo de Visser et al. (1999) com 22 pacientes em diálise, também foi
avaliada a validade e reprodutibilidade da ASG de 7 pontos, no qual observou-se alta
correlação com relação ao IMC, % de gordura corporal, circunferência do braço, CMB
e albumina sérica, além de demonstrar boa concordância intra observador.
Na ausência de métodos considerados como padrão ouro e a praticidade ,aliada
ao baixo custo na aplicação da ASG 7 pontos, recomenda-se aplica-la sempre em
conjunto com parâmetros objetivos e bioquímicos para uma avaliação nutricional mais
adequada, evitando complicações comuns a esses pacientes. Portanto, o monitoramento
do estado nutricional se torna necessário para prevenção e/ou tratamento da desnutrição.
Sendo assim, considerando a importãncia sobre a relação entre os fatores de
transcrição que modulam a inflamação e o estado nutricional, o presente trabalho se
propôs a avaliar os níveis de expressão de NF-kB e Nrf2 e possíveis associações com o
estado nutricional em pacientes em hemodiálise.
42
3.0 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar possível associação entre a expressão dos fatores de transcrição Nrf2 e
NF-κB e estado nutricional em pacientes renais crônicos em hemodiálise.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Caracterizar, através de parâmetros antropométricos e bioquímicos, o estado
nutricional dos pacientes em HD;
• Verificar possíveis associações entre a expressão dos fatores de transcrição
(Nrf2 e NF-κB), estado inflamatório e estresse oxidativo nos pacientes em HD.
43
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CASUÍSTICA
Foi realizado um estudo de coorte, transversal ,com 83 pacientes em tratamento
de HD da clínica RenalCor, localizada no Rio de Janeiro-RJ. Segundo cálculo amostral
com p=0,05 e poder de teste de 0,8, seriam necessários 24 pacientes baseado nos
valores de Nrf2 de um estudo piloto do nosso grupo de pesquisa.
Os pacientes realizavam 3 sessões semanais de HD com duração média de 4
horas, fluxo de sangue superior a 250mL/min e fluxo de dialisato de 500mL/min. Os
pacientes recebiam orientação dietética hipossódica com prescrição de 1,2g a 1,4g de
proteína/kg/dia e de 30 a 35 kcal/kg/dia, como recomendado para pacientes renais em
HD. O acompanhamento dietético era realizado pela nutricionista da clínica e
direcionado de acordo com os exames bioquímicos dos pacientes podendo ser prescrita
dieta hipocalêmica e hipofasfatêmica conforme os resultados bioquímicos.
4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Foram incluídos no estudo, homens e mulheres com idade maior de 20 anos,
com mais de 6 meses em tratamento de hemodiálise e portadores de fístula
arteriovenosa como acesso vascular. Pacientes fumantes, portadores de doenças
autoimunes e infecciosas, câncer, Aids, uso de drogas catabolizantes, uso de cateter para
o acesso hemodialítico e de suplementos vitamínicos antioxidantes foram excluídos.
44
4.3 ASCPECTOS ÉTICOS
O protocolo do estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Medicina - Universidade Federal Fluminense como adendo
do projeto nº 306.596 (Anexo 1). Os pacientes foram informados sobre a pesquisa e
assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).
4.4 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL
Os seguintes parâmetros antropométricos foram avaliados: massa corporal,
estatura, circunferência do braço (CB), dobras cutâneas de quatro pontos padrão
(bíceps, tríceps, subescapular e suprailíaca). A densidade corporal foi calculada pela
soma das quatro medidas de dobra cutânea, de acordo com o método de Durmin &
Womersley (1974), e o % de gordura corporal foi calculado utilizando-se a equação de
Siri (Lohman et al., 1991).
A aferição do peso seco foi realizada após a sessão de HD, com auxílio de uma
balança calibrada, da marca FILIZOLA, com capacidade máxima de 150 kg e
subdivisões a cada 100 gramas. O indivíduo era posicionado de pé, no centro da base da
balança, descalço e com roupas leves. A estatura foi obtida com o auxílio de um
estadiômetro acoplado à balança, referida anteriormente, ficando o indivíduo descalço,
com os calcanhares juntos, costas retas e braços estendidos no prolongamento do corpo.
O estado nutricional foi avaliado segundo o IMC, obtido pela razão entre o peso
e o quadrado da estatura, e sua classificação seguiu o proposto pela Organização
Mundial de Saúde (Quadro 3) (OMS, 1995; OMS, 1997).
45
Quadro 3. Estado nutricional de adultos segundo o índice de massa corporal (IMC)
Classificação IMC
Magreza ≤ 18,4 Kg/m2
Eutrofia 18,5-24,9 Kg/m2
Pré-obesidade 25-29,9 Kg/m2
Obesidade ≥ 30 Kg/m2
OMS, 1995; OMS, 1997.
O protocolo para aferição da circunferência braquial seguiu o descrito: o braço
avaliado (sem a fístula) foi flexionado em direção ao tórax, formando um ângulo de 90°.
Em seguida, o ponto médio entre o acrômio e o olécrano foi localizado, e o indívíduo
permaneceu com o braço estendido ao longo do corpo com a palma da mão voltada para
a coxa. O braço foi então contornado com uma fita flexível no ponto marcado de forma
ajustada, evitando compressão da pele ou folga. Para aferição da dobra cutânea tricipital
(DCT) o mesmo ponto médio foi utilizado para a medição da circunferência braquial
(CB) e separando levemente do tecido adiposo do braço não dominante, e a medida da
dobra cutânea foi realizada por meio do adipômetro do tipo Lange Skinfold Caliper
(Cambridge Scientific Industries Inc.).
Os valores de CB e DCT foram utilizados para o cálculo da circunferência
muscular do braço (CMB), segundo fórmula descrita por Frisancho (1981):
CMB = [CB (cm) - x DCT (cm)],
onde:CB = circunferência do braço
= 3,1415
46
Para medição da dobra cutânea bicipital (DCB), foi marcado o local da medida 1
cm acima daquele marcado para aferição da dobra tricipital (DCT). Com a palma da
mão do paciente voltada para fora, foi aplicado o adipômetro no local marcado. A dobra
cutânea subescapular (DCSE), foi aferida marcando-se o local abaixo do ângulo inferior
da escápula. A pele foi levantada 1 cm abaixo do ângulo inferior da escápula, de tal
forma que se observe um ângulo de 45o entre esta e a coluna vertebral. O adipômetro foi
aplicado estando o indivíduo com os braços e ombros relaxados. Na aferição da dobra
cutânea suprailíaca (DCSI), a dobra foi formada na linha média axilar, com o dedo
indicador logo acima da crista ilíaca, na posição diagonal, ou seja, seguindo a linha de
clivagem natural da pele no lado direito do indivíduo.
Após a aferição das dobras cutâneas (DCB, DCT, DCSE e DCSI) seu somatório
seguiu o proposto na equação de Durnin e Womersely (1974) para o cálculo da
Densidade Corporal (DC): (A – B) x log Σ 4 dobras
As fórmulas para o cálculo da DC, já com os coeficientes A e B, elaborados de
acordo com idade e gênero, estão apresentados no Quadro 4.
Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal
Idade (anos) Homens Mulheres
17 - 19 DC = 1,1620 - 0,0630 x (log Σ ) DC = 1,1549 – 0,0678 x (log Σ )
20 – 29 DC = 1,1631 - 0,0632 x (log Σ ) DC = 1,1599 – 0,0717 x (log Σ )
30-39 DC = 1,1422 - 0,0544 x (log Σ ) DC = 1,1423 – 0,0632 x (log Σ )
40 – 49 DC = 1,1620 - 0,0700 x (log Σ ) DC = 1,1333 – 0,0612 x (log Σ )
≥ 50 DC = 1,1715 - 0,0779 x (log Σ ) DC = 1,1339 – 0,0645 x (log Σ )
Fonte: Durnin & Womersley, 1974.
A partir dos valores de DC, o %GC total foi determinado utilizando a fórmula de
Siri (1961): %GC = 4,95/DC – 4,5 x 100.
Os valores de referência para o %GC são estabelecidos por Lohman et al.
(1992), conforme exposto no Quadro 5.
47
Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal
Homens Mulheres
Risco de distúrbios associados à desnutrição ≤ 5 ≤ 8
Abaixo da média 6 a 14 9 a 22
Média 15 23
Acima da Média 16 a 24 24 a 31
Risco de doenças associadas à obesidade ≥ 25 ≥ 32
Fonte: Lohman et al., 1992
Para o cálculo de massa magra, utilizou-se o índice de creatinina (IC) que é
derivado da massa livre de gordura, e foi utilizada a fórmula baseada no estudo Carnaud
B, et al. (2014):
IC (mg /kg/dia) = 16,2 + 1,12 x [1 mulheres; 0 homens ]- 0,06 x idade (anos)
– 0,08 x Kt /V + 0,009 x Cr pré dialise (mmol /l)
Vale ressaltar que todos os pacientes desse estudo eram anúricos. Assim,
utilizamos essa referência para o nosso estudo, já que pela antropometria poderíamos
estar sujeitos as variações devido as possíveis alterações hídricas presentes nesses
indivíduos.
Para o cálculo de massa livre de gordura, utilizamos o % de gordura corporal
avaliado pelo somatório das quatro pregas,( Triceps, biceps, subscapular e suprailiaca) e
o peso seco , através da seguinte equação :
Peso Seco - % GC = Kg gordura , e Peso Seco – Kg gordura = MLG
Também foi aplicada a ASG de 7 pontos indicada para pacientes com DRC em
HD, que consiste em um formulário composto pela avaliação da condição clínica e de
exame físico do paciente. A partir dessa avaliação o indivíduo foi classificado em bem
nutrido (7 e 6 pontos), desnutrido leve a moderado (5, 4 e 3 pontos) e desnutrido grave
(2 e 1 ponto), conforme proposto pelo método (Fetter et al. 2014) (Anexo 3).
48
A ingestão proteica foi estimativa por meio do cálculo do equivalente proteico
do aparecimento de nitrogênio (protein nitrogen appearance - PNA) através da seguinte
fórmula (NKF - KDOQI, 2000):
PNA (g/kg/dia) = {(uréia sérica/2,14) / [25,8 + (1,15/Kt/V)] + (56,4 / Kt/V)} + 0,168
4.5 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.5.1 Coleta do sangue
As amostras de sangue (20ml) foram coletadas em tubos Vacutainer® (4mL)
contendo EDTA como anticoagulante (1mg/mL), em seguida, centrifugado a 3000 rpm
por 15 minutos, a 4°C, para a obtenção do plasma. O plasma foi acondicionado em
tubos eppendorfs de polipropileno de 1,5mL, e conservado a –80°C para as análises. O
restante do sangue coletado seguiu outros procedimentos.
4.5.2 Análises bioquímicas de rotina
Os parâmetros bioquímicos de rotina (albumina, potássio, uréia, creatinina,
fósforo, cálcio, PTH, hemoglobina, hematócrito, colesterol total e triglicerídeos ) foram
retirados dos prontuários dos pacientes. As concentrações de albumina (normalidade ≥
3,8g/dL) (Fouque et al., 2008), ureia e creatinina foram determinadas pelos métodos
verdes de bromocresol, enzimático e colorimétrico, respectivamente. As concentrações
de fósforo (normalidade: 3,5 – 5,5 mg/dL), potássio (normalidade: 3,5 – 5,5 mg/dL) e
cálcio (normalidade: 8,4 – 9,5 mg/dL) tiveram como métodos de determinação,
respectivamente, cinético UV, eletrodo seletivo colorimétrico. Os níveis séricos totais
de cálcio foram corrigidos adicionando-se 0,8 mg/dL para cada redução de 1g/dL nos
níveis séricos de albumina a partir de 4g/dL. O PTH (normalidade: 2 a 9 vezes o valor
49
superior do método (Gueiros et al., 2011) foi determinado por imunoensaio e
enzimático de fase sólida (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Hb e Ht
foram determinados pelo método colorimétrico e microcentrifugação, respectivamente.
Para pacientes em HD, o diagnóstico de anemia é feito com base apenas nos valores de
Hb, sendo valores de 11-13g/dL considerados normais. O colesterol total (CT) e
triglicerídeos (TG) foram determinados pelo método enzimático colorimétrico através
do Kit específico KATAL® (Katal Biotecnológica Ind. Com. Ltda, Belo Horizonte -
MG – Brasil).
Os valores de referência apresentados, exceto para albumina e PTH, foram
baseados no Clinical Practice Guidelines for Nutrition in Chronic Renal Failure (NKF-
KDOQI, 2000), Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in
Chronic Kidney Disease (NKF, 2003) e Clinical Practice Guidelines and Clinical
Practice Recommendations for Anemia in Chronic Kidney Disease (NKF-KDOQI,
2006).Os valores de ureia pré e pós-HD, ultrafiltração e tempo de diálise foram
considerados no cálculo da dose de diálise (Kt/Vsp), parâmetro utilizado para estimar a
eficiência dialítica e cujos valores de normalidade são superiores a 1,2 (Sargent e Gotch,
1985).
4.5.3 Marcadores de estresse oxidativo e inflamação
* Determinação da Atividade da GPx
A atividade máxima da enzima GPx foi determinada no plasma com o auxílio de
kits comerciais para ELISA (Cayman®). Este método se baseia na reação em que a
enzima GPx catalisa a oxidação da glutationa reduzida por um hidroperóxido. Na
presença de GPx e NADPH, a glutationa oxidada é convertida à forma reduzida com a
oxidação concomitante do NADPH em NADH+. A diminuição na absorbância a 340 nm
foi então determinada (Paglia & Valentine, 1967).
50
* Determinação da Atividade da Catalase
A atividade da enzima catalase foi determinada no plasma com o auxílio de kits
comerciais para ELISA (Cayman®
). Este método se baseia na reação da catalase com
metanol na presença de uma concentração ótima de H2O2. O formaldeído produzido é
mensurado colorimetricamente com Purpald como cromógeno.
* Determinação da Atividade da SOD
A atividade dos três tipos de SOD (MnSOD, FeSOD e Cu/ZnSOD) foi
determinada no plasma com o auxílio de kits comerciais para ELISA (Cayman®
). Este
método utiliza um sal específico (tetrazolium) para detecção dos radicais superóxidos
produzidos pela xantina oxidase e hipoxantina.
* Determinação dos níveis de Il-6
Para a dosagem da citocinas inflamatória IL-6 foi utilizado kit comercial ELISA
(R&D Systems®
).
4.5.4 Isolamento das células mononucleares (PBMCs) e preparação do extrato
nuclear
O sangue total foi transferido para tubo falcon com ficol e centrifugado a 18°C.
A nuvem de célula em suspensão foi transferida para um novo tubo falcon, adicionado
PBS e centrifugado novamente a 18°C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet”
nuclear ressuspendido em 1mL meio de congelamento. O lisado nuclear foi estocado a -
80°C durante uma semana e após este período, em nitrogênio líquido. Uma alíquota foi
separada para quantificação da proteína pelo método de Bradford, utilizando como
padrão albumina bovina sérica.
51
4.5.5 Análise PCR em tempo real
O RNA total foi extraído das PBMC com o sistema de isolamento de RNA total
(SV Totla RNA Isolation System, Promega®). O cDNA foi sintetizado com o High-
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®). Ensaios TaqMan
Gene Expression (Applied Biosystems®) foram utilizados para detectar mRNA de Nrf2
(Hs00975961_g1), NF-κB (Hs00765730_m1), NQO1 (Hs00168547_m1), e o gene de
controle ABL1 (Hs00245445_m1). A expressão do mRNA de Nrf2, NF-κB e NQO1 foi
normalizada contra ABL1 e o nível de expressão calculado usando o método delta ciclo
limite delta.
5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para testar a distribuição das
variáveis, sendo os resultados expressos como média ± DP (desvio-padrão), mediana
(distância interquartílica) ou percentual, conforme adequado. Foi utilizado o teste de
Wilcoxon para avaliar a diferença nas variáveis de interesse em decorrência da
intervenção. O coeficiente de correlação de Pearson ou Spearmann foi considerado para
avaliar a correlação entre as variáveis. Análise de regressão múltipla linear foi realizada
para determinar associações com a expresão do NF-kB. As variáveis testadas foram
idade, sexo, IMC, PCR, IC, albumina, PNA e % gordura corporal.
Os testes serão fixados com valores de confiança em 95% (p < 0,05), sendo
considerados significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o
programs SPSS versão 20.0.
52
6.0 RESULTADOS
6.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES
Foram avaliados 83 pacientes em HD, 47 homens e 36 mulheres, média de idade
de 52,3 ± 14,4 anos e o tempo médio de tratamento em HD foi de 57,5 ± 50 meses.
A nefroesclerose hipertensiva configurou-se como a principal causa para DRC
(65%), seguida pela nefropatia diabética (19%), glomerulonefrite crônica (14%) e o
restante por outras causas. Com relação aos medicamentos utilizados, a maioria (90%)
dos pacientes fazia uso de eritropoietina recombinane humana. O cinacalcet estava
sendo utilizado por 24% dos pacientes devido ao hiperparatireoidismo grave, 90% dos
pacientes usavam sulfato ferroso e ácido fólico. Todos os pacientes utilizavam quelantes
de fósforo, sendo Sevelamer e/ou carbonato de cálcio. As drogas antipertensivas usadas
pelos pacientes incluíam inibidores da enzima conversora de angiotensina II (IECA), β-
bloqueadores, antagonistas dos canais de cálcio e antiadrenérgico de ação central.
De acordo com IMC, apenas 1 paciente apresentou magreza (IMC<18,5Kg/m2) e
39,8% apresentaram sobrepeso ou obesidade. Segundo a circunferência muscular do
braço realizada por antropometria, 3 pacientes apresentaram algum grau de depleção
muscular, os demais (85%) apresentaram massa magra preservada. Com relação ao %
de gordura corporal, 88% dos homens apresentam valores acima do considerado normal
(15%) e 52,4% das mulheres apresentaram valores acima de 23%. Entretanto, de acordo
com o cálculo do índice de creatinina (IC), observamos que 62% dos pacientes
apresentaram IC menor que 22mg/kg/d, constatando diminuição de massa muscular
nessa população. As características antropométricas da população são apresentadas na
Tabela 1.
53
Tabela 1. Características antropométricas dos pacientes estudados
Parêmetros Total Homens (47) Mulheres (N=35) p-valor
IMC (kg/m2) 24.7 ± 3.9 24.7 ± 3.9 24.8 ± 3.8 0.8
CMB (cm) 22,0 ± 3,3 24.2 ± 3.2 21.9 ± 3.0 0.09
GC (%) 23,8 ± 7,3 22.5 ± 5.8 25.6 ± 8.8 0.11
MLG (kg) 50,1 ± 9,2 53.2 ± 9.2 45.3 ± 7.3 0.03
IC (mg/Kg/d) 21,7 ± 3,4 22,5 ± 3,8 20,7 ± 2,6 0,009
Valores em media ± SD.IMC Indice de massa corporal; CMB circunferencia media do braço;
GC; Gordura corporal; MLG, massa livre de gordura; IC, índice de creatinina.
De acordo com a análise feita por sexo, os homens apresentaram, como já
esperado, maiores valores de massa magra e IC.
A ingestão média de proteína (PNA) foi de 1,2 ± 0,2g/kg/d, sendo que 19
pacientes apresentaram ingestão proteica abaixo do recomendado (1,2g/kg/d).
De acordo com os parâmetros bioquímicos dos pacientes (Tabela 2), 10
pacientes apresentaram valores de albumina < 3,8g/ dL, 39,7% apresentaram anemia
(Hto<33%) e 42% dos pacientes apresentaram hiperfosfatemia. Com relação ao perfil
lipídico, 25% dos pacientes apresentaram níveis elevados de triglicerídeos (TG) e,
apenas 6% apresentaram níveis de colesterol total acima dos valores recomendados.
54
Tabela 2. Parâmetros bioquímicos dos pacientes estudados
Parâmetros Valores Valores referência
Ureia (mg/dL) 142.1 ± 27.7 < 90
Creatinina (mg/dL) 8.4 ± 2.6 > 10
Potássio (mEq/l) 5.4 ± 0.5 3.5 - 5.0
Fósforo (mg/dL) 5.2 ± 1.2 ≤ 5.0
Cálcio (mg/dL) 8.9 ± 0.5 8.4 – 9.5
Albumina (g/dL) 3.9 ± 0.6 ≥ 3.8
Hemoglobina (g/dL) 10.6 ± 1.9 10 – 12
Hematócrito (%) 32.8 ± 5.6 33- 36%
PTH (pg/dL) 288 (188.2-452.2) 30 - 450
Kt/V 1.57 ± 0.4 ≥ 1.2
Colesterol total (mg/dL) 161.6 ± 37.3 < 200
Triglicerídeos (mg/dL) 186.5 ± 114 < 150
Valores em média ± SD. Kt/V, dose de diálise e PCR, proteina C reativa
6.2 FATORES DE TRANSCRIÇÃO, MARCADORES DE INFLAMAÇÃO e
ESTRESSE OXIDATIVO
A atividade das enzimas antioxidantes, níveis de marcadores inflamatórios e
expressão dos fatores de transcrição são apresentados na Tabela 3.
55
Tabela 3. Atividade das enzimas antioxidantes, marcadores inflamatórios e
expressão dos fatores de transcrição nos pacientes estudados.
Parâmetros Valores
SOD (U/mL) 38.6 ± 12.9
CAT (nmol/mL/min) 38.8 ± 27.6
GPx (nmol/mL/min) 35.1 ± 20.4
IL-6 (pg/dL) 24.1 ± 3.8
PCR (mg/dL) 2.7 (0.6 – 19.3)
Nrf2 0.69 (0.11 -2.75)
NF-κB 1.1 (0.26 -3.73)
Razão Nrf2/ NF-κB 0.66 ± 0.67
NQO1 1.2 ± 0.6
SOD, superóxido dismutase; CAT, catalase; GPX, glutation peroxidase,
NQO1, NAD(P)H quinona oxidoredutase 1; IL-6, Interleucina 6.
De acordo com os valores de PCR, 47,6% dos pacientes apresentavam
inflamação (valores acima de 3mg/dL). Com relação aos demais parâmetros, não foi
possivel realizar essas análises, devido a falta de um padrão de normalidade.
A expressão de NF-κB apresentou correlação positiva com idade (r = 0,33 e p=
0,02) e negativa com IC (r= -0,54 , p =0,001) (Figura 7), níveis de albumina (r=-0,32,
p = 0,02) e % GC (r =-0,61 p= 0,001). Não houve correlações com Nrf2. No entanto,
quanto maior foi a razão entre Nrf2/NF- kB, maior era o índice de creatinina nesses
pacientes (r=0,37, p=0,008).
56
Figura 8. Associação entre expressão de NF-κB e valores de índice de
creatinina nos pacientes em hemodiálise.
A ingestão proteica avaliada pelo PNA foi positivamente associada com os
valores de índice de creatinina (r= 0.35, p=0.001).
Não houve correlação entre os níveis das enzimas antioxidantes e a expressão
dos fatores nucleares.
A análise de regressão linear múltipla foi realizada para determinar as variáveis
que possuem associações independentes com a expressão de NF-κB. As variáveis
incluídas, foram, idade, genero, IMC, PCR, IC, albumina, PNA e % gordura corporal. A
análise revelou que a expressão de NF-κB foi independentemente associada com IC
(ajustado coeficienteβ= -0.8, p= 0.013 e % GC (ajustado coeficiente β:- 0.42; p=0.04).
De acordo com a ASG 7 pontos, os pacientes foram divididos em 2 grupos, um
grupo composto por pacientes classificados como desnutridos e outro de eutróficos. O
57
grupo de desnutridos apresentou elevada expressão do NF-κB (1,7 ± 0.9) quando
comparado com o grupo de eutróficos (1,1 ± 0,6) (p=0,03) (Gráfico 1).
Figura 9. Comparação da Expressão NF-κB entre pacientes Desnutridos e
Eutróficos segundo ASG.
58
7.0 DISCUSSÃO
A inflamação e estresse oxidativo são complicações bastante comuns em
pacientes com DRC em tratamento de HD e estão associadas com a síndrome protein
energy wasting, que é uma das principais causas de mobimortalidade nesses pacientes
(Stenvinkel, 2005, Fouque et al. 2008, Chen et al. 2013). Uma das hipótese para a
inflamação levar à desnutrição é através da ativação do NF-kB e, de fato, o presente
estudo verificou a relação entre aumentada expressão transcricional do NF-kB com
piora do estado nutricional de pacientes com DRC em HD.
O IMC é considerado o método mais simples, prático e de baixo custo para
avaliação do estado nutricional, entretanto, não fornece dados suficientes para adequada
análise da composição corporal (Mafra et al., 2008). A avaliação da massa muscular
desses pacientes em HD é sempre uma limitação nos estudos, no entanto, em pacientes
em HD, com função residual mínima ou nula, recebendo uma dose constante de HD, a
creatinina sérica pré diálise é propocional a massa muscular e a ingestão de proteína
(KDOQI, 2000). Assim, o modelo de cinética da creatinina baseado no princípio de que
a geração de creatinina é proporcional a massa magra em pacientes estáveis em HD que
possuem ingestão protéica constante, pode ser boa alternativa para avaliação da massa
muscular (Canaud, 1995). O cálculo da cinética, requer complexa fórmula matemática,
que inclui valores pós HD de creatinina sérica e depende da coleta do dialisado.
Entretanto, como maneira simplificada e prática de cálculo, Carnaud et al. (2014),
elaboraram uma fórmula baseada na idade, gênero, creatinina pré hemodiálise e dose de
diálise, que apresentou forte correlação com massa muscular nesses pacientes, pelo IC
através da cinética da creatinina.
59
Na análise antropométrica dos pacientes, observamos que pelo IMC, apenas 1
paciente estava desnutrido e, 39,8% apresentaram obesidade ou sobrepeso. Em
contrapartida, 62% dos pacientes apresentaram índice de creatinina menor que
22mg/kg/d, constatando diminuição de massa muscular nessa população. De fato, a
atrofia muscular, acompanhada ou não de depleção energética, é comumente observada
nos pacientes submetidos à HD (Carrero et al., 2008; Mak et al., 2011). Curiosamente,
elevada adiposidade e obesidade central podem ocorrer paralelamente à depleção
proteica (Gohda et al., 2008; Cordeiro et al., 2010). O que de fato, observamos na
população estudada que apresentava elevado percentual de gordura corporal.
Essa alteração na composição corporal nos pacientes em HD já é bastante
relatada na literatura e pode ser devida a diversos fatores como uremia per se, estresse
oxidativo, idade, e dentre vários outros fatores, a inflamação (Fouque et al., 2008).
Sabe-se que a inflamação induz o catabolismo protéico, a lipólise, o aumento do
gasto energético, a resistência a insulina e à supressão do apetite. O fator nuclear B
(NF-B), um fator de transcrição associado ao aumento da síntese de citocinas
inflamatórias, pode estar relacionado ao catabolismo muscular observado na DRC.
Langen et al. (2001) observaram in vitro que o tratamento com fator de necrose
tumoral-alfa (TNF-α) induziu à alterações na diferenciação dos miócitos via ativação do
NF-B. Portanto, devido aos inúmeros fatores catabólicos associados à inflamação, é
evidente sua relação com a atrofia muscular característica dos pacientes em HD
(Fouque, 2008, Fouque et al, 2008; Carrero et al., 2008, Cheung et al., 2010, Mak et al.,
2011).
Reforçando a associação entre inflamação e perda de massa muscular, em
indivíduos em HD, Huang et al. (2010) demonstraram num estudo randomizado,
placebo e controlado que a administração de anti-citocinas (receptor antagonista de IL-
60
1) durante 4 semanas melhorou significativamente a resposta inflamatória em pacientes
em HD, na concentração de pré albumina em 23% e, em 17% dos pacientes houve
aumento da massa magra avaliado pela absormetria de energia de RX (DXA).
Deger et al. (2015) mostraram que a inflamação afeta a massa muscular
esquelética, através da correlação positiva entre níveis de proteína C reativa e proteólise
e negativa com síntese proteica em pacientes em HD. Os níveis de PCR são preditores
independentes na manutenção da homeostasia muscular esquelética.
O sistema ubiquitina proteossoma está envolvido com inflamação e perda
muscular, sendo um dos principais mecanismos de proteólise ativado no músculo
esquelético nos pacientes com DRC, principalmente nos pacientes em HD. Quando a
degradação proteica é iniciada, há expressão de 2 ligases da ubiquitina específicas E3, a
muscle specific ring finger-1 – MuRF-1 e a muscle atrophy F-box –MAFbx. A ativação
dessas ligases se correlaciona com a aceleração da degradação proteica. O forkhead
transcription factors (FoxO) e o NF-𝜅B são fatores ativadores dessas enzimas que
condicionam à degradação proteica via sistema ubiquitina proteossoma (Chen et al.
2013).
No presente estudo, verificamos que a expressão de NF-𝜅B foi também
negativamente associada com massa gorda. De fato, estudos prévios mostraram que o
aumento dos níveis de TNF-α pode predispor à lipólise, devido à redução de perilipina,
proteína presente nas gotas lipídicas dos adipócitos que reduz o acesso das lipases para
estoque de gordura e assim, inibe a hidrólise de triglicerídeos (Ryden et al. 2004,
Brasaemle et al. 2000).
Adicionalmente, nossos resultados mostraram que pacientes desnutridos
segundo ASG de 7 pontos, apresentaram maior expressão do RNAm para NF-kB,
61
reforçando a hipótese de que o processo inflamatório leva à piora do estado nutricional
nos pacientes com DRC em HD.
Contrapondo as ações do NF-kB, o Nrf2 parece desempenhar papel importante
na proteção celular contra o estresse oxidativo e inflamação. Jiang et al. (2010)
exploraram o papel protetor de Nrf2 contra a nefropatia diabética usando dois modelos:
1) em tecidos de biópsia de rim de pacientes com nefropatia diabética observaram que
os glomérulos desses pacientes estavam sob estresse oxidativo e havia elevados níveis
de Nrf2; 2) em camundongos induzidos por estreptozotocina à nefropatia diabética
observaram que Nrf2 demonstrou ser fundamental na proteção ao dano renal. Isto é
evidente por camundongos Nrf2 (-/-) ter maior produção de EROs e sofrer maior dano
oxidativo no DNA e lesão renal em comparação com camundongos Nrf2 (+/+).
O fator de transcrição Nrf2 foi descoberto recentemente e tem sido visto como
mecanismo importante capaz de proteger contra essas condições, por induzir a síntese
de enzimas antioxidantes e desintoxidantes de fase II, que desempenham papel
fundamental na defesa celular, intensificando a remoção de EROs (Jung e Kwak, 2010;
Singh et al., 2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011), além disso, inibe a ativação do NF-
κB.
Kim e Vaziri (2010), em análise do tecido renal obtido a partir de ratos
nefrectomizados com DRC, mostraram deficiência na ativação de Nrf2 e,
consequentemente, na regulação das enzimas antioxidantes. Foi observado também
aumento na peroxidação lipídica, depleção de glutationa, e ativação de NF-B, bem
como as enzimas relacionadas com a inflamação, tais como ciclo-oxigenase-2 e 12-
lipoxigenase, e infiltração de células mononucleares.
Aminzadeh et al., (2013) estudando ratos com nefropatia túbulo-intersticial, uma
causa comum de DRC, observaram aumento da expressão de NAD(P)H-oxidase, ciclo-
62
oxigenase-2, 12-lipoxigenase e ativação de NF-B, além disso, observaram diminuição
da ativação Nrf2 e sub-regulação dos seus produtos, incluindo, catalase, HO-1 e de
GCL.
Nossos resultados estão de acordo com essas publicações e mostram claramente
diminuição na expressão de Nrf2 e aumentada de NF-B em pacientes em HD. Por ser
fator de transcrição ativado em resposta ao estado antioxidante perturbado, seria
plausível supor que a expressão de Nrf2 estaria aumentada em pacientes em HD. No
entanto, observamos o contrário e que isso pode estar relacionado ao fato de que antes
do desenvolvimento da doença ou na fase inicial da mesma, Nrf2 tem sua ativação
aumentada de modo a evitar danos induzidos por EROs. No estágio mais avançado,
porém, esse mecanismo de proteção pode tornar-se saturado pelo excesso de EROs.
Esse aumento de Nrf2 a resposta aguda e redução em meio à cronicidade/gravidade da
doença também são observados em outras doenças crônicas como a doença pulmonar
obstrutiva crônica (DPOC) (Malhotra et al., 2008; Suzuki et al., 2008, Leal et al. 2015).
Nosso grupo de pesquisa relatou pela primeira vez que pacientes em HD
apresentam diminuição na expressão do Nrf2 comparado a indivíduos saudáveis, além
do aumento da expressão do fator NF-κB. Foi observada diminuição na expressão da
enzima NQO1 nos pacientes em HD comparado a indivíduos saudáveis e aumento de
marcadores inflamatórios (TNF-alpha) e de peroxidação lipídica (MDA). Condições
essas que aumentam o risco dos pacientes em HD desenvolver DCV, levando ao
aumento da mortalidade nessa população (Pedruzzi et al. 2015).
Nosso estudo possui limitações, primeiramente métodos de avaliação
nutricional, como o DXA, não foi realizado, embora a avaliação da composição
corporal pelas dobras cutâneas já revelou ser um método confiável e seguro para
63
pacientes renais crônicos em HD, (Kamimura, et al. 2007). Além disso, esse é um
estudo transversal o que dificulta estabelecer uma relação causal.
Assim, diante dos resultados encontrados neste estudo, novas perspectivas para
avaliação dos fatores causais da perda de massa magra na DRC podem surgir, na
tentativa de diminuir a inflamação e o estresse oxidativo, aumentando a expressão de
Nrf2 e antagonizando a expressão do NF-κB, minimizando a perda de massa magra
para esses pacientes. Portanto, até o presente momento, as evidências apontam que a
perda de massa muscular se correlaciona com aumento da expressão do NF-κB.
64
8.0 CONCLUSÕES
Em conclusão, a expressão do Nrf2 parece não ter associação com estado
nutricional nos pacientes em HD. Por outro lado, a ativação do NF-κB pode ter
contribuído para o aumento da inflamação, do estresse oxidativo e perda de massa
muscular nesses indivíduos.
65
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77
ANEXO 2: TERMOS DE CONSENTIMENTO
PROJETO: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS FATORES TRANSCRICIONAIS
NRF2 E NFKB EM PACIENTES RENAIS CRÔNICOS, EM HEMODIÁLISE
Estas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste
estudo, que tem como objetivo avaliar a expressão desses fatores transcricionais em
indivíduos que realizam tratamento de hemodiálise.
A nutricionista Najla Elias Farage é a responsável pela pesquisa e coleta de
informações sobre o hábito alimentar e avaliação antropométrica que será realizado
durante o período da pesquisa.
Esta pesquisa tem como principal benefício observar se a expressão celular desses
fatores transcricionais e enzimas antioxidantes sofrem influencia do tratamento de
hemodiálise , relação com complicações clinicas, e se também podem ser associados a
marcadores inflamatórios .
A pesquisa será realizada com a coleta de sangue em 5 tubos antes do indivíduo ser
instalado na máquina de hemodiálise, uma vez somente, ou caso seja necessário repetir
a coleta por motivo de problemas no material não ter sido suficiente.
A qualquer momento voce poderá ter acesso aos resultados parcias da pesquisa, bem
como qualquer outro dado referente a pesquisa , e ao resultado de exames, com a
nutricionista Najla Elias Farage.
Você tem o direito de se retirar da pesquisa em qualquer momento que julgar
necessário sem haver qualquer prejuízo ao seu tratamento.
Esta pesquisa não envolverá qualquer custo ao participante. Todos os dados coletados
serão divulgados em pesquisa no meio científico sem qualquer identificação pessoal.
Somente a equipe de pesquisadores e seu médico terão acesso aos resultados de exames
.
Este documento deverá ser assinado em duas vias, uma que ficará com você, e outra
com o pesquisador.
Eu, .............................................................................................................................,
acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações sobre o estudo
citado, que li ou que foram lidas pra mim.
Eu aceitei perante a pesquisadora Najla Elias Farage sobre a minha participação no
estudo . Ficaram claros os propósitos da pesquisa, e procedimentos realizados. Ficou
claro que minha participação é isenta de despesas. Concordo voluntariamente em
participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento que
julgar necessário, sem que ocorra nenhum prejuízo ao meu tratamento.
............................................................................ data : ........../........./..........
79
ANEXO 4: ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO
NF-B EXPRESSION AND ITS ASSOCIATION WITH NUTRITIONAL
STATUS IN HEMODIALYSIS PATIENTS
Najla Elias Farage1, Milena Barcza Stockler-Pinto
2, Viviane de Oliveira Leal
2, Ludmila
LMF Cardozo2, José Carlos Eduardo-Carraro
3, Denis Fouque
4, Denise Mafra
1,2
1 Medical Sciences Graduate Program, Federal Fluminense University (UFF), Niterói,
RJ, Brazil
2 Cardiovascular Sciences Graduate Program, UFF, Niterói, RJ, Brazil
3 Medicine Faculty, UFF, Niterói, RJ, Brazil
4 Department of Nephrology, Centre Hopitalier Lyon Sud, Pierre-Bénite, France
Corresponding author: Viviane Leal (vivianeoleal@yahoo.com.br)
Programa de Pós-graduação em Ciências Cardiovasculares
Hospital Universitário Antônio Pedro, Universidade Federal Fluminense
Rua Marques do Paraná, 303, 4o andar, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
ZC: 24033-900
*