UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

NAJLA ELIAS FARAGE

EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO Nrf2 E NF-κB E

ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS

CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE

NITERÓI – RJ

2016

ii

NAJLA ELIAS FARAGE

EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO NRF2 E NF-ΚB E

ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS

CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense

como parte dos requisitos necessários

à obtenção do Grau de Doutora. Área

de Concentração: Ciências Médicas

Orientadora: Profª. Drª Denise Mafra

Co-orientador: Prof. Dra Milena Barcza Stockler-Pinto

NITERÓI – RJ

2016

iii

Farage, Najla Elias

Expressão dos fatores transcricionais Nrf2 e Nf-κB

e associação com estado nutricional em pacientes renais

crônicos em hemodialise/ Najla Elias Farage. – Niterói:

[s.n.], 2016

92f

Orientador: Denise Mafra

Co-Orientador: Milena B Stockler-Pinto

Tese (Pós-Graduação em Ciências Médicas)

– Universidade Federal Fluminense, 2016.

1. Ciências Médicas. 2. Doença Renal Crônica. 3.

desnutrição. 4. Inflamação.

iv

NAJLA ELIAS FARAGE

EXPRESSÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO NRF2 E NF-ΚB E

ASSOCIAÇÃO COM ESTADO NUTRICIONAL EM PACIENTES RENAIS

CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense

como parte dos requisitos necessários

à obtenção do Grau de Doutora. Área

de Concentração: Ciências Médicas

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Profª. Drª Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães

Universidade Federal Fluminense-UFF

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Perez Gomes

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. Julio Beltrame Daleprane

Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERJ

_____________________________________________________________________

Profa. Dra. Julie Calixto Lobo

Universidade Federal Fluminense-UFF

_____________________________________________________________________

Profa. Dra. Vivian Warlich

Universidade Federal Fluminense-UFF

NITERÓI – RJ

2016

v

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a todos os pacientes que sempre estiveram dispostos a contribuir

para a melhoria do seu tratamento e qualidade de vida durante todo o período do estudo.

As minhas orientadoras, Drª Denise Mafra, Drª Milena Stockler-Pinto.

vi

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar as minhas orientadoras Denise e Milena que sempre

acreditaram no meu potencial e não medem esforços na ajuda, e a parceira de bancada

MSc Cinthia Costa.

A Viviane Leal sempre presente nas revisões e críticas, enriquecendo o trabalho.

A minha família, especialmente meu filho, pela paciência durante esse período.

Aos diretores e funcionários da Clínica Renalcor que sempre incentivaram meu

crescimento profissional.

vii

Resumo

Pacientes renais crônicos, principalmente os que estão em diálise, possuem alta

prevalência da chamada síndrome protein energy wasting e, dentre os fatores de risco

destacam-se a inflamação e o estresse oxidativo. A ativação do Fator Nuclear- kappa B

(NF-κB) está associada com a síntese de citocinas inflamatórias e, recentemente neste

cenário, em contraste ao NF-κB, o sistema fator nuclear eritróide 2-relacionado ao fator

2-Kelch-like ECH proteína 1 (Nrf2-Keap1) tem surgido como importante mecanismo de

defesa contra o estresse oxidativo e inflamação, promovendo a síntese de enzimas

antioxidantes. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos

fatores de transcrição, NF-κB e Nfr2, em pacientes renais crônicos em hemodiálise

(HD) e verificar possíveis associações com estado nutricional. Foram avaliados 83

pacientes em HD (47 homens, 52,3 ± 14,4 (22-84) anos, 24,7 ± 3,9 Kg/m2

e 6,2 ± 3,8

anos em tratamento dialítico). Após a coleta de sangue as células mononucleares foram

isoladas (PMBC) a expressão de NF-κB e Nfr2 foi analisada pela Reação em cadeia de

polimerase em tempo real. A análise da concentração plasmática de proteína C reativa

ultrassensível foi realizada por ELISA. O estado nutricional foi avaliado por

antropometria (% gordura corporal e Índice de Massa Corporal - IMC), pela estimativa

de massa muscular (índice de creatinina - IC) e avaliação Subjetiva Global (ASG) de 7

pontos. De acordo com o IMC, 49,4% dos pacientes apresentaram sobrepeso ou

obesidade e apenas um paciente apresentou baixo peso (IMC< 18,5 Kg/m2). De acordo

com os níveis de proteína C reativa, 47,6% apresentaram inflamação (> 3mg/dL) e 62%

apresentou baixos valores de IC (<22mg/Kg/d). A expressão do NF-κB foi

positivamente correlacionada com a idade (r =0,33, p=0,02) e negativamente com o IC

(r= -0,54, p=0,0001), albumina (r= -0,32, p= 0,02) e % GC (r = -0,61, p= 0,001). De

acordo com a ASG, os pacientes desnutridos apresentaram maiores valores da expressão

de NF-κB (1,7 ± 0.9, p=0,03), quando comparados com os eutróficos (1,11 ± 0.6). A

expressão de Nrf2 não se correlacionou com os parâmetros antropométricos. Os dados

parecem mostrar que a ativação do NF-κB contribui para a perda de massa muscular e

desnutrição nos pacientes em HD, entretanto, estudos que avaliem melhor essa relação

são necessários.

Palavras chave: Doença renal crônica, inflamação, estresse oxidativo, estado

nutricional.

viii

Abstract

Protein energy wasting (PEW) is a common outcome in chronic kidney disease

patients undergoing hemodialysis (HD) and oxidative stress and inflammation are

common risk factors to PEW. Nuclear transcription factors are involved in these

processes as Fator Nuclear-kappa B (NF-κB) which plays important role in coordinate

expression of inflammatory genes and in contrast, the transcription nuclear E2-related

factor 2 (Nrf2) operates in the genes promoter region coding for detoxifying enzymes

stage II or antioxidant enzymes. The aim of this study was to evaluate the NF-kB and

Nrf2 expression in patients undergoing HD and the association with nutritional status.

Eighty three HD patients (47 men, 52.2 ± 14.4 (22-84) years, 24.7 ± 3.8 Kg/m2

and

dialysis vintage 6.2 ± 3.8 years) were enrolled in this study. Blood samples were

collected and peripheral blood mononuclear cells were isolated, and analyses of real

time polymerase chain reaction was performed to evaluate the Nrf2 and NF-kB mRNA

expression levels. The C-reactive protein (CRP) plasma levels were analyzed by

ELISA. Nutritional status was assessed by anthropometry (% body fat and body mass

index - BMI), estimation of muscle mass (creatinine index - CI) and subjective global

assessment (SGA- 7-point scale version). According to BMI, 49.4% of patients were

overweight or obese and only one patient had low weight (BMI <18.5 kg/m2).

According to C-reactive protein levels, 47.6% had inflammation (> 3 mg/dL) and 62%

had low CI values (<22mg/Kg/d). The expression of NF-κB was positively correlated

with age (r = 0.33, p = 0.02), and negatively with CI (r = -0.54, p = 0.0001), albumin (r

= - 0.32, p = 0.02) and % body fat (r = -0.61, p = 0.001). According to SGA,

malnourished patients showed higher values of NF-κB expression (1.7 ± 0.9, p = 0.03)

compared to eutrophic patients (1.11 ± 0.6). Nrf2 eas not correlated with nutritional

status. In conclusion, the activation of NF-κB seems contribute to muscle loss and

malnutrition in HD patients, however the mechanisms that lead to this mechanism

remain unknown.

Key Words: chronic kidney disease, inflammation, oxidative stress, nutritional status.

ix

Lista de Tabelas

Tabela 1. Características antropométricas dos pacientes estudados 53

Tabela 2. Parâmetros Bioquímicos dos pacientes estudados 54

Tabela 3. Atividades das enzimas antioxidantes, marcadores inflamatórios e

expressão dos fatores de transcrição

55

x

Lista de Quadros

Quadro 1. Classificação dos estágios da DRC 19

Quadro 2. Enzimas reguladas pelo Nrf 2 33

Quadro 3. Estado nutricional de adultos segundo o índice de massa corporal (IMC) 45

Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal 46

Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal 47

xi

Lista de Figuras

Figura 1. Causas da Inflamação na DRC avançada 23

Figura 2. Ativação de NF-kB e translocação para o núcleo 24

Figura 3. Regiões do Nrf2 29

Figura 4. Sistema de ubiquitinação do Nrf2 e degradação a proteossoma 31

Figura 5. Nrf2, Estresse Oxidativo 33

Figura 6. Etiolgia da Sarcopenia uremica 38

Figura 7. Modelo Conceitual para etiologiae consequências da Protein Energy

Wasting na doença renal Crõnica

39

Figura 8.

Figura 9 .

Associação entre a expressão de NF-kB e valores de ìndice de creatinina

nos pacientes em hemodiálise

Comparação da Expressão do NF-κB entre pacientes desnutridos e

eutróficos segundo ASG.

56

57

xii

SUMÁRIO

1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ..................................................... 16

2.0 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 18

2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA ................................................................... 18

2.2 EPIDEMIOLOGIA ..................................................................................... 19

2.3 ESTRESSE OXIDATIVO.......................................................................... 20

2.4 NF-kb E DOENÇA RENAL CRÔNICA.................................................... 23

2.5 SISTEMA KEAP-1 E NRF2....................................................................... 28

2.6 DOENÇA RENAL CRÔNICA E NRF2.................................................... 35

2.7 ESTADO NUTRICIONAL E DRC............................................................. 36

3.0 OBJETIVOS .............................................................................................. 42

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 42

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 42

4.0 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 43

4.1 CASUÍSTICA ............................................................................................. 43

4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ........................................... 43

4.3 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................. 44

4.4 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL......................................... 44

4.5 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ...................................................................... 48

4.5.1 Coleta de Sangue .............................................................................. 48

4.5.2 Análise de parâmetros bioquímicos de rotina............................... 48

4.5.3 Marcadores de estresse oxidativo e inflamação............................ 49

4.5.4 Isolamento de células monocleares.................................................. 50

4.5.5 Análise de PCR Real Time............................................................... 51

5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................... 51

6.0

6,1

6,2

RESULTADOS...........................................................................................

CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES..................................................

FATORES TRANSCRICIONAIS,MARCADORES DE INFLAMAÇÃO

E ESTRESSE OXIDATIVO ................................................

52

52

54

7.0 DISCUSSÃO .............................................................................................. 58

8.0 CONCLUSÕES ......................................................................................... 64

9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 65

10.0 ANEXOS .................................................................................................... 76

xiii

10.1 ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA 76

10.2 ANEXO 2: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO 77

10.3 ANEXO 3: AVALIAÇÃO SUBJETIVA GLOBAL – 7 PONTOS............. 78

10.4 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO................................................. 79

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ASG Avvaliação Subjetiva Global

bZIP basic region leucine zipper

CB Circunferência do braço

CC Circunferência da cintura

CMB Circunferência muscular do braço

DCB Dobra cutânea biciptal

DCSE Dobra cutânea subescapular

ERA Elementos de resposta antioxidante

ERNs Espécies reativas de nitrogênio

EROs Espécies reativas de oxigênio

ELISA Reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas

FAV Fístula arteriovenosa

GC Gordura corporal

GCL Glutamato cisteína ligase

GSH-Px Glutationa peroxidase

GST Glutationa-S-transferase

HAS Hipertensão arterial sistêmica

HO-1 Heme oxigenase-1

ICAM-1 Moléculas de adesão intracelular 1

IC – Índice de creatinina

IL Interleucina IkB- proteina IkB

Ikk – proteina Ik Kinase

IMC Índice de massa corporal

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

KDIGO Kidney Disease Improving Global Outcomes

KDOQI Kidney Disease Outcome Quality Initiative

Kt/Vsp Dose de diálise single pool

Mafs Fibrosarcoma musculoaponeurótico

MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos-1

MDA Malondialdeído

MIA Malnutrition-inflammation-atherosclerosis

xv

MMP-9 Metaloproteinase de matriz 9

mRNA RNA mensageiro

NFkB fator nuclear kB

NKF National Kidney Foundation

NQO1 NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1

Nrf2 Fator nuclear eritróide 2-

Nrf2 Keap1 –Fator nuclear eritroide relacionado ao fator 2-Kelch-like ECH proteína 1

OMS Organização Mundial de Saúde

PBMC Células mononucleares do sangue periférico

PCR Reação em cadeia de polimerase

PRX I Peroxirredoxinas I

PTH Paratormônio

SatFe Saturação de transferrina

SOD Superóxido dismutase

SRATB Substância reativas ao ácido tiobarbitúrico

TAC Taxa albumina-creatinina

TBA Ácido tiobarbitúrico

TEA Taxa de excreção de albumina

TFG Taxa de filtração glomerular

TNF-α Fator de necrose tumoral – alfa

VCAM-1 Moléculas de adesão das células vasculares 1

1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A Doença Renal Crônica (DRC) possui prevalência crescente na população,

sendo considerada um problema de saúde pública, pois estima-se que 10% brasileiros

apresentem a doença. A DRC é baseada na diminuição progressiva da função renal e,

pode ser classificada em cinco estágios de acordo com a taxa de filtração glomerular

(TFG). Geralmente, somente no estágio 5 a terapia renal substitutiva deve ser instituída,

configurando-se como opções de tratamento a hemodiálise (HD), a diálise peritoneal ou

o transplante renal (Sesso et al. 2010).

A sobrevida dos pacientes em HD aumentou nos últimos anos devido ao avanço

tecnológico do procedimento de diálise. Apesar da HD prolongar a sobrevida dos

pacientes com DRC, ela não altera o desenvolvimento natural da doença renal

subjacente, nem supre por completo a função renal, além de estar relacionada a diversas

alterações sistêmicas, metabólicas e hormonais, como a desnutrição, inflamação crônica

e o estresse oxidativo (Fouque et al., 2008; Zanetti et al., 2011; Wang & Bennett, 2012).

O estresse oxidativo e a inflamação constituem importantes fatores etiológicos

na aterogênese e são características comuns de pacientes com DRC em diferentes

estágios da doença (Freigang et al., 2011; Lobo et al., 2011). Fatores de transcrição

nucleares como o fator nuclear-kappa B (NF-κB) e o fator nuclear eritróide 2-

relacionado ao fator 2-Kelch-like ECH proteína 1 (Nrf2-Keap1) estão envolvidos nesses

processos (Kim et al., 2010).

17

O fator de transcrição NF-κB desempenha papel importante na regulação

coordenada de genes inflamatórios em pacientes com DRC, apresentando papel

patogênico na mediação da inflamação crônica nesses pacientes (Rangan et al., 2009;

Kim et al., 2010). Em contraste com o NF-κB, o sistema Keap1-Nrf2 tem surgido como

importante mecanismo de defesa endógena, sendo fundamental para a resposta anti-

inflamatória e no combate ao estresse oxidativo e, portanto, pode contribuir para a

melhoria de muitas doenças, incluindo a DRC (Pedruzzi et al., 2012; Ruiz et al., 2013).

O aumento do estresse oxidativo e do processo inflamatório tem sido

considerados importantes fatores de risco para desnutrição e complicações

cardiovasculares já bem estabelecidos na literatura. Assim, a DRC apresenta como

maiores causas de complicações, as alterações do estado nutricional, com prevalência da

desnutrição em torno de 20 a 70%. Nesse sentido, a modulação destes fatores constitui

importante alvo a ser alcançado e para isso, a análise da expressão de fatores

transcricionais como NF-κB e o Nrf2 deve ser avaliada .

18

2.0 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA (DRC)

A perda progressiva e irreversível das funções renais caracteriza a DRC.

Segundo a National Kidney Foundation (NKF-KDIGO, 2013), em seu documento

Kidney Disease Improving Global Outcomes (K/DIGO) a DRC é definida como

anormalidades da estrutura ou função renal, presentes por > 3 meses, com implicações

para a saúde. A classificação da DRC é baseada em sua causa, na TFG e na

albuminúria. De acordo com a TFG, a progressão da DRC é dividida em 5 categorias

(Quadro 1). As categorias de G1 a G4 correspondem ao tratamento conservador e na

categoria G5, o paciente é direcionado à diálise (NKF-KDIGO, 2013).

Na HD, o sangue obtido do acesso vascular é impulsionado por uma bomba para

um sistema de circulação extracorpórea onde se encontra um filtro (dialisador). No

dialisador ocorrem as trocas entre o sangue e a solução de diálise (dialisato), através de

uma membrana semipermeável. Neste processo, a remoção de solutos do plasma é

realizada por difusão, baseada no gradiente de concentração do soluto entre o sangue e o

dialisato, embora também ocorra a difusão de substâncias do dialisato para o

compartimento sanguíneo (p.ex., bicarbonato). A HD tradicional normalmente é

realizada 3 vezes por semana, por 4 horas, com fluxo de sangue de 250-300 mL/min e

fluxo de dialisado de 500 mL/min (Gonçalves et al., 2013).

19

Quadro 1. Classificação dos Estágios da DRC

TFG: taxa de filtração glomerular.

Fonte: NKF-KDOQI, 2012

2.2 EPIDEMIOLOGIA

A DRC está associada a taxas elevadas de morbimortalidade, redução da

qualidade de vida e elevação de custo para o sistema de saúde (Ronksley et al., 2012) e

recebe cada vez mais atenção da comunidade científica internacional, já que sua elevada

prevalência vem sendo demonstrada em estudos recentes. Particularmente significante

foi a análise transversal do National Health and Nutrition Examination Survey

(NHANES), conduzida entre 1999 e 2004, que envolveu uma amostra representativa da

população de adultos não institucionalizados dos EUA, com 20 anos de idade ou mais

(n = 13.233), que baseado na presença de albuminúria persistente (> 30 mg/g) e

diminuição na TFG estimada usando a equação abreviada do estudo Modification of

Diet in Renal Disease (MDRD), revelou que aproximadamente 13% da população

adulta dos EUA tem DRC nos estágios 1 a 4 (NHANES, 2004).

No Brasil, de acordo com o censo de diálise de 2013, o número estimado de

pacientes em tratamento dialítico era 100.397 (SBN, 2013). Enquanto o número de

20

brasileiros nos diferentes estágios pré-diálise da DRC não é conhecido com exatidão, a

análise dos dados laboratoriais de adultos utilizando a nova definição de DRC revelou

que 2,3% dos indivíduos avaliados tinham TFG<45mL/min/1,73m2 ou DRC nos

estágios 3B, 4 e 5. Extrapolando-se esses resultados para a população adulta brasileira,

sugere-se que cerca de 2,9 milhões de brasileiros teriam um terço ou menos da TFG dos

indivíduos saudáveis (Fernandes et al., 2010).

Mesmo diante dos avanços tecnológicos observados ao longo das últimas

décadas, a HD ainda está associada a diversas complicações agudas e crônicas, bem

como a altas taxas de hospitalização e mortalidade (Salomão et al., 2002; Riella et al.,

2008). A diálise é capaz de prolongar a sobrevida dos pacientes com DRC, porém não

altera o desenvolvimento natural da doença renal subjacente e não substitui

completamente todas as funções renais (Smeltzer & Bare, 2005). Além disso, devido ao

contato do sangue com a superfície do dialisador, o que resulta no acúmulo de

proteínas modificadas e produtos da peroxidação lipídica, a HD está relacionada a

diversas alterações sistêmicas, metabólicas e hormonais, dentre as quais estão a

inflamação crônica e o estresse oxidativo (Fouque et al., 2008; Lee et al., 2011; Zanetti

et al., 2011).O estresse oxidativo na DRC prevalece devido a presença de vários

fatores, dentre eles, as comorbidades, a bioincompatiblidade das membranas, as

dislipidemias , enquanto que o sistema antioxidante se encontra deficiente.

2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E INFLAMAÇÃO

Espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) são

constantemente produzidas em organismos aeróbios como subprodutos do metabolismo

de oxigênio normal e incluem radicais livres como o ânion superóxido (O2-), radical

hidroxila (OH), oxigênio singlete e radical peróxido de hidrogênio (H2O2) (Jung e

21

Kwak, 2010). Em pequenas concentrações, as EROs servem como sinalizador celular,

contribuindo para importantes funções celulares, como a proliferação, diferenciação e

sobrevivência celular. No entanto, concentrações elevadas podem levar à morte celular

por danificar macromoléculas celulares como DNA, proteínas e lipídios. Como

mecanismo de proteção, as células desenvolveram um sistema de defesa antioxidante,

porém, a produção excessiva de EROs pode levar ao desequilíbrio redox celular. Este

desequilíbrio entre EROs e capacidade antioxidante celular, como resultado do aumento

da geração de EROs e/ou disfunção do sistema antioxidante leva à condição de estresse

oxidativo (Steinbrenner e Sies, 2009; Junge Kwak, 2010; Mari et al., 2010; Singh et al.,

2010).

O estresse oxidativo é observado em diferentes doenças tais como Diabetes

mellitus, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e insuficiência cardíaca congestiva, as

quais podem contribuir para o aparecimento ou agravamento da DRC (Appendino et al.,

2011). Todavia, a própria DRC é também fonte importante de estresse oxidativo,

condicionando aumento significativo do risco de ocorrência de doença cardiovascular

nos pacientes com doença renal crônica (Himmelfarb et al., 2003; Teixeira, 2010). O

estado urêmico em que se encontram os pacientes nas categorias mais avançados de

DRC leva à superprodução de EROs, tal como o ânion superóxido e os aldeídos

reativos; ao aumento da quantidade de proteínas com grupos tiol oxidados; aumento dos

produtos resultantes da peroxidação lipídica e consequente aparecimento de anticorpos

anti-LDL oxidada (oxLDL); proteína C reativa e citocinas .Além disso, a HD também é

fator que induz ao estresse oxidativo, pois remove vitaminas hidrossolúveis,

prejudicando assim a defesa antioxidante; diminui ainda mais a quantidade de proteínas

plasmáticas com grupos tiol reduzidos e de glutationa peroxidase, e aumenta a formação

22

de EROs por expor os leucócitos às membranas de HD (Himmelfarb et al., 2003;

Teixeira, 2010).

No rim comprometido, o aumento da produção de EROs é impulsionado

principalmente pela ativação de enzimas produtoras de EROs, incluindo isoformas de

NAD(P)H-oxidase (NOX), ciclooxigenase-2, lipoxigenase, desacopladora óxido nítrico

sintase (NOS), disfunção mitocondrial e estresse do retículo endoplasmático (Ruiz et

al., 2013).

Apesar das EROs serem a forma biológica, sua baixa concentração e vida muita

curta, os torna inviável como marcador de estresse oxidativo. Desta forma, outras

moléculas podem ser usadas para esse fim, por serem produtos finais da oxidação, uma

vez que correspondem ao resultado da ação do estresse oxidativo sobre biomoléculas

importantes, como proteínas, lípidios, carboidrato e DNA (Teixeira, 2010; Fassett et al.,

2011). Dentre esses biomarcadores, podemos citar: malondialdeído (MDA), 8- hidroxi-

2'-deoxiguanosina, isoprostanos-F2, LDL oxidadas, proteínas carboniladas, produtos

finais de glicação avançada; entre outros, os quais se encontram aumentados no paciente

com DRC (Oberg et al., 2004; Dincer et al., 2008; Fassett et al., 2011, Lee et al., 2011).

Além disso, atividades das enzimas antioxidantes tais como superóxido dismutase,

glutationa peroxidase e catalase também podem ser destinadas para se avaliar o estresse

oxidativo (Fassett et al., 2011).

Além do estresse oxidativo, outra condição encontrada na DRC e que, por sua

vez, também está relacionada à diminuição da função renal é a inflamação (Shankar et

al., 2011), que também está implicada em diferentes doenças, e apresenta estreita

relação com o estresse oxidativo, de tal forma que este pode provocar inflamação e

vice-versa. O estresse oxidativo contribui diretamente para o desenvolvimento de

23

inflamação de fase aguda e, pacientes com níveis mais altos de inflamação têm níveis

mais elevados de biomarcadores de estresse oxidativo (Himmelfarb, 2004). O estresse

oxidativo provoca inflamação por vários mecanismos, incluindo ativação do fator de

transcrição kappa B (NF-B), o que leva ao recrutamento e ativação de células imunes.

A inflamação, por sua vez, provoca o estresse oxidativo através da produção de espécies

reativas de oxigênio, nitrogênio e halógenos por ativar leucócitos e células residentes.

(Figura 1). Juntos, esses eventos promovem o dano tecidual por causar apoptose,

necrose e fibrose (Aminzadeh et al., 2013).

Figura 1. Causas de Inflamação na DRC avançada (Adaptado de

Ikizler, 2008).

2.4 NF-kB E DOENÇA RENAL CRÔNICA

NF-кB é um complexo proteico composto por homo ou heterodímeros de um

grupo de cinco genes a saber: p65 (RelA), RelB, c-Rel, NF-кB1 (p50 e seu precursor

p105) e NF-кB2 (p52 e seu precursor p100). Proteínas NF-кB exibem homologia

estrutural com a oncopoteína retroviral r-Rel com aproximadamente 300 aminoácidos

chamados Rel homologia domínio (RHD) (Gloire e Piette, 2009). NF-кB é um fator de

24

transcrição redox sensível vital que é ativado por ampla gama de estímulos. Após a

ativação, NF-кB regula a transcrição de inúmeros genes, muitos dos quais estão

associados com inflamação (Antunes e Han, 2009). Quando o fator NF-кB é ativado

pelo estresse oxidativo, várias citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose

tumoral-alfa (TNF-α) e interleucinas (IL)-1β, IL-2, IL-6 e IL-12 são produzidas em

excesso (Himmelfarb, 2004; Kim, et al., 2010).

Na ausência de estímulos, o NF-κB se encontra no citoplasma acoplado à

proteína inibidora IκB. Já na presença de estímulos, tais como estresse oxidativo com

superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROs), citocinas pró-inflamatórias

(TNF-α), mitógenos, e fatores de crescimento de RNA de cadeia dupla, a proteína IκB é

rapidamente fosforilada pela IκB kinase (IKK), o que resulta no desacoplamento do NF-

κB com subsequente translocação dele para o núcleo da célula, onde irá promover suas

ações nos genes alvo, atuando na inflamação, apoptose, proliferação e diferenciação

celular (Figura 1) (Pedruzzi et al., 2012).

Figura 2. Ativação do NF-kB e consequente translocação para o núcleo com produção

de marcadores inflamatórios. Fonte: Adaptado de Pedruzzi et al, 2012.

Desde a sua descoberta em 1986 (Sen e Baltimore, 1986), o NF-kB tem sido

associado as mais variadas doenças, incluindo câncer, aterosclerose, artrite, diabetes,

25

acidente vascular cerebral, e a própria DRC. O NF-кB pode ser rapidamente induzido

em resposta a diversos estímulos extracelulares, sem a necessidade de nova síntese de

proteína ou mRNA (RNA mensageiro), bem como, por ser fator de transcrição que

regula toda rede pró-inflamatória, além dos genes reguladores da apoptose. Nesse

sentido, a modulação de NF-kB acaba sendo vista como importante oportunidade

terapêutica em doenças aonde a inflamação conduz ao mau prognóstico (Rangan et al.,

2009). Além disso, o NF-kB pode ser encontrado em quase todos os tipos de células,

incluindo as do rim, onde de fato, componentes do sistema NF-kB são altamente

expressos em pacientes com DRC, apresentando papel patogênico na mediação da

inflamação crônica nesta doença (Rangan et al., 2009; Kim e Vaziri, 2010; Trinanes et

al., 2012; Bolati et al., 2013). A gravidade da lesão glomerular e tubulointersticial e a

perda da função renal estão diretamente relacionadas à quantidade de células

inflamatórias presentes no interstício (Noronha et al., 2002). Além disso, experimentos

com animais sustentam a hipótese de que o NF-kB tem papel patogênico nos eventos

celulares que fundamentam a progressão da DRC (Sakural et al., 1996; Donadelli et al.,

2000). O reconhecimento de que EROs podem estimular vias inflamatórias de

sinalização vem com importantes consequências clínicas e terapêuticas. O aumento na

produção de EROs e/ou diminuição na capacidade antioxidante, resulta em estresse

oxidativo para a célula, que pode levar à ativação redox sensível e expressão de genes

inflamatórios resultando num estado pró-inflamatório (Chen e Kunsch, 2004). O

estresse oxidativo, através das EROs desencadeia a ativação do NF-кB, que por sua vez,

induz ao aumento da produção de citocinas pró- inflamatórias e de proteínas

plasmáticas de inflamação aguda, como a proteína C reativa; à quimiotaxia; e à

produção de moléculas de adesão celular, colaborando desta forma para a inflamação

(Oberg et al., 2004; Teixeira, 2010; Ruiz et al., 2013).

26

Pacientes com DRC possuem elevados níveis de marcadores inflamatórios que

se agravam após o início do tratamento dialítico (Barreto et al, 2010). Além disso, a

biocompatibilidade de membranas, a contaminação do dialisato por endotoxinas,

infecção do acesso venoso, acidose metabólica, o próprio estresse oxidativo dentre

outros presentes nos pacientes em HD, contribuem ainda mais para a inflamação (Ikizler

et al,2008 e Cheung et al, 2010) (Figura 2)

A DRC avançada está associada à inflamação crônica, como evidenciado pelos

elevados níveis de diversas citocinas pró-inflamatórias como: IL-6, TNF-α e níveis

alterados de Proteína C reativa (Oberg et al., 2004; Shankar et al., 2011; Barros et al.,

2013; Lobo et al., 2013).

A IL-6, é uma proteína de 26 kDa importante na regulação de repostas

inflamatórias e é expressa em diversos tipos de células, includindo

macrófagos/monócitos, adipócitos, células T, células da musculatura lisa, células

endoteliais e fibroblastos. Durante infecção, injúria ou processo imunológico, todos os

tecidos e tipos celulares do corpo expressam IL-6. Esta citocina é considerada crucial na

ativação e proliferação de linfócitos, diferenciação de células B, no recrutamento de

leucócitos, na hematopoiese e na regulação da síntese de proteínas de fase aguda, como

por exemplo a síntese de proteína C reativa (PCR) (Fouque, 2008; Carrero, 2008).

O aumento dos níveis de IL-6 já está bem documentada em pacientes com DRC,

e parece agir diretamente como promotora da aterosclerose por participar ativamente

nos processos de calcificação vascular e disfunção endotelial (Honda et al., 2006;

Dummer et al., 2007; Elewa et al., 2012). Além disso, a IL-6 induz o catabolismo

protéico, a lipólise, o aumento do gasto energético, a resistência a insulina e a supressão

do apetite. Ao mesmo tempo, a IL-6 parece contribuir para a diminuição dos hormônios

27

da tireóide, da adiponectina, e da testosterona, o que também contribui para a PEW

(síndrome chamada ”protein-energy wasting” – PEW, utilizado para definir a redução

tanto da massa magra quando da gordura corporal em pacientes renais) e para a doença

vascular (Fouque, 2008, Carrero, 2007). Na DRC, dentre os biomarcadores de

inflamação, a IL-6 parece estar mais associada a mortalidade, sendo forte preditora de

mau prognóstico (Cheung et al., 2010). Assim como a IL-6, o TNF-α também é uma

citocina pleiotrópica produzida por vários tipos celulares, como: macrófagos,

mastócitos, células linfóides, células endotheliais, células do miocárdio, tecido adiposo,

fibroblastos e tecido neural).

Diante da importância do NF-кB como promotor da resposta inflamatória, via

síntese de citocinas inflamatórias, bem como do extresse oxidativo exacerbado, e essas

complicações terem íntima relação com aumentado risco cardiovascular já bem

estabelecido em pacientes em diálise, novos tratamentos anti-inflamatórios, capazes de

inibir/modular NF-кB, como os antioxidantes, são necessários, de modo a minimizar os

efeitos negativos que a inflamação e o estresse oxidativo podem ocasionar nos pacientes

com DRC. Recentes pesquisas voltadas para esse assunto estão sendo desenvolvidas,

como por exemplo, estudos com o fator nuclear eritróide 2 (Nrf2).

28

2.5 SISTEMA KEAP1-NRF2

Em meados dos anos 90, pesquisadores identificaram a existência de duas

proteínas, o Nrf2 e Keap1, envolvidas na indução da síntese de enzimas antioxidantes,

tais como NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e glutationa-Stransferases

(GSTs) (Talalay et al., 1988; Itoh et al., 1999).

Nrf2, uma proteína contendo 605 aminoácidos, é expressa em ampla gama de

tipos de tecidos e células. Pertence a um subconjunto da família bZIP (basic region

leucine zipper) e é membro da família Cap 'n' Collar de proteínas reguladoras que

também incluem a NF-E2, Nrf1, Nrf3, Bach1 e Bach2 (Motohashi et al., 2002; Kaspar

et al., 2009). A estrutura molecular apresenta seis domínios funcionais chamados

Neh1eNeh6 (homologia Nrf2-ECH). O primeiro domínio conservado, Neh1, é a região

de interação com pequenas Mafs (fibrosarcoma musculoaponeurótico) e ligação ao

DNA como heterodímero (Itoh et al., 1999; Baird e Dinkova-kostova, 2011). Neh2

consiste na região amino terminal da proteína e, assim como o domínio Neh6 é

identificado como regulador negativo de Nrf2 (Itoh et al., 1999; McMahon et al., 2004).

Neh3, por sua vez, consiste da região carboxilo terminal da proteína e está envolvida na

ativação da transcrição de genes Elementos de Resposta Antioxidante (ERA)-

dependente (Itoh et al., 1999; Nioi et al., 2005). Os domínios Neh4 e Neh5 atuam

cooperativamente para ligar outro coativador de transcrição, o CBP [CREB (cAMP

response element-binding protein) (Katoh et al., 2001) (Figura 3).

29

Figura 3. Regiões do Nrf2. Fonte: Adaptado de Boutten et al, 2011.

Em condições basais, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por sua proteína

repressora Keap1, essencial para a rotatividade de Nrf2, funcionando como proteína

adaptadora entre Nrf2 e a região N-terminal de Cullin 3 (Cul3). Isto promove a

degradação proteosomal constante de Nrf2 (Baird e Dinkova-kostova, 2011). Assim, em

situações normais, Nrf2 está inativo devido à sua retenção citoplasmática por Keap1 e

degradação rápida através do sistema de proteassoma – proteínas destinadas à

eliminação, são inicialmente ligadas aos polímeros de ubiquitina e depois são

reconhecidas e degradadas pelo proteassoma 26S (Ravid e Hochstrasser, 2008).

O Nrf2 tem como função permitir a adaptação e a sobrevivência das células

sobre condições de estresse, regulando a expressão de genes de diversas redes de

proteínas com ação citoprotetoras, incluindo as enzimas de detoxicação, anti-

inflamatórias e as de ação antioxidantes, assim como as proteínas com ação reparadora

e de remoção de macromoléculas que possuem ação de deterioração celular. A sua

atividade no equilíbrio do sistema antioxidante celular se deve a sua regulação na

biossíntese da enzima glutationa transferase e na regeneração da NAD(P)H, controlando

também a produção de espécies reativas de oxigênio pela mitocôndria. Portanto, em

condições normais e de equilíbrio, Nrf2 afeta o potencial da membrana mitocondrial, a

oxidação de ácidos graxos e a disponibilidade de substratos para respiração e síntese de

ATP. Assim o Nrf2 possui importante papel em manter a integridade estrutural e

30

funcional da mitocôndria quando o organismo se encontra em condições de estresse

(Kostova e Abramov, 2015).

A proteína Keap1 é composta por 624 aminoácidos e tem três domínios

principais: 1) domínio de dimerização BTB (Broad-Complex, Tramtrack, e Bric à

Brac), 2) uma região intermédia (IVR) rica em cisteínas e 3) uma região com 6

repetições do domínio Kelch, local de ligação entre Keap1 e Nrf2. Keap1 contém vários

resíduos de cisteína reativos que servem como sensores do estado redox intracelular,

dentre os quais, C273 e C288, que, ligados à IVR, são importantes para a repressão de

Nrf2 por Keap1 em condições basais e, sua modificação por indutores pode reduzir a

taxa de ubiquitinação e degradação de Nrf2. O resíduo de cisteína C151, por sua vez,

localizado no domínio BTB é importante para a ligação de Keap1 para Cul3,

trabalhando como sensor de tensão. Cullin 3 (Cul3), uma subunidade do complexo

ligase E3, interage especificamente com Keap1. Keap1 associada com a região

Nterminal de Cul3 promove a ubiquitinação de Nrf2 em cooperação com o complexo

Cul3-Roc1, o qual apresenta o substrato proteico ao proteassoma. Keap1 assim funciona

como proteína adaptadora entre Nrf2 e Cul3 e essa associação promove a degradação

contínua de Nrf2 pelo proteassoma em condições normais (Figura 4)

31

Figura 4. Nrf2 – Sistema de ubiquitinação contínua e degradação a proteossoma.

Fonte: Kostova e Abramov, 2015.

A modificação oxidativa ou covalente de tióis em alguns dos resíduos de cisteína

resulta na dissociação de Nrf2 de Keap1 e translocação para o núcleo (Kim e Vaziri,

2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011). A translocação nuclear de Nrf2 também pode

ocorrer através de fosforilação de alguns de seus resíduos de serina ou treonina por

quinases, tais como a proteína quinase C, fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), e caseína

quinase-2 (Surh, 2008; Kim et al.2010). No núcleo, após heterodimerização com outros

fatores de transcrição as pequenas Maf (fibrosarcoma musculoaponeurótico), o Nrf2 se

liga às sequências regulatórias, denominadas elementos de resposta antioxidante ou

elementos de resposta eletrofílico (ERA ou ERE), localizado na região promotora dos

genes que codificam enzimas desintoxicantes de fase II ou enzimas antioxidantes (Surh,

2008; Kim et al., 2010).

Existem várias substâncias envolvidas na ativação de Nrf2, entre as quais

podemos citar, as EROs e insultos eletrofílicos (Kobayashi e Yamamoto, 2006), óxido

nítrico (Buckley et al., 2003), lipoproteína de baixa densidade oxidada (LDLox) (Ishii et

32

al., 2004), as prostaglandinas (Itoh et al., 2004), entre outros (Kobayashi e Yamamoto,

2005), que atuam provavelmente, inibindo a ubiquitinação de Nrf2.

Embora o principal consenso seja de que o mecanismo de inibição da

ubiquitinação/degradação de Nrf2 mediada por Keap1 ocorra exclusivamente no

citoplasma (Dinkova-kostova et al., 2005; Watai et al., 2007; Kaspar et al., 2009),

estudo recente realizado por Li et al. (2012) demonstrou que essa inibição pode ocorrer

no núcleo, ou seja, ativadores também exercem a sua função a nível nuclear.

Independente do local de ativação, atualmente, o sistema Keap1- Nrf2 tem sido

reconhecido como um dos principais mecanismos de defesa celular contra o estresse

oxidativo e inflamação (Copple et al., 2008; Kim et al., 2010). A proteína repressora

Keap1, essencial para a rotatividade de Nrf2, funciona como proteína adaptadora entre

Nrf2 e a região N-terminal de Cullin 3 (Cul3). Isto promove a degradação proteosomal

constante de Nrf2 (Baird e Dinkova-kostova, 2011). Assim, em situações normais, Nrf2

está inativo devido à sua retenção citoplasmática por Keap1 e degradação rápida através

do sistema de proteassoma – proteínas destinadas à eliminação, são inicialmente ligadas

aos polímeros de ubiquitina e depois são reconhecidas e degradadas pelo proteassoma

26S (Ravid e Hochstrasser, 2008).

A modificação oxidativa ou covalente de tióis em alguns dos resíduos de

cisteína, porém, resulta na dissociação de Nrf2 de Keap1 e sua translocação para o

núcleo celular (Kim e Vaziri, 2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011).

A translocação nuclear de Nrf2 também pode ocorrer através de fosforilação de

alguns de seus resíduos de serina ou treonina por quinases, tais como a proteína quinase

C, fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), e caseína quinase-2 (Surh, 2008; Kim et al., 2010).

No núcleo, após heterodimerização com outros fatores de transcrição, as pequenas Maf

33

(fibrosarcoma musculoaponeurótico), e o Nrf2 se ligam às sequências regulatórias,

denominadas elementos de resposta antioxidante ou elementos de resposta eletrofílico

(ERA ou ERE), localizados na região promotora dos genes que codificam enzimas

desintoxicantes de fase II ou enzimas antioxidantes (Surh, 2008; Kim et al., 2010)

(Figura 5).

Figura 5. Ativação do Nrf2 pelo estresse oxidativo e inibição do NF-kB (Pedruzzi et al. 2014)

A ativação do Nrf2 leva à regulação de uma série de genes antioxidantes e

desintoxicantes (Quadro 2), que pode ser significativo no tratamento de doenças, como

câncer, diabetes, complicações neuro-degenerativas, cardiovasculares e pulmonares,

onde o estresse oxidativo causa desordem no sistema Nrf2 (Zakkar et al., 2009; Cook et

al., 2011; Jiang et al., 2010; Singh et al., 2010)

Quadro 2. Enzimas reguladas pelo Nrf2/ERA

Enzimas Função

NADPH quinona

oxidoredutase (NQO1)

Enzima chave pertencente à família de flavoproteínas homodiméricas,

facilita a excreção quinona catalisando a redução de quinonas para

hidroquinonas através de reação de redução de etapa única de dois

elétrons (Gang et al., 2013).

34

Glutationa S-transferase

(GST)

Compreendem uma família de enzimas multifuncionais que atuam em

rotas de excreção de substâncias, sendo xenobióticas, protegendo as

células contra toxicidade química e estresse, em diferentes tecidos. A

função das enzimas GST tem sido tradicionalmente considerada a

desintoxicação de eletrófilos por conjugação de glutationa (Torres et

al., 2004; Huber et al., 2008; Lu, 2013).

Heme oxigenase-1

(HO-1)

Catalisa a degradação do grupo heme produzindo bileverdina,

monóxido de carbono (CO) e ferro. A expressão dessa enzima é

desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse

(Santos, 2007; Dezoti et al., 2009).

Glutationa peroxidase

(GSH-Px)

Catalisa a redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) e peróxidos

orgânicos para seus correspondentes álcoois às custas da conversão da

glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada (GSSG) (Huber et al.,

2008; Margis et al., 2008; Lu, 2013).

Glutamato cisteína ligase

(GCL)

Catalisa a síntese de glutationa pela formação de γ-glutamil cisteína a

partir de glutamato e cisteína, na presença de ATP. Glicina é então

adicionado a este dipeptídeo pela enzima glutationa sintetase para

rendimento de glutationa (Lu, 2013).

Catalase (CAT) É uma hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a

H2O e O2 (Leite e Sarni, 2003; Barreiros et al. 2006).

Superóxido dismutase

(SOD)

Catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e O2 na

presença do próton H+. Existem 3 formas de SOD: Fe-SOD, CuZn-

SOD e Mn-SOD (Leite e Sarni, 2003).

UDP-

glucuronosiltransferase

Catalisa a conjugação de substâncias exógenos e endógenos com o

ácido glicurônico. Representa importante via que facilita a eliminação

de xenobióticos e endobióticos aos compostos mais solúveis em água

(King et al., 2000).

Tiorredoxina Está envolvida na defesa antioxidante, redução de ribonucleotídeos e

a redução de peroxidases e fatores de transcrição (Nordberg e Arner,

2001).

35

Peroxirredoxinas I

(PRX I)

Também denominada tiorredoxinas peroxidases, são enzimas capazes

de catalisar a remoção de H2O2 e peróxidos orgânicos às custas de

doadores de elétrons tiólicos (Maia, 2003).

2.6 DOENÇA RENAL CRÔNICA E NRF2

Investigar a eficácia de ativadores e/ou moduladores do estresse oxidativo e

inflamação em pacientes com DRC é de fundamental importância, pois há ainda poucas

pesquisas sobre o papel do Nfr2 nos pacientes com DRC (Pedruzzi et al. 2015).

Em modelos animais com DRC, parece que há disfunção desse mecanismo, com

redução da ativação de Nrf2 e consequentemente das enzimas que regula e aumento de

NF-κB e de seus efeitos inflamatórios (Jiang et al., 2010; Kim e Vaziri, 2010). Assim,

parece que a ativação diminuída do sistema Keap1-Nrf2 pode agravar o estresse

oxidativo e a inflamação na DRC.

Jiang et al. (2010) identificaram papel protetor de Nrf2 ao dano renal em ratos

induzidos à nefropatia diabética. No estudo de Kim e Vaziri (2010) ratos com DRC

apresentaram redução na ativação de Nrf2 e enzimas antioxidantes e, em contrapartida,

maior ativação de NF-κB e enzimas associadas à inflamação. Aminzadeh et al. (2013)

também verificaram que ratos induzidos à nefropatia túbulo-intersticial apresentaram

ativação diminuída de Nrf2/enzimas reguladas e aumentada de NFκB/enzimas

reguladas. Em estudo conduzido por Bolati et al. (2013), indoxil sulfato, uma toxina

urêmica que acelera a progressão da DRC, reduziu a expressão de Nrf2 por meio da

ativação de NF-κB in vitro e in vivo.

Em pacientes em HD, Pedruzzi et al. (2015) avaliando a expressão de Nrf2 e

NF-κB, observaram que o aumento da expressão de NF-κB acontecia ao mesmo tempo

36

em que as expressões de Nrf2 e NQO-1 diminuíam. Esses resultados estão de acordo

com achados prévios em animais.

Atualmente pesquisas que reconheçam as alterações no sistema de defesa

antioxidante e mecanismos que possam restabelecer sua recuperação tem sido de

extrema relevância, devido a este ser um fator de proteção aos danos renais causados.

Existem evidências experimentais consideráveis que o Nrf2 possui papel de proteção a

esses danos, portanto intervenções que ativam esse fator poderão ser benéficas a fim de

evitar ou minimizar as complicações durante a DRC (Choi, et al 2014).

Dentre as complicações envolvidas com inflamação nesses pacientes está a

desnutrição, e vale ressaltar que pacientes com DRC desnutridos apresentam elevadas

taxas de mortalidade. Assim, estudos sobre estresse oxidativo, inflamação e suas

consequências como piora do estado nutricional são fundamentais para os pacientes

com DRC.

2.7 ESTADO NUTRICIONAL E DRC

A prevalência da desnutrição energética proteica ou mais recentemente

denominada de Protein Energy Wasting (Fouque et al. 2008) nesses pacientes é elevada

e como já dito, contribui para o aumento da morbimortalidade.

As causas que contribuem para o PEW variam desde a insuficiente ingestão

alimentar devido à redução do apetite, inflamação crônica, acidose metabólica,

múltiplas desordens endócrinas, aumento do gasto energético de repouso e o próprio

tratamento dialítico. Contribuem também fatores como a redução da atividade física,

fraqueza e envelhecimento (Carrero et al., 2013). Adicionalmente, as toxinas urêmicas e

infecções recorrentes colaboram para o quadro inflamatório crônico do paciente com

DRC o qual aceleram a progressão do PEW (Kalantar et al., 2005).

37

Dentre os fatores relacionados à diminuição da ingestão alimentar, citamos:

redução da acuidade do paladar, inflamação crônica, restrições alimentares, regime

múltiplo de medicamentos, uremia e aspectos sócio-econômicos. Dentre os aspectos que

elevam o catabolismo proteico podemos citar: acidose metabólica, resistência à insulina,

inflamação crônica, hiperparatireoidismo secundário e a presença de comorbidades

(Diabetes Melitus, AIDS e outras) (Kovesdy, 2009; Chen, 2013).

O PEW acarreta em redução progressiva de peso corporal podendo ser

identificado com diversos sinais clínicos como baixos valores de IMC (<23kg/m2),

redução de massa livre de gordura, baixa ingestão de proteína e energia, baixos níveis

de albumina e pré-albumina sérica e altas concentrações de citocinas inflamatórias

(Fouque et al., 2008). Todos os agravos dos sinais clínicos do PEW contribuem para

desfavorável prognóstico e qualidade de vida de pacientes com DRC, além do aumento

de incidência de eventos cardiovasculares (Carrero et al., 2007; Lopes et al., 2007;

Fouque et al., 2008). Entre os diversos fatores supracitados que promovem o PEW, a

inflamação parece ser importante elemento da protein-energy wasting. De fato, o PEW

e a inflamação estão inter-relacionadas, uma vez que estudos têm demonstrado que

níveis de IL-6 e PCR são inversamente correlacionados com a massa livre de gordura de

pacientes em HD (Wang et al., 2004). Além disto, elevados níveis da citocina pró-

inflamatória interleucina-1 beta (IL-1ᵦ) estão associados com diminuição de massa livre

de gordura destes pacientes (Johansen et al., 2003). O processo inflamatório contribui

para o catabolismo muscular, pois as citocinas inflamatórias atuam influenciando a

sinalização do Fator de Crescimento Insulino-Símile Tipo 1 (IGF-1) e consequente

aumento nos níveis de glicocorticoides o que ocasiona resistência muscular ao IGF-1

(Hu et al., 2009). Em geral, a sarcopenia também se encontra associada a complexos

fatores, com por exemplo, mediadores que estimulam o sistema ubiquitina proteossoma,

38

inflamação, acidose metabólica, alterações hormonais , e o sedentarismo (Souza et al,

2015). Todo esse processo levará a presença de fraqueza muscular e fadiga que é

comumente relatada por esses indivíduos. A perda de massa magra é multifatorial e está

descrita na Figura 6.

Figura 6: Representação esquemática dos mecanismos etiológicos da sarcopenia

urêmica ( Souza, et al 2015).

Somado a isso, o NF-κB, também contribui para o catabolismo muscular na

DRC, pois estimula promotores específicos que aumentam a ubiquitinação de proteínas

contribuindo desta forma para o catabolismo proteico (Lecker et al., 2003).

Assim, o ambiente urêmico e a inflamação (Caballo et al., 2012) somados ao

tratamento dialítico (Papayianni et al., 2002; El-Korai et al., 2013) contribuem para a

redução de reservas de energia com o desfecho do PEW, que por sua vez aumenta a

incidência de depressão, fragilidade muscular e mortalidade cardiovascular nestes

pacientes (Figura 6) (Carrero et al., 2013; Ikizler et al., 2013).

39

Figura 7. Modelo conceitual para a etiologia e consequências da Protein-Energy

Wasting na doença renal crônica. Adaptado de Ikizler et al., 2013. Legenda: PEW, Protein-Energy Wasting; RI, resistência a insulina; DCV, doença cardiovascular; HPT,

hiperparatireoidismo; GH, hormônio do crescimento.

Embora não exista um protocolo considerado ideal na avaliação nutricional de

pacientes renais crônicos, consideramos que seja essencial o constante

acompanhamento de alterações nutricionais nessa população, para que intervenções

sejam instituídas o mais precocemente possível. Vários parâmetros antropométricos e

bioquímicos se encontram alterados nesses indivíduos devido aos fatores mencionados

acima, e sua associação com parâmetros objeticos e subjetivos se tornam necessários

para o rastreamento mais adequado.

Existem vários métodos objetivos de avaliação do estado nutricional desses

pacientes, métodos de referência, como a absorciometria por duplo feixe de raios X

(DXA), a ressonância magnética e a tomografia computadorizada, ou a antropometria,

que é um método simples, no entanto mais barato e de fácil aplicação, como

circunferência da cintura (CC), percentual de gordura corporal por somatórios das

dobras cutâneas e a impedância biolétrica (BIA) (Kovesdy et al. 2012).

40

Outro instrumento não muito utilizado, mas bastante útil é a estimativa da massa

muscular pela cinética da creatinina, um instrumento confiável e validado para avaliar

massa muscular e estado nutricional em pacientes em tratamento de hemodiálise. Este

índice é baseado no princípio que a creatinina é proporcional a massa magra em

pacientes estáveis que possuem ingestão protéica constante (Desmeules, 2004). De

acordo com esses autores, valores menores que 22mg/kg/dia foram associados com

menor sobrevida de pacientes em HD.

Com relação aos métodos subjetivos, um dos parâmetros muito usados nas

unidades de terapia renal substitutiva é a Avaliação Subjetica Global de 7 pontos (ASG)

e a ASG modificada (ASGm) específica para pacientes em diálise. As duas ASGs foram

baseadas na ASG criada por Detsky et al 1987, para diagnosticar pacientes internados

em hospitais, com prognóstico de complicações devido ao seu estado nutricional

comprometido. Vegine et al. 2011, comparou a sensibilidade da ASG 7 pontos com

métodos objetivos, e verificou que ASG 7 isoladamente foi capaz de detectar maior

numero de pacientes desnutridos, sendo assim considerado método prático e eficaz em

diagnosticar algum grau de desnutrição. Considera-se ideal aplicar a ASG

semestralmente para medidas de controle e monitoramento do estado nutricional nesses

indivíduos, e caso tenha sido detectado algum grau de desnutrição, aplicar

trimestralmente para avaliar a efetividade da conduta nutricional de recuperação.

A ASG de 7 pontos apresenta abrangência suficiente para diagnosticar os

desnutridos e também prevenir que a desnutrição se agrave para níveis mais graves

nesses indivíduos (Detsky et al. 1987).

Jones et al. (2004) compararam em 72 pacientes em hemodiálise a ASG de

Detsky com a ASG de 7 pontos, além de um escore formado por parâmetros objetivos e

subjetivos, e verificaram que o método também teve boa associação com circunferência

41

do braço (CB), circunferência muscular do braço (CMB), creatinina e hemoglobina. A

ASG de 7 pontos teve resultados semelhantes, classificando 71% dos pacientes nas

pontuações 6 e 7 (sem risco e risco leve), e nenhum nas pontuações 1 e 2 (desnutrição

grave). O método também teve associação com CB, CMB e creatinina. A ASG de 7

pontos proporciona melhor discriminação dos diferentes graus de desnutrição entre os

pacientes, por ter maior número de classificações possíveis, e por esse motivo parece ser

bom método a ser utilizado nessa população.

Em estudo de Visser et al. (1999) com 22 pacientes em diálise, também foi

avaliada a validade e reprodutibilidade da ASG de 7 pontos, no qual observou-se alta

correlação com relação ao IMC, % de gordura corporal, circunferência do braço, CMB

e albumina sérica, além de demonstrar boa concordância intra observador.

Na ausência de métodos considerados como padrão ouro e a praticidade ,aliada

ao baixo custo na aplicação da ASG 7 pontos, recomenda-se aplica-la sempre em

conjunto com parâmetros objetivos e bioquímicos para uma avaliação nutricional mais

adequada, evitando complicações comuns a esses pacientes. Portanto, o monitoramento

do estado nutricional se torna necessário para prevenção e/ou tratamento da desnutrição.

Sendo assim, considerando a importãncia sobre a relação entre os fatores de

transcrição que modulam a inflamação e o estado nutricional, o presente trabalho se

propôs a avaliar os níveis de expressão de NF-kB e Nrf2 e possíveis associações com o

estado nutricional em pacientes em hemodiálise.

42

3.0 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar possível associação entre a expressão dos fatores de transcrição Nrf2 e

NF-κB e estado nutricional em pacientes renais crônicos em hemodiálise.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar, através de parâmetros antropométricos e bioquímicos, o estado

nutricional dos pacientes em HD;

• Verificar possíveis associações entre a expressão dos fatores de transcrição

(Nrf2 e NF-κB), estado inflamatório e estresse oxidativo nos pacientes em HD.

43

4.0 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CASUÍSTICA

Foi realizado um estudo de coorte, transversal ,com 83 pacientes em tratamento

de HD da clínica RenalCor, localizada no Rio de Janeiro-RJ. Segundo cálculo amostral

com p=0,05 e poder de teste de 0,8, seriam necessários 24 pacientes baseado nos

valores de Nrf2 de um estudo piloto do nosso grupo de pesquisa.

Os pacientes realizavam 3 sessões semanais de HD com duração média de 4

horas, fluxo de sangue superior a 250mL/min e fluxo de dialisato de 500mL/min. Os

pacientes recebiam orientação dietética hipossódica com prescrição de 1,2g a 1,4g de

proteína/kg/dia e de 30 a 35 kcal/kg/dia, como recomendado para pacientes renais em

HD. O acompanhamento dietético era realizado pela nutricionista da clínica e

direcionado de acordo com os exames bioquímicos dos pacientes podendo ser prescrita

dieta hipocalêmica e hipofasfatêmica conforme os resultados bioquímicos.

4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO

Foram incluídos no estudo, homens e mulheres com idade maior de 20 anos,

com mais de 6 meses em tratamento de hemodiálise e portadores de fístula

arteriovenosa como acesso vascular. Pacientes fumantes, portadores de doenças

autoimunes e infecciosas, câncer, Aids, uso de drogas catabolizantes, uso de cateter para

o acesso hemodialítico e de suplementos vitamínicos antioxidantes foram excluídos.

44

4.3 ASCPECTOS ÉTICOS

O protocolo do estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Medicina - Universidade Federal Fluminense como adendo

do projeto nº 306.596 (Anexo 1). Os pacientes foram informados sobre a pesquisa e

assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).

4.4 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL

Os seguintes parâmetros antropométricos foram avaliados: massa corporal,

estatura, circunferência do braço (CB), dobras cutâneas de quatro pontos padrão

(bíceps, tríceps, subescapular e suprailíaca). A densidade corporal foi calculada pela

soma das quatro medidas de dobra cutânea, de acordo com o método de Durmin &

Womersley (1974), e o % de gordura corporal foi calculado utilizando-se a equação de

Siri (Lohman et al., 1991).

A aferição do peso seco foi realizada após a sessão de HD, com auxílio de uma

balança calibrada, da marca FILIZOLA, com capacidade máxima de 150 kg e

subdivisões a cada 100 gramas. O indivíduo era posicionado de pé, no centro da base da

balança, descalço e com roupas leves. A estatura foi obtida com o auxílio de um

estadiômetro acoplado à balança, referida anteriormente, ficando o indivíduo descalço,

com os calcanhares juntos, costas retas e braços estendidos no prolongamento do corpo.

O estado nutricional foi avaliado segundo o IMC, obtido pela razão entre o peso

e o quadrado da estatura, e sua classificação seguiu o proposto pela Organização

Mundial de Saúde (Quadro 3) (OMS, 1995; OMS, 1997).

45

Quadro 3. Estado nutricional de adultos segundo o índice de massa corporal (IMC)

Classificação IMC

Magreza ≤ 18,4 Kg/m2

Eutrofia 18,5-24,9 Kg/m2

Pré-obesidade 25-29,9 Kg/m2

Obesidade ≥ 30 Kg/m2

OMS, 1995; OMS, 1997.

O protocolo para aferição da circunferência braquial seguiu o descrito: o braço

avaliado (sem a fístula) foi flexionado em direção ao tórax, formando um ângulo de 90°.

Em seguida, o ponto médio entre o acrômio e o olécrano foi localizado, e o indívíduo

permaneceu com o braço estendido ao longo do corpo com a palma da mão voltada para

a coxa. O braço foi então contornado com uma fita flexível no ponto marcado de forma

ajustada, evitando compressão da pele ou folga. Para aferição da dobra cutânea tricipital

(DCT) o mesmo ponto médio foi utilizado para a medição da circunferência braquial

(CB) e separando levemente do tecido adiposo do braço não dominante, e a medida da

dobra cutânea foi realizada por meio do adipômetro do tipo Lange Skinfold Caliper

(Cambridge Scientific Industries Inc.).

Os valores de CB e DCT foram utilizados para o cálculo da circunferência

muscular do braço (CMB), segundo fórmula descrita por Frisancho (1981):

CMB = [CB (cm) - x DCT (cm)],

onde:CB = circunferência do braço

= 3,1415

46

Para medição da dobra cutânea bicipital (DCB), foi marcado o local da medida 1

cm acima daquele marcado para aferição da dobra tricipital (DCT). Com a palma da

mão do paciente voltada para fora, foi aplicado o adipômetro no local marcado. A dobra

cutânea subescapular (DCSE), foi aferida marcando-se o local abaixo do ângulo inferior

da escápula. A pele foi levantada 1 cm abaixo do ângulo inferior da escápula, de tal

forma que se observe um ângulo de 45o entre esta e a coluna vertebral. O adipômetro foi

aplicado estando o indivíduo com os braços e ombros relaxados. Na aferição da dobra

cutânea suprailíaca (DCSI), a dobra foi formada na linha média axilar, com o dedo

indicador logo acima da crista ilíaca, na posição diagonal, ou seja, seguindo a linha de

clivagem natural da pele no lado direito do indivíduo.

Após a aferição das dobras cutâneas (DCB, DCT, DCSE e DCSI) seu somatório

seguiu o proposto na equação de Durnin e Womersely (1974) para o cálculo da

Densidade Corporal (DC): (A – B) x log Σ 4 dobras

As fórmulas para o cálculo da DC, já com os coeficientes A e B, elaborados de

acordo com idade e gênero, estão apresentados no Quadro 4.

Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal

Idade (anos) Homens Mulheres

17 - 19 DC = 1,1620 - 0,0630 x (log Σ ) DC = 1,1549 – 0,0678 x (log Σ )

20 – 29 DC = 1,1631 - 0,0632 x (log Σ ) DC = 1,1599 – 0,0717 x (log Σ )

30-39 DC = 1,1422 - 0,0544 x (log Σ ) DC = 1,1423 – 0,0632 x (log Σ )

40 – 49 DC = 1,1620 - 0,0700 x (log Σ ) DC = 1,1333 – 0,0612 x (log Σ )

≥ 50 DC = 1,1715 - 0,0779 x (log Σ ) DC = 1,1339 – 0,0645 x (log Σ )

Fonte: Durnin & Womersley, 1974.

A partir dos valores de DC, o %GC total foi determinado utilizando a fórmula de

Siri (1961): %GC = 4,95/DC – 4,5 x 100.

Os valores de referência para o %GC são estabelecidos por Lohman et al.

(1992), conforme exposto no Quadro 5.

47

Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal

Homens Mulheres

Risco de distúrbios associados à desnutrição ≤ 5 ≤ 8

Abaixo da média 6 a 14 9 a 22

Média 15 23

Acima da Média 16 a 24 24 a 31

Risco de doenças associadas à obesidade ≥ 25 ≥ 32

Fonte: Lohman et al., 1992

Para o cálculo de massa magra, utilizou-se o índice de creatinina (IC) que é

derivado da massa livre de gordura, e foi utilizada a fórmula baseada no estudo Carnaud

B, et al. (2014):

IC (mg /kg/dia) = 16,2 + 1,12 x [1 mulheres; 0 homens ]- 0,06 x idade (anos)

– 0,08 x Kt /V + 0,009 x Cr pré dialise (mmol /l)

Vale ressaltar que todos os pacientes desse estudo eram anúricos. Assim,

utilizamos essa referência para o nosso estudo, já que pela antropometria poderíamos

estar sujeitos as variações devido as possíveis alterações hídricas presentes nesses

indivíduos.

Para o cálculo de massa livre de gordura, utilizamos o % de gordura corporal

avaliado pelo somatório das quatro pregas,( Triceps, biceps, subscapular e suprailiaca) e

o peso seco , através da seguinte equação :

Peso Seco - % GC = Kg gordura , e Peso Seco – Kg gordura = MLG

Também foi aplicada a ASG de 7 pontos indicada para pacientes com DRC em

HD, que consiste em um formulário composto pela avaliação da condição clínica e de

exame físico do paciente. A partir dessa avaliação o indivíduo foi classificado em bem

nutrido (7 e 6 pontos), desnutrido leve a moderado (5, 4 e 3 pontos) e desnutrido grave

(2 e 1 ponto), conforme proposto pelo método (Fetter et al. 2014) (Anexo 3).

48

A ingestão proteica foi estimativa por meio do cálculo do equivalente proteico

do aparecimento de nitrogênio (protein nitrogen appearance - PNA) através da seguinte

fórmula (NKF - KDOQI, 2000):

PNA (g/kg/dia) = {(uréia sérica/2,14) / [25,8 + (1,15/Kt/V)] + (56,4 / Kt/V)} + 0,168

4.5 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

4.5.1 Coleta do sangue

As amostras de sangue (20ml) foram coletadas em tubos Vacutainer® (4mL)

contendo EDTA como anticoagulante (1mg/mL), em seguida, centrifugado a 3000 rpm

por 15 minutos, a 4°C, para a obtenção do plasma. O plasma foi acondicionado em

tubos eppendorfs de polipropileno de 1,5mL, e conservado a –80°C para as análises. O

restante do sangue coletado seguiu outros procedimentos.

4.5.2 Análises bioquímicas de rotina

Os parâmetros bioquímicos de rotina (albumina, potássio, uréia, creatinina,

fósforo, cálcio, PTH, hemoglobina, hematócrito, colesterol total e triglicerídeos ) foram

retirados dos prontuários dos pacientes. As concentrações de albumina (normalidade ≥

3,8g/dL) (Fouque et al., 2008), ureia e creatinina foram determinadas pelos métodos

verdes de bromocresol, enzimático e colorimétrico, respectivamente. As concentrações

de fósforo (normalidade: 3,5 – 5,5 mg/dL), potássio (normalidade: 3,5 – 5,5 mg/dL) e

cálcio (normalidade: 8,4 – 9,5 mg/dL) tiveram como métodos de determinação,

respectivamente, cinético UV, eletrodo seletivo colorimétrico. Os níveis séricos totais

de cálcio foram corrigidos adicionando-se 0,8 mg/dL para cada redução de 1g/dL nos

níveis séricos de albumina a partir de 4g/dL. O PTH (normalidade: 2 a 9 vezes o valor

49

superior do método (Gueiros et al., 2011) foi determinado por imunoensaio e

enzimático de fase sólida (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Hb e Ht

foram determinados pelo método colorimétrico e microcentrifugação, respectivamente.

Para pacientes em HD, o diagnóstico de anemia é feito com base apenas nos valores de

Hb, sendo valores de 11-13g/dL considerados normais. O colesterol total (CT) e

triglicerídeos (TG) foram determinados pelo método enzimático colorimétrico através

do Kit específico KATAL® (Katal Biotecnológica Ind. Com. Ltda, Belo Horizonte -

MG – Brasil).

Os valores de referência apresentados, exceto para albumina e PTH, foram

baseados no Clinical Practice Guidelines for Nutrition in Chronic Renal Failure (NKF-

KDOQI, 2000), Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in

Chronic Kidney Disease (NKF, 2003) e Clinical Practice Guidelines and Clinical

Practice Recommendations for Anemia in Chronic Kidney Disease (NKF-KDOQI,

2006).Os valores de ureia pré e pós-HD, ultrafiltração e tempo de diálise foram

considerados no cálculo da dose de diálise (Kt/Vsp), parâmetro utilizado para estimar a

eficiência dialítica e cujos valores de normalidade são superiores a 1,2 (Sargent e Gotch,

1985).

4.5.3 Marcadores de estresse oxidativo e inflamação

* Determinação da Atividade da GPx

A atividade máxima da enzima GPx foi determinada no plasma com o auxílio de

kits comerciais para ELISA (Cayman®). Este método se baseia na reação em que a

enzima GPx catalisa a oxidação da glutationa reduzida por um hidroperóxido. Na

presença de GPx e NADPH, a glutationa oxidada é convertida à forma reduzida com a

oxidação concomitante do NADPH em NADH+. A diminuição na absorbância a 340 nm

foi então determinada (Paglia & Valentine, 1967).

50

* Determinação da Atividade da Catalase

A atividade da enzima catalase foi determinada no plasma com o auxílio de kits

comerciais para ELISA (Cayman®

). Este método se baseia na reação da catalase com

metanol na presença de uma concentração ótima de H2O2. O formaldeído produzido é

mensurado colorimetricamente com Purpald como cromógeno.

* Determinação da Atividade da SOD

A atividade dos três tipos de SOD (MnSOD, FeSOD e Cu/ZnSOD) foi

determinada no plasma com o auxílio de kits comerciais para ELISA (Cayman®

). Este

método utiliza um sal específico (tetrazolium) para detecção dos radicais superóxidos

produzidos pela xantina oxidase e hipoxantina.

* Determinação dos níveis de Il-6

Para a dosagem da citocinas inflamatória IL-6 foi utilizado kit comercial ELISA

(R&D Systems®

).

4.5.4 Isolamento das células mononucleares (PBMCs) e preparação do extrato

nuclear

O sangue total foi transferido para tubo falcon com ficol e centrifugado a 18°C.

A nuvem de célula em suspensão foi transferida para um novo tubo falcon, adicionado

PBS e centrifugado novamente a 18°C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet”

nuclear ressuspendido em 1mL meio de congelamento. O lisado nuclear foi estocado a -

80°C durante uma semana e após este período, em nitrogênio líquido. Uma alíquota foi

separada para quantificação da proteína pelo método de Bradford, utilizando como

padrão albumina bovina sérica.

51

4.5.5 Análise PCR em tempo real

O RNA total foi extraído das PBMC com o sistema de isolamento de RNA total

(SV Totla RNA Isolation System, Promega®). O cDNA foi sintetizado com o High-

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®). Ensaios TaqMan

Gene Expression (Applied Biosystems®) foram utilizados para detectar mRNA de Nrf2

(Hs00975961_g1), NF-κB (Hs00765730_m1), NQO1 (Hs00168547_m1), e o gene de

controle ABL1 (Hs00245445_m1). A expressão do mRNA de Nrf2, NF-κB e NQO1 foi

normalizada contra ABL1 e o nível de expressão calculado usando o método delta ciclo

limite delta.

5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para testar a distribuição das

variáveis, sendo os resultados expressos como média ± DP (desvio-padrão), mediana

(distância interquartílica) ou percentual, conforme adequado. Foi utilizado o teste de

Wilcoxon para avaliar a diferença nas variáveis de interesse em decorrência da

intervenção. O coeficiente de correlação de Pearson ou Spearmann foi considerado para

avaliar a correlação entre as variáveis. Análise de regressão múltipla linear foi realizada

para determinar associações com a expresão do NF-kB. As variáveis testadas foram

idade, sexo, IMC, PCR, IC, albumina, PNA e % gordura corporal.

Os testes serão fixados com valores de confiança em 95% (p < 0,05), sendo

considerados significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o

programs SPSS versão 20.0.

52

6.0 RESULTADOS

6.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES

Foram avaliados 83 pacientes em HD, 47 homens e 36 mulheres, média de idade

de 52,3 ± 14,4 anos e o tempo médio de tratamento em HD foi de 57,5 ± 50 meses.

A nefroesclerose hipertensiva configurou-se como a principal causa para DRC

(65%), seguida pela nefropatia diabética (19%), glomerulonefrite crônica (14%) e o

restante por outras causas. Com relação aos medicamentos utilizados, a maioria (90%)

dos pacientes fazia uso de eritropoietina recombinane humana. O cinacalcet estava

sendo utilizado por 24% dos pacientes devido ao hiperparatireoidismo grave, 90% dos

pacientes usavam sulfato ferroso e ácido fólico. Todos os pacientes utilizavam quelantes

de fósforo, sendo Sevelamer e/ou carbonato de cálcio. As drogas antipertensivas usadas

pelos pacientes incluíam inibidores da enzima conversora de angiotensina II (IECA), β-

bloqueadores, antagonistas dos canais de cálcio e antiadrenérgico de ação central.

De acordo com IMC, apenas 1 paciente apresentou magreza (IMC<18,5Kg/m2) e

39,8% apresentaram sobrepeso ou obesidade. Segundo a circunferência muscular do

braço realizada por antropometria, 3 pacientes apresentaram algum grau de depleção

muscular, os demais (85%) apresentaram massa magra preservada. Com relação ao %

de gordura corporal, 88% dos homens apresentam valores acima do considerado normal

(15%) e 52,4% das mulheres apresentaram valores acima de 23%. Entretanto, de acordo

com o cálculo do índice de creatinina (IC), observamos que 62% dos pacientes

apresentaram IC menor que 22mg/kg/d, constatando diminuição de massa muscular

nessa população. As características antropométricas da população são apresentadas na

Tabela 1.

53

Tabela 1. Características antropométricas dos pacientes estudados

Parêmetros Total Homens (47) Mulheres (N=35) p-valor

IMC (kg/m2) 24.7 ± 3.9 24.7 ± 3.9 24.8 ± 3.8 0.8

CMB (cm) 22,0 ± 3,3 24.2 ± 3.2 21.9 ± 3.0 0.09

GC (%) 23,8 ± 7,3 22.5 ± 5.8 25.6 ± 8.8 0.11

MLG (kg) 50,1 ± 9,2 53.2 ± 9.2 45.3 ± 7.3 0.03

IC (mg/Kg/d) 21,7 ± 3,4 22,5 ± 3,8 20,7 ± 2,6 0,009

Valores em media ± SD.IMC Indice de massa corporal; CMB circunferencia media do braço;

GC; Gordura corporal; MLG, massa livre de gordura; IC, índice de creatinina.

De acordo com a análise feita por sexo, os homens apresentaram, como já

esperado, maiores valores de massa magra e IC.

A ingestão média de proteína (PNA) foi de 1,2 ± 0,2g/kg/d, sendo que 19

pacientes apresentaram ingestão proteica abaixo do recomendado (1,2g/kg/d).

De acordo com os parâmetros bioquímicos dos pacientes (Tabela 2), 10

pacientes apresentaram valores de albumina < 3,8g/ dL, 39,7% apresentaram anemia

(Hto<33%) e 42% dos pacientes apresentaram hiperfosfatemia. Com relação ao perfil

lipídico, 25% dos pacientes apresentaram níveis elevados de triglicerídeos (TG) e,

apenas 6% apresentaram níveis de colesterol total acima dos valores recomendados.

54

Tabela 2. Parâmetros bioquímicos dos pacientes estudados

Parâmetros Valores Valores referência

Ureia (mg/dL) 142.1 ± 27.7 < 90

Creatinina (mg/dL) 8.4 ± 2.6 > 10

Potássio (mEq/l) 5.4 ± 0.5 3.5 - 5.0

Fósforo (mg/dL) 5.2 ± 1.2 ≤ 5.0

Cálcio (mg/dL) 8.9 ± 0.5 8.4 – 9.5

Albumina (g/dL) 3.9 ± 0.6 ≥ 3.8

Hemoglobina (g/dL) 10.6 ± 1.9 10 – 12

Hematócrito (%) 32.8 ± 5.6 33- 36%

PTH (pg/dL) 288 (188.2-452.2) 30 - 450

Kt/V 1.57 ± 0.4 ≥ 1.2

Colesterol total (mg/dL) 161.6 ± 37.3 < 200

Triglicerídeos (mg/dL) 186.5 ± 114 < 150

Valores em média ± SD. Kt/V, dose de diálise e PCR, proteina C reativa

6.2 FATORES DE TRANSCRIÇÃO, MARCADORES DE INFLAMAÇÃO e

ESTRESSE OXIDATIVO

A atividade das enzimas antioxidantes, níveis de marcadores inflamatórios e

expressão dos fatores de transcrição são apresentados na Tabela 3.

55

Tabela 3. Atividade das enzimas antioxidantes, marcadores inflamatórios e

expressão dos fatores de transcrição nos pacientes estudados.

Parâmetros Valores

SOD (U/mL) 38.6 ± 12.9

CAT (nmol/mL/min) 38.8 ± 27.6

GPx (nmol/mL/min) 35.1 ± 20.4

IL-6 (pg/dL) 24.1 ± 3.8

PCR (mg/dL) 2.7 (0.6 – 19.3)

Nrf2 0.69 (0.11 -2.75)

NF-κB 1.1 (0.26 -3.73)

Razão Nrf2/ NF-κB 0.66 ± 0.67

NQO1 1.2 ± 0.6

SOD, superóxido dismutase; CAT, catalase; GPX, glutation peroxidase,

NQO1, NAD(P)H quinona oxidoredutase 1; IL-6, Interleucina 6.

De acordo com os valores de PCR, 47,6% dos pacientes apresentavam

inflamação (valores acima de 3mg/dL). Com relação aos demais parâmetros, não foi

possivel realizar essas análises, devido a falta de um padrão de normalidade.

A expressão de NF-κB apresentou correlação positiva com idade (r = 0,33 e p=

0,02) e negativa com IC (r= -0,54 , p =0,001) (Figura 7), níveis de albumina (r=-0,32,

p = 0,02) e % GC (r =-0,61 p= 0,001). Não houve correlações com Nrf2. No entanto,

quanto maior foi a razão entre Nrf2/NF- kB, maior era o índice de creatinina nesses

pacientes (r=0,37, p=0,008).

56

Figura 8. Associação entre expressão de NF-κB e valores de índice de

creatinina nos pacientes em hemodiálise.

A ingestão proteica avaliada pelo PNA foi positivamente associada com os

valores de índice de creatinina (r= 0.35, p=0.001).

Não houve correlação entre os níveis das enzimas antioxidantes e a expressão

dos fatores nucleares.

A análise de regressão linear múltipla foi realizada para determinar as variáveis

que possuem associações independentes com a expressão de NF-κB. As variáveis

incluídas, foram, idade, genero, IMC, PCR, IC, albumina, PNA e % gordura corporal. A

análise revelou que a expressão de NF-κB foi independentemente associada com IC

(ajustado coeficienteβ= -0.8, p= 0.013 e % GC (ajustado coeficiente β:- 0.42; p=0.04).

De acordo com a ASG 7 pontos, os pacientes foram divididos em 2 grupos, um

grupo composto por pacientes classificados como desnutridos e outro de eutróficos. O

57

grupo de desnutridos apresentou elevada expressão do NF-κB (1,7 ± 0.9) quando

comparado com o grupo de eutróficos (1,1 ± 0,6) (p=0,03) (Gráfico 1).

Figura 9. Comparação da Expressão NF-κB entre pacientes Desnutridos e

Eutróficos segundo ASG.

58

7.0 DISCUSSÃO

A inflamação e estresse oxidativo são complicações bastante comuns em

pacientes com DRC em tratamento de HD e estão associadas com a síndrome protein

energy wasting, que é uma das principais causas de mobimortalidade nesses pacientes

(Stenvinkel, 2005, Fouque et al. 2008, Chen et al. 2013). Uma das hipótese para a

inflamação levar à desnutrição é através da ativação do NF-kB e, de fato, o presente

estudo verificou a relação entre aumentada expressão transcricional do NF-kB com

piora do estado nutricional de pacientes com DRC em HD.

O IMC é considerado o método mais simples, prático e de baixo custo para

avaliação do estado nutricional, entretanto, não fornece dados suficientes para adequada

análise da composição corporal (Mafra et al., 2008). A avaliação da massa muscular

desses pacientes em HD é sempre uma limitação nos estudos, no entanto, em pacientes

em HD, com função residual mínima ou nula, recebendo uma dose constante de HD, a

creatinina sérica pré diálise é propocional a massa muscular e a ingestão de proteína

(KDOQI, 2000). Assim, o modelo de cinética da creatinina baseado no princípio de que

a geração de creatinina é proporcional a massa magra em pacientes estáveis em HD que

possuem ingestão protéica constante, pode ser boa alternativa para avaliação da massa

muscular (Canaud, 1995). O cálculo da cinética, requer complexa fórmula matemática,

que inclui valores pós HD de creatinina sérica e depende da coleta do dialisado.

Entretanto, como maneira simplificada e prática de cálculo, Carnaud et al. (2014),

elaboraram uma fórmula baseada na idade, gênero, creatinina pré hemodiálise e dose de

diálise, que apresentou forte correlação com massa muscular nesses pacientes, pelo IC

através da cinética da creatinina.

59

Na análise antropométrica dos pacientes, observamos que pelo IMC, apenas 1

paciente estava desnutrido e, 39,8% apresentaram obesidade ou sobrepeso. Em

contrapartida, 62% dos pacientes apresentaram índice de creatinina menor que

22mg/kg/d, constatando diminuição de massa muscular nessa população. De fato, a

atrofia muscular, acompanhada ou não de depleção energética, é comumente observada

nos pacientes submetidos à HD (Carrero et al., 2008; Mak et al., 2011). Curiosamente,

elevada adiposidade e obesidade central podem ocorrer paralelamente à depleção

proteica (Gohda et al., 2008; Cordeiro et al., 2010). O que de fato, observamos na

população estudada que apresentava elevado percentual de gordura corporal.

Essa alteração na composição corporal nos pacientes em HD já é bastante

relatada na literatura e pode ser devida a diversos fatores como uremia per se, estresse

oxidativo, idade, e dentre vários outros fatores, a inflamação (Fouque et al., 2008).

Sabe-se que a inflamação induz o catabolismo protéico, a lipólise, o aumento do

gasto energético, a resistência a insulina e à supressão do apetite. O fator nuclear B

(NF-B), um fator de transcrição associado ao aumento da síntese de citocinas

inflamatórias, pode estar relacionado ao catabolismo muscular observado na DRC.

Langen et al. (2001) observaram in vitro que o tratamento com fator de necrose

tumoral-alfa (TNF-α) induziu à alterações na diferenciação dos miócitos via ativação do

NF-B. Portanto, devido aos inúmeros fatores catabólicos associados à inflamação, é

evidente sua relação com a atrofia muscular característica dos pacientes em HD

(Fouque, 2008, Fouque et al, 2008; Carrero et al., 2008, Cheung et al., 2010, Mak et al.,

2011).

Reforçando a associação entre inflamação e perda de massa muscular, em

indivíduos em HD, Huang et al. (2010) demonstraram num estudo randomizado,

placebo e controlado que a administração de anti-citocinas (receptor antagonista de IL-

60

1) durante 4 semanas melhorou significativamente a resposta inflamatória em pacientes

em HD, na concentração de pré albumina em 23% e, em 17% dos pacientes houve

aumento da massa magra avaliado pela absormetria de energia de RX (DXA).

Deger et al. (2015) mostraram que a inflamação afeta a massa muscular

esquelética, através da correlação positiva entre níveis de proteína C reativa e proteólise

e negativa com síntese proteica em pacientes em HD. Os níveis de PCR são preditores

independentes na manutenção da homeostasia muscular esquelética.

O sistema ubiquitina proteossoma está envolvido com inflamação e perda

muscular, sendo um dos principais mecanismos de proteólise ativado no músculo

esquelético nos pacientes com DRC, principalmente nos pacientes em HD. Quando a

degradação proteica é iniciada, há expressão de 2 ligases da ubiquitina específicas E3, a

muscle specific ring finger-1 – MuRF-1 e a muscle atrophy F-box –MAFbx. A ativação

dessas ligases se correlaciona com a aceleração da degradação proteica. O forkhead

transcription factors (FoxO) e o NF-𝜅B são fatores ativadores dessas enzimas que

condicionam à degradação proteica via sistema ubiquitina proteossoma (Chen et al.

2013).

No presente estudo, verificamos que a expressão de NF-𝜅B foi também

negativamente associada com massa gorda. De fato, estudos prévios mostraram que o

aumento dos níveis de TNF-α pode predispor à lipólise, devido à redução de perilipina,

proteína presente nas gotas lipídicas dos adipócitos que reduz o acesso das lipases para

estoque de gordura e assim, inibe a hidrólise de triglicerídeos (Ryden et al. 2004,

Brasaemle et al. 2000).

Adicionalmente, nossos resultados mostraram que pacientes desnutridos

segundo ASG de 7 pontos, apresentaram maior expressão do RNAm para NF-kB,

61

reforçando a hipótese de que o processo inflamatório leva à piora do estado nutricional

nos pacientes com DRC em HD.

Contrapondo as ações do NF-kB, o Nrf2 parece desempenhar papel importante

na proteção celular contra o estresse oxidativo e inflamação. Jiang et al. (2010)

exploraram o papel protetor de Nrf2 contra a nefropatia diabética usando dois modelos:

1) em tecidos de biópsia de rim de pacientes com nefropatia diabética observaram que

os glomérulos desses pacientes estavam sob estresse oxidativo e havia elevados níveis

de Nrf2; 2) em camundongos induzidos por estreptozotocina à nefropatia diabética

observaram que Nrf2 demonstrou ser fundamental na proteção ao dano renal. Isto é

evidente por camundongos Nrf2 (-/-) ter maior produção de EROs e sofrer maior dano

oxidativo no DNA e lesão renal em comparação com camundongos Nrf2 (+/+).

O fator de transcrição Nrf2 foi descoberto recentemente e tem sido visto como

mecanismo importante capaz de proteger contra essas condições, por induzir a síntese

de enzimas antioxidantes e desintoxidantes de fase II, que desempenham papel

fundamental na defesa celular, intensificando a remoção de EROs (Jung e Kwak, 2010;

Singh et al., 2010; Baird e Dinkova-kostova, 2011), além disso, inibe a ativação do NF-

κB.

Kim e Vaziri (2010), em análise do tecido renal obtido a partir de ratos

nefrectomizados com DRC, mostraram deficiência na ativação de Nrf2 e,

consequentemente, na regulação das enzimas antioxidantes. Foi observado também

aumento na peroxidação lipídica, depleção de glutationa, e ativação de NF-B, bem

como as enzimas relacionadas com a inflamação, tais como ciclo-oxigenase-2 e 12-

lipoxigenase, e infiltração de células mononucleares.

Aminzadeh et al., (2013) estudando ratos com nefropatia túbulo-intersticial, uma

causa comum de DRC, observaram aumento da expressão de NAD(P)H-oxidase, ciclo-

62

oxigenase-2, 12-lipoxigenase e ativação de NF-B, além disso, observaram diminuição

da ativação Nrf2 e sub-regulação dos seus produtos, incluindo, catalase, HO-1 e de

GCL.

Nossos resultados estão de acordo com essas publicações e mostram claramente

diminuição na expressão de Nrf2 e aumentada de NF-B em pacientes em HD. Por ser

fator de transcrição ativado em resposta ao estado antioxidante perturbado, seria

plausível supor que a expressão de Nrf2 estaria aumentada em pacientes em HD. No

entanto, observamos o contrário e que isso pode estar relacionado ao fato de que antes

do desenvolvimento da doença ou na fase inicial da mesma, Nrf2 tem sua ativação

aumentada de modo a evitar danos induzidos por EROs. No estágio mais avançado,

porém, esse mecanismo de proteção pode tornar-se saturado pelo excesso de EROs.

Esse aumento de Nrf2 a resposta aguda e redução em meio à cronicidade/gravidade da

doença também são observados em outras doenças crônicas como a doença pulmonar

obstrutiva crônica (DPOC) (Malhotra et al., 2008; Suzuki et al., 2008, Leal et al. 2015).

Nosso grupo de pesquisa relatou pela primeira vez que pacientes em HD

apresentam diminuição na expressão do Nrf2 comparado a indivíduos saudáveis, além

do aumento da expressão do fator NF-κB. Foi observada diminuição na expressão da

enzima NQO1 nos pacientes em HD comparado a indivíduos saudáveis e aumento de

marcadores inflamatórios (TNF-alpha) e de peroxidação lipídica (MDA). Condições

essas que aumentam o risco dos pacientes em HD desenvolver DCV, levando ao

aumento da mortalidade nessa população (Pedruzzi et al. 2015).

Nosso estudo possui limitações, primeiramente métodos de avaliação

nutricional, como o DXA, não foi realizado, embora a avaliação da composição

corporal pelas dobras cutâneas já revelou ser um método confiável e seguro para

63

pacientes renais crônicos em HD, (Kamimura, et al. 2007). Além disso, esse é um

estudo transversal o que dificulta estabelecer uma relação causal.

Assim, diante dos resultados encontrados neste estudo, novas perspectivas para

avaliação dos fatores causais da perda de massa magra na DRC podem surgir, na

tentativa de diminuir a inflamação e o estresse oxidativo, aumentando a expressão de

Nrf2 e antagonizando a expressão do NF-κB, minimizando a perda de massa magra

para esses pacientes. Portanto, até o presente momento, as evidências apontam que a

perda de massa muscular se correlaciona com aumento da expressão do NF-κB.

64

8.0 CONCLUSÕES

Em conclusão, a expressão do Nrf2 parece não ter associação com estado

nutricional nos pacientes em HD. Por outro lado, a ativação do NF-κB pode ter

contribuído para o aumento da inflamação, do estresse oxidativo e perda de massa

muscular nesses indivíduos.

65

9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS :

Abraham G, Sundaram V, Mathew M, Leslie N, Sathiah V. C-Reactive protein,

valuable predictive marker in chronic kidney disease. Saudi J Kidney Dis

Transpl.2009;20(5):811-5.

Aminzadeh MA, Nicholas SB, Norris KC, Vaziri ND. Role of impaired Nrf2 activation

in the pathogenesis of oxidative stress and inflammation in chronic tubulointerstitia

nephropathy. Nephrol Dial Transplant. 2013;19:18.

Antunes F, Han D. Redox regulation of NF-kappaB: from basic to clinical research.

Antioxid Redox Signal. 2009;11(9):2055-6.

Awad E, Khan S, Sokolikova B, Brunner P, Olcaydu D, Wojta J, et al. Cold induces

ROS-production and activation of the NF-kappa B response in endothelial cells and

inflammation in vivo. J Thromb Haemost. 2013.

Baird L, Dinkova-Kostova AT. The cytoprotective role of the Keap1- Nrf2 pathway.

Arch Toxicol. 2011;85(4):241-72.

Barbosa KBF, Costa NMB, Alfenas RCG, De Paula SO, Minim VPR, Bressan J.

Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Rev.Nutr. 2010;

23(4):629-643

Barreiros A, David JM, David JP. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies

reativas e defesa do organismo. Quim. Nova. 2006;29(1):113-123.

Barros AD, Moraes C, Pinto MB, Lobo JC, Mafra D. Is there association between acyl-

ghrelin and inflammation in hemodialysis patients? J Bras Nefrol. 2013;35(2):120-6.

Bolati D, Shimizu H, Yisireyili M, Nishijima F, Niwa T. Indoxyl sulfate, a uremic

toxin, downregulates renal expression of Nrf2 through activation of NF-kappaB. BMC

Nephrol. 2013;14:56.45.

66

Brasaemle DL, Rubim B, Harten IA, Gruia-Gray J, Kimmel AR, Londos C , Perilipin A

increases triacylglycerol storage by decreasing the rate of triacylglycerol hydrolysis. J

Biol Chem,2000; 275: 38486-93.

Canziani MEF, Draibe, A.S; Nadaletto, M.A.J. Técnicas dialíticas na Insuficiência

Renal crônica. In: Ajzen H, Schor N. Guias de medicina ambulatorial e hospitalar -

UNIFESP/Escola Paulista de Medicina: Nefrologia. Barueri: Manole. 2005:223-37.

Canziani MEF e Ammirati A.L Fatores de risco da Doença Cardiovascular na doença

renal crônica .J Brás Nefrol , 2009;31 (supl 31)

Cardozo LF, Pedruzzi LM, Stenvinkel P, Stockler-Pinto MB, Daleprane JB, Leite M,

Jr., et al. Nutritional strategies to modulate inflammation and oxidative stress pathways

via activation of the master antioxidant switch Nrf2. Biochimie. 2013; 95(8):1525-33.

Canaud B, Granger Alexander et al , Creatinine Index as a Surrogate of Lean Body

MassDerived from Urea Kt/V, Pre-Dialysis Serum Levels and Anthropometric

Characteristics of Haemodialysis Patients, PLoSONE; 2014 9(3).

Chen XL, Dodd G, Thomas S, Zhang X, Wasserman MA, Rovin BH, et al. Activation

of Nrf2/ARE pathway protects endothelial cells from oxidant injury and inhibits

inflammatory gene expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006; 290(5):1862-70.

Chen XL, Kunsch C. Induction of cytoprotective genes through Nrf2/antioxidant

response element pathway: a new therapeutic approach for the treatment of

inflammatory diseases. Curr Pharm Des. 2004; 10(8):879-91.

Chen XL, Varner SE, Rao AS, Grey JY, Thomas S, Cook CK, et al. Laminar flow

induction of antioxidant response element-mediated genes in endothelial cells. A novel

anti-inflammatory mechanism. J Biol Chem. 2003;278(2):703-11.

Chen J, Peng H, Xiao L, Zhang K, Yuan Z, et al. Inflammation but not Dietary

Macronutrients Insufficiency Associated with malnutrition Inflammation Score in

haemodialisys population. PlosOne, 2013; 8(12).

Cheung WW, Paik KH, Mak RH. Inflammation and cachexia in chronic kidney disease.

Pediatr Nephrol. 2010; 25(4):711-24.

67

Copple IM, Goldring CE, Kitteringham NR, Park BK. The Nrf2-Keap1 defence

pathway: role in protection against drug-induced toxicity. Toxicology. 2008; 246(1):24-

33.46

Cordeiro AC, Qureshi AR, Stenvinkel P, Heimburger O, Axelsson J, Barany P, et al.

Abdominal fat deposition is associated with increased inflammation, proteinenergy

wasting and worse outcome in patients undergoing haemodialysis. Nephrol Dial

Transplant. 2010;25(2):562-8.

Cuppari L, Kamimura MA. Avaliação nutricional na doença renal crônica: desafios na

prática clínica. J Bras Nefrol. 2009;31(Supl 1):28-35.

Da Silveira FL. Análise da função renal em pacientes com Insuficiência renal crônica.

[monografia]. Governador Valadares-MG: Universidade Vale do Rio Doce/UNIVALE;

2011.

Degler MA. Histórico das funções renal e urinária. In: Smeltzer SC; Bare BG. Brunner

& Suddarth. Tratado de Enfermagem Médico-Cirúrgica. Rio de Janeiro Guanabara

Koogan, 2005:1323-1363.

Deger SM, Hung A, Siew ED, Booker C, Ikizler TA: Systemic Inflammation affects

skeletal muscle protein homeostasis in maintenance hemodialysis (MHD) patients. Am

Soc Nephrol.,2015 Resumo.

Detsky AS et al. What is Subjective Global Assessment of nutritional status? J

Parenteral Enteral Nutr. 1987; 11(1):8-13.

Dezoti C, Watanabe M, Pinto CF, Neiva L, Vattimo M. Proteção funcional da enzima

heme-oxigenase-1 na lesão renal aguda isquêmica e tóxica. Acta Paul Enferm.

2009;22:490-3.

Dincer Y, Sekercioglu N, Pekpak M, Gunes KN, Akcay T. Assessment of DNA

oxidation and antioxidant activity in hypertensive patients with chronic kidney disease.

Ren Fail. 2008;30(10):1006-11.

Dinkova-Kostova AT, Holtzclaw WD, Kensler TW. The role of Keap1 in cellular

protective responses. Chem Res Toxicol. 2005;18(12):1779-91.

68

Donadelli R, Abbate M, Zanchi C, Corna D, Tomasoni S, Benigni A, et al. Protein

traffic activates NF-kB gene signaling and promotes MCP-1-dependent interstitial

inflammation. Am J Kidney Dis. 2000;36(6):1226-41.

Dounousi E, Papavasiliou E, Makedou A, Ioannou K, Katopodis KP, Tselepis A,

Siamopoulos KC, Tsakiris D. Oxidative stress is progressively enhanced with

advancing stages of CKD. Am J Kidney Dis. 2006;48(5):752-60.

Dummer CD, Thomé FS, Veronese FV. Doença renal crônica, inflamação e

aterosclerose: novos conceitos de um velho problema. Rev Assoc Med Bras 2007;

53(5): 446-50.

Durnin JV, Womersley J. Body fat assessed from total body density and its estimation

from skinfold thickness: measurements on 481 men and women aged from 16 to 72

years. Br J Nutr. 1974;32(1):77-97.

Elewa U, Sanchez-Nino MD, Martin-Cleary C, Fernandez-Fernandez B, Egido J, Ortiz

A. Cardiovascular risk biomarkers in CKD: the inflammation link and the road less

traveled. Int Urol Nephrol. 2012;44(6):1731-44.47

Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education

Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of High Blood

Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA: the journal of the American

Medical Association. 2001;285(19):2486-97.

Fassett RG, Venuthurupalli SK, Gobe GC, Coombes JS, Cooper MA, Hoy WE

Biomarkers in chronic kidney disease: a review. Kidney Int. 2011;80(8):806-21.

Fetter RL, Bigogno FG, de Oliveira FG, Avesani CM. Cross-cultural adaptation to

Portuguese of tools for assessing the nutritional status of patients on dialysis. J Bras

Nefrol. 2014;36(2):176-85.

Fouque D, Kalantar-Zadeh K, Kopple J, Cano N, Chauveau P, Cuppari L, et al. A

proposed nomenclature and diagnostic criteria for protein-energy wasting in acute and

chronic kidney disease. Kidney Int. 2008;73(4):391-8.

69

Freigang S, Ampenberger F, Spohn G, Heer S, Shamshiev T,Kisielow J, et al. Nrf2 is

essential for cholesterol crystal induced inflammasome activation and exacerbation of

atherosclerosis .Eur.J.Immun.2011;41(7):2040-51

Frisancho AR. New norms of upper limb fat and muscle areas for assessment of

nutritional status. Am J Clin Nutr. 1981;34(11):2540-5.

Gang GT, Kim YH, Noh JR, Kim KS, Jung JY, Shong M, et al. Protective role of

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) in cisplatin-induced nephrotoxicity.

Toxicol Lett. 2013;221(3):165-75.

Gloire G, Piette J. Redox regulation of nuclear post-translational modifications during

NF-kappaB activation. Antioxid Redox Signal. 2009;11(9):2209-22.

Grotto HZW. Metabolismo do ferro: uma revisão sobre os principais mecanismos

envolvidos em sua homeostase. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 2008;30(5):390-397.

Himmelfarb J. Linking oxidative stress and inflammation in kidney disease: which is

the chicken and which is the egg? Semin Dial. 2004;17(6):449-54.

Honda H, Qureshi AR, Heimburger O, Barany P, Wang K, Pecoits-Filho R, et al. Serum

albumin, C-reactive protein, interleukin 6, and fetui a as predictors of malnutrition,

cardiovascular disease, and mortality in patients with ESRD. Am Kidney Dis.

2006;47(1):139-48.

Howden R. Nrf2 and cardiovascular defense. Oxid Med Cell Longev. 2013; 1-10.

Huang CX, Tighiouart H, Beddhu S, Cheung AK, Dwyer JT, Eknoyan G, et al. Both

low muscle mass and low fat are associated with higher all-cause mortality

inhemodialysis patients. Kidney Int. 2010;77(7):624-9.48

Huber PC, Almeida WP, Fátima Ad. Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico

e importância em processos patológicos. Quim. nova. 2008;31(05):1170-9.

Ishii T, Itoh K, Ruiz E, Leake DS, Unoki H, Yamamoto M, et al. Role of Nrf2 in the

regulation of CD36 and stress protein expression in murine macrophages: activation by

oxidatively modified LDL and 4-hydroxynonenal. Circ Res. 2004;94(5):609-16.

70

Itoh K, Wakabayashi N, Katoh Y, Ishii T, Igarashi K, Engel JD, et al. Keap1 represses

nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the

amino-terminal Neh2 domain. Genes Dev. 1999;13(1):76-86.

Jones CH, Wolfenden RC, Wells LM. Is Subjective Global Assessment a reliable

measure of nutritional status in hemodialysis? J Ren-Nutr. 2004; 14(1):26-30.

Transcription factor Nrf2 regulates inflammation by mediating the effect of 15-

deoxyDelta(12,14)-prostaglandinj(2). Mol Cell Biol. 2004;24(1):36-45.

Jiang T, Huang Z, Lin Y, Zhang Z, Fang D, Zhang DD. The protective role of Nrf2 in

streptozotocin-induced diabetic nephropathy. Diabetes. 2010;59(4):850-60.

Jin W, Wang H, Yan W, Xu L, Wang X, Zhao X, et al. Disruption of Nrf2 enhances

upregulation of nuclear factor-kappaB activity, proinflammatory cytokines, and

intercellular adhesion molecule-1 in the brain after traumatic brain injury. Mediators

Inflamm. 2008;2008:1-7.

Jung KA, Kwak MK. The Nrf2 system as a potential target for the development of

indirect antioxidants. Molecules. 2010;15(10):7266-91.

Kansanen E, Kuosmanen SM, Leinonen H, Levonen AL. The Keap1-Nrf2 pathway:

Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol.2013;1(1):45-49.

Kaspar JW, Niture SK, Jaiswal AK. Nrf2:INrf2 (Keap1) signaling in oxidatives tress.

Free Radic Biol Med. 2009;47(9):1304-9.

Kato A, Odamaki M, Yamamoto T, Yonemura K, Maruyama Y, Kumagai H, et al.

Influence of body composition on 5 year mortality in patients on regular haemodialysis.

Nephrol Dial Transplant. 2003;18(2):333-40.

Katoh Y, Itoh K, Yoshida E, Miyagishi M, Fukamizu A, Yamamoto M. Two domains

of Nrf2 cooperatively bind CBP, a CREB binding protein, and synergistically activate

transcription. Genes Cells. 2001;6(10):857-68.

Kim J, Cha YN, Surh YJ. A protective role of nuclear factor-erythroid 2-related factor-2

(Nrf2) in inflammatory disorders. Mutat Res. 2010; 690(1-2):12-23.

71

Kim HJ, Vaziri ND. Contribution of impaired Nrf2-Keap1 pathway to oxidative stress

and inflammation in chronic renal failure. Am J Physiol RenalPhysiol. 2010;

298(3):662-71.

Kovesdy CP, Kalantar-Zadeh K. Accuracy and limitations of the diagnosis of

malnutrition in dialysis patients. Semin Dial. 2012; 25(4):423-7.

King CD, Rios GR, Green MD, Tephly TR. UDP-glucuronosyltransferases. Current

drug metabolism. 2000; 1(2):143-61.

Krishnamurthy, VM, Wei G, Baird BC, Murtaugh M, Chonchol MB, Raphael KL. High

dietary fiber intake is associated with decreased inflammation and all-cause mortality in

patients with chronic kidney disease. Kidney Int, 2011; 81(3), 300-306.

Kobayashi M, Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1

pathway of antioxidant gene regulation. Antioxid Redox Signal. 2005; 7(3-4):385-94.

Kobayashi M, Yamamoto M. Nrf2-Keap1 regulation of cellular defense mechanisms

against electrophiles and reactive oxygen species. Adv Enzyme Regul. 2006; 46:113-40.

Kovesdy CP, George SM, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Predictability of biomarkers

of protein-energy wasting and inflammation inmoderate and advanced chronic kidney

disease .Am J Clin Nutr 2009; 90 : 407 – 414 .

Lankhorst CE, Wish JB. Anemia in renal disease: diagnosis and management. Blood

Rev. 2010; 24(1):39-47.

Lee DM, Jackson KW, Knowlton N, Wages J, Alaupovic P, Samuelsson O, et al.

Oxidative stress and inflammation in renal patients and healthy subjects. PloSone.

2011;6(7):1-10.

Leite HP, Sarni RS. Radicais livres, antioxidantes e nutrição. Rev Bras Nutr Clin.

2003;18(2):60-5.

Levonen AL, Inkala M, Heikura T, Jauhiainen S, Jyrkkanen HK, Kansanen E, et al.

Nrf2 gene transfer induces antioxidant enzymes and suppresses smooth muscle cell

growth in vitro and reduces oxidative stress in rabbit aorta in vivo. Arterioscler Thromb

Vasc Biol. 2007; 27(4):741-7.

72

Li Y, Paonessa JD, Zhang Y. Mechanism of chemical activation of Nrf2. PloS one.

2012; 7(4):1-7.

Lin CC, Liu XM, Peyton K, Wang H, Yang WC, Lin SJ, et al. Far infrared therapy

inhibits vascular endothelial inflammation via the induction of heme oxygenase-1.

Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008; 28(4):739-45.

Lobo JC, Farage NE, Abdalla DS, Velarde LG, Torres JP, Mafra D. Association

between circulating electronegative low-density lipoproteins and serum ferritin in

hemodialysis patients: a pilot study. J Ren Nutr. 2012; 22(3):350-6.

Lobo JC, Mafra D, Farage NE, Faulin Tdo E, Abdalla DS, de Nobrega AC, et al.

Increased electronegative LDL and decreased antibodies against electronegative LDL

levels correlate with inflammatory markers and adhesion molecules in hemodialysed

patients. Clin Chim Acta. 2011;412(19-20):1788-92.

Lobo JC, Stockler-Pinto MB, Farage NE, Faulin Tdo E, Abdalla DS, Torres JP, et al.

Reduced plasma zinc levels, lipid peroxidation, and inflammation biomarkers levels in

hemodialysis patients: implications to cardiovascular mortality. Ren Fail.

2013;35(5):680-5.

Lohman TJ, Roche AF, Martorell R. Anthropometric standardization reference manual.

Champaign (IL): Human Kinetics, 1991.

Lu SC. Glutathione synthesis. Biochim Biophys Acta. 2013; 1830(5):3143-53.

Lysaght MJ. Maintenance dialysis population dynamics: current trends and long-term

implications. J Am Soc Nephrol. 2002;13(suppl 1):S37-S40.

Maia MdS. Espécies reativas do metabolismo do oxigênio, antioxidantes e função

espermática [monografia]. Botucatu (SP): Faculdade de Medicina Vetarinária e

Zootecnia-Unesp; 2003.

Maines MD. New insights into biliverdin reductase functions: linking heme metabolism

to cell signaling. Physiology (Bethesda). 2005 Dec; 20:382-9.

NKF-KDIGO. KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and

Management of Chronic Kidney Disease. Kidney Int. 2013; 3:5-6.

73

NKF-K/DOQI Clinical Practice Guidelines and Clinical Practice Recommendations for

Anemia in Chronic Kidney Disease. Am J Kidney Dis. 2006; 47(5 Suppl 3): 11-15,

2006.

NKF – KDOQI. National Kidney Foundation - Kidney Disease Outcome Quality

Initiative. Clinical practice guidelines for nutrition in chronic renal failure. Kidne

Disease Outcome Quality Initiative. Am J Kidney Dis. 2000; 35: 1-141.

NKF. National Kidney Foundation. Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism

and Disease in Chronic Kidney Disease. Am J Kidney Dis. 2004

Oberg BP, McMenamin E, Lucas FL, McMonagle E, Morrow J, Ikizler TA, et al.

Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to

severe chronic kidney disease. Kidney Int. 2004; 65(3):1009-16

Park PH, Hur J, Kim YC, An RB, Sohn DH. Involvement of heme oxygenase-1

induction in inhibitory effect of ethyl gallate isolated from Galla Rhois on nitric oxide

production in RAW 264.7 macrophages. Arch Pharm Res. 2011; 34(9):1545-52

Pedruzzi LM, Stockler-Pinto MB, Leite M, Jr., Mafra D. Nrf2-keap1 system versus

NF-kappaB: the good and the evil in chronic kidney disease? Biochimie. 2012;

94(12):2461-6.

Rangan G, Wang Y, Harris D. NF-kappaB signaling in chronic kidney disease. Front

Biosci (Landmark Ed).2009; 14:3496-522.

Reinisalo M; Karlund A et al. Polyphenol stilbenes molecular mechanismis of defense

against oxidative stress and aging related diseases. Oxidative Medicine and cellular

longevity, vol. 2015.

Riella L, de Moura L, Riella M. Anatomia renal. RIELLA, MC. Princípios de

nefrologia e distúrbios hidroeletrolíticos Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2008:1-

16.

Ruiz S, Pergola PE, Zager RA, Vaziri ND. Targeting the transcription factor Nrf2 to

ameliorate oxidative stress and inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int.

2013; 83(6):1029-41.

74

Rutkowski P, Słominska EM, Szołkiewicz M, Aleksandrowicz E, Smolenski RT,

Wołyniec W, Renke M, Wisterowicz K, Swierczynski J, Rutkowski B.

Relationship between uremic toxins and oxidative stress in patients with chronic

renal failure. Scand J Urol Nephrol. 2007; 41(3):243-8.

Ryden M, Arvidsson E, Blomqvist L, Perbeck L, Dicker A, Arner P Targets for TNF-α-

induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004, 318: 168-

75.

Sakurai H, Hisada Y, Ueno M, Sugiura M, Kawashima K, Sugita T. Activation of

transcription factor NF-kappa B in experimental glomerulonephritis in rats. Biochim

Biophys Acta. 1996; 1316(2):132-8.

Salomão A, Cristelli MP, Santos A, Pereira JE, Gonçalves A, Pessoa GH.

Projeto-piloto de hemodiálise curta duração: melhora da qualidade de vida de renais

crônicos. J Bras Nefrol. 2002; 24:168-75.

Santos DGd. Caracterização do papel da enzima heme oxigenase I (HO-1) na rota de

apoptose [dissertação]. Porto Alegre (RS): UFRGS; 2007.

Sargent J, Gotch F. Principles and biophysics of dialysis. In: Drukker W, Parsons F,

Maher J. Eds. Replacement of Renal Function by Dialysis. The Hague: Martinues

Nijhoff, 1985:15 - 63.

Sesso RC, Lopes AA, Thomé FS, Lugon JR, Burdmann EA. Brazilian dialysis census,

2009. J Bras Nefrol 2010, 32: 374-378.

Souza V.A, Oliveira D, Mansur N H, Fernandes N.M.S, Bastos M.G: Sarcopenia na

Doença Renal Crônica. J Bras Nefrol. Artigo de Revisão 2015 ; 37(1):98-105.

Steinbrenner H, Sies H. Protection against reactive oxygen species by selenoproteins.

Biochim Biophys Acta. 2009; 1790(11):1478-85.

Teixeira PJM. Stress oxidativo na doença renal crónica. [dissertação]. Faculdade

de Medicina da Universidade do Porto FMUP; 2010.

Tucker PS, Dalbo VJ, Han T, Kingsley MI. Clinical and research markers of

oxidative stress in chronic kidney disease. Biomarkers. 2013; 18(2):103-15

75

Vaziri ND. Roles of oxidative stress and antioxidant therapy in chronic kidney disease

and hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2004; 13(1):93-9

Vegine PM, Fernandes ACP, Torres MRSG Silva MIB, Avesani CM. Avaliação de

méto- dos para identifcar desnutrição energético- -protéica de pacientes em hemodiálise.

J Bras Nefrol. 2011; 33(1):55-61.

Visser R, Dekker FW, Boeschoten EW, StevensP, Krediet RT. Reliability of the 7-Point

Sub- jective Global Assessment Scale in assessing nutritional status of dialysis patients.

Advances in Peritoneal Dialysis, Conference on Peritoneal Dialysis. 1999; 15:222-5.

Watai Y, Kobayashi A, Nagase H, Mizukami M, McEvoy J, Singer JD, et al.

Subcellular localization and cytoplasmic complex status of endogenous Keap1.

Genes Cells. 2007;12(10):1163-78

Zanetti M, Barazzoni R, Gortan Cappellari G, Burekovic I, Bosutti A, Stocca A,

Hemodialysis induces p66(shc) gene expression in nondiabetic humans:

correlations with oxidative stress and systemic inflammation. J.Ren.Nutr.2011;

21(5):401-9

76

10. ANEXOS

ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

77

ANEXO 2: TERMOS DE CONSENTIMENTO

PROJETO: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS FATORES TRANSCRICIONAIS

NRF2 E NFKB EM PACIENTES RENAIS CRÔNICOS, EM HEMODIÁLISE

Estas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste

estudo, que tem como objetivo avaliar a expressão desses fatores transcricionais em

indivíduos que realizam tratamento de hemodiálise.

A nutricionista Najla Elias Farage é a responsável pela pesquisa e coleta de

informações sobre o hábito alimentar e avaliação antropométrica que será realizado

durante o período da pesquisa.

Esta pesquisa tem como principal benefício observar se a expressão celular desses

fatores transcricionais e enzimas antioxidantes sofrem influencia do tratamento de

hemodiálise , relação com complicações clinicas, e se também podem ser associados a

marcadores inflamatórios .

A pesquisa será realizada com a coleta de sangue em 5 tubos antes do indivíduo ser

instalado na máquina de hemodiálise, uma vez somente, ou caso seja necessário repetir

a coleta por motivo de problemas no material não ter sido suficiente.

A qualquer momento voce poderá ter acesso aos resultados parcias da pesquisa, bem

como qualquer outro dado referente a pesquisa , e ao resultado de exames, com a

nutricionista Najla Elias Farage.

Você tem o direito de se retirar da pesquisa em qualquer momento que julgar

necessário sem haver qualquer prejuízo ao seu tratamento.

Esta pesquisa não envolverá qualquer custo ao participante. Todos os dados coletados

serão divulgados em pesquisa no meio científico sem qualquer identificação pessoal.

Somente a equipe de pesquisadores e seu médico terão acesso aos resultados de exames

.

Este documento deverá ser assinado em duas vias, uma que ficará com você, e outra

com o pesquisador.

Eu, .............................................................................................................................,

acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações sobre o estudo

citado, que li ou que foram lidas pra mim.

Eu aceitei perante a pesquisadora Najla Elias Farage sobre a minha participação no

estudo . Ficaram claros os propósitos da pesquisa, e procedimentos realizados. Ficou

claro que minha participação é isenta de despesas. Concordo voluntariamente em

participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento que

julgar necessário, sem que ocorra nenhum prejuízo ao meu tratamento.

............................................................................ data : ........../........./..........

78

ANEXO 3: AVALIAÇÃO SUBJETIVA GLOBAL de 7 pontos

79

ANEXO 4: ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO

NF-B EXPRESSION AND ITS ASSOCIATION WITH NUTRITIONAL

STATUS IN HEMODIALYSIS PATIENTS

Najla Elias Farage1, Milena Barcza Stockler-Pinto

2, Viviane de Oliveira Leal

2, Ludmila

LMF Cardozo2, José Carlos Eduardo-Carraro

3, Denis Fouque

4, Denise Mafra

1,2

1 Medical Sciences Graduate Program, Federal Fluminense University (UFF), Niterói,

RJ, Brazil

2 Cardiovascular Sciences Graduate Program, UFF, Niterói, RJ, Brazil

3 Medicine Faculty, UFF, Niterói, RJ, Brazil

4 Department of Nephrology, Centre Hopitalier Lyon Sud, Pierre-Bénite, France

Corresponding author: Viviane Leal (vivianeoleal@yahoo.com.br)

Programa de Pós-graduação em Ciências Cardiovasculares

Hospital Universitário Antônio Pedro, Universidade Federal Fluminense

Rua Marques do Paraná, 303, 4o andar, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil

ZC: 24033-900

*