UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA ... · Graduação em Odontologia da...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

FILIPE NOBRE CHAVES

ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR

HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES

POTENCIALMENTE MALIGNAS.

FORTALEZA

2013

FILIPE NOBRE CHAVES




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Faculdade de

Farmácia, Odontologia e Enfermagem da

Universidade Federal do Ceará, como um dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre

em Odontologia.

Área de Concentração: Clínica Odontológica

Orientadora: Profa. Dra. Karuza Maria Alves

Pereira

FORTALEZA

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

C438a Chaves, Filipe Nobre.

Análise da marcação imunohistoquímica do fator induzido por hipóxia-1α em carcinoma

epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. / Filipe Nobre Chaves. – 2013.

78 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia

e Enfermagem. Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Fortaleza, 2013.

Área de Concentração: Clínica Odontológica.

Orientação: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira.

1. Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. 2. Neoplasias Bucais. 3. Lesões Pré-

Cancerosas. 4. Carcinoma de células escamosas . I. Título.

CDD 616.99431

FILIPE NOBRE CHAVES




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Odontologia, da Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre em Odontologia.

Aprovada em: 26 de dezembro 2013

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________

Prof. Dr. Karuza Maria Alves Pereira (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC campus Sobral

________________________________________________

Prof. Dr. Fábio Wildson Gurgel Costa

Universidade Federal do Ceará – UFC

__________________________________________________

Profa. Dra. Roberta Barroso Cavalcante

Universidade de Fortaleza - UNIFOR

A Deus e a Nossa Senhora , que tem a cada

dia renovado minha força para vencer os

obstáculos da vida e momentos de cansaço.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Rosangela e Hélder, pela dedicação à nossa família e por

demonstrarem, a cada dia, o valor do trabalho.

À minha noiva Vilminha, que está comigo em todos os desafios, me fortalecendo e

ajudando a vencê-los, além do amor incondicional.

Ao meu irmão, Samir, um verdadeiro amigo e confidente.

Aos meus familiares, por me darem uma base de pedra perante os ventos da vida,

Ao meu amigo Paulim, pela ajuda intelectual, estatística e pessoal durante o desenrolar

do estudo.

À minha orientadora, Professora Karuza, pelos grandes ensinamentos científicos,

pessoais e morais transmitidos. Sou imensamente grato pela sua disponibilidade, palavras de

incentivo e ajuda profissional.

Ao Professor Fábio, ao qual devo grande parte da minha formação profissional e

pessoal. Obrigado pela confiança, oportunidades, além de me dar oportunidade de conhecer

cada vez mais essa grande pessoa que você é, um ser humano impecavelmente inteligente,

simples e acessível, não medindo esforços para transmitir toda a sua sabedoria.

Ao meu “irmão” Samuel, um verdadeiro amigo, pronto para mover montanhas.

À Professora Ana Paula e ao professor Fabrício Bitu, por investir e confiar neste

projeto, bem como pelo nosso trabalho diário, formando um forte vínculo entre Laboratório

de Patologia Bucodental e Universidade Federal do Ceará campus Sobral.

Aos técnicos em anatomia patológica Alceu Machado e Júnior, não apenas pelos

impecáveis cortes histológicos e análise imunohistoquímica, mas especialmente pela

paciência.

À bolsista Sthefane pela ajuda e disponibilidade interminável.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Patologia Bucodental Artur, Clarissa, Thales,

Malena, Carol, Ealber, Mariana, Laryssa, Camila e Erasmo pela amizade, companhia e troca

de experiências.

Aos bolsistas de iniciação científica Khalil, Larissa e Laís. Sem seu esforço esse

trabalho não seria possível. Obrigado por transformar todos os momentos de trabalho de

bancada em instantes de alegria e descontração.

Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFC, Clínica de Métodos

Diagnóstico I e II e ao Laboratório de Patologia Bucodental, por me permitir fazer parte e

ajudar no crescimento e reconhecimento do serviço.

Ao programa REUNI, pela concessão da bolsa de estudos.

A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

FUNCAP, pelo apoio financeiro e por acreditar em nossa pesquisa.

“Importante é ser feliz”

RESUMO

Introdução: Hipóxia constitui em uma característica comum de tumores sólidos, como em

cânceres de cabeça e pescoço, e nessas condições, uma via de sinalização envolvendo um

regulador de resposta a oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) tem-se

destacado, na tentativa de permitir uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do

câncer. Objetivo: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em

lesões potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Métodos:

Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise imuno-

molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos

biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Utilizou-se a técnica

imunohistoquímica da Estreptoavitina-Biotina com o anticorpo HIF-1 (marca Abcam,

diluição 1:200, 60 minutos, recuperação antigênica com citrato pH6 Pascal), analisando 05

campos de cada caso no aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco

campos foi somado e considerou-se como unidade amostral o percentual de células imuno-

positivas para HIF-1α conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade

desta última. Os resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de

Student e ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os

níveis de significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de

HIF-1α em 58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO,

com diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com

marcação nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e

CEO (2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com

imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve

aumento significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada

(p=0.029) e forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da

expressão, nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu

envolvimento em estágios iniciais da carcinogênese oral. Relevância Clínica: Buscar o

entendimento das complexas vias de sinalização, bem como do microambiente tumoral, e

diferentes comportamentos biológicos no câncer oral.

Palavras-chave: Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. Neoplasias Bucais.

Lesões Pré-Cancerosas. Carcinoma de Células Escamosas.

ABSTRACT

Introduction: Hypoxia is a common feature in solid tumors, such as head and neck cancers,

and in these conditions a signaling pathway involving a response regulator oxygen, called

hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) we have highlighted in an attempt to provide a better

understanding of tumor biology of cancer. Objective: To investigate the role of HIF-1 in oral

squamous cell carcinoma and premalignant lesions presenting oral epithelial dysplasia.

Methods : Observational, analytical and cross through the diagnosis and immuno-molecular

analysis of malignant and premalignant lesions. 10 biopsied cases with histopathological

diagnosis of the CEO and DEO 10 cases were included. It was used the technique of

immunohistochemistry Estreptoavitina-Biotin with HIF-1 antibody (Abcam mark, 1:200

dilution, 60 min pH6 citrate antigen retrieval Pascal) analysis of 05 fields each case at 400X

magnification. The number of cells in each of five fields was added and the sample was

considered as a unit the percentage of positive cells immuno-HIF-1α nuclear and cytoplasmic

as well as intensity thereof. The results were obtained and compared between groups by the

Student and multifactor ANOVA followed by Bonferroni post-test t test, based on the

significance levels of 5%. Results: Cytoplasmic expression of HIF-1α was observed in 58.4 ±

6.0% of the epithelial cells of the DEO and 77.8 ± 3.9% of the cells of the CEO, with a

significant difference (p = 0.022). The percentage of cells positive for HIF-1α nuclear staining

also showed significant difference (p = 0.021) between DEO (0.2 ± 0.1%) and CEO (2.4 ±

0.8). There was no significant difference between the percentage of cells with weak positive

immunostaining in the cytoplasm between DEO and CEO (p = 0.337), however, a significant

increase in the percentage of cells with moderate cytoplasm staining (p = 0.029) and strong (p

= 0.031) between DEO and CEO. Conclusion: One increasing the expression, nuclear and

cytoplasmic HIF-1α DEO to CEO was observed, suggesting their involvement in the early

stages of oral carcinogenesis. Clinical Relevance: Seek understanding of the complex

signaling pathways, as well as the tumor microenvironment, and different biological

behaviors in oral cancer.

Keywords : Hypoxia-Inducible Factor-1α, Alpha Subunit. Mouth Neoplasms. Precancerous

Condition. Carcinoma, Squamous Cell.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1 - Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em

ambientes normóxico e hipóxico........................................................... 18

FIGURA 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em

Citoplasma............................................................................................. 43


núcleo..................................................................................................... 44

FIGURA 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente

por HIF-1α em Citoplasma.................................................................... 45


Citoplasma por Gênero.......................................................................... 46

FIGURA 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente

por HIF-1α em Citoplasma por Gênero................................................. 47


Nucleo por Gênero................................................................................. 48

FIGURA 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em

espécimes de displasia epitelial oral (DEO)........................................... 49

FIGURA 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em

espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO)................................. 50

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por

localização topográfica da peça de biópsia............................................ 42

LISTA DE ABREVIATURAS

ARNT

Arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease

bHLH Basic helix-loop-helix

CEO

Carcinoma epidermóide oral

CSC

Células tronco cancerígenas

DEO

Displasia epitelial oral

DNA Ácido desoxirribonucleico

EPO

Eritropoietina

GLUT-1

Transportador de glicose - 1

HIF

Fator induzido por hipóxia

HPV

Papilomavirus Humano

HRE Complexo de resposta a hipóxia

INCA

Instrituto Nacional de Câncer

LPM

Lesões potencialmente malignas

PCNA

Antígeno de proliferação nuclear

pVHL

Proteína supressora tumoral de von Hippel-Lindau

VEGF

Fator de crescimento vascular endotelial

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................ 13

1.1 Fator Induzido por Hipóxia (HIF) 15

2 PROPOSIÇÃO............................................................................................................ 20

2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 20

2.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 20

3 CAPÍTULOS............................................................................................................... 21

3.1 CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido

por Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente

malignas.......................................................................................................................... 22

4 CONCLUSÃO GERAL.............................................................................................. 51

5 REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 52

ANEXOS...................................................................................................................... 56

13

1 INTRODUÇÃO GERAL

Câncer tem sido grande alvo de estudos e investigações científicas por ser uma

importante causa de morbidade e mortalidade em todo mundo, sendo, atualmente,

considerado como a segunda maior causa de morte no mundo, atrás de mortalidades

relacionadas a doenças coronarianas; por isso os fatores relacionados ao câncer apresentam

grande relevância em pesquisas científicas. (SCULLY, 2005). Cânceres orais continuam

sendo uma doença letal para mais de 50% dos casos diagnosticados anualmente e, em grande

parte, isso se deve ao fato de a maioria dos casos serem diagnosticados em estágios avançados

da doença (WARNAKULASURIYA, 2009).

O CEO representa o sexto câncer mais frequente no mundo, abrangendo uma ampla

variação geográfica. Em países de alto risco (Sri Lanka, Índia e Paquistão), câncer oral pode

ser a neoplasia maligna mais comum entre homens e contribuir com até 25% de todos os

novos casos de câncer (WARNAKULASURIYA, 2010). França, Austrália, Hungria,

Espanha, Canadá e Brasil também apresentam altas taxas de incidência de tumores em

cavidade oral (WARNAKULASURIYA, 2009).

De acordo com o Instituto Nacional do Câncer do Brasil (INCA), em previsão para o

ano de 2012, estimou-se 9.990 novos casos de câncer oral em homens e 4.180 em mulheres.

Esses valores correspondem a um risco estimado de 10 novos casos a cada 100 mil homens e

4 a cada 100 mil mulheres, sendo essa predileção pelo sexo masculino observada na maioria

dos países. No Nordeste, excluindo os tumores da pele (não melanoma), o câncer da cavidade

oral é o quarto mais comum entre homens (6 casos/100 mil homens) e oitavo mais comum

entre mulheres (3 casos/100 mil mulheres). No Ceará, estimam-se 430 novos casos para 2012,

estando entre os três estados com maior incidência da região Nordeste, atrás apenas de Bahia

e Pernambuco (INCA, 2012a; INCA, 2012b).

O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) representa aproximadamente 90% das

neoplasias em cavidade oral, apresentando uma etiologia multifatorial. Não há um agente ou

fator causador isolado, claramente definido ou aceito, mas tanto fatores extrínsecos quanto

intrínsecos podem estar associados (SCULLY, 2005). Agentes químicos (fumo e álcool),

físicos (radiação) e infecciosos (vírus oncogênicos) podem alterar a estrutura genética

promovendo múltiplas alterações no genoma celular. O acúmulo dessas alterações genéticas,

incluindo ativação ou supressão de oncogenes e genes supressores tumorais, leva ao

desequilíbrio no ciclo celular, gerando danos ao DNA celular e a perda do controle do ciclo

14

de divisão da célula, favorecendo uma instabilidade genética (NAGPAL, 2003).

Normalmente, o prognóstico do câncer de boca no Brasil é considerado ruim. Embora a

cavidade oral seja facilmente acessível à exploração, o que torna mais fácil a detecção de

lesões incipientes, o diagnóstico do câncer oral, em estágio assintomático é incomum

(NEVILLE et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).

CEO apresenta um prognóstico bastante oneroso, sendo observado severas sequelas

terapêuticas em decorrência dos tratamentos tardios associados a graves comprometime ntos

psíquicos desses pacientes, encorajando pesquisas adicionais sobre fatores que podem

modificar a evolução da doença (MASSANO et al., 2006). Apesar dos grandes avanços e

descobertas, o prognóstico desse tipo de câncer ainda é pobre, com taxa de sobrevida

estimada de 56% em cinco anos (KADEMANI et al., 2005).

Desordens potencialmente malignas também estão associadas a carcinogênese oral,

sendo que CEOs têm sido documentados em associação ou precedidos por uma lesão

potencialmente maligna (LPM). Leucoplasia, eritroplasia, eritroleucoplasia e queilite actínica

são as principais desordens envolvidas no surgimento de lesões malignas intraorais (BARNES

et al., 2005; WARNAKULASURIYA, 2007). Quando o desfecho de um grande número de

lesões potencialmente malignas é revisto, a freqüência de transformação em lesão maligna é

maior do que o risco associado a uma mucosa normal ou não-alterada, ressaltando a

importância do diagnóstico precoce dessas lesões para o correto tratamento e

acompanhamento dessas patologias (WARNAKULASURIYA, 2008).

LPMs podem apresentar alterações morfológicas e citológicas que caracterizam um

quadro histopatológico de displasia epitelial oral (DEO), o qual demonstra um maior

potencial de transformação maligna para CEO quando comparado com o tecido epitelial

normal (WARNAKULASURIYA, 2007; SILVEIRA et al., 2009). Histologicamente, as

células epiteliais malignas invadem a lâmina própria subjacente, organizadas em ninhos,

cordões e/ou lençóis, ou isoladamente. Estas células exibem atipias, tais como: pleomorfismo

celular, aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromatismo nuclear, formação de pérolas

de ceratina, dentre outras (SCULLY, 2005). Assim, o diagnóstico histopatológico de DEO é

considerado um importante indicativo de transformação para CEO (BARNES et al., 2005;

BRENNAN et al., 2007; WARNAKULASURIYA, 2007).

Carcinoma epidermóide evolui a partir de um complexo processo resultante da

exposição a agentes carcinogênicos e inclui várias etapas constituídas de mudanças genéticas,

epigenéticas e metabólicas. Exposição crônica a esses agentes levam a instabilidade genética

15

nas células epiteliais da mucosa oral, desenvolvimento de lesões potencialmente malignas e,

posteriormente, ao carcinoma invasivo. Muitos estudos tem revelado o importante papel

desempenhado por proto-oncogenes e genes supressores tumorais durante o curso de evolução

do câncer oral (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012).

Anormalidades afetando proteínas relacionadas à proliferação celular, angiogênese e

metástase também tem sido reportadas e relacionadas com o prognóstico do tumor

(BRINKMAN; WONG 2006; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012).

Na prática clínica, o planejamento do tratamento e avaliação do prognóstico para CEO é

principalmente baseado no estadiamento tumoral (sistema TNM). No entanto, essa

classificação fornece informações limitadas sobre a resposta do tratamento à agressividade

biológica e prognóstico (HEO et al., 2012). Portanto, novos marcadores moleculares que

buscam prever o prognóstico e a agressividade tumoral devem ser estudados de forma

individualizada, procurando estabelecer e definir prognóstico e, assim, buscar alternativas ao

tratamento do câncer oral.

Esforços tem sido direcionados tanto à descoberta de proteínas e moléculas que

funcionam como alvos terapêuticos quanto ao melhor entendimento das vias de sinalização

moleculares funcionantes durante a inicialização e progressão tumoral. Estudos recentes

evidenciam novos achados sobre câncer de cabeça e pescoço, conduzindo a uma melhor

compreensão das características biológicas desses tumores, bem como fornecendo mais

opções de tratamento, como novos agentes terapêuticos dirigidos contra múltiplos alvos

moleculares (HADDAD et al., 2008). Nesse contexto uma das vias que já vem sendo

estudada, inclusive para o CEO, é do Fator Induzido por Hipóxia.

1.1 Fator Induzido por Hipóxia (HIF)

O comportamento biológico das neoplasias malignas, incluindo o CEO, é complexo,

pois o crescimento e a disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular

neoplásica, mas também das respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para

tal, que uma variedade de interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o

sistema imune e o tecido conjuntivo (NAGPAL, 2003). Mais recentemente, tem-se destacado

o estudo sobre o metabolismo enérgico das células tumorais, buscando uma melhor

compreensão sobre a biologia tumoral do câncer (MORENO-SÁNCHEZ et al., 2007).

A carcinogênese oral é um processo complexo e vários genes podem estar alterados. A

16

evolução e progressão do carcinoma oral são promovidas por múltiplas alterações celulares e

moleculares no epitélio oral. Proteínas geneticamente alteradas podem exercer efeitos

importantes nas neoplasias malignas. Mais recentemente, têm-se destacado as proteínas do

metabolismo celular (STRYER, TYMOCZO, JEREMY 2004; DEMASI et al., 2010).

Hipóxia é uma situação comum nos cânceres, importante nos tumores localmente

agressivos, pois com o crescimento tumoral, a lesão rapidamente ultrapassa sua

vascularização, gerando déficit de nutrientes e oxigênio, principalmente em tumores sólidos.

Lembrando que todas as células do nosso organismo necessitam de oxigênio para exercer sua

função metabólica normal, incluindo a fosforilação oxidativa, a capacidade das células

cancerosas de adaptação à hipóxia, transitória ou extensa, é essencial para a sobrevivência

tumoral (BRAHIMI-HORN; POUYSSÉGUR 2006; RYU et al., 2010; PEREZ-SAYANS et

al., 2011; OLIVEIRA; RIBEIRO-SILVA, 2011). CEO é caracteristicamente uma neoplasia

localmente agressiva com rápida progressão; nesses tumores, a concentração de oxigênio (O2)

é significantemente reduzida. Sugere-se que o caráter invasivo e metastático do CEO esteja

relacionado a uma consequência de sua adaptação ao microambiente hipóxico (RYU et al.,

2010; ECKERT et al., 2011; PEREIRA et al., 2013).

Resposta celular aos níveis de oxigênio é monitorada, em parte, pela atividade

transcricional dos fatores induzidos por hipóxia. Nessas condições, uma via de sinalização

envolvendo um regulador da resposta ao oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia

(HIF), é ativada (BRAHIMI-HORN et al., 2006; HEDDLESTON et al., 2010; SUN et al.,

2012). HIF é um fator de transcrição que, em hipóxia, coordena a indução e repressão de

vários genes que controlam múltiplas funções celulares tais como angiogênese, metabolismo,

invasão/metástase e apoptose/sobrevida celular (BRAHIMI-HORN et al., 2006). O HIF-1 é

um fator transcricional que exerce um papel essencial na resposta adaptativa das células em

meio à baixa concentração de oxigênio (BRENNAN et al., 2005). Em alguns cânceres, a

superexpressão de HIF-1 é associada ao aumento da mortalidade (BRENNAN et al., 2005,

ECKERT et al., 2011). Recentemente descoberto, o complexo molecular do HIF-1 consiste

em uma base, hélice-alça-hélice-PAS, heterodímera composta de duas subunidades, uma alfa

(α) e beta (β), a subunidade α não é constitutiva e é sensível ao oxigênio, já a subunidade β,

também chamada de ARNT (arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease), é expressa

constitutivamente na célula, expressando uma proteína de 91–94 kDa. O gene que codifica

HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) e sob hipóxia, o núcleo celular gera

uma resposta por meio da mensagem transmitida por HIF-1α (BRENNAN et al., 2005;

17

ECKERT et al., 2012; PEREIRA et al., 2013).

O Fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1 α) é um fator de transcrição que exerce um

papel na homeostase celular em resposta a hipóxia, desempenhando papel relevante na

carcinogênese (HEDDLESTON et al., 2010; KEITH, B. et al., 2011; SUN et al., 2012;

PEREIRA et al., 2013), através da sobre regulação de mais de 100 genes envolvidos na

adaptação tumoral como no transporte glicolítico, alterando o microambiente tumoral,

estabilização de pH, angiogênese e agindo sobre células-troncos cancerígenas (ECKERT et

al., 2012; PEREIRA et al., 2013). Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como

fator de crescimento endotelial), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da

proteína ras podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do

gene supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da

VEGF e EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais,

resultando na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e

crescimento tumoral. Assim expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão câncer bucal

através da promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula

tumoral (LIN et al., 2008; PEREIRA et al., 2013).

Normalmente, em células bem oxigenadas, a molécula de HIF-1α é hidroxilada através

da enzima prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e de prolina 564 (Pro-564)

(ECKERT et al., 2012). Após hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a uma proteína

supressora tumoral de von Hippel-Lindau (pVHL), que promove a degradação e eliminação

do fator através da complexo enzimático ligase E3-ubiquitina (SEMENZA et al., 2010;

PEREIRA et al., 2013). Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de

inibição do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e

consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP (PEREIRA et al.,

2013) (Figura 1).

18

Figura 1: Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em ambientes normóxico e hipóxico.

PHD, domín io hidroxilase prolil; PRO 402, prolina 402; pVHL, von Hippel -Lindau supressor de tumor; E3UB,

E3 ubiqu itina ligase; HRE, elemento de resposta a hipóxia; CA IX, an idrase carbônica IX; VEGF, fator de

crescimento endotelial vascular; PDGF-β , derivado de plaquetas growth factor-β; GLUT 1, transportador de

glicose 1; CSC, de células-tronco do câncer.

Fonte: (PEREIRA et al., 2013).

Os HIFs também têm a atividade basal aumentada no compartimento neoplásico.

Porém, esse nível de reforço da atividade transcricional ainda não é completamente entendido.

O fluxo de tensão de oxigênio utilizado pelas células neoplásicas é consequência de algumas

características do meio tumoral, como vascularidade, difusão do oxigênio deficiente em

virtude da expansão tumoral e fluxo sanguíneo irregular. Tem sido descrito, também que ciclo

constante de hipóxia no tumor permite o reforço do potencial metastático e atividade

transcricional do HIF (HEDDLESTON et al., 2010; PEREIRA et al., 2013).

Uma variedade de alterações genéticas no interior das células tumorais podem ocorrer

sob condições de hipoxia celular. Essas alterações podem ajudar a células tumorais a

sobreviverem em um microambiente hipóxico através do aumento da indução ou estabilização

do HIF-1α, que é um importante ativador da transcrição de um grande número de genes (KIN

19

et al., 2007; PEREIRA et al., 2013).

Observa-se que o oxigênio é uma molécula essencial para muitos processos biológicos,

como metabolismo, proliferação e sobrevida celular. Hipóxia também está associada com

resistência a radioterapia e quimioterapia, e também contribui para manutenção das células-

troncos cancerígenas, bem como promove o estado indiferenciado destas (HEDDLESTON et

al., 2010; SUN et al., 2012). Células neoplásicas necessitam e fazem uso da sensibilidade ao

oxigênio das proteínas induzidas por hipóxia, representadas pelo HIF, que também mostra

uma atividade basal aumentada no compartimento neoplásico. Porém, esse nível de reforço da

atividade transcricional ainda não é completamente entendido.

Considerando o papel da hipóxia na progressão tumoral e a escassez de estudos

utilizando esses marcadores para estes eventos biológicos em DEO e CEO, o propósito desse

estudo foi analisar a imunoexpressão do HIF-1α em casos de DOE e CEO, visando contribuir

para o entendimento do comportamento biológico do câncer oral, além da busca por

marcadores de prognóstico para esta neoplasia.

20

2 PROPOSIÇÃO

2.1 Objetivo Geral

Analisar a participação do fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1α) em casos de

carcinomas epidermóides orais, bem como em lesões potencialmente malignas associadas a

displasia epitelial oral.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em carcinomas

epidermóides orais;

Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em displasias epiteliais

orais;

Comparar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α entre os casos de

displasias epiteliais orais e carcinoma epidermóide oral;

Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α segundo sexo, idade e localização;

Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α com classificação histopatológica das

displasias epiteliais.

21

3 CAPÍTULO

Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará, que regulamenta o formato

alternativo para dissertações de Mestrado e teses de Doutorado, e permite a inserção de

artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato (Anexo A).

O projeto de pesquisa foi submetido a apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica da

Universidade Federal do Ceará sob o número do parecer 137.019, sendo aprovado em

01/11/12 sob o CAAE: 06720312.3.0000.5054 (Anexo B).

O participante da pesquisa é convidado como voluntário e esclarecido sobre as

informações dos dados e objeto de estudo do referido projeto. Em caso de aceite, é assinado o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo C), que está em duas vias. Uma delas

será entregue ao pesquisado e a outra pertence ao pesquisador responsável. Foi ressaltado que

em caso de recusa não haverá penalizações nem alteração no plano de tratamento. Foi

também fornecido o telefone, para dúvidas, do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Federal do Ceará pelo telefone.

Assim sendo, esta dissertação é composta por um capítulo contendo um artigo

científico que será submetido para publicação no periódico “Oral Oncology” (Anexo D),

conforme descrito abaixo:

Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell

carcinoma and potentially malignant lesions.

Chaves FN, Alves KMA.

22

3.1 CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido por

Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. Este

artigo seguiu as normas de publicação do periódico Oral Oncology (ISSN 1368-8375)

Autores:

Filipe Nobre Chaves

Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia

Posição: Estudante de Mestrado em Odontologia

Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Diagnóstico Oral,

Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil.

Karuza Maria Alves Pereira

Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia, Mestre em Patologia Oral; Doutora em Patologia

Oral

Posição: Professora Adjunta II da Universidade Federal do Ceará- Campus Sobral

Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Patologia Oral,

Universidade Federal do Ceará campus Sobral, Sobral, Brasil.

Autor de Correspondência: Filipe Nobre Chaves

Endereço: Rua Ministro Joaquim Bastos, Fátima – Fortaleza, Ceará, Brasil. CEP: 60415-040

Telefone Residencial: 55-85-9922-1498

E-mail: [email protected]

23

Title page

Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell

carcinoma and potentially malignant lesions.

Filipe Nobre Chaves DDSa*; Karuza Maria Alves Pereira DDS, MSc, PhDb

aPostgraduate Student, School of Dentistry, Department of Clinical Dentistry, Federal University of

Ceará, Fortaleza, Brazil.

bAdjunct Professor, Division of Oral Pathology, School of Dentistry, Federal University of Ceará –

campus Sobral, Sobral, Brazil

Competing interests: None declared

Funding: None

*Corresponding author.: Filipe Nobre Chaves

Rua Alexandre Barauna, 949, Rodolfo Teofilo, 60430-160, Fortaleza, Ceara, Brazil. Federal

University of Ceará, Department of Dental Clinic, School of Dentistry. Phone/Fax: +55 85

3366 8232. E-mail address: [email protected]

24

RESUMO

Objetivos: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em lesões

potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Materiais e

Métodos: Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise

imuno-molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos

biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Realizou estudo

imunohistoquímico com anticorpo anti-HIF-1α, analisando 05 campos de cada caso no

aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco campos foi somado e

considerou-se como unidade amostral o percentual de células imuno-positivas para HIF-1α

conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última. Os

resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de Student e

ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os níveis de

significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de HIF-1α em

58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO, com

diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com marcação

nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e CEO

(2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação

positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve aumento

significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada (p=0.029) e

forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da expressão,

nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu envolvimento em

estágios iniciais da carcinogênese oral.

Palavras-chave: fator induzido por hipóxia-1α, câncer oral, lesões pré-cancerosas, carcinoma

de células escamosas

25

INTRODUÇÃO

O comportamento biológico das neoplasias malignas é complexo, pois o crescimento e a

disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular neoplásica, mas também das

respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para tal, que uma variedade de

interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o sistema imune e o tecido

conjuntivo [1]. Mais recentemente, tem-se destacado o estudo sobre o metabolismo enérgico

das células tumorais, buscando uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do câncer

[2].

Hipóxia focal é encontrada na maioria dos tumores sólidos, devido às alterações

quantitativas e qualitativas na vasculatura do tumor, que promovem a uma redução local da

disponibilidade de oxigênio. Isso constitui uma característica comum de tumores sólidos em

câncer de cabeça e pescoço e outros tipos de câncer. Esse meio hipóxico é relevante em

tumores localmente agressivos, que apresentam rápido crescimento tumoral que geralmente

não são acompanhados pela vascularização ou neoformação vascular e, frequentemente, as

células tumorais necessitam de suplementação de nutrientes e oxigênio para realizar seu

metabolismo normal [3,4]. Essa baixa concentração de oxigênio estimula uma cascata de vias

moleculares, resultando em angiogênese, glicólise e mudanças no ciclo celular. Nestas

condições, uma via de sinalização envolvendo um regulador de resposta a oxigênio, chamado

de Fator Induzido por Hipóxia (HIF), é ativada [3,5,6].

O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel

essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio [3,6].

Quando ativado, HIF-1 pode induzir a transcrição de mais de 60 genes, como uma tentativa

de evitar a morte celular pela hipóxia tumoral, importantes na proliferação celular e para a

carcinogênese [4]. A expressão de HIF-1α pode, portanto, fornecer informações valiosas para

informar a escolha do tratamento ou para avaliar o p rognóstico [6], sendo considerado um

26

marcador de prognóstico tumoral para CEOs [7].

Diante da escassez de estudos evidenciando o papel do HIF-1 na biologia tumoral do

câncer de boca, o presente estudo busca analisar a participação do HIF-1α em Carcinomas

Epidermóides Orais, bem como em Lesões Potencialmente Malignas que apresentam graus

histopatológicas com característica de Displasias Epiteliais Orais, visando contribuir para o

melhor entendimento da carcinogênese oral.

MATERIAIS E MÉTODOS

O presente trabalho consistiu em um estudo observacional e prospectivo, analítico e

transversal, através do diagnóstico e análise imuno-molecular de lesões malignas e

potencialmente malignas. A população do estudo envolveu todos os espécimes cirúrgicos

oriundos de lesões malignas (carcinomas epidermóides orais) e potencialmente malignas (que

apresentem graus histopatológicos de displasias epiteliais) de pacientes atendidos no

Ambulatório de Estomatologia / Métodos de Diagnóstico da Universidade Federal do Ceará -

Campus Sobral durante o período de dezembro de 2012 a dezembro de 2013.

Foram incluídos casos biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e DEO,

cujo os espécimes tenham quantidade suficiente de material disponível nos blocos de parafina

para análises morfológica e imunohistoquímica. Foram excluídos da amostra os casos que

apresentaram quantidade insuficiente de material emblocado em parafina para estudo

morfológico e amostras com material insuficiente para realização da análise

imunohistoquímica. Os casos em que os pacientes não permitiram a realização da pesquisa,

bem como pacientes sem autorização do responsável também não foram incluídos na

pesquisa. A amostra foi dimensionada para proporcionar um poder de 80% e uma confiança

de 95% para detectar diferença imunohistoquímica (expressão dos marcadores estudados)

relevante entre os grupos de pacientes com lesões bucais.

27

Dados prévios [7], [8], [9] e [10] foram utilizados, e para que tais requisitos sejam

satisfeitos, o tamanho da amostra foi calculado em 10 casos de CEO e 10 casos de DEO. A

esse valor, já foi avaliado 20% para suprir eventuais perdas, de modo que o tamanho final da

amostra foi estimado em 20 pacientes. Amostra pode ser elevada em virtudo do número de

casos observdaos na população do ESTUDO (do período já mencionado - 12/11 a 12/13)

Essa pesquisa foi submetida à apreciação e aprovada pelo Comitê de Ética em

Pesquisa Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica

da Universidade Federal do Ceará.

Análise Imunohistoquímica

Parte do tecido coletado emblocado em parafina foi utilizado para a confecção de

lâminas, referentes aos casos selecionados. Estas foram avaliadas à microscopia de luz através

de cortes histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica de Hematoxilina/Eosina

(H/E), para o diagnóstico histopatológico e imuno-histoquímico. Após a confirmação

diagnóstica, os espécimes foram novamente submetidos a cortes 5 μm de espessura e

montados em lâminas de vidro previamente preparadas com adesivo à base de organosilano

(3- aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co®, St Louis, MO, USA).

Os cortes foram submetidos ao anticorpo anti HIF-1α pela técnica imunohistoquímica

da estreptoavidina-biotina (Labeled StreptAvidin Biotin – LSAB). Esta consistiu

resumidamente nos seguintes passos: as secções passaram por dois banhos em xilol, durante

dez minutos cada. Em seguida, foram imersas em três passagens de álcool absoluto, sendo

posteriormente lavadas em água corrente e, logo após, uma passagem em água destilada. A

recuperação antigênica foi realizada com citrato pH 6.0, por 30 minutos a 99oC. À

temperatura ambiente, as secções foram mergulhadas em uma solução de bloqueio de

peróxido de hidrogênio a 3% durante 10 minutos. Em seguida, realizou-se a incubação com o

anticorpo monoclonal de coelho anti HIF-1 alpha (clone EP1215Y, Abcam®, Cambridge,

28

MA, USA) por 60 minutos à Temperatura Ambiente (TA), na diluição de 1:200, e,

posteriormente, lavadas com solução de tampão fosfato-salino, PBS (phosphate buffered

saline).

As amostras foram incubadas com o anticorpo secundário LSAB Kit (DAKO®,

Carpinteria, CA, USA) por 10 minutos à TA. Em seguida, foi feita a incubação em solução

cromógena preparada com DAB, durante 10 minutos em câmara escura (DAKO®,

Carpinteria, CA, USA). Posteriormente, os espécimes foram lavados em água corrente e, em

seguida, com água destilada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina e depois

foram desidratados em álcool e diafanizadas em xilol.

Por fim, foi realizado a montagem em lâminas de vidro, as quais foram examinadas

em microscópio óptico NIKON® Eclipse E200. Como controle positivo, utilizaram-se

carcinomas de fígado e pulmão, paralelamente ao controle interno por linfócitos,

paralelamente às secções incubadas, foi realizado o controle negativo, excluindo-se a

aplicação do anticorpo primário.

Análise do padrão de marcação imunohistoquímica e de marcação quantitativa

O parâmetro de positividade da marcação imunohistoquímica do antígeno em todos os

espécimes incluídos na amostra consistiu nas células que exibiram coloração acastanhada em

núcleo ou citoplasma, independentemente da intensidade da imunomarcação. Foram

selecionados aleatoriamente cinco campos, no aumento de 400x, visualizando-se através do

microscópio óptico supracitado, e fotografados em câmera digital SONY® Cyber-shot DSC-

H10 de 8,1 megapixeis, com zoom óptico 10x em máxima resolução.

A análise quantitativa da expressão do anticorpo HIF-1α foi realizada através da

contagem do número de células imunomarcadas. Essa contagem, em valores absolutos, foi

realizada em células imunomarcadas dos casos de lesões potencialmente malignas que

apresentavam microscopicamente graus de displasias epiteliais oral e nos casos de carcinomas

29

por um único observador, previamente calibrado, em momentos distintos, através do

programa Image J (Image and Processing Analysis in Java – Rasband, W.S., ImageJ, National

Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2004).

Na avaliação da qualidade de imunomarcação, foram atribuídos escores de acordo

com o padrão de marcação imuno-histoquímico positivo, sendo o valor atribuído de acordo

com a razão média entre a quantidade de células imunopositivas sobre o total de células

contadas, modificado de [11], na qual a intensidade da imunomarcação foi descrita e dividida

em: fraca imunomarcação (1), moderada (2) e intensa imunomarcação (3).

O número de células em cada um dos cinco microcampos foi somado e considerou-se

como unidade amostral o percentual de células imunopositivas para HIF-1α conforme

marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última.

Análise estatística

Os dados categóricos (sexo) foram analisados por meio do teste Exato de Fisher e os

dados quantitativos foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov,

expressos em forma de média ± erro-padrão da média (dados paramétricos) e comparados

entre grupos por meio dos testes t de Student e ANOVA multifatorial seguido do pós-teste de

Bonferroni.

Adotou-se índice de significância p < 0.05 para todas as avaliações, realizadas no

software GraphPad Prism versão 5.0 para Windows®.

RESULTADOS

Um total de 20 casos foi obtido neste estudo, sendo 10 amostras de CEO e 10

amostras de displasias. Destes, 11 eram homens e 9 mulheres; igualmente distribuídos em

ambos os grupos (DEO: 5 homens e 5 mulheres / CEO: 6 homens e 4 mulheres) (p=1.000). A

30

média de idade geral foi de 63.1±2.8 anos, sem diferença significante entre os dois grupos de

estudo (DEO: 61.7±4.0 e CEO: 64.9±3.9 anos, p=0.585).

Com relação ao perfil de imuno-marcação para HIF-1α, pôde-se observar que

58.4±6.0% das células epiteliais das displasias e 77.8±3.9% das células dos CEO avaliados

mostraram imuno-marcação citoplasmática positiva, com diferença significante entre os dois

grupos de estudo (p=0.022) (Figura 2). O percentual de células positivas para HIF-1α com

marcação nuclear também mostrou diferença significante entre os grupos de DEO (0.2±0.1%)

e CEO (2.4±0.8) (p=0.021) (Figura 3).

Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação

positiva fraca em citoplasma entre DEO (34.5±2.1%) e os CEOs (30.5±3.6%) (p=0.337); no

entanto, houve aumento significante no percentual de células marcadas com intensidade

moderada no CEO (31.5±3.8%) em relação às displasias (17.7±4.2%) (p=0.029), bem como

com intensidade forte (17.3±4.6% e 5.4±2.3%, respectivamente) (p=0.031) (Figura 4).

O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação

com os sexos masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e feminino (DEO: 54.7±8.1

e CEO: 76.5%) (p=0.350) (Figura 5). Quanto ao sexo, o percentual de imunomarcação

citoplasmática fraca no sexo masculino (DEO: 35.6±3.8 e CEO: 23.3±4.0%) e no sexo

feminino (DEO: 33.5±2.2% e CEO: 35.2±4.5%) não apresentaram diferenças significatica

(p=0.093). Da mesma forma, o sexo não influenciou de forma significante o percentual de

imunomarcação citoplasmática moderada, onde o sexo masculino DEO: 20.4±6.7 e CEO:

26.3±7.6%) apresentou imunomarcação sem diferença significativa em relação ao sexo

feminino (DEO: 15.0±5.7 e CEO: 31.6±4.8%) (p=0.398). O perfil de percentual de células

com imunomarcação citoplasmática forte também não mostrou diferença entre DEO e CEO

mediante análise do sexo (p=0.415), sendo que o homens apresentaram uma imunoexpressão

de 8.4±3.8% e 20.0±8.4%, em displasias e carcinomas respectivamente, e as mulheres

31

apresentaram uma imunomarcação de 6.2±4.0% e 9.7±4.2% em displasias e carcinomas

respectivamente (Figura 6).

Por outro lado, o percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens

mostrou aumento significante nos CEO (5.5±1.6%) em relação às DEO (0.1±0.1%) quando

comparado ao aumento da imunomarcação nuclear nos CEO (1.2±0.5%) em relação às

displasias (0.2±0.2%) de mulheres (p=0.003) (Figura 7).

Com relação ao perfil de imunomarcação mediante localização topográfica, os dados

se encontram dispostos na Tabela 1.

DISCUSSÃO

O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel

essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio.

Consiste em um complexo heterodimérico de transcrição que funciona como um regulador-

mestre da homeostase de oxigênio e é passível de sofrer mudanças conformacionais em

resposta a diferentes concentrações de oxigênio [3,6,12].

O complexo transcricional HIF-1 consiste em duas subunidades, a subunidades α e β,

que dimerizam para formar o complexo HIF-1. A subunidade HIF-1β, também conhecida

como aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ou ARNT, é expressa

constitutivamente e está presente no núcleo celular. Já a subunidade HIF-1α, presente no

citoplasma celular, é sensível ao oxigênio e têm como função o transporte da mensagem de

hipóxia ao núcleo celular promovendo a geração de uma resposta celular ao meio de baixa

concentração de oxigênio [5,12,13,14]. Ambas subunidades α e β consistem em uma base

helix- loop-helix (bHLH) e PER-ARNT-SIM (PAS) de domínio, como bHLH e PAS,

contendo factores de transcrição que mediam a ligação de DNA e a dimerização. O gene que

codifica HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) [12,13].

32

Normalmente em células bem oxigenadas, HIF-1α é hidroxilada através da enzima

prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e prolina 564 (Pro-564) [12,14]. Após

hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a proteína supressora tumoral, o ligante von

Hippel-Lindau (pVHL), que promove sua degradação através do complexo enzimático da E3-

ubiquitina [12,15]. Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de inibição

do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e

consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP [14].

Em resposta à hipóxia tumoral, HIF-1α é ativado e translocado para o núcleo celular,

onde dimeriza com HIF-β, recrutas co-ativadores p300/CBP e induz a expressão dos seus

alvos transcricionais através da ligação a elementos que formam um complexo de resposta a

hipóxia (HRE), que estão presentes no promotor ou regiões potenciadoras do HIF-1 genes

alvo [12,13,16].

O papel do HIF-1α na cacinogênese se dá pelo transporte da mensagem de hipóxia ao

núcleo celular, que promove uma resposta ao estresse hipóxico ao atuar no controle de mais

de 100 genes envolvidos na adaptação tumoral, como o transporte glicolítico e relacionados à

alteração do microambiente tumoral, por meio da ação na estabilização de pH e angiogênese

[12,17,18,19].

A expressão/superexpressão de HIF-1α é comumente encontrada numa variedade de

neoplasias malignas, incluindo várias neoplasias extra-gnáticas, como no carcinoma renal

[20], de bexiga [21], em trato digestivo [22], câncer de mama [23], em ovário [24], do

endométrio [25], do colo do útero [26], e em câncer de cabeça e pescoço [27]. Assim, o HIF-

1α pode consistir em um biomarcador de certos tipos de malignidades humanas e pode

desempenhar um papel importante na carcinogênese humana.

Eckert et al. [7] estudaram o HIF-1α e o Transportador de Glicose-1 (GLUT-1) em

carcinomas epidermóides, através da imunohistoquímica, na qual evidenciaram elevada

33

expressão dessas proteínas, além de sugerirem que uma superexpressão de HIF-1 possa estar

associada a um pior prognóstico, implicando que HIF-1 possa ser utilizada como marcador de

prognóstico tumoral.

A análise imunohistoquímica do presente estudo demonstrou imunomarcação de HIF-

1α em todos os casos de CEO e de DEO, condizente com alguns trabalhos que obtiveram

100% de expressão positiva em todos os casos de CEO analisados, como no estudo de [17] e

[28], e diferindo do trabalho de [7] no qual não foi observada imunomarcação em 13,4% dos

espécimes, mesmo assim, ainda persistindo em uma porcentagem significante dos casos,

indicando que o HIF-1α está envolvido no processo da carcinogênese.

A imunoexpressão de HIF-1α em CEO foi de 77.8%, um valor próximo ao encontrado

em estudos semelhantes, como o estudo de [7] (86,6%) e [8] (63,5%). Já a Imunoexpressão de

HIF-1α em DEO foi de 58.4%, valor próximo ao de [17], onde 67% das células apresentaram

imunomarcação. Ressaltamos que poucos estudos, apenas o estudo de [17], avaliam a

expressão de HIF-1α em DEO e CEO, dificultando a comparação entre os dados.

O presente estudo apresenta uma análise diferente da expressão de HIF-1α, na qual a

imunoexpressão é observada quantitativamente e qualitativamente no citoplasma e no núcleo

célular. Na literatura, encontramos trabalhos com metodologias diferentes, como o trabalho de

Eckert et al. [7] que avaliou apenas a imunomarcação citoplasmática, enquanto Lin et al. [17]

considerou apenas a contagem da imunomarcação nuclear. Dessa forma, este estudo procura

fornecer mais informações sobre a participação do HIF-1α nos estágios iniciais da progressão

tumoral.

São escassos na literatura os trabalhos que comparam e avaliam a expressão

imunohistoquímica de HIF-1α em carcinomas e displasias epiteliais orais, contudo, a grande

maioria dos trabalhos mostram fortes evidências de que carcinomas apresentam uma

imunomarcação mais intensa, principalmente marcação nuclear, quando comparado com

34

displasias [7,8,17]. Neste estudo, os resultados seguiram o que a literatura relata, sendo

evidenciada uma maior imunoexpressão nuclear e citoplasmática (moderada a forte) de HIF-

1α em carcinomas, quando comparados a displasias.

Quanto à expressão nuclear do HIF-1α, o presente estudo observou diferença

significativa na imunoexpressao entre CEO e DEO (p=0.021), sendo observado um aumento

gradual e significativo na expressão nuclear de HIF-1α de DEO para CEO, corroborando com

o estudo de Lin et al. [17], que encontrou imunoexpressão nuclear significativamente

diferente entre DEO severa e DEO moderada com CEO. Esse significativo aumento da

expressão de nuclear displasias para carcinomas sugere que o HIF-1α tenha papel importante

em eventos precoces da carcinogênese oral [17]. Contudo, a porcentagem de células com

expressão nuclear de HIF-1α foi bem pequena, apenas 2.4±0.8% dos carcinomas e raros casos

de displasias (0.2±0.1%), mas corroboram com o trabalho de Koukourakis et al. [29], que

também observou uma marcação nuclear em 6% dos casos.

Em DEO, a imunomarcação de HIF-1α não se restringiu ao terço médio do epitélio, mas

também está presente na camada basal e superficia l do epitélio (Figura 8). A expressão

nuclear de HIF-1α em amostras de CEO mostrou-se focal ou difusa. Quando focal, a

imunomarcação nuclear concentrou-se em áreas circundantes de regiões necróticas, em

células tumorais com elevada produção de ceratina e na borda infiltrante tumoral (Figura 9).

Essa imunoexpressão de HIF-1α foi mais forte em células adjacentes a áreas de necrose das

células tumorais e sugerem a presença de tecido neoplásico induzido por HIF-1α em

carcinomas [7].

É destacado que imunoexpressão, principalmente uma forte imunomarcação, de HIF-1α

pode estar associado a progressão tumoral, através do estímulo à angiogênese e à estimulação

direta de células cancerígenas [17]. Isso porque essa superexpressão é observada sob

condições em que as células necessitam de capacitação de energia para seu crescimento e

35

proliferação [7,8].

Ressalta-se neste estudo uma diferença significativa (p=0.003) de imunomarcação

nuclear de HIF-1α em carcinomas quanto ao sexo, onde o sexo masculino apresentou uma

imunomarcação significativamente maior quando comparado ao sexo feminino,

possivelmente em virtude da maior incidência de CEO e de fatores de risco associados a esse

grupo.

Na atual pesquisa, imunomarcação citoplasmática foi diferente entre CEO e DEO, onde

foi observado um maior expressão de HIF-1α em carcinomas, semelhantes ao trabalho de

Eckert et al. [7]. No presente estudo foram observados que em 77.8±3.9% das células dos

CEO apresentavam imuno-marcação citoplasmática positiva, corroborando com Fillies et al.

[8], na qual níveis detectáveis de HIF-1α foram encontrados em 63,5%.

No presente estudo, a imunoexpressão citoplasmática do HIF-1α foi significativamente

diferente entre CEO e DEO (p=0.022). Em CEO a imunoexpressão citoplasmática foi de

77,8%, corroborando com o estudo de Eckert et al. (2011) onde apresentou 86,6% marcação

citoplasmática, bem maior que observado no estudo de Koukourakis et al. [29], onde 36% das

células tiveram expressão positiva, e de Fillies et al. [8], onde 15,5% das células

apresentavam marcação citoplasmática em CEOs.

Foi observado um aumento significativo de imunomarcação citoplasmática moderada

(p=0.029) e forte (p=0.031) em carcinomas, quando comparados às displasias. Koukourakis et

al. [29] relataram que uma forte imunomarcação citoplasmática é um achado tumoral

específico e que reflete a regulação das vias de sinalização do HIF. Eckert et al. [7]

observaram que a expressão de HIF-1α foi significativamente correlacionada com a taxa de

sobrevida, pacientes cujos tumores demonstraram uma alta expressão citoplasmática de HIF-

1α apresentaram uma taxa de sobrevida bem menor quando comparados com imunomarcação

fraca.

36

Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como fator de crescimento

endotelial - VEGF), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da proteína ras

podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do gene

supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da VEGF e

EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais, resultando

na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e crescimento

tumoral. Assim, expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão do câncer bucal através da

promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula tumoral [17].

A expressão de HIF-1α exerce efeito significativo na progressão tumora l, e pacientes

com elevada expressão de HIF-1α apresentaram uma taxa de sobrevida 3,49 vezes menor

quando comparada a neoplasias orais com pouca expressão dessa proteína [18]. Beasley et al.

[30] e Fillies et al. [8] propuseram a forte expressão do HIF-1α como um marcador

independente para taxa de sobrevida em pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço de

células escamosas. Santos et al. [4] sugerem a utilização da expressão da proteína HIF-1α

como um marcador tumoral de carcinoma de células escamosas para avaliar melhor as opções

terapêuticas à mão, especialmente na decisão do tratamento radioterápico pós-operatório e ao

estabelecimento de um correto prognóstico afim de evitar recidivas e necessidades de novas

intervenções terapêuticas.

Adicionalmente, no presente estudo, DEO apresentaram uma rara, mas presente,

marcação nuclear, além de elevada imunoexpressão citoplasmática de HIF-1α. Esses achados

podem refletir o envolvimento da HIF-1 nos estágios iniciais da carcinogênese [7,8,17]. De

acordo com o alto índice de marcação observado no CEO e em DEO, acredita-se que a

expressão do HIF-1 possa ser um determinante para o fenótipo tumoral e, portanto, sugere-se

que seja um indício de fenótipo maligno com maior potencial de agressividade [7].

Lin et al. [17] analisaram a expressão do HIF-1α em carcinomas epidermóides e

37

displasias epiteliais orais e observaram que os casos mais agressivos de CEO tiveram maior

expressão do HIF-1α, com correlação significativa entre a elevada expressão nuclear dessa

proteína com o tamanho do tumor e metástase para linfonodos regionais. Além disso, a

imunoexpressão aumentava entre os casos de displasias para os CEO. Assim, acredita-se que

a expressão do HIF-1α pode ser considerada um evento inicial na carcinogênese oral.

Em 2009, Uehara et al. [31] estudaram a expressão do HIF-1α e do antígeno de

proliferação nuclear (PCNA) em casos de carcinomas orais, encontrando maior índice de

marcação do HIF-1α (12,1%) nos pacientes com pior prognóstico e com metástase nos

linfonodos regionais. Nesse mesmo estudo, não observaram correlação entre HIF-1 e PCNA.

Com base nesses resultados, os autores sugerem que o HIF-1 parece exercer um importante

papel nas metástases em linfonodos regionais e pior prognóstico para pacientes com CEO.

Um dos papéis do HIF-1α é na carcinogênese e progressão tumoral. Koukourakis et al.

[29] observaram que uma superexpressão do HIF-1α está associada a um comportamento

mais agressivo de carcinomas orais e a uma elevada resistência ao tratamento radioterápico.

Já Keith et al. [19], em análise univariada, observaram que o aumento da expressão de HIF-1α

esteve correlacionado a um prognóstico ruim para casos de CEC orais.

CEO orais apresentam rápido crescimento local, com potencial significativo de invasão

local e metástases. Apesar do tratamento agressivo, a taxa de sobrevida em cinco anos ainda

se mantém sombria. O planejamento do tratamento e o prognóstico para o câncer oral são

estimados com base no aspecto clínico, por meio do sistema TNM e pelo aspecto

histopatológico [32]. No entanto, a classificação TNM é limitada, pois não fornece

informações sobre a agressividade biológica e resposta a tratamento, sendo impossível prever

com exatidão o prognóstico [32,33]. Portanto, novos marcadores moleculares que possam

predizer o prognóstico e a agressividade tumoral necessitam ser estudados, buscando um

tratamento individualizado para o câncer de boca e, nesse contexto, o HIF-1α é elencado

38

como um marcador que pode contribuir para a identificação de novos prognósticos e fatores

preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante.

CONCLUSÃO

Como conclusão do estudo, verificou-se que há uma maior expressão, nuclear e

citoplasmática, do HIF-1α em carcinomas do que em displasias, sugerindo que a expressão do

HIF-1α desempenha um papel importante na carcinogênese oral. Essa proteína pode ser

elencada como um possível marcador de progressão tumoral e estar correlacionada com o

prognóstico do câncer de cavidade oral. Portanto, sugere-se que a superexpressão dessa

proteína seja um indício de malignidade e da apresentação de um prognóstico mais agressivo.

No entanto, ainda necessita-se de mais estudos que comprovem essa real associação.

RELEVÂNCIA CLÍNICA

O Fator Induzido por Hipóxia consiste em um regulador-chave da resposta celular à

hipóxia celular e presumivelmente desempenha um papel central no controle do crescimento

do tumor. Polimorfismos ou mutações foram recentemente identificados, podendo promover

sua maior expressão.

A taxa de sobrevida do carcinoma epidermóide oral não mudou significativamente ao

longo das últimas décadas. Assim, compreender o desenvolvimento e progressão deste tipo

tumoral é fundamental para uma bem-sucedida intervenção terapêutica. Um melhor

conhecimento da sua biologia poderia contribuir para a identificação de novos prognósticos e

fatores preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante.

Assim, estudos com HIF-1a ajudam a reflectir na adaptação de células tumorais ao meio

hipoxico e na sua contribuição para invasão tumoral.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem aos Laboratórios de Patologia Bucal da Universidade Federal do

Ceará e ao Laboratório de Histologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do

39

Ceará campus Sobral pela colaboração técnica e estrutural para o desenvolvimento dessa

pesquisa, e à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(FUNCAP), pelo auxílio na realização deste trabalho e concessão de bolsa de estudo ao

estudante de pós-graduação.

REFERÊNCIAS

1. Nagpal JK, Das BR. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular

mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol 2003;39(3): 213-221.

2. Moreno-Sánchez R, Rodríguez-Enríquez S, Marín-Hernández A, Saavedra E.. Energy metabolism in tumor cells. FEBS J 2007;274(6):1393-418.

3. Brahimi-Horn C, Pouysségur J. The role of hypoxia- inducible factor-1 in tumor metabolism growth and incasion. Bull Cancer 2006;93(8):E73-80.

4. dos Santos M, Mercante AM, Louro ID, Gonçalves AJ, de Carvalho MB, da Silva EH, da

Silva AM. HIF1-alpha expression predicts survival of patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. PLoS One 2012;7(9):e45228

5. Brennan M, Migliorati CA, Lockhart PB, Wray D, Al-Hashimi I, Axéll T, et al. Management of oral epithelial dysplasia: a review. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral

Radiol Endod 2007;103 Suppl:S19.e1-12 6. Zheng Y, Ni Y, Huang X, Wang Z, Han W. Overexpression of HIF-1alpha indicates a poor

prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis. Oncol Lett 2013;5(4):1285-1289

7. Eckert AW, Lautner MH, Schütze A, Taubert H, Schubert J, Bilkenroth U. Coexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha and glucose transporter-1 is associated with poor prognosis

in oral squamous cell carcinoma patients. Histopathology 2011; 58(7):1136-47.

8. Fillies T, Werkmeister R, van Diest PJ, Brandt B, Joos U, Buerger H. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor. BMC Cancer 2005;5:84.

9. Dellas K, Bache M, Pigorsch SU, Taubert H, Kappler M, Holzapfel D. Prognostic impact

of HIF-1alpha expression in patients with definitive radiotherapy for cervical cancer. Strahlenther Onkol 2008;184(3):169-74.

10. Ayala FR, Rocha RM, Carvalho KC, Carvalho AL, da Cunha IW, Lourenço SV, et al. GLUT1 and GLUT3 as potential prognostic markers for Oral Squamous Cell Carcinoma.

Molecules 2010;15(4):2374-87.

40

11. Ravindran G, Devaraj H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with clinicopathological

factors. Head Neck 2012;34(8):1129-35. 12. Pereira KM, Chaves FN, Viana TS, Carvalho FS, Costa FW, Alves AP, et al. Oxygen

metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review). Oncol Lett 2013;6(2):311-6.

13. Kaluz S, Kaluzová M, Stanbridge EJ. Regulation of gene expression by hypoxia: integration of the HIF-transduced hypoxic signal at the hypoxia-responsive element. Clin Chim Acta 2008;395(1-2):6-13.

14. Eckert AW, Kappler M, Schubert J, Taubert H. Correlation of expression of hypoxia-

related proteins with prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Maxillofac Surg 2012; 16(2):189-96.

15. Semenza GL. Hypoxia- inducible factor 1: regulator of mitochondrial metabolism and mediator of ischemic preconditioning. Biochim Biophys Acta 2011;1813(7):1263-8.

16. Fraga CA, de Oliveira MV, de Oliveira ÉS, Barros LO, Santos FB, Gomez RS, et al. A high HIF-1α expression genotype is associated with poor prognosis of upper aerodigestive

tract carcinoma patients. Oral Oncol 2012;48(2):130-5.

17. Lin PY, Yu CH, Wang JT, Chen HH, Cheng SJ, Kuo MY, Chiang CP. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha is significantly associated with the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan. J Oral Pathol Med 2008;37(1):18-25.

18. Oliveira LR, Ribeiro-Silva A. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in oral squamous cell carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg 2011;40(3):298-307.

19. Keith B, Johnson RS, Simon MC. HIF1alpha and HIF2alpha: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression. Nat Rev Cancer 2012;12(1):9-22.

20. Na X, Wu G, Ryan CK, Schoen SR, Di’Santagnese PA, Messing EM. Overproduction of vascular endotelial growth factor related to von Hippel-Lindau tumor suppressor gene

mutations and hypoxia- inducible factor- 1a expression in renal cell carcinomas. J Urol 2003;170(1):588–92.

21. Theodoropoulos VE, Lazaris ACh, Sofras F, Gerzelis I, Tsoukala V, Ghikonti I, et al. Hypoxia- inducible factor 1a expression correlates with angiogenesis and unfavorable

prognosis in bladder cancer. Eur Urol 2004;46(2):200-8.

22. Kuwai T, Kitadai Y, Tanaka S, Onogawa S, Matsutani N, Kaio E, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma. Int J Cancer 2003;105(2):176-81.

23. Vleugel MM, Greijer AE, Shvarts A, van der Groep P, van Berkel M, Aarbodem Y.

Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1a expression in invasive breast cancer. J Clin Pathol 2005;58(2):172-7.

41

24. Nakayama K, Kanzaki A, Hata K, Katabuchi H, Okamura H, Miyazaki K, et al.

Hypoxiainducible factor 1alpha (HIF-1 alpha) gene expression in human ovarian carcinoma. Cancer Lett 2002;176(2):215-23.

25. Sivridis E, Giatromanolaki A, Gatter KC, Harris AL, Koukourakis MI. Association of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha with activated angiogenic pathways and

prognosis in patients with endometrial carcinoma. Cancer 2002;95(5):1055-63.

26. Burri P, Djonov V, Aebersold DM, Lindel K, Studer U, Altermatt HJ, et al. Significant correlation of hypoxia- inducible factor-1a with treatment outcome in cervical cancer treated with radical radiotherapy. Int J Rad Oncol Biol Phys 2003;56(2):494-501.

27. Katsuta M, Miyashita M, Makino H, Nomura T, Shinji S, Yamashita K, et al. Correlation

of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-C in human esophageal cancer. Exp Mol Pathol 2005;78(2):123-30.

28. Mohamed KM, Le A, Duong H, Wu Y, Zhang Q, Messadi DV. Correlation between VEGF and HIF-1alpha expression in human oral squamous cell carcinoma. Exp Mol Pathol

2004;76(2):143-52. 29. Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, Simopoulos C, Turley H, Talks K, et al.

Hypoxia- inducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys

2002;53(5):1192-202. 30. Beasley NJ, Leek R, Alam M, Turley H, Cox GJ, Gatter K, et al. Hypoxia- inducible

factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in head and neck cancer: relationship to tumor biology and treatment outcome in surgically resected patients. Cancer Res 2002;62(9):2493-7.

31. Uehara M, Sano K, Ikeda H, Nonaka M, Asahina I. Hypoxia- inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma and its relation to prognosis. Oral Oncol 2009;45(3):241-6.

32. Muñoz-Guerra MF, Fernández-Contreras ME, Moreno AL, Martín ID, Herráez B,

Gamallo C. Polymorphisms in the hypoxia inducible factor 1-alpha and the impact on the prognosis of early stages of oral cancer. Ann Surg Oncol 2009;16(8):2351-8.

33. Heo K, Kim YH, Sung HJ, Li HY, Yoo CW, Kim JY, et al. Hypoxia-induced up-regulation of apelin is associated with a poor prognosis in oral squamous cell carcinoma

patients. Oral Oncol 2012;48(6):500-6.

42

TABELAS

Tabela I: Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por localização

topográfica da peça de biópsia.

Percentual de Células imuno-positivas para HIF-1α

Citoplasma Núcleo

Citoplasma

Marcado

Levemente

Citoplasma

Marcado

Moderadamente

Citoplasma

Marcado

Fortemente

CEO Gengiva (n=1) 67.7 3.7 32.1 30.9 4.6 Palato (n=1) 90.3 0.1 17.5 31.5 41.2

Mucosa Jugal (n=2) 78.6±12.7 3.15±2.5 20.7±1.2 32.7±14.5 25.25±0.6 Língua (n=3) 57.6±13.8 1.3±0.9 30.9±10.5 17.5±8.2 9.2±7.0

DEO

Lábio (n=5) 58.2±9.6 0.1±0.1 33.8±2.8 16.4±7.2 7.9±3.8 Assoalho bucal (n=1) 67.4 1.0 30.7 14.6 22.1 Língua (n=1) 74.6 0.1 40.1 29.4 5.1

Palato (n=3) 53.6±13.0 0.0±0.0 35.2±5.6 17.0±8.5 1.4±0.7

Dados expressos em forma de média±EPM.

43

FIGURAS

Figura 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma:

imunomarcação citoplasmática positiva em 58.4±6.0% das DEOs e em 77.8±3.9% dos CEOs, independente da intensidade, com diferença significante entre os dois grupos (p=0.022).

44

Figura 3 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Núcleo:

imunomarcação nuclear positiva em 0.2±0.1% das DEOs e em 2,4%±0.8 dos CEOs com diferença significante entre os dois grupos (p=0.021).

45

Figura 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-

1α em Citoplasma: imunomarcação fraca em citoplasma de 34.5±2.1% das DEO e em

30.5±3.6% de CEOs sem diferença significante entre os dois grupos (p=0.337); imunomarcação moderada em citoplasma de 17.7±4.2% das DEOs e em 31.5±3.8% de CEOs com diferença significante (p=0.029); imunomarcação forte em citoplasma de 5.4±2.3% das

DEOs e em 17.3±4.6% dos CEOs com diferença significante (p=0.031).

46

Figura 5 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma

por Gênero: Imunomarcação citoplasmática em sexo masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e em sexo feminino (DEO: 54.7±8.1 e CEO: 76.5%), não foi observada

diferença significativa (p=0.350).

47

Figura 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-

1α em Citoplasma por Gênero:

Imunomarcação citoplasmática fraca em DEO (Homens - 35.6±3.8% / Mulheres - 33.5±2.2%) e em CEO (Homens - 23.3±4.0% / Mulheres - 35.2±4.5%) não apresentou diferenças significativas entre sexos (p=0.093). Imunomarcação citoplasmática moderada em DEO

(Homens - 20.4±6.7% / Mulheres - 15.0±5.7%) e em CEO (Homens - 26.3±7.6% / Mulheres - 31.6±4.8%) não foi observado diferença em relação ao sexo (p=0.398). Imunomarcação

citoplasmática forte em DEO (Homens - 8.4±3.8% / Mulheres - 6.2±4.0%) e CEO (Homens - 20.0±8.4% / Mulheres - 20.0±8.4%) não houve diferença entre sexos (p=0.415).

48

Figura 7 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Nucleo por

Gênero: Aumento significante de imunomarcação nuclear em CEO (5.5±1.6%) com relação à

DEO (0.1±0.1%) no sexo masculino quando comparado ao aumento da imunomarcação nuclear em CEO (1.2±0.5%) com relação à DEO (0.2±0.2%) do sexo feminino (p=0.003).

13

Figura 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de displasia epitelial oral (DEO). (A) DEO exibindo imunomarcação nuclear. (B) DEO evidenciando imunomarcação extensa em células epitelias, exceto na camada basal e parabasal. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica, também apresentaram imunomarcação de HIF-1α. (400x).

14

Figura 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO). (A) CEO bem diferenciado exibindo imunomarcação nuclear em numerosas células. (B) CEO moderadamente diferenciado evidenciando imunomarcação nuclear e citoplasmática moderada a forte. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica,

também apresentaram imunomarcação de HIF-1α (400x).

13

4 CONCLUSÃO GERAL

Da avaliação dos resultados obtidos, pode-se concluir que:

A imunomarcação citoplasmática para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença

significante entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imunomarcação em CEO;

A imunomarcação nuclear para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença significante

entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imuno-marcação em CEO;

Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação

positiva fraca em citoplasma entre CEO e DEO;

Houve aumento significante na imunomarcação citoplasmática moderada e forte de CEO

em relação às DEO;

O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação entre

os sexos;

O percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens mostrou aumento

significante nos CEO em relação às DEO quando comparado com a imunomarcação em

mulheres.

14

REFERÊNCIAS

BARNES, L. et al. Pathology & Genetics: Head and Neck Tumours. Lyon: IARC Press, 2005.

BEASLEY, N.J. et al. Hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in head and neck cancer: relationship to tumor biology and treatment outcome in surgically resected

patients. Cancer Res., v. 69, n. 9, p. 2493-2497, May 2002.

BRAHIMI-HORN, C.; POUYSSÉGUR, J. The role of hypoxia- inducible factor-1 in tumor metabolism growth and incasion. Bull. Cancer, v.93, n.8, p. E73-80, 2006.

BRENNAN, M. et al. Management of oral epithelial dysplasia: a review. Oral Surg. Oral

Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v.103, p.S19.e1-S19.e12, 2007.

BURRI, P. et al. Significant correlation of hypoxia- inducible factor-1a with treatment outcome in cervical cancer treated with radical radiotherapy. Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys.,

v. 56, n. 1, p. 494–501, 2003.

DELLAS, K. et al. Prognostic impact of HIF-1alpha expression in patients with definitive radiotherapy for cervical cancer. Strahlenther Onkol., v. 184, n. 3, p. 169-174, Mar. 2008.

DEMASI, A. P. et al. Glucose transporter protein 1 expression in mucoepidermoid carcinoma of salivary gland: correlation with grade of malignancy. Int. J. Exp. Pathol., v. 91, n. 2, p.

107-113, Apr. 2010.

DENKO, N. C. Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour. Nat. Rev.

Cancer, v. 8, n. 9, p. 705-713, Sept. 2008.

DOS SANTOS, M. et al. HIF1-alpha expression predicts survival of patients with squamous

cell carcinoma of the oral cavity. PLoS One, v. 7, n. 9, p. e45228, 2012.

ECKERT, A. W. et al. Co-expression of HIF-1alpha and CAIX is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. J. Oral Pathol. Med., v. 39, n. 4, p. 313-

317, Apr. 2010.

ECKERT, A. W. et al. Coexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha and glucose transporter-1 is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Histopathology, v. 58, n. 7, p. 1136-1147, June 2011.

ECKERT, A. W. et al. Correlation of expression of hypoxia-related proteins with prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. Oral Maxillofac. Surg., v. 16, n. 2, p. 189-196, June 2012.

FILLIES, T. et al. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage

squamous cell carcinomas of the oral floor. BMC Cancer, v. 21, n. 5, p. 84, July 2005.

FRAGA, C.A. et al. A high HIF-1α expression genotype is associated with poor prognosis of upper aerodigestive tract carcinoma patients. Oral Oncol., v. 48, n. 2, p. 130-135, Feb. 2012.

15

HADDAD, R. I.; SHIN, D. M. Recent advances in head and neck cancer. N. Engl. J. Med., v.

359, n. 11, p. 1143-1154, Sept. 2008.

HEDDLESTON, J. M. et al. Hypoxia- induced mixed- lineage leukemia 1 regulates glioma stem cell tumorigenic potential. Cell Death Differ., v. 19, n. 3, p. 428-439, Mar. 2012.

HEO, K. et al. Hypoxia-induced up-regulation of apelin is associated with a poor prognosis in

oral squamous cell carcinoma patients. Oral Oncol., v. 48, n. 6, p. 500-506, June 2012.

INCA. Estimativa 2012: Incidência de Câncer no Brasil, 2012a. Disponível em: < http://www.inca.gov.br>. Acesso em: 17 dez. 2013.

INCA. Atlas de Mortalidade por Câncer, 2012b. Disponível em: < http://www.inca.gov.br>.

Acesso em: 28 nov. 2013.

ISHIKAWA, T. et al. Hypoxia enhances CXCR4 expression by activating HIF-1 in oral squamous cell carcinoma. Oncol. Rep., v. 21, n. 3, p. 707-712, Mar. 2009.

KADEMANI, D. et al. Prognostic factors in intraoral squamous cell carcinoma: The influence

of histologic grade. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 63, p. 1599-1605, 2005.

KALUZ, S.; KALUZOVA, M.; STANBRIDGE, E. J. Regulation of gene expression by hypoxia: integration of the HIF-transduced hypoxic signal at the hypoxia-responsive element. Clin. Chim. Acta, v. 395, n. 1/2, p. 6-13, Sept. 2008.

KATSUTA, M. et al. Correlation of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-C in human esophageal cancer. Exp. Mol. Pathol., v. 78, p. 123-130, 2005.

KEITH, B.; JOHNSON, R. S.; SIMON, M. C. HIF1alpha and HIF2alpha: sibling rivalry in

hypoxic tumour growth and progression. Nat. Rev. Cancer, v. 12, n. 1, p. 9-22, Jan. 2012.

KOUKOURAKIS, M.I. et al. Hypoxia- inducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cancer. Int. J. Radiat.

Oncol. Biol. Phys., v. 53, n. 5, p. 1192-1202, Aug. 2002.

KUWAI, T. et al. Expression of hypoxia- inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma. Int. J. Cancer, v. 105, n. 2, p. 176–181, Jun. 2003.

LI, S. J. et al. Expression of Glut-1 in primary and recurrent head and neck squamous cell carcinomas, and compared with 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose accumulation in positron emission tomography. Br. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 46, n. 3, p. 180-186, Apr. 2008.

LIANG, X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and SNIP1,

is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma. Oral Oncol.,

v. 47, n. 2, p. 92-97, Feb. 2011.

http://www.inca.gov.br/

http://www.inca.gov.br/

16

LIN, P. Y. et al. Expression of hypoxia- inducible factor-1 alpha is significantly associated

with the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan. J. Oral

Pathol. Med., v. 37, n. 1, p. 18-25, Jan. 2008.

LIU, C. J. et al. miR-31 ablates expression of the HIF regulatory factor FIH to activate the

HIF pathway in head and neck carcinoma. Cancer Res., v. 70, n. 4, p. 1635-1644, Feb. 2010.

LIU, S. Y. et al. Clinicopathologic significance of tumor cell- lined vessel and microenvironment in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 44, n. 3, p. 277-285,

Mar. 2008.

MASSANO, J. et al. Oral squamous cell carcinoma: Review of prognostic and predictive factors. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 102, p. 67-76, 2006.

MOHAMED, K. M. et al. Correlation between VEGF and HIF-1alpha expression in human oral squamous cell carcinoma. Exp. Mol. Pathol., v. 76, n. 2, p. 143-152, Apr. 2004.

MORENO-SÁNCHEZ, R. et al. Energy metabolism in tumor cells. FEBS J., v. 274, n. 6, p.1303-1418, 2007.

MUNOZ-GUERRA, M. F. et al. Polymorphisms in the hypoxia inducible factor 1-alpha and the impact on the prognosis of early stages of oral cancer. Ann. Surg. Oncol., v. 16, n. 8, p.

2351-2358, Aug. 2009.

NA, X. et al. Overproduction of vascular endotelial growth factor related to von Hippel-Lindau tumor suppressor gene mutations and hypoxia- inducible factor- 1a expression in renal

cell carcinomas. J. Urol., v. 170, n. 1, p. 588–592, 2003.

NAGPAL, J.K.; DAS, B.R. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol., v.39, p.213-221, 2003.

NAKANO, Y. et al. Oral administration of K-11706 inhibits GATA binding activity, enhances hypoxia- inducible factor 1 binding activity, and restores indicators in an in vivo mouse model of anemia of chronic disease. Blood, v. 104, n. 13, p. 4300-4307, Dec. 2004.

NAKAYAMA, K. et al. Hypoxiainducible factor 1alpha (HIF-1 alpha) gene expression in

human ovarian carcinoma. Cancer Lett., v. 176, n. 1, p. 215–223, 2002.

NEVILLE, B.W. et al. Patologia Oral & Maxilofacial. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009.

OLIVEIRA, L. R.; RIBEIRO-SILVA, A. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in oral squamous cell carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 40, n. 3, p.

298-307, Mar. 2011.

OLIVER, R. J. et al. Prognostic value of facilitative glucose transporter Glut-1 in oral squamous cell carcinomas treated by surgical resection; results of EORTC Translational

Research Fund studies. Eur. J. Cancer, v. 40, n. 4, p. 503-507, Mar. 2004.

17

PEREIRA, K.M., et al. Oxygen metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review). Oncol.

Lett., v. 6, n. 2, p. 311-316, 2013.

RAVINDRAN, G.; DEVARAJ, H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with

clinicopathological factors. Head Neck, Nov. 2011.

RYU, M. H. et al. Hypoxia- inducible factor-1alpha mediates oral squamous cell carcinoma invasion via upregulation of alpha5 integrin and fibronectin. Biochem. Biophys. Res.

Commun., v. 393, n. 1, p. 11-15, Feb. 2010.

SCULLY, C. Oral cancer; evidence for sexual transmission. Br. Dent. J., v.199, n. 4, p.203-207, Aug. 2005.

SILVEIRA, E. J. D. Lesões orais com potencial de malignização: análise clínica e morfológica de 205 casos. J. Bras. Patol. Med. Lab., v.45, n.3, p.233-238, 2009.

SIVRIDIS, E. et al. Tumor and Angiogenesis Research Group. Association of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha with activated angiogenic pathways and prognosis in patients with endometrial carcinoma. Cancer, v. 95, n. 1, p. 1055–1063, 2002.

SOUSA, F.A.C.G. et al. Alterações gênicas e câncer bucal – uma breve revisão. RBPO, v.3, n.1, p.20-25, jan./mar. 2004.

STRYER, L.; TYMOCZO, J. L.; JEREMY, M. Bioquímica. 5. ed. São Paulo: Guanabara Kooogan, 2004.

SUN, W. et al. Mitochondrial mutations contribute to HIF1alpha accumulation via increased

reactive oxygen species and up-regulated pyruvate dehydrogenease kinase 2 in head and neck squamous cell carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 15, n. 2, p. 476-484, Jan. 2009.

THEODOROPOULOS, V.E. et al. Hypoxia- inducible factor 1a expression correlates with

angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer. Eur. Urol., v. 46, p. 200–208, 2004.

UEHARA, M. et al. Hypoxia- inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma and its relation to prognosis. Oral Oncol., v. 45, n. 3, p. 241-246, Mar. 2009.

VLEUGEL, M.M. et al. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1a

expression in invasive breast cancer. J. Clin. Pathol., v. 58, n. 1, p. 172–177, 2005.

ZHENG, Y. et al. Overexpression of HIF-1alpha indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis. Oncol. Lett., v. 5, n. 4, p. 1285-

1289, Apr. 2013.

ZHOU, H. et al. The hypoxia-inducible factor-responsive proteins semaphorin 4D and vascular endothelial growth factor promote tumor growth and angiogenesis in oral squamous

cell carcinoma. Exp. Cell Res., May 2012.

18

ZHU, G. Q. et al. Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play

distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma. Clin. Cancer

Res., v. 16, n. 19, p. 4732-4741, Oct. 2010.

ANEXO A – SEGUIMENTO DO REGIMENTO INTERNO

19

ANEXO B – PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM

PESQUISA

20

ANEXO C – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, de uma pesquisa. Após ser esclarecido(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine

ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado(a) de forma alguma. Em caso de dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará

pelo telefone: (85) 3366-8338.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA: Título do Projeto: “IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α E CD133 EM DISPLASIAS

EPITELIAIS ORAIS E CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS.”

Pesquisadora Responsável: Filipe Nobre Chaves

Endereço e Telefone para contato : Rua Min. Joaquim Bastos, 471 apto. 1502- Fátima –

CEP: 60415-040 – Tel: (85) 34912963; Cel: (85) 99221498

Orientador: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira

O propósito deste estudo é analisar a exressão imunohistoquímica do fator indutor por

hipóxia (HIF-1α) e da célula-tronco CD133 nos casos de carcinomas epidermóides e em displasias epiteliais orais, buscando marcadores de prognóstico para o câncer oral.

Está garantido o sigilo de todos os dados obtidos na pesquisa, assim como o direito de retirada do consentimento da participação na pesquisa a qualquer momento.

CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO:

Eu_____________________________________________, portador do RG ___________________________, abaixo assinado, concordo em participar, como sujeito, do estudo intitulado “IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α E CD133 EM

DISPLASIAS EPITELIAIS ORAIS E CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS ”. Fui devidamente informado e esclarecido pelo pesquisador, sobre a pesquisa, os

procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido que não terei qualquer prejuízo financeiro e que posso retirar meu consentimento a qualquer momento. Foi garantido, também,

o anonimato e o sigilo dos meus dados durante todas as fases da pesquisa, inclusive após a publicação da mesma.

Sobral, ___/___/___ ____________________________ __________________________

Assinatura do Sujeito da Pesquisa Assinatura do Pesquisador

21

ANEXO D – NORMAS DE PUBLICAÇÃO EM PERIÓDICO

ORAL ONCOLOGY

Guide for Authors

Oral Oncology accepts the following article types for publication:

Editorial: Authors who are considering submitting an editorial should contact the Editor-in-

Chief with a brief outline of the proposed contribution before submission. Editorials are

welcome on any topic; however, they may also be related to work previously published

in Oral Oncology. Editorials have no abstract and no keywords, and are usually restricted to

1500 words, up to 10 references and up to 2 tables or figures if not agreed otherwise with the

Editor-in-Chief. The Editor-in-Chief can be contacted at [email protected].

Original Research Articles: Original research articles which have not been published

previously, except in a preliminary form, may be submitted as original full length research

papers. Research articles must contain an abstract, a list of up to ten keywords, and are limited

to between 3,500 and 5,000 words in length.

Review Articles: Review articles which are topical and are a critical assessment of any aspec t

of head and neck are welcome. Review articles must contain an abstract, a list of up to ten

keywords, and are limited to 5,000 words in length. Authors whose manuscripts exceed 5,000

words are advised to contact the Editorial Office prior to submission

([email protected]).

Letters to the Editor: Letters to the Editor relating to published work in Oral Oncology are

welcome. Letters should be closely related to the contents of the article they refer to. No other

(unrelated) letters will be considered for publication.

22

After reading the Guide for Authors, please visit our online submission system to submit your

manuscript:http://ees.elsevier.com/oo.

Submission checklist

It is hoped that this list will be useful during the final checking of an article prior to sending it

to the journal's Editor for review.

Ensure that the following items are present:

One Author designated as corresponding Author:

E-mail address

Full postal address

Telephone(s) and fax numbers

• All necessary files have been uploaded

• Keywords (as comprehensive as possible)

• All figure captions

• All tables (including title, description, footnotes)

• The Author Form has been completed and uploaded to EES

Further considerations:

• Manuscript has been "spellchecked" and is written in good English

• Title is clear and unambiguous

• If the manuscript is an original research article it should contain a structured abstract, if the

manuscript is a review article it should contain an unstructured abstract

• References are in the correct format for this journal

• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa

• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including

the Web)

http://ees.elsevier.com/oo

http://www.elsevier.com/inca/publications/misc/ooauthorguide2011.pdf

23

• Colour figures are clearly marked as being intended for colour reproduction on the Web

(free of charge) and in print or to be reproduced in colour on the Web (free of charge) and in

black-and-white in print

• If only colour on the Web is required, black and white versions of the figures are also

supplied for printing purposes

• The manuscript conforms to the limits imposed on original research and review articles

(3,500 words for original research articles and 5,000 words for review articles, excluding the

abstract, keywords, references, tables and figures)

For any further information please contact the Author Support Department at

[email protected]

Prior to Submission

Oral Oncology will consider manuscripts prepared according to the guidelines adopted by the

International Committee of Medical Journal Editors ("Uniform requirements for manuscripts

submitted to biomedical journals", available as a PDF from http://www.icmje.org). Authors

are advised to read these guidelines.

Open Access

This journal offers authors two choices to publish their research;

1. Open Access

• Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted reuse

• An Open Access publication fee is payable by authors or their research funder

2. Subscription

• Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient groups

through our access programs (http://www.elsevier.com/access)

http://www.icmje.org/

http://www.elsevier.com/access

24

• No Open Access publication fee

All articles published Open Access will be immediately and permanently free for everyone to

read and download. Permitted reuse is defined by your choice of one of the following

Creative ommons user licenses:

Creative Commons Attribution-Non Commercial-ShareAlike (CC BY-NC-SA): for non-

commercial purposes, lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts

and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a

translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text and data mine the

article, as long as they credit the author(s), do not represent the author as endorsing their

adaptation of the article, do not modify the article in such a way as to damage the author’s

honor or reputation, and license their new adaptations or creations under identical terms (CC

BY NC SA).

Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs (CC-BY-NC-ND): for non-

commercial purposes, lets others distribute and copy the article, and to include in a collective

work (such as an anthology), as long as they credit the author(s) and provided they do not

alter or modify the article.

Creative Commons Attribution (CC-BY): available only for authors funded by organizations

with which Elsevier has established an agreement. For a full list please

see http://www.elsevier.com/fundingbodies

Elsevier has established agreements with funding bodies. This ensures authors can comply

with funding body Open Access requirements, including specific user licenses, such as CC-

BY. Some authors may also be reimbursed for associated publication

fees. http://www.elsevier.com/fundingbodies

http://www.elsevier.com/fundingbodies


25

To provide Open Access, this journal has a publication fee which needs to be met by the

authors or their research funders for each article published Open Access. Your publication

choice will have no effect on the peer review process or acceptance of submitted articles. The

Open Access publication fee for this journal is 2500 USD, excluding taxes.

Learn more about Elsevier’s pricing policy http://www.elsevier.com/openaccesspricing

Previous Publication

Submission of an article implies that the work described has not been published previously

(except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis), that it

is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all

authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out,

and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in English or in any

other language, without the written consent of the Publisher.

Online-only Publication

Oral Oncology offers authors the opportunity to select online-only publication as their

preferred option for publishing original research papers in the journal, rather than print

publication. Letters to the Editor which are accepted for publication and errata and corrigenda

will be published online-only and will not appear in print.

Any material which is published online-only will be published online on ScienceDirect as

paginated and fully citable electronic article. It will be listed in the contents page of a printed

issue and the full citation and abstract will be published in print. The citation and abstract of

http://www.elsevier.com/openaccesspricing

26

the paper will also still appear in the usual abstracting and indexing databases, including

PubMed/Medline, Current Contents/Clinical Medicine and the Science Citation Index.

Authors will be asked to select which publication option they would prefer when submitting

their paper to the Editorial Office.

Randomised Controlled Trials

All randomised controlled trials submitted for publication in Oral Oncology should include a

completed Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) flow chart. Please refer

to the CONSORT statement website at http://www.consort-statement.org for more

information. Oral Oncology has adopted the proposal from the International Committee of

Medical Journal Editors (ICMJE) which require, as a condition of consideration for

publication of clinical trials, registration in a public trials registry. Trials must register at or

before the onset of patient enrolment. The clinical trial registration number should be included

at the end of the abstract of the article. For this purpose, a clinical trial is defined as any

research project that prospectively assigns human subjects to intervention or comparison

groups to study the cause-and-effect relationship between a medical intervention and a health

outcome. Studies designed for other purposes, such as to study pharmacokinetics or major

toxicity (e.g. phase I trials) would be exempt. Further information can be found

at www.icmje.org.

Ethics

Work on human beings that is submitted to Oral Oncology should comply with the principles

laid down in the Declaration of Helsinki; Recommendations guiding physicians in biomedical

http://www.consort-statement.org/

http://www.elsevier.com/journals/oral-oncology/1368-8375/www.icmje.org

27

research involving human subjects. Adopted by the 18th World Medical Assembly, Helsinki,

Finland, June 1964, amended by the 29th World Medical Assembly, Tokyo, Japan, October

1975, the 35th World Medical Assembly, Venice, Italy, October 1983, and the 41st World

Medical Assembly, Hong Kong, September 1989. The manuscript should contain a statement

that the work has been approved by the appropriate ethical committees related to the

institution(s) in which it was performed and that subjects gave informed consent to the work.

Studies involving experiments with animals must state that their care was in accordance with

institution guidelines. Patients' and volunteers' names, initials, and hospital numbers should

not be used.

Patient Consent Guidelines

Studies on patients or volunteers require ethics committee approval and informed consent

which should be documented in your paper.

Patients have a right to privacy. Therefore, identifying information, including patients'

images, names, initials, or hospital numbers, should not be included in videos, recordings,

written descriptions, photographs, and pedigrees unless the information is essential for

scientific purposes and you have obtained written informed consent for publication in print

and electronic form from the patient (or parent, guardian or next of kin where applicable). If

such consent is made subject to any conditions, Elsevier must be made aware of all such

conditions. Written consents must be provided to Elsevier on request.

Even where consent has been given, identifying details should be omitted if they are not

essential. If identifying characteristics are altered to protect anonymity, such as in genetic

pedigrees, authors should provide assurance that alterations do not distort scientific meaning

and Editors should so note.

28

If such consent has not been obtained, personal details of patients included in any part of the

paper and in any supplementary materials (including all illustrations and videos) must be

removed before submission.

Conflict of Interest

By means of a "Conflict of interest statement", all authors must disclose any financial and

personal relationships with other people or organisations that could inappropriately influence

(bias) their work. If there are no conflicts of interest, please state "None declared". This

document should be uploaded as a separate file alongside the submitted manuscript.

Role of the Funding Source

All sources of funding should be declared as an acknowledgment at the end of the text.

Authorship and Acknowledgments

All authors must be accredited on the paper and all must submit a completed Author

Form with their submission. The form must be signed by the corresponding author on behalf

of all authors and can be scanned and uploaded to EES. If you are unable to upload your

Author Form to EES, please contact the Editorial Office ([email protected]) for

further information. No subsequent change in authorship will be possible.

Copyright



29

Upon acceptance of an article, Authors will be asked to transfer copyright (for more

information on copyright seehttp://authors.elsevier.com). This transfer will ensure the widest

possible dissemination of information. A letter will be sent to the corresponding Author

confirming receipt of the manuscript. A form facilitating transfer of copyright will be

provided.

If excerpts from other copyrighted works are included, the Author(s) must obtain written

permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has

preprinted forms for use by Authors in these cases: contact Elsevier's Rights Department,

Philadelphia, PA, USA: phone (+1) 215 239 3804, fax (+1) 215 239 3805, e-mail

[email protected]. Requests may also be completed online via the Elsevier

homepage (http://www.elsevier.com/locate/permissions).

Authors' Rights

As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you are

referred to:http://www.elsevier.com/authorsrights.

Manuscript Submission

Submission to Oral Oncology proceeds totally online. Use the following guidelines to prepare

your article. Via the "Author Gateway" page of this journal (http://authors.elsevier.com/) you

will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system

automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article,

which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files

are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for

http://authors.elsevier.com/

http://www.elsevier.com/locate/permissions

http://www.elsevier.com/authorsrights


30

further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's

decision and requests for revision, takes place by e-mail and via the Author's homepage,

removing the need for a hard-copy paper trail.

General Points

We accept most wordprocessing formats, but Word, WordPerfect or LaTeX is preferred.

Always keep a backup copy of the electronic file for reference and safety. Save your files

using the default extension of the program used.

It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The text

should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible. Most

formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not

use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold

face, italics, subscripts, superscripts etc. Do not embed "graphically designed" equations or

tables, but prepare these using the wordprocessor's facility. When preparing tables, if you are

using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row. If

no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The electronic text should be prepared

in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Author Gateway's

Guide to Publishing with Elsevier:http://authors.elsevier.com). Do not import the figures into

the text file but, instead, indicate their approximate locations directly in the electro nic text and

on the manuscript. See also the section on Preparation of electronic illustrations.

To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spellchecker" function of

your wordprocessor.

Word Limits


31

Original research articles submitted to the journal must be 3,500 words in length or less

(excluding the abstract, keywords, references, tables and figures). Review articles submitted

to the journal must be 5,000 words or less in length (excluding the abstract, keywords,

references, tables and figures).

Presentation of Manuscript

Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not a

mixture of these). Italics are not to be used for expressions of Latin origin, for example, in

vivo, et al., per se. Use decimal points (not commas); use a space for thousands (10 000 and

above).

Language Polishing

Authors who require information about language editing and copyediting services pre- and

post-submission please visit http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/

languagepolishing or contact [email protected] for more information. Please note

Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any products, goods or services offered

by outside vendors through our services or in any advertising. For more information please

refer to our Terms and Conditions:http://www.elsevier.com/wps/find/termsconditions.cws_

home/termsconditions

Provide the following data on the title page:

http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/languagepolishing

http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/languagepolishing

32

Title: Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoid

abbreviations and formulae where possible.

Author names and affiliations: Where the family name may be ambiguous (e.g., a double

name), please indicate this clearly. Present the Authors' affiliation addresses (where the actual

work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter

immediately after the Author's name and in front of the appropriate address. Provide the full

postal address of each affiliation, including the country name, and, if available, the e-mail

address of each Author.

Corresponding Author: Clearly indicate who is willing to handle correspondence at all stages

of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone and fax numbers

(with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete

postal address.

Present/permanent address: If an Author has moved since the work described in the article

was done, or was visiting at the time, a "Present address"' (or "Permanent address") may be

indicated as a footnote to that Author's name. The address at which the Author actually did

the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are

used for such footnotes.

Suggestions for reviewers: Please supply the names of up to three potential reviewers for your

manuscript. Please do not suggest reviewers from your own institution, previous or current

collaborators. Please provide full names, addresses and email addresses of suggested

reviewers. Please note: the final choice of reviewers is that of the Editor and the journal

reserves the right not to use reviewers which have been suggested by the authors.

Abstract: A concise and factual abstract of no more than 250 words is required. The abstract

must be structured for original research articles and articles reporting the results of clinical

33

trials. The abstract should be divided by subheadings as follows: Objectives, Materials and

Methods, Results and Conclusion.

The abstract should not be structured for review articles. The abstract should state briefly the

purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often

presented separate from the article, so it must be able to stand alone.

Keywords: Immediately after the abstract provide a maximum of ten keywords, to be chosen

from the Medical Subject Headings from Index Medicus. These keywords will be used for

indexing purposes. It is usually necessary to include keywords such as Oral Cancer, or Head

and Neck cancer

Abbreviations: Define abbreviations or acronyms that are not standard in this field at their

first occurrence in the article: in the abstract but also in the main text after it. Ensure

consistency of abbreviations throughout the article.

Text: This should start on the third page and should be subdivided into the following sections:

Introduction, Patients (or Materials) and Methods, Results, and Discussion.

References: Responsibility for the accuracy of bibliographic citations lies entirely with the

authors.

Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and

vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. "Unpublished data" and

"Personal communications" are not allowed. As an alternative, say in the text, for example,

'(data not shown)' or '(Dr F.G. Tomlin, Karolinska Institute)'. Citation of a reference as "in

press" implies that the item has been accepted for publication and a copy of the title page of

the relevant article must be submitted.

Indicate references by superscript numbers in the text. The actual authors can be referred to,

but the reference numbers must always be given. Number the references in the reference list

in the order in which they appear in the text.

34

Examples:

1. Llewellyn CD, Johnson NW, Warnakulasuriya KAAS. Risk factors for squamous cell

carcinoma of the oral cavity in young people - comprehensive literature review. Oral

Oncol 2001;37(5):401-418.

2. Gullick WJ, Venter DJ. The c-erbB2 and its expression in human tumors. In: Waxman J,

Sikora K, editors. The molecular biology of cancer. Oxford: Blackwell Scientific, 1989. p. 38-

53.

3. Scully C, Cawson RA. Medical Problems in Dentistry. 5th edition Oxford: Butterworth-

Heinemann. 2004

For more than 6 authors that first 6 should be listed followed by "et al". For further details

you are referred to "Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical

Journals" (J Am Med Assoc 1997; 277 : 927-934) (see

also http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/terms_cond.html).

Figure Captions, Tables, Figures and Schemes

Present these, in this order, at the end of the article. They are described in more detail below.

High-resolution graphics files must always be provided separate from the main text file (see

Preparation of illustrations).

Footnotes

Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article, using

superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text, and this

feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in the text

and present the footnotes themselves on a separate sheet at the end of the article. Do not

include footnotes in the Reference list.

http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/terms_cond.html

35

Table footnotes

Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.

Tables

Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes

to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid

vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do

not duplicate results described elsewhere in the article.

Nomenclature and Units

Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of units

(SI). If other quantities are mentioned, give their equivalent in SI.

Preparation of Electronic Illustrations

• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.

• Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.

• Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Helvetica, Times, Symbol.

• Number the illustrations according to their sequence in the text.

• Use a logical naming convention for your artwork files.

• Provide all illustrations as separate files and as hardcopy printouts on separate sheets.

• Provide captions to illustrations separately.

36

• Produce images near to the desired size of the printed version.

• A detailed guide on electronic artwork is available on our

website: http://authors.elsevier.com/artwork

You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here.

Formats

Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please "save as"

or convert the images to one of the following formats (Note the resolution requirements for

line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below.):

EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as "graphics".

TIFF: Colour or greyscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.

TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.

TIFF: Combinations bitmapped line/halftone (colour or greyscale): a minimum of 500 dpi is

required.

DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft Office

applications please supply "as is".

Please do not:

• Supply embedded graphics in your wordprocessor (spreadsheet, presentation) document;

• Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution

is too low;

• Supply files that are too low in resolution;

• Submit graphics that are disproportionately large for the content.

http://authors.elsevier.com/artwork

37

If, together with your accepted article, you submit usable colour figures then Elsevier will

ensure, at no additional charge, that these figures will appear in colour on the Web (e.g.,

ScienceDirect and other sites) in addition to colour reproduction in print.

Captions

Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the

figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a descr iption of the

illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all symbols

and abbreviations used.

Line drawings

The lettering and symbols, as well as other details, should have proportionate dimensions, so

as not to become illegible or unclear after possible reduction; in general, the figures should be

designed for a reduction factor of two to three. The degree of reduction will be determined by

the Publisher. Illustrations will not be enlarged. Consider the page format of the journal when

designing the illustrations.

Do not use any type of shading on computer-generated illustrations.

Photographs (halftones)

Remove non-essential areas of a photograph. Do not mount photographs unless they form part

of a composite figure. Where necessary, insert a scale bar in the illustration (not below it), as

opposed to giving a magnification factor in the caption.

Note that photocopies of photographs are not acceptable.

Preparation of supplementary data

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Elsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific

research. Supplementary files offer the Author additional possibilities to publish supporting

applications, movies, animation sequences, high-resolution images, background datasets,

sound clips and more. Supplementary files supplied will be published online alongside the

electronic version of your article in Elsevier Web products, including

ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material

is directly usable, please ensure that data is provided in one of our recommended file formats.

Authors should submit the material in electronic format together with the article and supply a

concise and descriptive caption for each file. For more detailed instructions please visit our

artwork instruction pages at the Author Gateway athttp://authors.elsevier.com/artwork.

AudioSlides

The journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their published

article. AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online

article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their research in

their own words and to help readers understand what the paper is about. More information

and examples are available at http://www.elsevier.com/audioslides. Authors of this journal

will automatically receive an invitation e-mail to create an AudioSlides presentation after

acceptance of their paper.

Special Subject Repositories

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Proofs are not to be regarded as "drafts".

One set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to the corresponding Author, to

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