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GABRIEL EDGARDO REMONDETTO PROPRIÉTÉS DE RÉTENTION ET DE LIBÉRATION
DE MICRONUTRIMENTS PAR DES RÉSEAUX PROTÉIQUES:
ÉTUDE DU SYSTÈME GÉLIFIÉ β-LACTOGLOBULINE/FER
Thèse
présentée
à la Faculté des études supérieures
de l'Université Laval
pour l’obtention de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Département des Sciences des Aliments et de Nutrition
FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
MAI, 2003 © Gabriel Edgardo Remondetto, 2003
ii
Résumé court
Ces travaux de recherche visent à comprendre le mécanisme de formation de gels
protéiques en présence de fer en vue de les utiliser comme systèmes dans le développement
de nouveaux aliments fonctionnels. Les résultats obtenus montrent qu’il est possible de
former des gels à froid de β-lactoglobuline en présence de fer. En fonction des conditions
utilisées, deux types de gels ont été identifiés et caractérisés : d’une part, des gels
filamenteux sont obtenus à faibles concentrations en fer et essentiellement maintenus par
des interactions hydrophobes et d’autre part, des gels particulaires inhomogènes sont
obtenus à fortes concentrations en fer et maintenus par des interactions de type van der
Waals. Des études in vitro ont montré que les gels filamenteux permettaient de libérer le fer
au niveau de la barrière intestinale et favorisaient son absorption. Ces gels constituent donc
de très bons véhicules pour transporter le fer et optimiser sa biodisponibilité.
Gabriel Edgardo Remondetto Muriel Subirade, Ph.D.
Étudiant gradué Directrice
iii
Résumé long
Le manque en micronutriments et spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un
des principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. Parmi les différentes
stratégies adoptées pour pallier ce problème de santé publique, le développement
d’aliments enrichis en fer constitue une des avenues les plus intéressantes. Cependant,
malgré tous les efforts déployés dans ce secteur, les résultats escomptés sont loin d’être
concluants en raison notamment de la sensibilité du fer aux conditions de préparation des
aliments - oxydation, pH, présence d’autres nutriments, etc.- qui modifient sa
biodisponibilité. L’objectif général de ce projet d’études doctorales vise à comprendre le
mécanisme de formation de gels protéiques en présence de fer en vue de les utiliser comme
systèmes de transport du fer et d’optimiser sa biodisponibilité dans le développement de
nouveaux aliments fonctionnels.
Dans un premier temps, nous avons étudié la formation de gels à froid de β-lactoglobuline
en présence de fer ionique (Fe2+). L’impact de différents paramètres –concentration en Fe2+,
concentration en protéine et pH- sur la formation des gels a été étudié en relation avec les
propriétés macroscopiques et microscopiques des gels obtenus. Les travaux obtenus
montrent que le comportement élastique des gels et la force à la rupture augmentent avec la
concentration en protéine et diminuent quand la concentration en Fe2+ augmente. La
capacité de rétention d’eau est élevée pour de faibles concentrations en Fe2+. L’étude
microscopique des gels formés révèle la formation de deux types de gels : des gels
filamenteux, ordonnés pour de faibles rapports Fe2+/protéine et des gels particulaires non-
homogènes pour des rapports Fe2+/protéine élevés. Dans un deuxième temps, des études à
l’échelle moléculaire, par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et à l’ échelle
iv supramoléculaire, par rhéologie, ont permis d’identifier les différentes interactions mises en
jeu lors de la formation de ces deux types de gels. La formation des gels particulaires
obtenus à fortes concentrations en Fe2+ (30mM) est essentiellement contrôlée par des
interactions de type van der Waals, alors que les gels filamenteux obtenus à faibles
concentrations en Fe2+ (10 mM) sont maintenus par des interactions hydrophobes. Enfin
dans un dernier temps, l’impact de la miscrostructure des gels sur la libération du fer a été
étudié in vitro dans différentes conditions incluant les conditions du tractus digestif.
L’ensemble de ces travaux a montré que les gels filamenteux permettaient de libérer le fer
au niveau de la barrière intestinale et favorisaient son absorption.
L’ensemble de ces travaux permet de conclure que les gels filamenteux constituent de très
bons véhicules pour transporter le fer et optimiser sa biodisponibilité.
Gabriel Edgardo Remondetto Muriel Subirade, Ph.D.
Étudiant gradué Directrice
v
Avant-Propos
Cette thèse de doctorat a été réalisée au Département des Sciences des Aliments et de
nutrition de l’Université Laval sous la direction de la professeure Madame Muriel Subirade.
Ce travail est divisé en cinq parties principales. La première section, rédigée en français, est
constituée de l’introduction générale, de la revue de littérature, de l’hypothèse et des
objectifs de l’étude. Elle vise à apporter les éléments essentiels pour la bonne
compréhension de la problématique de doctorat. Les trois sections subséquentes sont
constituées d’articles scientifiques, rédigés en langue anglaise, qui sont ou seront soumis à
des revues scientifiques.
Le chapitre II, intitulé “Cold gelation of β-lactoglobulin in the presence of iron”, a été
publié dans Journal of Food Science, 67(2) : 586-595. Les auteurs sont : Gabriel E
Remondetto, Paul Paquin et Muriel Subirade. La planification, la mise au point du
protocole et les manipulations ont été faites par Gabriel E Remondetto. L’analyse des
résultats et la rédaction de l’article ont été réalisés par Gabriel E Remondetto avec l’étroite
collaboration, critique et corrections de Muriel Subirade. Ce travail a été révisé par Paul
Paquin.
Le chapitre III, intitulé “Molecular mechanisms of Fe2+-induced β-lactoglobulin cold
gelation”, a été accepté pour publication dans Biopolymers. Les auteurs sont : Gabriel E
Remondetto et Muriel Subirade. La planification, la mise au point du protocole et les
manipulations ont été réalisées par Gabriel E Remondetto. L’analyse des résultats et la
rédaction de l’article ont été effectués par Gabriel E Remondetto avec l’étroite
collaboration, guide, critique et corrections de Muriel Subirade.
vi Le chapitre IV, intitulé “Influence of the microstructure of biodegradable whey protein
hydrogels in controlled iron delivery : an in vitro study”, est en préparation. Les auteurs
sont : Gabriel E Remondetto, Erick Beyssac et Muriel Subirade. La planification a été
réalisée conjointement par les auteurs. Toute la mise au point du protocole de dissolution a
été effectuée par Gabriel E. Remondetto et le docteur Erick Beyssac. Les manipulations,
l’analyse des résultats et la rédaction de l’article ont été réalisés par Gabriel E Remondetto
avec l’étroite collaboration, guide, critique et corrections de Muriel Subirade.
La cinquième partie, rédigée en français, présente les conclusions principales de ce travail
de recherche.
vii
Remerciements
Je souhaite à travers ces quelques lignes exprimer toute ma reconnaissance et ma gratitude
à différentes personnes qui, chacune à leur façon, ont rendu la grande aventure de doctorat
possible.
Cette thèse n’aurait vu le jour sans la confiance, la patience et la générosité de ma directrice
de recherche, Mme Muriel Subirade, professeur au Département des Sciences des Aliments
et de Nutrition, que je veux vivement remercier. La pleine confiance qu’elle m’a accordée,
m’a permis d’élaborer un plan de thèse personnel et propre à mes aspirations. Je voudrais
spécifiquement la remercier pour le temps et la disponibilité dont elle a fait preuve pendant
toutes ces années ainsi que pour avoir cru en mes capacités en me donnant une véritable
liberté d’action et ce, dans d’excellentes conditions logistiques et financières. De plus, les
conseils qu’elle m’a prodigués tout au long de la rédaction, ont toujours été clairs et précis,
me facilitant grandement la tâche et me permettant d’aboutir à la production de cette thèse.
Je remercie aussi le Dr. Paul Paquin, co-directeur de la thèse, qui m’a offert la possibilité de
travailler dans le cadre très stimulant de la Chaire Industrielle du CRSNG sur les propriétés
fonctionnelles des protéines sériques.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au docteur Paul Angers, professeur au
département des sciences des aliments et de nutrition de l’Université Laval et chercheur au
Centre de recherche en sciences et technologie du lait (STELA), au docteur Michel Britten,
chercheur responsable de la section laitière au Centre de recherche et de développement sur
les aliments (CRDA, Agriculture Canada, St-Hyacinthe), au docteur Mircéa-Alexandru
Mateescu, professeur de biochimie dans le département de chimie-biochimie de
viii l’Université de Québec à Montréal, et au docteur Érick Beyssac, professeur à la faculté de
pharmacie de l’Université d’Auvergne (Clermont-Ferrand, France) et chercheur co-
responsable de l’ERT Cidam (Équipe de Recherche Technologique Conception Ingénierie
et Développement de l’Aliment et du Médicament) qui ont accepté de juger ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr Thierry Lefèvre pour les fructueuses
discussions que nous avons eues ainsi que Madame Anne-Françoise Allain pour sa
précieuse collaboration technique et sa grande disponibilité.
Je voudrais également remercier mes amis, le Dr Aurelio Dominguez-Lopez, la Dre Maria
Guadalupe Macedo et Pierre Laflamme, pour leur appui et leur soutien moral. Je ne saurais
oublier mes amis argentins de l’Institut de technologie des aliments, en particulier Ing.
Rolando Gonzalez, et ceux de la Faculté de Biochimie de l’Universidad National del
Littoral qui malgré l’éloignement géographique, sont restés très proches ainsi qu’Eduardo
Marcelo Sobrero pour son inconditionnel soutien.
Je tiens à remercier l’Universidad Nacional del Litoral (projet FOMEC, Argentine), la
Chaire industrielle du Conseil National de la Recherche en Sciences et ingénierie du
Canada (CRSNG) sur les propriétés fonctionnelles des protéines sériques (titulaire : Dr.
Paul Paquin) et ses partenaires financiers (Agropur, CRSNG, Novalait et Parmalat), la
Fondation de l’Université Laval et la Chaire de recherche du Canada sur les protéines, les
bio-systèmes et les aliments fonctionnels (titulaire : Dre Muriel Subirade) pour leur
contribution financière indispensable à la réalisation de ce travail. .
ix
À celles qui m’ont aidé à me mettre
debout, ma mère et ma tante.
À ceux qui m’ont aidé à me maintenir
debout, Lara, Pablo et Marta
x Table des matières Résumé court.......................................................................................................................... ii Résumé long.......................................................................................................................... iii Avant-Propos ......................................................................................................................... v Remerciements..................................................................................................................... vii Table des matières.................................................................................................................. x Liste des tableaux................................................................................................................ xiii Liste des figures .................................................................................................................. xiv Liste des abréviations.......................................................................................................... xvi Chapitre I................................................................................................................................ 1 Problématique de recherche ................................................................................................... 1
1.1 Introduction générale ................................................................................................... 2 1.2. Revue bibliographique ................................................................................................ 5
1.2.1 Le fer ..................................................................................................................... 5 1.2.1.1. Le rôle du fer dans l'organisme ..................................................................... 6 1.2.1.2. Les conséquences des carences et sub-carences en fer sur la santé .............. 8 1.2.1.3. Les besoins en fer.......................................................................................... 8 1.2.1.4. Les sources alimentaires de fer et la biodisponibilité du fer alimentaire...... 9 1.2.1.5. Aliments enrichis en fer .............................................................................. 11 1.2.1.6. Réflexions sur une nouvelle stratégie ......................................................... 13
1.2.2. Hydrogels protéiques ......................................................................................... 16 1.2.2.1. Hydrogels .................................................................................................... 16
1.2.2.1.1. Sensibilité des hydrogels à l’environnement ....................................... 18 1.2.2.1.2. Les hydrogels sensibles aux variations de pH ..................................... 18 1.2.2.1.3. Hydrogels synthétiques vs. naturels..................................................... 19
1.2.2.2. Hydrogels protéiques .................................................................................. 20 1.2.2.3. Protéines du lactosérum .............................................................................. 24 1.2.2.4. La β-lactoglobuline ..................................................................................... 24 1.2.2.5. Mécanismes d’induction de la gélification de la β-lactoglobuline ............. 30
1.2.2.5.1. Gélification thermique ......................................................................... 30 1.2.2.5.2. Gélification à froid ............................................................................... 33
1.3. Hypothèse et objectifs ............................................................................................... 36 1.3.1. Hypothèse........................................................................................................... 36 1.3.2. Objectifs ............................................................................................................. 37
Chapitre II ............................................................................................................................ 39 Cold gelation of β-lactoglobulin in the presence of iron ..................................................... 39
Abstract ............................................................................................................................ 40 Résumé............................................................................................................................. 41 2.1. Introduction............................................................................................................... 42 2.2. Materials and Methods.............................................................................................. 47
2.2.1. Materials............................................................................................................. 47 2.2.2. Room temperature salt-induced gelation ........................................................... 47 2.2.3. Experimental design........................................................................................... 47 2.2.4. Statistical analysis .............................................................................................. 48 2.2.5. Color measurements........................................................................................... 48 2.2.6. Mechanical assays.............................................................................................. 49
xi
2.2.7. Relaxation test.................................................................................................... 50 2.2.8. Water-holding capacity ...................................................................................... 51 2.2.9. Scanning and transmission electron microscopy ............................................... 51
2.3. Results and discussion .............................................................................................. 53 2.3.1. Statistical analysis .............................................................................................. 53 2.3.2. Light reflectance and color analysis................................................................... 53 2.3.3. Mechanical assays.............................................................................................. 55 2.3.4. Water-holding capacity ...................................................................................... 58 2.3.5. Microstructure analysis ...................................................................................... 58
2.4. Discussion ................................................................................................................. 61 2.5. Conclusion ................................................................................................................ 64
Chapitre III ........................................................................................................................... 79 Molecular mechanisms of Fe2+-induced β-lactoglobulin cold gelation............................... 79
Abstract ............................................................................................................................ 80 3.1. Introduction............................................................................................................... 83 3.2. Experimental ............................................................................................................. 87
3.2.1. Materials............................................................................................................. 87 3.2.2. Methods.............................................................................................................. 87
3.2.2.1. FT-IR spectroscopy..................................................................................... 87 3.2.2.2. Dynamic oscillatory measurements ............................................................ 88
3.3. Results ....................................................................................................................... 90 3.3.1. FT-IR Study ....................................................................................................... 90 3.3.2. Reological study................................................................................................. 93
3.4. Discussion ................................................................................................................. 97 Chapitre IV......................................................................................................................... 109 Influence of the microstructure of biodegradable whey protein hydrogels in controlled iron delivery: an in vitro study .................................................................................................. 109
Abstract .......................................................................................................................... 110 Résumé........................................................................................................................... 111 4.1. Introduction............................................................................................................. 112 4.2. Materials and Methods............................................................................................ 115
4.2.1. Gels preparation ............................................................................................... 115 4.2.2. Dissolution experiments................................................................................... 115 4.2.3. Dissolution data analysis.................................................................................. 117
4.2.3.1. Preliminary data ........................................................................................ 118 4.2.3.2. Release Kinetics ........................................................................................ 118
4.2.4. Simulated iron intracellular absorption on intestinal wall ............................... 119 4.2.4.1. Culture cell preparation............................................................................. 119 4.2.4.2. Iron intracellular absorption...................................................................... 120
4.3. Results and Discussion............................................................................................ 121 4.3.1. Impact of environmental conditions on iron release ........................................ 121
4.3.1.1. pH-sensitive iron delivery ......................................................................... 121 4.3.1.2. Enzymes-sensitive iron delivery ............................................................... 124
4.3.2. Iron delivery in gastro-intestinal conditions .................................................... 127 4.4. Conclusions............................................................................................................. 130
Chapitre V .......................................................................................................................... 138 Conclusion et perspectives................................................................................................. 138
Conclusion générale ....................................................................................................... 139
xii
Perspectives du travail ................................................................................................... 142 BIBLIOGRAPHIE................................................................................................................... 143
Bibliographie :................................................................................................................ 144
xiii Liste des tableaux Table 2.1: Coded and uncoded level combinations for a 3-variable in Box-
Behnken model for β-lactoglobulin gelation. .............................................................. 65 Table 2.2: Results of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress,
ruture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC) for each condition of experimental design......................................................................... 66
Table 2.3: Analysis of variance of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC). .......................................................................................................... 67
Table 2.4: Regression coefficients of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC). .......................................................................................................... 68
xiv Liste des figures Figure 1.1: Position des ponts disulfure dans la β-lactoglobuline ....................................... 25 Figure 1.2: Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline. .......................................... 27 Figure 1.3: Structure du dimère de la β-lactoglobuline. ...................................................... 28 Figure 1.4: Modèles de mécanisme d’agrégation thermique (Lefèvre & Subirade,
2000) ............................................................................................................................ 33 Figure 2.1: Response surface graph of the light reflectance (L*) (pH 8) ............................ 69 Figure 2.2: Response surface graph of the a* parameter ([Protein]= 7.5 %)....................... 70 Figure 2.3: Response surface graph of the elastic constant (pH 8)...................................... 71 Figure 2.4: Response surface graph of the rupture stress (pH 8) ......................................... 72 Figure 2.5: Response surface graph of the relaxation (pH 8) .............................................. 73 Figure 2.6: Response surface graph of the k2 parameter (pH 8) .......................................... 74 Figure 2.7: Response surface graph of the water-holding capacity (WHC) (pH 8)............. 75Figure 2.8: Transmission electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-
lactoglobulin prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% protein (b); 10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d)..................................................................................................................... 76
Figure 2.9: Scanning electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% f protein (b); 10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d). ............................................................................................................. 77
Figure 2.10: Transmission (TEM) and scanning (SEM) electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin prepared with a 10 mM iron concentration and a 6% protein concentration at pH 7, TEM (a); pH 7, SEM (b); pH 8, TEM (c); pH 8, SEM (d); pH 9, TEM (e); pH 9, SEM (f). ........................ 78
Figure 3. 1: Deconvoluted spectra of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7: (a) native protein, (b) pre-heated protein (at 80oC, 30 min)....................................................... 101
Figure 3.2: Deconvoluted spectra of cold-gels of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7 (a) with 10 mM FeSO4 concentration; (b) with 30 mM FeSO4 concentration. ............... 102
Figure 3.3: Rheological behavior of cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in function time: (a) storage modulus G’, (b) loss modulus G”, and (c) the phase angle tanδ. ................................................................ 103
Figure 3.4: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: (a) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration, (b) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 30 mM of iron concentration. .................................... 104
Figure 3.5: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg (6% w/v) with 30 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-mercaptethanol, and (d) 1% SDS............................................................ 105
Figure 3.6: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-mercaptethanol, and (d) 1% SDS............................................................ 106
Figure 3.7: Mechanisms of denaturation/aggregation and gelation of cold-gels of β-lg: (a) random-aggregated gels and (b) filamentous gels. ...................................... 107
xv Figure 3.8: Mechanisms of three-dimensional organization of filamentous cold-
gels of β-lactoglobulin. .............................................................................................. 108 Figure 4.1: Scanning electron micrographs of β-lactoglobulin cold gels elaborated
in the presence of: (a) 10 and (b) 30 mM of iron (Remondetto et al., 2002)............. 131 . 131 Figure 4.2: Schematic representation of the device use in the dissolution test. (a)
The paddle apparatus II and extraction cell. (b) Extraction cell system. ................... 132 Figure 4.3: Effect of pH on the iron release (a and c) and matrix degradation (b
and d) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line) at pH 1.2 (a and b) and pH 7.5 (c and d)........................................................................ 133
Figure 4.4: Effect of enzyme on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line): pepsin pH 1.2 (a and b) and pancreatin pH 7.5 (c and d).......................................... 134
Figure 4.5: Impact of the GI conditions on the iron release (a) and matrix degradation (b) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line). .............................................................................................................. 135
Figure 4.6: Iron concentration (mg/L) inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+). ............. 136
Figure 4.7: Ferritin concentration in ng/mL inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+). ............. 137
xvi Liste des abréviations β-lg: β-lactoglobuline
2-Mer: 2-mercaptethanol
Ba 2+: Baryum divalent
Ca 2+: Calcium divalent
Cs+: Caesium monovalent
Cys : Cystéine
Da : Dalton
EDXA: Energy-dispersive X-ray analysis
Fe 2+: Fer divalent
FTIR: Fourier transform-infrared
G’: Module élastique
GRAS: Generally recognized as safe
K+: Potassium monovalent
Li+: Lithium monovalent
Mg 2+: Magnésium divalent
mM: Mili-molaire
Na+: Sodium monovalent
NMWL: Nominal molecular weight limit
Rb+: Rubidium monovalent
SDS: Sodium dodecil sulphate
SEM: Scaning electronic microscopy
SH: Groupe sulfhydryle
TEM: Trasmition electronic microscopy
WHC: Water-holding capacity
Chapitre I
PROBLÉMATIQUE DE RECHERCHE
2
1.1 Introduction générale
Le manque en micronutriments, spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un des
principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. D’après l'Organisation
Mondiale de la Santé, il concernerait plus d'un milliard d'individus (WHO, 1994; Thomas
& Frankenberg, 2002). Il touche en premier lieu les populations des pays en voie de
développement où il constitue la première cause d’anémie (Thomas & Frankenberg, 2002).
Dans les pays industrialisés, certains groupes de populations tels que les femmes en âge de
procréer et notamment les femmes enceintes, les jeunes enfants et les adolescents, sont
particulièrement exposés à une carence en fer (Hurrell, 1998; Bothwell, 2000; Moy, 2000;
Lynch, 2002).
Parmi les différentes stratégies adoptées pour pallier ce problème de santé publique, le
développement d’aliments enrichis en fer constitue une des avenues les plus intéressantes
(Lynch, 2002). Cependant, malgré tous les efforts déployés dans ce secteur, notamment aux
USA, les résultats escomptés sont loin d’être concluants (Hurrell, 1998; Hertrampf, 2002).
Une des principales raisons de cet échec est due au fait que le fer est particulièrement
sensible aux conditions de préparation des aliments - oxydation, pH, présence d’autres
nutriments, etc.- qui peuvent modifier sa biodisponibilité (Hurrell, 1997; Dary, 2002). Ceci
nécessite de développer des matrices alimentaires de structure bien définie dans lesquelles
le fer serait piégé et protégé jusqu’à son site d’absorption au niveau intestinal.
Différentes approches ont été élaborées pour protéger et transporter des composés
essentiels à l’organisme (Shahidi & Han, 1993; Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997;
Schrooyen et al., 2001). Parmi celles-ci, le développement d’hydrogels piégeant dans leur
réseau des molécules actives connaît un intérêt grandissant, notamment dans les domaines
3 biomédical et pharmaceutique (Park, 2002; Kikuchi & Okano, 2002). La possibilité de
moduler les propriétés des hydrogels pour permettre une libération contrôlée et ciblée des
molécules actives sous l’effet d’un simple stimulus tel que le pH ou la température a induit
un engouement important pour ce type de véhicules (Brannon-Peppas, 1993; Bae & Kwon,
1998; Gupta et al., 2002). Mais la plupart de ces matrices nécessitent soit l’utilisation de
polymères de synthèse soit l’utilisation d’agents chimiques ou de solvants organiques
incompatibles avec des applications alimentaires (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997).
Dans l’industrie alimentaire, les gels de biopolymères, sont largement utilisés en raison de
leurs propriétés nutritionnelles et de leur capacité à fixer la texture des aliments. De par
leurs propriétés – comestibles, biodégradables, etc.- ils pourraient constituer des matrices
de choix pour la protection de molécules sensibles telles que les micronutriments
(Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997; Schrooyen et al., 2001). Parmi les protéines
alimentaires utilisées en raison de leurs bonnes propriétés nutritionnelles et fonctionnelles,
les protéines du lactosérum sont certainement les plus intéressantes (Aguilera, 1995;
Hongsprabhas & Barbut, 1999; Bauer et al., 2000). La β-lactoglobuline, protéine majeure
du lactosérum, a fait l’objet de nombreux travaux tant sur le plan structural que fonctionnel
(Boye et al., 1997b; Boye et al., 1997a; Foegeding et al., 1999). Cette protéine globulaire
possède la capacité à former soit des gels thermiques (Foegeding et al., 1999; Ikeda &
Nishinari, 2001), soit des gels à froid (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements,
1998; Marangoni et al., 2000). Cette dernière caractéristique est particulièrement
intéressante pour le piégeage de molécules thermosensibles, notamment. De plus, élaborés
en présence de cations divalents, ces gels permettent le piégeage et le maintien des ions
dans le réseau via des liaisons électrostatiques protéines-ions.
4
Nous proposons d’étudier, dans le cadre de ce projet de recherche, l’aptitude des matrices
protéiques à piéger et transporter des micronutriments, en particulier du fer. De par sa
capacité à gélifier à froid en présence d’ions divalents, la β-lactoglobuline, protéine
majeure du lactosérum, constitue un matériau de choix pour l’élaboration d’hydrogels
piégeant des ions Fe2+. Ce travail s’articule autour de trois grandes parties.
Dans la première partie, nous présenterons une revue de littérature qui nous permettra de
dégager une hypothèse de travail et les objectifs de l’étude.
La seconde partie sera constituée de trois chapitres, présentés sous forme d’articles, dans
lesquels nous exposerons les résultats expérimentaux de ce travail ainsi que leur analyse. Il
s’agit, dans un premier temps, de présenter l’influence de différents paramètres -
concentration en protéine, concentration en fer et pH- sur la formation de gels à froid de β-
lactoglobuline et d’étudier l’impact de ces paramètres sur les propriétés macroscopiques
des gels obtenus. Dans un deuxième temps, nous présenterons les mécanismes de formation
des gels et étudierons les interactions responsables de leur stabilité. Enfin dans un troisième
temps, nous étudierons in vitro l’impact de différents paramètres – pH, enzymes..- sur la
libération du fer en relation avec la microstructure des gels en utilisant un système standard
de dissolution.
La dernière partie de ce travail sera consacrée à la conclusion et aux perspectives de cette
étude.
5
1.2. Revue bibliographique
1.2.1 Le fer
Le manque en micronutriments, spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un des
principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. D’après l'Organisation
Mondiale de la Santé, il concernerait plus d'un milliard d'individus (WHO, 1996). Il touche
en priorité les pays en voie de développement mais également, à un degré d'intensité
moindre, les pays industrialisés (Thomas & Frankenberg, 2002).
Ce problème a conduit de nombreux chercheurs à s’intéresser à la formulation d’aliments
enrichis en fer (Wapnir, 1990a; Hurrell, 1998; Van Der Meer et al., 1998). Plusieurs
produits alimentaires tels que le lait (Rivera et al., 1982), le sucre (Viteri et al., 1995) et les
condiments (la sauce du poisson et la poudre du curry) ont été fortifiés avec du fer.
Cependant, du fait de son interaction avec les autres ingrédients, le fer est souvent
faiblement absorbé (Hurrell, 1997) et l’efficacité de ces incorporations n'a jamais été
démontrée (Hurrell, 1998). Le fer est aussi souvent ajouté aux produits diététiques, tels que
les aliments pour enfants ou les aliments qui ont été conçus pour avoir un impact positif sur
la santé (aliments fonctionnels) (Malaspina, 1996; Hilliam, 1998). Ainsi, les produits
alimentaires fortifiés avec du fer peuvent améliorer les fonctions immunitaires (Bradley &
Xu, 1996; Walter et al., 1997), activer des enzymes importantes en prévenant certains
maladies, telles que des maladies cardio-vasculaires ou du vieillissement (Dreosli, 1996;
Pollitt, 1997). Plusieurs travaux démontrent l’effet du fer sur les anémies (De Andrada et
al., 1997; Walter et al., 1997; Pollitt, 1997; Lynch, 2002). Quelque soit l’environnement,
les femmes en âge de procréer et notamment les femmes enceintes, les jeunes enfants et les
adolescents constituent les groupes de population les plus affectés par le manque en fer
6 (Allen, 1997; Erkkola et al., 1998; Whittaker et al., 2001). De plus, ils varient suivant la
répartition géographique - 50% de personnes affectées dans les pays en voie de
développement et approximativement 10% dans les pays industrialisés (Hurrell, 1998).
Dans les pays en voie de développement, l’effet du manque en fer est aggravé par les
infections dues au ver intestinal, la malaria et le manque en vitamine A (Hurrell, 1998). Il y
a une évidence claire de l’effet du fer sur le développement de quelques tissus comme par
exemple le cerveau (Guesry, 1998). Par conséquent, on peut dire que le manque en fer a des
effets importants aussi bien sur le plan physiologique de l'individu, que sur la santé
publique et l’économie d’un pays (Thomas & Frankenberg, 2002).
1.2.1.1. Le rôle du fer dans l'organisme
Bien que présent en très faibles quantités dans l'organisme (0,005 % du poids corporel), le
fer joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques (Walter et al., 1997;
Yip, 2000). Il intervient dans la constitution de l'hémoglobine (protéine respiratoire des
globules rouges qui assure les échanges gazeux avec le milieu extérieur), de la myoglobine
(forme de réserve de l'oxygène du muscle) et d'enzymes jouant un rôle capital dans de
nombreuses réactions métaboliques. Il existe sous deux formes : le fer héminique et le fer
non héminique (Prasad, 1978). Le fer héminique (incorporé dans la structure de l'hème)
entre dans la constitution de l'hémoglobine, de la myoglobine et des enzymes
hémoprotéiques; le fer non héminique est présent dans certaines enzymes et correspond aux
formes de transport (par la transferrine) et de réserve du fer. Les réserves en fer de
l'organisme sont localisées au niveau du système réticulo-endothélial, notamment dans la
rate, la moelle osseuse et les muscles squelettiques et dans le parenchyme hépatique. Le fer
est distribué dans de nombreux organes au niveau de multiples localisations subcellulaires
7 et intervient ainsi dans des fonctions métaboliques variées (Benito & Miller, 1998; Nunez
et al., 2001).
Le fer circule dans le plasma lié à une protéine, la transferrine (ou sidérophiline). Chez les
humains, cette protéine a une capacité totale de fixation de l'ordre de 300 à 350 µg/dL, mais
elle ne transporte qu’environ 100 µg/dL de fer, le tiers de sa capacité (Hercberg et al.,
2000). D'autres protéines, telles que la lactoferrine et la ferritine, sont également
susceptibles de transporter le fer, mais elles n'ont, semble-t-il, aucun rôle dans le transport
physiologique du fer (Hercberg et al., 2000). L'originalité du métabolisme du fer tient au
fait qu'il s'effectue quasiment en circuit fermé. L'organisme est particulièrement économe
de son fer. Le pool du fer de l'organisme (4 g chez l'homme adulte; 2,5 g chez la femme
adulte) est en renouvellement permanent: le fer ayant servi à la synthèse de l'hémoglobine
est récupéré après la destruction des globules rouges et réutilisé. Les quantités de fer
quotidiennement éliminées sont très faibles, de 1 à 2 mg/jour, ce qui ne représente que
1/1000 à 1/4000 du pool total de fer de l'organisme. Mais cette faible élimination envers
l'extérieur est un facteur d'une extrême importance car en cas de non-compensation de ces
pertes par les apports alimentaires, il y a risque de déséquilibre de la balance en fer. Chez le
sujet sain, il existe un état d'équilibre entre les apports et les pertes. Cette balance peut être
deséquilibrée dans le sens de la carence en diverses circonstances : soit par insuffisance des
apports ou par diminution de l'absorption, soit par augmentation des pertes, soit par
augmentation des besoins. En cas de rupture de l'équilibre de la balance en fer, l'organisme
puise dans ses réserves disponibles; lorsque celles-ci sont épuisées, les fonctions
métaboliques dans lesquelles le fer intervient sont perturbées.
8
1.2.1.2. Les conséquences des carences et sub-carences en fer sur la santé
À côté du tableau clinique de l'anémie ferriprive, stade avancé de la carence en fer,
largement décrit dans les traités médicaux depuis plus d'un demi-siècle, se pose le problème
des éventuels effets néfastes de la carence modérée en fer, i.e avant le stade d'anémie. Il
faut garder à l'esprit que le fer participe dans l'organisme à des processus biochimiques
aussi importants que le transport des électrons au niveau mitochondrial, le métabolisme des
catécholamines, la synthèse de l'ADN. Mais les informations concernant les conséquences
de déficiences modérées en fer (les plus largement répandues dans les populations des pays
industrialisés) sur ces fonctions sont encore très limitées (Thomas & Frankenberg, 2002).
Certaines informations sont fournies par les travaux expérimentaux réalisés sur des modèles
animaux permettant de connaître le fonctionnement des systèmes enzymatiques dans
lesquels le fer intervient; d'autres proviennent d'études chez l'homme évaluant les effets de
la supplémentation en fer sur diverses fonctions de l'organisme (Hercberg et al., 2000). Ces
études montrent que des perturbations métaboliques liées au déficit modéré en fer peuvent
entraîner une réduction de la capacité physique à l'effort, une diminution des performances
intellectuelles, une moindre résistance aux infections, des perturbations au cours de la
gestation ou des anomalies de la thermogénèse.
1.2.1.3. Les besoins en fer
Les pertes basales journalières par desquamation des cellules des différentes surfaces du
corps humain, principalement des intestins, varient chez l'adulte de 0,9 à 1 mg de fer/jour,
ce qui correspond à des pertes d'environ 14 µg/kg. Pour les femmes de la puberté à la
ménopause, il est nécessaire d'ajouter aux pertes basales celles liées aux hémorragies
9 menstruelles soit environ de 0,4 à 0,5 mg/jour de moyenne annuel. Les besoins en fer sont
considérablement augmentés durant la grossesse, du fait de l'augmentation physiologique
de la masse érythrocytaire, de la constitution des tissus du fœtus et du placenta. Ces
dépenses spécifiques viennent s'ajouter aux pertes basales. Au total, c'est de plus de 1 g de
fer dont la femme enceinte a besoin pour assurer sa balance en fer au cours de la grossesse,
ce qui correspond à des besoins journaliers de 2,5 à 5,2 mg/jour en fonction du niveau des
réserves en fer au début de la grossesse.
Les besoins de l'enfant au cours de la première année de la vie sont considérables. Ils
doivent permettre la couverture des pertes basales, l'expansion de la masse érythrocytaire et
la croissance des tissus de l'organisme. Au cours de la première année de la vie, l'enfant né
à terme va tripler son poids de naissance et presque doubler son fer corporel. Compte tenu
des besoins liés à la croissance, les besoins totaux en fer sont considérables chez le jeune
enfant: à un an, ils sont de 8 à 10 fois supérieurs à ceux d'un adulte de sexe masculin
(lorsqu'ils sont exprimés par kg de poids corporel). L'accélération de la croissance,
particulièrement au cours des années de maturation sexuelle, s'accompagne également d'une
augmentation des besoins en fer. Chez les adolescentes, s’ajoutent les besoins en fer liés à
l'apparition des menstruations.
1.2.1.4. Les sources alimentaires de fer et la biodisponibilité du fer alimentaire
Seule une fraction du fer consommé est réellement absorbée. Les apports "réels" en fer
(apports qui traversent réellement la barrière digestive) dépendent donc du contenu en fer
des aliments, mais également de la biodisponibilité de ce fer (Hercberg et al., 2000).
10
La teneur en fer des aliments est très variable d'un aliment à l'autre: les aliments les plus
riches sont les abats et les légumes secs. Dans un régime de type occidental, les principales
sources de fer sont les produits carnés, les céréales, les fruits et légumes, ainsi que les
racines et tubercules amylacés. Mais, au-delà de fer présente dans l'alimentation, c'est la
qualité de ce fer qui constitue le facteur déterminant pour la couverture des besoins. En
terme de biodisponibilité, le fer alimentaire peut être divisé en deux types: le fer héminique
et le fer non héminique. Le premier, qui fournit de 10 à 15 % du fer alimentaire consommé
dans les pays industrialisés, se trouve dans l'hémoglobine et la myoglobine des viandes
rouges et est particulièrement biodisponible (de 20 à 30 %). Le fer non héminique fournit
par les céréales, les légumes, les fruits et les produits laitiers, a une absorption très variable
qui dépend de la nature et de la composition du repas. Certains facteurs favorisent ou
compromettent la biodisponibilité du fer non héminique. Selon l'action de ces facteurs,
l'absorption du fer à partir d'un repas peut varier de 1 à 20 % chez les individus ayant un
statut en fer comparable. Ainsi certaines protéines d’origine animale et différents acides
organiques, tel que l'acide ascorbique, stimulent l'absorption du fer non héminique. Par
contre, les polyphénols, y compris les tannins, les phytates et certains types de protéines,
ainsi que différentes formes de fibres alimentaires, entravent l'absorption du fer non
héminique. Parmi les aliments qui contiennent ces substances et qui inhibent donc
fortement l'absorption du fer, on trouve le thé, le café, le jaune d'œuf et le son.
Au total, selon la composition des régimes alimentaires, on peut considérer que le
coefficient d'absorption du fer varie de 5 % pour des repas à base de céréales et/ou de
racines-tubercules, pauvres en produits carnés et en vitamine C, à 15 % pour des repas
contenant des quantités importantes d'aliments carnés et de sources de vitamine C.
11
Toutes ces informations montrent qu’il est très difficile de remplir le besoin journalier en
fer avec un régime alimentaire normal en raison des nombreux facteurs susceptibles de
moduler sa biodisponibilité (Hurrell, 1997; Benito & Miller, 1998; Lynch, 2000; Lynch,
2002). Le développement d’aliments enrichis en fer constitue une alternative intéressante
pour pallier ce problème de santé publique.
1.2.1.5. Aliments enrichis en fer
L’incorporation de fer à des systèmes alimentaires présente de nombreux problèmes d’un
point de vue pratique. En effet, le fer est un composé très oxydable dont la solubilité varie
en fonction de sa forme d’oxydation. À pH 7, la solubilité de l’ion ferreux est de 0,1 M,
tandis que celle de l’ion ferrique est 10-16 M. De plus en présence d’oxygène, l’ion ferreux
réagit pour former l’ion ferrique, moins biodisponible (Prasad, 1978; Wapnir, 1990b;
Wapnir, 1990a). La préoccupation principale est de sélectionner un composé du fer qui va
être bien absorbé, qui ne doit pas être détérioré dans l’élaboration de l’aliment et ne doit pas
modifier les propriétés du produit final (Lynch, 2002). Une fois incorporé, le fer doit être
protégé de l’oxydation, de la précipitation et de toutes réactions susceptibles de diminuer sa
biodisponibilité. Il y a beaucoup de formes de présentation du fer mais toutes ne respectent
pas les conditions mentionnées. Ainsi pour des raisons organoleptiques, le sulfate ferreux,
qui est la forme la moins chère et la plus efficace, est uniquement utilisé dans les formules
pour bébé, dans quelques produits de la boulangerie destinés à la consommation rapide et
dans les pâtes qui ont un très bas taux d'humidité. Par contre, le fer élémentaire, le
pyrophosphate ferrique, l’orthophosphate ferrique, le fumarate ferreux et la saccharate
ferrique sont utilisés pour fortifier les céréales et d’autres aliments tels que le chocolat en
poudre, le riz, le sel, la farine du blé et les céréales du petit déjeuner. Mais ces
12 enrichissements ne sont pas comparables en terme de biodisponibilité relative. Ces
composants qui sont faiblement solubles dans l'acide dilué ont une biodisponibilité variable
chez l’homme. Comparé au sulfate ferreux (100), le pyrophosphate ferrique,
l’orthophosphate ferrique et le fer élémentaire, donnent généralement des résultats
inférieurs à 50. Quelques exemples montrent que chez l’homme, le pyrophosphate ferrique
varie de 21 à 74 et l'orthophosphate d’ammonium ferrique de 30 à 60 (Hurrell, 1998). Mais
en terme de biodisponibilité, le sulfate ferreux reste la meilleure source d’incorporation en
fer à condition de pouvoir le protéger de l’oxydation et de la précipitation (Lysionek et al.,
2002).
De plus, de nombreux facteurs affectent l’absorption intestinale du fer. Les composés
solubles dans l’eau, tel que le sulfate ferreux, se dissolvent instantanément dans le jus
gastrique, alors que les composés plus insolubles, tel que le fer élémentaire, se dissolvent
rarement complètement. Une fois dissous, le fer est absorbé mais son absorption peut être
modulée par les autres composants présents dans les repas, comme il a été mentionné
précédemment. Étant donné que la majorité de composés à base d’ion ferreux sont plus
biodisponibles que ceux à base d’ion ferrique, l’état ferreux sera à privilégier dans le cadre
d’une incorporation alimentaire.
A l’heure actuelle, les aliments fortifiés avec du fer n’ont pas démontré d’amélioration dans
l’absorption globale du fer. En effet, très souvent les aliments qui sont transporteurs du fer
contiennent également quelques facteurs qui inhibent son absorption. On peut, par exemple,
mentionner l’acide phytique contenu dans le blé et le maïs ou le calcium et les caséines
contenus dans les produits du lait. Le sel, les condiments et le sucre ne sont pas des
inhibiteurs mais sont consommés habituellement avec des légumes, des céréales, du thé ou
13 du café qui contiennent de l'acide phytique et des polyphénols. Les boissons au chocolat
contiennent un haut niveau de polyphénols (Hurrell, 1998). Par contre, certains composés
tels que l’acide ascorbique, les acides organiques et les tissus animaux améliorent
l’absorption du fer (Lynch et al., 1989; Hurrell, 1998; Lynch, 2002). De même, pendant la
digestion, les protéines alimentaires sont transformées en peptides qui peuvent se lier au fer
dans l’intestin et ainsi influencer son absorption. Ces effets peuvent être inhibiteurs ou
stimulants de l’absorption du fer, dépendant de la nature des protéines (Lynch, 2000). Les
protéines de soya, de l’œuf, ainsi que les caséines ont montré un effet inhibiteur sur
l’absorption du fer (Lynch et al., 1989; Hurrell, 1997; Benito & Miller, 1998; Lynch,
2000). L’effet inhibiteur des protéines de soya est dû à la formation de peptides résultant de
la digestion de la conglycinine (7S) qui présentent des interactions avec le fer avec la
formation de chélates qui empêchent le passage au niveau de la paroi intestinale. Les autres
protéines végétales présentent quelques comportements semblables (Lynch et al., 1989;
Hurrell, 1998; Cork, 2000).
D’autre part, certaines protéines animales, telles que la lactoferrine, ont montré un effet
stimulant sur l’absorption du fer (Hurrell, 1998). De même les protéines du lactosérum
forment par digestion des peptides susceptibles de fixer le fer favorisant ainsi son passage à
travers la barrière intestinale et améliorant sa biodisponibilité (Meisel, 2001).
1.2.1.6. Réflexions sur une nouvelle stratégie
À ce jour, les travaux de recherche menés sur l’incorporation de fer dans les aliments et
l’impact de ces aliments sur la santé de la population n’ont pas permis d’obtenir des
résultats concluants (Uauy et al., 2002). Les problèmes de stabilité et d’interaction avec les
autres nutriments doivent mieux être pris en compte pour le développement de formulations
14 d’aliments enrichis en fer ou d’aliments fonctionnels susceptibles d’améliorer la santé de la
population. Dans le développement d’aliments fonctionnels, la première étape à prendre en
considération est l’identification de l’interaction entre une molécule active de l’aliment et
une fonction de l’organisme. Dans le cas du fer, l’identification de ces interactions avec
l’organisme a été largement étudiée (Hurrell, 1997; Mai & Tan, 2000; Raja et al., 2000;
Schümann, 2001). La deuxième étape est d’établir une stratégie de protection, de transport
et de libération du fer dans les endroits cibles susceptibles de garantir sa biodisponibilité.
Pour protéger et transporter des composés essentiels dans des endroits cibles de
l’organisme, différentes stratégies ont été développées (Pothakamury & Barbosa-Canovas,
1997). Une des plus populaires ces dernières années consiste à encapsuler les molécules
d’intérêt dans des matrices polymériques (Lysionek et al., 2001). Cette approche trouve de
nombreuses applications dans des domaines pharmaceutique et cosmétique mais également
dans le domaine alimentaire que ce soit pour (i) l’encapsulation d’arômes, (ii) la protection
des vitamines et (iii) la libération contrôlée des composés actifs d’intérêt (Shahidi & Han,
1993; Brannon-Peppas, 1993). Une fois encapsulé, le composé d’intérêt est rajouté au
système alimentaire. Cependant l’inconvénient majeur dans ce type d’approche est
d’arriver à contrôler la stabilité du système et d’éviter les séparations de phases.
Une autre approche consiste à incorporer les molécules actives lors de l’élaboration d’un
réseau de type gel. Les gels de biopolymères constituent des véhicules de choix et
connaissent depuis quelques années un intérêt croissant surtout dans le domaine biomédical
ou pharmaceutique (Peppas, 1997; Philipon, 1997; Park, 2002; Kikuchi & Okano, 2002).
Ces hydrogels sont particulièrement versatiles et sont susceptibles d’être modifiés à souhait
pour produire une libération contrôlée de la molécule piégée (“relargage intelligent”)
15 (Brannon-Peppas, 1993; Bae & Kwon, 1998; Gupta et al., 2002) et atteindre un endroit
cible dans un temps donné (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997).
Dans l’industrie alimentaire, les gels de biopolymères, sont largement utilisés en raison de
leurs propriétés nutritionnelles et de leur capacité à fixer la texture des aliments. De par
leurs propriétés –comestibles, biodégradables, etc.- ils pourraient constituer des matrices de
choix pour la protection de molécules sensibles telles que les micronutriments et en
particulier le fer.
16
1.2.2. Hydrogels protéiques
1.2.2.1. Hydrogels
L'hydrogel est un réseau tridimensionnel de polymères hydrophiles dans lequel une grande
quantité d'eau est présente. En général, la quantité d'eau est comprise entre 20% et 95% du
poids total (Park & Park, 1996). La principale caractéristique de l'hydrogel est sa capacité à
gonfler en présence d'eau et à se contracter en l'absence d'eau. Cette propriété est
conditionnée par la nature des chaînes du polymère et par leur densité d’enchevêtrement.
Dépendant des interactions mises en jeu, les hydrogels peuvent être soit chimique soit
physique. Les hydrogels sont dits "chimiques" lorsqu’ils sont maintenus par des liaisons
covalentes. Les hydrogels chimiques atteignent un niveau de gonflement d'équilibre dans
des solutions aqueuses qui dépendent principalement de la densité de liaisons (estimée par
l’augmentation du poids moléculaire MW de la chaîne moléculaire). Ces gels ne sont pas
homogènes et contiennent habituellement des zones d’enchevêtrement élevé contenant peu
d'eau, dispersées parmi des zones de bas enchevêtrement qui présentent un gonflement
élevé (Hoffman, 2002). Dans certains cas, dépendamment de la composition du solvant, de
la température et de la concentration des solides durant la formation du gel, une phase de
séparation peut se produire, et des pores peuvent se former. De plus, les bouts de chaînes
libres et les boucles représentent des zones défectueuses qui ne peuvent contribuer à
l'élasticité du réseau.
Les hydrogels sont dits "physiques" quand ils sont maintenus par des liaisons notamment
de faible énergie incluant les forces ioniques, les liaisons hydrogène ou hydrophobes
(Peppas et al., 2000a; Peppas et al., 2000b). Les hydrogels physiques sont moins
homogènes que les hydrogels chimiques, car ils présentent de nombreuses régions
17 d’enchevêtrements élevés. Les bouts de chaîne libre et les boucles représentent aussi des
réseaux défectueux transitoires dans les gels physiques. Quand un polyélectrolyte est
combiné avec un ion multivalent de charge opposée, il peut former un hydrogel physique
connu sous le nom d'hydrogel "ionotropique". L'alginate de calcium est un exemple de ce
type d'hydrogel. De plus, quand les polyélectrolytes de charges opposées sont mélangés, ils
peuvent se gélifier ou précipiter suivant leur concentration, la force ionique ou le pH de la
solution. Les produits d'un tel système ionique interrelié sont connus comme complexes
"coacervats", polyions complexes ou polyélectrolytes complexes. Quelquefois, les gels
physiques peuvent former une sorte de reconnaissance biospécifique. Toutes ces
interactions sont réversibles, et peuvent être perturbées par de simples changements des
conditions du milieu tels que la force ionique, le pH, la température ou l'application d'un
stress.
Un autre aspect important à prendre en considération est la relation entre le réseau formé et
l’eau. Le caractère de l'eau dans un hydrogel peut déterminer la rétention des molécules
piégées dans des produits de type gel. Quand un hydrogel sec commence à absorber de
l'eau, les premières molécules d'eau entrant dans la matrice vont hydrater les régions les
plus "polaires" des groupes hydrophiles menant à de "l'eau primaire liée". Dès que le
groupe polaire est hydraté, le réseau gonfle, et expose les groupes hydrophobes, qui
interagissent alors à leur tour avec les molécules d'eau, menant à une organisation
particulière de l’eau de solvatation des régions hydrophobes ou une "eau secondaire liée".
Les eaux liées primaire et secondaire sont souvent combinées et simplement appelées "total
d'eau liée". Quand les zones polaires et hydrophobes auront interagi avec les molécules
d'eau liée, le réseau va imbiber de l'eau additionnelle, en raison de sa force d'énergie
d'osmose. Ce gonflement additionnel est opposé aux forces de liaisons parmi les molécules
18 du réseau, menant à une élasticité de la force de rétraction du réseau. Ainsi, l'hydrogel va
atteindre un niveau de gonflement d'équilibre. L'eau de gonflement additionnel est appelée
"eau libre" et est présumée remplir l'espace entre les chaînes du réseau, et/ou le centre des
pores plus larges. Quand le réseau est gonflé, si les interactions parmi les constituants du
réseau sont dégradées, le gel commencera à se désagréger et à se dissoudre, à un taux
dépendant de sa composition et des conditions environnementales.
1.2.2.1.1. Sensibilité des hydrogels à l’environnement
Les hydrogels sont tout d’abord utilisés pour protéger les molécules bioactives d'un
environnement hostile, i.e. présence d'enzymes ou variation de pH de l’organisme. De plus,
ils peuvent libérer ces molécules par simple réponse à des stimuli physiques ou chimiques
(Peppas, 1997; Philipon, 1997; Peppas et al., 2000a; Peppas et al., 2000b). Les stimuli
physiques incluent principalement la température, mais également les champs électriques,
la lumière, la pression, le son ou les champs magnétiques. Les stimuli chimiques ou
biochimiques comprennent le pH, les ions et la reconnaissance d'événements moléculaires
spécifiques (Bae & Kwon, 1998; Hoffman, 1998). Ces hydrogels sont particulièrement
utilisés dans diverses applications, tel que la fabrication de muscles artificiels, les valves
chimiques, l'immobilisation d'enzymes et de cellules, etc. (Qiu & Park, 2001). Les
hydrogels sensibles aux variations de températures sont très étudiés et sont, en général, de
nature synthétique (Kaneko & Sakai, 1998; Peppas et al., 2000a). Les hydrogels formés à
partir de polymères naturels sont, quant à eux, particulièrement sensibles aux variations de
pH (Miyata et al., 2002).
1.2.2.1.2. Les hydrogels sensibles aux variations de pH
19
Les hydrogels sensibles aux variations de pH contiennent des groupements acides -i.e.
acides carboxyliques - ou des groupements basiques -i.e. amines- qui acceptent ou libèrent
des protons en fonction du pH de l'environnement, générant des polymères ionisés connus
sous le nom de polyélectrolytes. C’est le cas, notamment des protéines.
Les hydrogels constitués de polyélectrolytes présentent de grandes différences dans leurs
propriétés de gonflement en fonction du pH de l'environnement. Les groupes acides ou
basiques des polyélectrolytes subissent une ionisation de la même façon que les groupes
acides ou basiques des monoacides ou monobases. Cependant, l'ionisation des
polyélectrolytes est plus difficile en raison des effets électrostatiques exercés par d'autres
groupes ionisés adjacents. Cela tend à produire une constante apparente de dissociation
(Ka) différente de celle du monoacide ou de la monobase correspondant. Ces groupements
ionisés entraînent le gonflement des hydrogels bien au-delà de ce qui peut être obtenu par
les polymères non-chargés. Puisque le gonflement des hydrogels polyélectrolytes est
principalement dû à la répulsion électrostatique entre les charges présentes sur la chaîne de
polymère, l'extension du gonflement est influencée par toute condition qui module la
répulsion électrostatique, tel que le pH, la force ionique, et le type de zwitterion.
Les hydrogels sensibles aux variations de pH sont très fréquemment utilisés dans le
développement de formulations administrées par voie orale. Le pH de l'estomac (< 3) est
très différent du pH neutre-alcalin (> 7.2) des intestins, et une telle différence est
suffisamment importante pour entraîner des comportements très différents en milieu gastro-
instestinal.
1.2.2.1.3. Hydrogels synthétiques vs. naturels
20
Il est possible de former des hydrogels soit à partir de polymères de synthèse, soit à partir
de polymères naturels. Très utilisés dans l’industrie pharmaceutique en raison de leurs
nombreuses possibilités, les polymères de synthèse ne peuvent pas être utilisés dans
l’industrie alimentaire qui nécessite la classification GRAS (Generally Recognized As
Safe) des constituants (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997). Par contre déjà largement
utilisés dans notre alimentation en raison de leurs propriétés nutritionnelles et
fonctionnelles –gélifiantes, notamment- les polymères naturels, et spécifiquement les
protéines, constituent des véhicules de choix pour le transport de molécules bio-actives
(Katzhendler et al., 2000).
1.2.2.2. Hydrogels protéiques
Un gel de protéines peut être défini comme un état intermédiaire entre une solution et un
précipité, où le liquide empêche l'effondrement du réseau en même temps que le réseau
empêche le liquide de s'écouler. Ceci nécessite un équilibre entre les interactions protéines-
protéines, protéines-eau, et des forces attractives et répulsives entre les chaînes
polypeptidiques adjacentes (Totosaus et al., 2002). Un réseau de protéines est généralement
maintenu par des liaisons non covalentes et résulte d’interactions hydrophobes, de liens
d'hydrogène ou d’interactions électrostatiques entre les chaînes polypeptidiques. Des liens
covalents de type ponts disulfure peuvent également intervenir dans l’élaboration du réseau.
La contribution relative de chaque type de liaisons est fonction des propriétés des protéines
et des conditions de l'environnement (Ziegler & Foegeding, 1990; Foegeding et al., 1992;
Totosaus et al., 2002). L'intégrité physique du gel est maintenue par le contre-équilibre des
forces d'attraction et de répulsion entre les chaînes protéiques. Le mécanisme de
21 gélification est déterminé par cet équilibre et les interactions protéine-solvant (Ziegler &
Foegeding, 1990; Clark, 1993; Lips et al., 1990; Totosaus et al., 2002)
Les interactions protéine-protéine et solvant-protéine affectent le type et les propriétés du
gel résultant (Ziegler & Foegeding, 1990; Foegeding et al., 1992; Totosaus et al., 2002).
Selon Phillips et al. (1994), les facteurs qui peuvent affecter la gélification peuvent être soit
intrinsèques soit extrinsèques.
Parmi les facteurs intrinsèques, on peut citer:
Les interactions électrostatiques - La charge nette de la molécule de protéine qui modifiee
les forces d'attraction et de répulsion, affecte les interactions protéine-protéine et protéine-
solvant (Phillips et al., 1994). Ces interactions électrostatiques sont le résultat des
changements de la force ionique ou du pH.
• Les ponts disulfure et les échanges thiol-disulfure - Les ponts disulfure, liens
covalents entre les chaînes polypeptidiques impliquées dans la gélification des
protéines augmentent la longueur apparente de la chaîne de polypeptide, au lieu de
réagir comme un stabilisant initial du réseau (Clark & Lee-Tuffnell, 1985; Li-Chan
& Nakai, 1989; Ziegler & Foegeding, 1990; Damodaran & Anand, 1997). Les liens
disulfure ne sont pas essentiels dans la gélification des protéines, mais leur rôle dans
la gélification est associé à leur capacité d'accroître le poids moyen du poids
moléculaire donc la longueur de la chaîne (Wang & Damodaran, 1990).
• La masse moléculaire - Les variations dans la résistance du gel peuvent être
rattachées aux différences dans le poids moléculaire et la forme hydrodynamique de
22
la protéine. Le poids moléculaire critique du polypeptide dans la formation d'un gel
est d'environ 23000 Da (Wang & Damodaran, 1990).
• La composition en acides aminés - La quantité d’acides aminés chargés versus
d’acides aminés hydrophobes joue un rôle important dans le processus de
gélification et les caractéristiques des gels résultants (Damodaran, 1988).
• L’hydrophobicité - L’association des acides aminés hydrophobes forme un amas
entouré par une couche résiduelle polaire en contact avec le solvant (Li-Chan &
Nakai, 1989). En raison de la propension des résidus d’acides aminés non polaires à
se positionner eux-mêmes à l'intérieur d'une molécule de protéine en solution, donc
évitant tout contact avec le milieu aqueux qui l'entoure, seulement une portion de
ceux-ci peut être retenue à l’extérieur constituant l'hydrophobicité effective. Ce type
d’hydrophobicité se réfère à la valeur représentant l'hydrophobicité de la protéine
impliquée directement dans les interactions entre les protéines et le milieu ambiant
(Li-Chan & Nakai, 1989; Totosaus et al., 2002).
Les facteurs extrinsèques sont les conditions de l'environnement entourant les protéines.
Ceux-ci peuvent être relativement bien contrôlés afin de parvenir à une bonne formation
d'un gel:
• La concentration en protéine - La concentration en protéine conditionne le nombre
d’enchevêtrements susceptibles de se former lors de la gélification. En-deçà d’une
concentration minimale appelée concentration critique, le réseau gel ne peut être
formé (Ferry, 1948). La solidité du gel et la possibilité qu'il se déforme sont
23
étroitement dépendantes de la concentration en protéine (Hongsprabhas & Barbut,
1997b; Totosaus et al., 2002)
• Le pH - La charge nette d’une protéine à son point isoélectrique est égale à zéro.
Cependant, plus l'environnement autour de la protéine s'éloigne de ce point
isoélectrique plus sa charge augmente. En conséquence, plus la charge nette est
grande sur une molécule de protéine, plus il y a de répulsions électrostatiques entre
les molécules, empêchant les interactions requises pour former la matrice de gel
(Langton & Hermansson, 1992; Ju & Kilara, 1998; Kavanagh et al., 2000)
• La température - La température est un des facteurs les plus importants parce
qu’elle conduit la force qui produit le dépliement des domaines protéiques lors de la
gélification thermique. Quand le coefficient de température de gélification est élevé,
la première étape de gélification ( la dénaturation) est complète bien avant la
seconde étape (l’aggregation). Ainsi, pour une vitesse de dénaturation donnée, le
taux d'agrégation est lent si les forces attractives entre les chaînes de protéines
dénaturées sont faibles, résultant en une fin réseau de gel translucide (Ferry, 1948).
• La force ionique - La force ionique a un effet significatif sur l'adsorption de l'eau, le
gonflement et la solubilité des protéines ainsi que sur les caractéristiques finales du
gel (Totosaus et al., 2002), et notamment sur sa microstructure (Stading et al., 1992;
Foegeding et al., 1992; Stading et al., 1993)
• Le type de sel - Les ions monovalents (Na+, Li+, K+, Rb+, Cs+) forment une matrice
gélifiée lorsque les forces ioniques sont de l’ordre de 100 mM alors que pour les
ions divalents (Ca2+, Mg2+, Ba2+) il suffit de faibles concentrations (10 -20 mM)
24
(Bryant & McClements, 1998; Marangoni et al., 2000). La concentration des sels
requise pour former un gel dépend de la position de l’ion dans la série d’Hofmeister.
Parmi les protéines alimentaires largement utilisées pour leurs propriétés gélifiantes, les
protéines de lactosérum constituent des substrats de choix en raison de leur capacité à
former des gels thermiques et des gels à froid. De plus, elles présentent un bon profil
nutritionnel. Pour ces différentes raisons, l’utilisation de ces protéines est une alternative
intéressante pour le retention de micronutriments.
1.2.2.3. Protéines du lactosérum
Les protéines du lactosérum constituent une des fractions protéiques du lait. Le lactosérum,
dérivé de l'industrie fromagère longtemps considérée comme un déchet, est aujourd'hui
récupéré en raison des propriétés de ses protéines. En effet, en plus de leur valeur
nutritionnelle, les protéines du lactosérum ont des propriétés fonctionnelles intéressantes,
incluant une très bonne aptitude à la gélification (Twomey et al., 1997). Elles sont utilisées
dans de nombreux produits alimentaires, en raison de leurs qualités nutritionnelles
(boissons) et technofonctionnelles (charcuteries, desserts). Ces propriétés sont
principalement dues à la β-lactoglobuline, protéine majeure du lactosérum.
1.2.2.4. La β-lactoglobuline
La β-lactoglobuline est une protéine globulaire dont la structure compacte et repliée résulte
d'un agencement particulier dans lequel les groupements apolaires (hydrophobes) tendent à
se placer vers l'intérieur de la molécule tandis que les résidus polaires (hydrophiles) sont
répartis principalement à la surface. Le repliement de la protéine suit un chemin séquentiel
25 unique et l'ensemble du processus est gouverné par la minimisation de l'énergie libre de
stabilisation du système. Le compromis thermodynamique et le respect d'un certain degré
de liberté de la chaîne polypeptidique font que la somme des interactions intramoléculaires
et de l'entropie de solvatation doit compenser l'entropie de la chaîne de manière à fixer la
protéine dans une configuration native hautement ordonnée donc de basse énergie.
La séquence primaire de la β-lactoglobuline comporte 162 acides aminés pour une masse
moléculaire de 18400g/mol. Elle contient deux ponts disulfure entre les résidus cystéine
(Cys) 66 et Cys 160, Cys 106 et Cys 119 ou 121. Un groupement sulfhydryle libre (-SH)
est positionné sur le résidu 119 ou 121 (Figure 1.1). Sept variants génétiques sont
actuellement connues: A, B, C, D, Dr, Dyak et E. Les variants A et B sont les plus
communs et se rencontrent dans des proportions voisines. Le variant A diffère du variant B
par la nature de deux résidus: Asp respectivement Gly en 64 et Val respectivement Ala en
118.
Figure 1.1: Position des ponts disulfure dans la β-lactoglobuline
26
La structure secondaire de la β-lactoglobuline a été étudiée par différentes techniques. Les
données de dispersion optique rotatoire et de dichroïsme circulaire suggèrent que la β-
lactoglobuline contient 10-15% d'hélice α, 43% de feuillet β, 47% de régions désordonnées
ce qui concorde avec les résultats de modélisation moléculaire: 15% d'hélice α, 50% de
feuillet β et 15-20% de coude β (Figure 1.2) (Papiz et al., 1986; Edwards et al., 2002).
La structure tertiaire de la β-lactoglobuline a également été déterminée. Les études
cristallographiques aux rayons X à haute résolution ont montré que cette structure consiste
en 5 feuillets anti-parallèles composés de neuf brins enroulés formant une sorte de calice
(Papiz et al., 1986). Le cœur de la molécule est constitué de 9 brins β anti-parallèles. Les
brins A à I comprennent les résidus 16-27, 39-44, 47-58, 62-76, 80-84, 89-97, 102-109,
115-124 et 145-150. Les brins E, F, G, H, A et I sont encadrés sur le côté- par une hélice α
à 3 tours (résidus 130-140). Les coudes β sont en position 44-47, 78-81, 84-85, 98-102 et
111- 115. Le brin I est impliqué dans la formation du dimère par des interactions anti-
parallèles avec son homologue sur la molécule voisine. La β-lactoglobuline appartient de
par sa séquence et sa structure à la super-famille des lipocalines (Brownlow et al., 1997).
Elles ont pour principales caractéristiques d'avoir une masse moléculaire voisine de
18000g/mol et de fixer et transporter de nombreux ligands hydrophobes, labiles et
insolubles.
27
Hélice α
Brin I
Figure 1.2: Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline.
La structure quaternaire de la β-lactoglobuline est très influencée par les conditions
environnementales. Les effets du pH, de la concentration en protéine et de la force ionique
sont rendus difficilement dissociables du fait de leur contribution souvent concomitante à la
formation d'une large gamme de structures quaternaires de la β-lactoglobuline. De pH 3 à 7
et à température ambiante, la β-lactoglobuline existe sous forme de dimère de masse
moléculaire 36700g/mol (Figure 1.3). Cette association serait due à des interactions
électrostatiques entre les résidus d’acide aspartique 130 et acide glutamique 134 d'un
monomère et les résidus lysine d'un autre monomère. Des interactions hydrophobes entre
les résidus isoleucine 29 et isoleucine 147 ainsi qu'un empilement des imidazoles des
résidus histidine 146 reliés symétriquement sont également mis en jeu (Papiz et al., 1986;
Jameson et al., 2002). Les données de cristallographie aux rayons X ont montré que le
dimère de β-lactoglobuline s'apparente à un ellipsoïde de longueur 69.3Å et de largeur
34.6Å composée de deux sphères de rayon 17.9Å, légèrement écrasées au niveau de leur
28 surface de contact, ce qui donne une distance centre à centre de 33.5Å, et liées entre elles
de manière non covalente (Papiz et al., 1986; Jameson et al., 2002). Cette structure possède
un axe de symétrie binaire perpendiculaire au grand axe du dimère. Le rayon de giration
calculé à partir de cette structure est de 21.6Å en accord avec celle déterminée en solution
(pH 5.7 à 25 oC µ=0.lM) par diffusion des rayons X aux petits angles (Brownlow et al.,
1997).
Figure 1.3: Structure du dimère de la β-lactoglobuline.
Entre pH 3.7 et 5.1, à basse température (0-4 oC) et pour une concentration supérieure à
15g/l, le dimère se tétramérise pour former un octamère d'environ 147000g/mol avec un
maximum d'octamérisation à pH 4,6 et 0 oC. L'implication de liaisons hydrogène entre les
groupements carboxyles des résidus de l’acide aspartique 64 localisés à l'interface
d'association des dimères serait probable puisque ce phénomène est plus important pour le
variant A que pour le B (Brownlow et al., 1997). Lorsque l'on s'éloigne de cette gamme de
pH, la protéine se monomérise et ce phénomène devient appréciable en-dessous de pH 3,5
29 et au-dessus de pH 7,5. Cette dissociation est d'autant plus importante que la concentration
et la force ionique sont faibles et que la température est élevée. Elle correspond à une
énergie libre d'association d'environ -25kJ/mol et résulte de la présence de forces
électrostatiques répulsives liées à l'augmentation de la charge nette de la β-lactoglobuline.
La dissociation n’induit pas de changement majeur dans la forme de la protéine (Aymard et
al., 1996) mais elle provoque des modifications dans sa structure secondaire (Lefèvre &
Subirade, 1999; Lefèvre & Subirade, 2001).
La β-lactoglobuline a une hydratation d’environ 35g d'eau pour 100g de protéine pour la
forme dimérique et de 60g d'eau pour 100g de protéine la forme octamérique (Aymard et
al., 1996). La cavité dans l'octamère pourrait être responsable de la plus grande partie de
l'eau liée à la molécule octamérique. En effet, des études de relaxation de protons par
résonance magnétique nucléaire ont montré qu’il y avait environ 5 à 6 molécules d'eau par
dimère soit 20 à 24 molécules d'eau par octamère.
Le point isoélectrique de la β-lactoglobuline diminue avec l’augmentation de la
concentration en KCl et CaCl2 (Renard, 1994). Il y aurait fixation de potassium et de
calcium sur la protéine isoionique. L'interaction préférentielle du NaCl avec la β-
lactoglobuline augmente significativement lorsque le pH diminue en raison d'une
distribution de charge singulière sur la surface de la protéine autour du pH neutre
conduisant à un moment dipolaire élevé égal à 730 Debye (Renard, 1994). Au-dessus du
point isoélectrique, le sodium est capable de se fixer aux groupements carboxyliques et
imidazoles; le nombre d'ions fixés par monomère passe de 0 à 2 lorsque le pH augmente de
6 à 9 (Boye et al., 1996).
30
De nombreuses études de fixation ionique sur la β-lactoglobuline montrent que cette
protéine est capable de fixer des molécules hydrophobes ou amphiphiles sur au moins deux
sites distincts. Aucun de ces sites n'affecte ou n'est affecté pas l'état dimérique de la β-
lactoglobuline mais par un état d'association plus élevé (Brownlow et al., 1997). La fixation
sur l'un des deux sites implique des changements dans l'environnement du groupement
sulfhydryle susceptible de conduire à la dissociation du dimère alors que la fixation sur
l'autre site semble impliquer dans certains cas un résidu tryptophane.
1.2.2.5. Mécanismes d’induction de la gélification de la β-lactoglobuline
La gélification de la β-lactoglobuline peut être induite par différents facteurs (température,
pression, présence d’urée, etc.) et conduire à des gels thermiques ou des gels à froid.
1.2.2.5.1. Gélification thermique
Le traitement thermique de la β-lactoglobuline entraîne des modifications de structures
pouvant conduire à sa gélification. Les principales étapes du phénomène sont le dépliement
et l'agrégation-gélification (Boye et al., 1997b; Bauer et al., 2000). Il faut cependant
différencier les mécanismes de dénaturation thermique de la β-lactoglobuline et les
mécanismes de gélification. Même si ces deux phénomènes peuvent se produire en même
temps, il est possible de les séparer en faisant varier la vitesse de chauffage (Renard, 1994;
Le Bon et al., 1999).
Le mécanisme de dénaturation thermique est très différent selon le pH de la solution
étudiée (Tang et al., 1995; Qi et al., 1995; Le Bon et al., 1999). Dès 40 oC à pH 6.8, les
dimères se dissocient, permettant ainsi l'exposition des groupements -SH libres, enfouis
31 auparavant à l'intérieur des dimères (Shimada & Cheftel, 1988; Verheul & Roefs, 1998;
Kavanagh et al., 2000). Entre 30 et 60 oC, de légères variations de la structure tertiaire de la
protéine sont déjà observées, entraînant une plus grande exposition des sites hydrophobes à
la surface de la protéine. L'exposition des sites hydrophobes est irréversible lorsque la
température dépasse 60 oC (Liu et al., 1994; Le Bon et al., 1999). Le dépliement de la
protéine durant le chauffage, dû à l'affaiblissement des liaisons intra et intermoléculaires,
entraîne donc un exposition des groupements hydrophobes, des groupements thiols et des
ponts disulfure qui favorisera l'agrégation ultérieure (Robin et al., 1993). Le mécanisme
d'agrégation est en grande partie dû à la réactivité des groupements thiols et des ponts
disulfure à la chaleur. Un autre travail (Sawyer, 1968) a cependant montré que la β-
lactoglobuline est capable de former des agrégats même en présence d'un agent bloquant les
groupements -SH. D'autres types de liaisons, telles que les liaisons hydrogène ou les
interactions hydrophobes peuvent alors intervenir jusqu’à la formation du réseau.
Le mécanisme de gélification thermique des protéines lactosériques, et plus
particulièrement de la β-lactoglobuline, a fait l'objet de nombreux travaux (Renard, 1994;
Tang et al., 1995; Twomey et al., 1997; Otte et al., 2000; Bryant & McClements, 2000b;
Ikeda & Nishinari, 2001). Différentes techniques telles que la rhéologie (Ikeda & Nishinari,
2001), la microscopie électronique (Langton & Hermansson, 1992; Barbut, 1995), la
microscopie à force atomique (Ikeda & Morris, 2002), et la spectroscopie infrarouge à
transformée de Fourier (Lefèvre & Subirade, 2000) ont été utilisées pour caractériser les
gels obtenus. Dépendant du pH de la solution protéique, il a été montré l’existence de deux
types de gels (Langton & Hermansson, 1992; Barbut, 1994). Entre pH 4 et pH 6, les gels
obtenus thermiquement sont opaques. Ces gels sont formés d'agrégats, et sont qualifiés de
coagulum ou gels particulaires. Les zones de jonction de ce type de gels sont constituées
32 d'un grand nombre de molécules protéiques. Ils sont divisés en deux catégories: entre pH 5
et pH 6, la structure du réseau gel est régulière, et la taille des particules est uniforme. Entre
pH 4 et pH 5, le réseau est plus non-homogène, avec des particules de tailles très
différentes. Les gels opaques ont une faible capacité de rétention d'eau (Barbut, 1995). À
des pH inférieurs à pH 4 ou supérieurs à pH 6, les gels obtenus thermiquement sont
translucides. Ils sont formés d'un réseau de brins, et qualifiés de filamenteux (Langton &
Hermansson, 1992; Ikeda & Morris, 2002). Les zones de jonction de ces gels sont
constituées de quelques molécules dont les liaisons font suite à une agrégation physique. À
des pH inférieurs à pH 4, les brins sont obtenus par un arrangement linéaire des monomères
et sont donc très fins. Le passage d'un réseau filamenteux à un réseau de type particulaire se
fait graduellement avec une augmentation du pH, les brins étant de plus en plus épais
lorsque la valeur du pH avoisine le pH 4. À pH 6, la transition entre gel particulaire (pH 6)
et gel filamenteux (pH 6.05) est immédiate. Les brins les plus fins sont observés à pH 9.
Les gels filamenteux acides ou basiques ont une excellente capacité de rétention d'eau et
sont très élastiques. La capacité élevée de rétention d’eau dans les gels filamenteux peut
être due à la présence de petits pores qui maintiennent l’eau libre par des forces capillaires.
Par contre dans les gels particulaires, la dimension des pores est beaucoup plus importante
conduisant à une expulsion plus grande d’eau libre de la structure du gel. Des travaux
récents réalisés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (Lefèvre & Subirade,
2000) ont permis de proposer des mécanismes moléculaires rendant compte de la formation
des gels filamenteux et particulaires schématisés sur la Figure 1.4.
33
Figure 1.4: Modèles de mécanisme d’agrégation thermique (Lefèvre & Subirade, 2000)
Les gels filamenteux résultent, dans une première étape, de la dissociation des dimères en
monomères, puis du dépliement des chaînes polypeptiques qui s’associent en filaments
pour enfin conduire à la formation d’un réseau tridimensionnel. Quant à eux, les gels
particulaires résultent de l’association de dimères partiellement dénaturés qui conduit à la
formation d’un gel.
1.2.2.5.2. Gélification à froid
La formation de gels à froid en présence d’ions a été particulièrement étudiée ces dernières
années (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998; Marangoni et al., 2000;
Totosaus et al., 2002). Ces travaux ont principalement porté sur l’étude de la gélification à
froid par le calcium (ions divalents) de protéines prédénaturées thermiquement (Roff &
Foegeding, 1996; Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b;
Hongsprabhas & Barbut, 1998). Cependant il a également été montré que les ions
magnésium et le baryum peuvent induire la formation de gels à froid (Roff & Foegeding,
1996).
34
Des études ont montré que le temps nécessaire pour arriver à une valeur maximale de G’est
approximativement compris entre 30 min et 2 hrs (Barbut & Foegeding, 1993). Les valeurs
de G’obtenues sont inférieures à celles trouvées pour les gels thermiques. De plus, dans le
cas des gels à froid, la fermeté des gels est maximale pour une concentration en calcium de
30 mM alors qu’il suffit de 10 mM dans le cas des gels thermiques (Hongsprabhas &
Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b). Contrairement aux gels thermiques, la
fermeté des gels à froid ne diminue pas significativement avec la concentration en calcium
(Hongsprabhas & Barbut, 1997b; Hongsprabhas & Barbut, 1998). Ces informations
suggèrent que le mécanismes de formation des gels thermiques et des gels à froid sont
différents.
Cette stratégie de gélification à froid pourrait être particulièrement intéressante en présence
de fer. En effet, les interactions ioniques entre le fer et les protéines pourraient être
comparables à celles obtenues entre le calcium et les protéines. De plus, le fer peut interagir
avec le groupe –SH des cystéines et les électrons disponibles de l’azote du groupe
imidazole de la chaîne latérale de l’histidine. Ces différentes interactions devraient lui
permettre de former des amas (“clusters”) avec les protéines et en même temps d’être
protégé et transporté par cette structure. Ce type de gels devrait être formé par des liaisons
de faibles énergies sensibles aux conditions environnementales, notamment aux variations
de pH de l’organisme lors d’une administration orale. L’impact de ces variations de pH et
de la présence d’enzymes digestives sur la structure de la matrice devrait conditionner le
transport et la libération du fer.
Pour pouvoir utiliser les gels à froid de β-lactoglobuline formés en présence de fer comme
matrice de transport de ce micronutriment, nous devons connaître les conditions de
35 formation des gels, leurs mécanismes de formation et leur comportement vis à vis des
conditions environnementales. Toutes ces informations nous permettront d’utiliser
potentiellement les gels à froid comme véhicule de transport du fer dans les systèmes
alimentaires et de contrôler sa libération et à terme, sa biodisponibilité .
36
1.3. Hypothèse et objectifs
Tel que présenté dans l’introduction et la revue de littérature, plusieurs travaux mettent en
évidence que le déficit en fer est un problème nutritionnel important dans le monde avec de
fortes conséquences sociaux-économiques. Parmi les solutions envisagées pour pallier ce
problème de santé publique, le développement d’aliments enrichis en fer est actuellement
l’avenue la plus exploitée. Cependant, cette approche ne conduit pas aux résultats
escomptés en raison de la diminution de la biodisponibilité du fer qui est due notamment, à
ses interactions avec les autres nutriments ou à sa réactivité dans les conditions de
préparation des aliments. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des véhicules
alimentaires susceptibles de protéger le fer et de le transporter au niveau de la barrière
intestinale pour optimiser sa biodisponibilité. Les matrices gélifiées ou hydrogels
constituent des supports de choix pour le transport de molécules bioactives et sont
largement exploitées dans le domaine pharmaceutique pour la libération ciblée des
molécules. Dans le domaine alimentaire, les protéines du lactosérum sont utilisées en raison
notamment de leur très bonne aptitude à la gélification. Ces protéines sont susceptibles de
former des gels à froid en présence d’ions divalents. Cette propriété pourrait être exploitée
pour le transport du fer dans sa forme Fe2+ et ainsi améliorer sa biodisponibilité.
1.3.1. Hypothèse
Les travaux de cette recherche viseront donc à valider l’hypothèse suivante : il est possible
de transporter le fer ionique et d’optimiser sa biodisponibilité en le piégeant dans des
matrices protéiques obtenues à froid à partir des protéines de lactosérum prétraitées
thermiquement.
37
1.3.2. Objectifs
L’objectif général de cette thèse est de comprendre le mécanisme de formation des gels à
froid de protéines de lactosérum en présence du Fe2+ et d’étudier l’impact des
caractéristiques des gels sur la libération du fer. Pour atteindre cet objectif, trois objectifs
spécifiques seront poursuivis :
Objectif 1 : Étude de l’élaboration des gels - Cet objectif vise à
étudier les conditions responsables de la gélification à froid de la β-lactoglobuline, protéine
majeure du lactosérum, en présence Fe2+. Plusieurs paramètres pouvant influencer
l’élaboration des gels tels que le pH de la solution, la concentration de protéine, et la
concentration de Fe2+ seront étudiés en relation avec les propriétés macroscopiques et
microscopiques des gels obtenus.
Objectif 2 : Étude des mécanismes de formation des gels - Cet
objectif vise à comprendre les bases moléculaires et structurales de la gélification à froid de
la β-lactoglobuline en présence de Fe2+ et à étudier les interactions responsables de la
formation des gels.
Objectif 3 : Étude des propriétés de libération des gels – Ce
dernier objectif vise à étudier l’impact de la structure des gels sur la libération de fer
ionique dans différentes conditions incluant les conditions du tractus gastro-intestinal et à
caractériser sa diffusion cellulaire par des techniques in vitro.
Au terme de ce travail, nous pourrons conclure en apportant de nouvelles informations sur
les mécanismes de gélification à froid de la β-lactoglobuline en présence de fer et sur le
comportement des gels dans des conditions in vitro qui simulent le système gastro-
38 intestinal. Ce travail permettra également de présenter des perspectives d’utilisation plus
large pour ces matrices protéiques en tant que transporteurs de molécules bio-actives.
Chapitre II
COLD GELATION OF β-LACTOGLOBULIN IN THE PRESENCE OF IRON
The content of this chapter has been published:
Remondetto, G. E.; Paquin , P. & Subirade, M. 2002.
Journal of Food Science. 67(2): 586-595.
40
Abstract
To protect and transport iron, we investigated the trapping properties of a network formed
from β-lactoglobulin. We studied the influence of different parameters—pH, iron, and
protein concentrations—on gel properties (optical and mechanical properties, water-holding
capacity and microstructure). For all conditions tested, the results show the formation of a
cold gel in the presence of iron. The mechanical properties reveal that the elastic behavior
and the strength of rupture increase with higher protein concentrations and decrease with
higher iron concentrations. The water-holding capacity is high for low iron concentrations.
The microstructure shows that, at low iron/protein ratios, a homogeneous filamentous
network is obtained whereas, at high iron/protein ratios, more random aggregated particles
are present.
Keywords: β-lactoglobulin, iron, gel properties, mechanical properties, microstructure
41
Résumé
Afin de protéger et de transporter le fer, nous avons étudié les propriétés de piégeage d’un
réseau formé à partir de β-lactoglobuline en présence de fer. L’impact de différents
paramètres –concentration en fer, concentration en protéine et pH- sur la formation des gels
a été étudié en relation avec les propriétés des gels obtenus (propriétés optiques, propriétés
mécaniques, capacité de rétention d’eau et microstructure). Pour toutes les conditions
testées, les résultats montrent la formation d'un gel à froid en présence de fer. Les
propriétés mécaniques révèlent que le comportement élastique des gels et la force à la
rupture augmentent avec la concentration en protéine et diminuent quand la concentration
en fer augmente. La capacité de rétention d’eau est élevée pour de faibles concentrations en
fer. L’étude microscopique des gels formés révèle que, pour de faibles rapports
fer/protéine, des gels filamenteux, ordonnés sont obtenus alors que, pour des rapports
fer/protéine élevés, des gels particulaires non-homogènes sont formés.
42
2.1. Introduction
Iron deficiency is the world’s most common nutritional disorder. It affects close to 2 billion
people (WHO, 1996; WHO, 1998; The Micronutrient Initiative, 1998). There is clear
evidence of a high prevalence of iron deficiency anemia in developing countries and, to
lesser extent, in the more industrialized parts of the world as well. The population groups
most affected are the preschool and school-age children as well as women of reproductive
age (Hurrell, 1998). Unfortunately, much of the ingested iron is poorly bioavailable
(Hurrell, 1997; Hurrell, 1998), which adds to the difficulties associated with the recovery
and prevention of iron deficiencies. Several concrete and well-defined actions successfully
contribute to the prevention and control of iron deficiency. They include food fortification,
supplementation, dietary improvement, and public health measures. The ideal strategy is to
improve the diet to include a large variety of iron-rich foods and to increase dietary iron
absorption (The Micronutrient Initiative, 1998). However, the iron incorporated into
complex systems such as foods confronts various problems, such as oxidation and
precipitation, resulting in its reduced bioavailability (Wapnir, 1990b; Hurrell, 1997;
Hurrell, 1998; Van Der Meer et al., 1998). For these reasons, the manufacture of food
systems that can effectively transport and protect iron represents a field of growing interest.
Different strategies have been developed to carry and protect bioactive molecules. A
strategy, which has recently been the subject of many studies (Brannon-Peppas, 1993;
Kamath & Park, 1993; Park & Park, 1996), consists of trapping molecules of interest in
networks. This approach has essentially been developed for the biomedical and
pharmaceutical sectors to transport drugs in a biodegradable hydrogel matrix (Park & Park,
1996; Philipon, 1997). Among the different hydrogels, protein gels are of particular
43 interest. Unfortunately, they are generally obtained upon heating a solution above the
denaturation temperature, which results in the deterioration of the thermosensitive
molecules (Kamath & Park, 1993). In the Food industry, the use of protein gels of high
nutritional value constitutes an interesting strategy for the protection of micronutrients such
as iron. Moreover, the presence of amino acids in the intestine is required to increase iron
bioavailability (Prasad, 1978; Wapnir, 1990b; Benito & Miller, 1998). This explains why
food formulations that contain both iron and amino acids are, from a nutritional point of
view, very valuable. A fundamental advantage to this approach is that the carrier gel adds
texture to the food, which constitutes a highly desirable functional property. For these
reasons, the formation of a protein matrix that can trap and protect the micronutrient is a
strategy of potential application in the manufacture of techno-functional foods.
Among the many animal and vegetable proteins, whey proteins, by-products of cheese
manufacture, are extensively used in food products because of their high nutritional value
and their ability to form gels. To induce gelation, whey protein (WP) requires heat
treatments or the addition of a denaturing agent (such as urea) (Xiong & Kinsella, 1990).
Heating protein dispersions causes molecular unfolding, which leads to aggregation and
gelation provided the amount of aggregated protein exceeds the critical concentration.
Drastic changes in the state of the gels can be brought on by small changes in external
conditions (Tanaka 1981). For example, the temperature of gelation, the pH, the gel type,
and the salt concentration all affect the final characteristics of the gels (Clark & Ross-
Murphy, 1987; Mulvihill & Kinsella, 1988; Ziegler & Foegeding, 1990; Boye et al., 1995;
Allain et al., 1999; Lefèvre & Subirade, 2000). Schmidt (Schmidt et al., 1978) found that,
at pH 7, whey protein concentrate (WPC) dispersions formed gels at 7.5% w/v protein,
when heated at 100oC for 10 min and at 5% protein with extended heating periods. With β-
44 lactoglobulin, the main WP (10% w/v, 90oC for 30 min, pH 8) or whey protein isolate
(WPI) (10% w/v, 80oC for 30 min, pH 7) dispersions, gelation will not occur unless salts
(about 5 mmol/L) are added (Kuhn & Foegeding, 1991). When a salt is added, the ions
shield the surface charge to reduce repulsion and facilitate aggregation to particulate gels
(Elofsson et al., 1997). Depending on the type and the concentration of the added salt, the
gels can form a wide range of structures, varying from soft, white, and curdy to translucent,
rubbery and firm (Kuhn & Foegeding, 1991). The pH in gel formation also plays a very
important role. Depending on pH conditions, two types of β-lactoglobulin gels are possible.
In salt-free solutions, gels are transparent above pH 6 and below pH 4. They are composed
of more or less flexible linear strands and are called “fine-stranded.” Between pH 4 and pH
6, gels are opaque. They are characterized by a random association into large and almost
spherical aggregates linked together to constitute the threads of the network. These gels are
called “particulate gels.” Rheological experiments have shown that these gels are less
elastic than fine-stranded ones (Stading & Hermansson, 1991) and their molecular
structures are also different (Lefèvre & Subirade, 2000).
Another protein gelation methodology has been developed by Barbut and Foegeding
(Barbut & Foegeding, 1993) where predenatured WPIs (10% w/v, 80oC for 30 min, pH 7)
will form salt-induced gels with the addition of CaCl2 at 25oC. Other studies have used
BaCl2 with similar results (Roff & Foegeding, 1996). The preheating step is essential to
cause enough molecular alteration in the protein molecules (for example, expose reactive
groups, open the structure), which is necessary for the formation of a network (Barbut &
Foegeding, 1993; Hongsprabhas & Barbut, 1998). The modified protein structures have
been reported to range from dimers to polymers and are MW-dependent and maintained by
disulfide bonds (Wang & Damodaran, 1991; Zhu & Damodaran, 1994; Hongsprabhas &
45 Barbut, 1998). Hongsprabhas and Barbut (Hongsprabhas & Barbut, 1997b) have shown
that WPI suspensions subjected to a preheating step (70oC for 30 min) resulted in opaque
gels, whereas higher preheating (90oC for 30 min) formed translucent gels after the addition
of CaCl2 by dialysis. This is probably due to the creation of low molecular weight (MW)
aggregates, compared to the high-MW aggregates formed at 90oC. Gels formed by
preheating to 70oC exhibited lower water-holding capacity (WHC) than those heated at
90oC. However, it was not clear whether the fine-strand gel structure resulting from
preheating at 90oC was due to a slow aggregation rate, or to differences in the exposed
reactive binding sites on the surfaces of the aggregates (Hongsprabhas & Barbut, 1997a).
Microstructure study confirms that the network formation processes are governed by CaCl2
concentration in the cold-set gelation resulting in different gelation mechanisms
(Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b; Hongsprabhas & Barbut,
1998; Hongsprabhas et al., 1999; Hongsprabhas & Barbut, 1999). The WP cold-set gel
exhibited higher gel strengths and water-holding properties compared to a heat-induced gel
produced with the same amount of CaCl2 (10 mM) (Hongsprabhas & Barbut, 1998). Many
recent studies have been essentially carried out in relation to cold gelation in the presence
of calcium, but the mechanism involved in this process remains unclear. In these studies, no
information exists on the iron-mediated cold-gelation. This methodology could prove to be
an interesting strategy to trap, protect and transport iron.
Thus, the objective of this study was to determine the possibility of producing a Fe2+ cold-
gelation of preheated β-lactoglobulin and to identify the influence of protein and iron
concentrations as well as pH values on this process. Such information could provide a
better insight into the mechanism(s) of cold-set gelation of globular protein in the presence
of iron.
46
47
2.2. Materials and Methods
2.2.1. Materials
β-Lactoglobulin was obtained from Davisco International, Inc.(Le Sueur, MN., U.S.A.). It
contained 98.2% protein measured by semi-micro Kjeldahl method (AOAC, 1984) using
N-factor 6.38. Ferrous sulfate (FeSO4) used in this study was of reagent grade (Analar;
BDH Inc., Toronto, Canada).
2.2.2. Room temperature salt-induced gelation
Preliminary studies showed that heat treatment at protein concentration higher than or
similar to 10% produces thermal gelation of β-lactoglobulin. Moreover, pH values lower
than 7 and higher than 9 resulted in aggregation or the gelation of the preheated protein
without the addition of salt. Iron concentrations below 10 or above 40 mM produced
nonauto-support gels. These preliminary studies allowed us to define the range of the
different variables used in this work.
β-lactoglobulin suspensions (9.5 % protein w/v) prepared in double-distilled water at pH 7
were heated at 80 oC for 30 min, then cooled to room temperature (24 oC) lasted 4 h. The
protein suspensions (6 to 9% protein w/v), adjusted to different pH values (7 to 9), were
mixed by vortexing with different volumes of a 1 M solution of FeSO4 (10 to 40 mM) at 24
oC.
2.2.3. Experimental design
The interactive effect of Fe2+ concentrations (10 to 40 mM), protein (6 to 9% w/v), and pH
(7–9) were investigated. A Box-Behnken experimental design was employed (Mason et al.,
48 1989). This design can be considered a particular fraction of the 33 factorial that allows the
estimation of all first-order and two-factor interaction terms and pure quadratic effects (Box
& Draper, 1987). The design consisted of 16 experimental points performed in random
order. The measured responses were: color parameter, strain rupture, stress rupture,
relaxation (300 s), and water-holding properties. Values of the variables corresponding to
the levels of the experimental design are shown in Table 2.1.
2.2.4. Statistical analysis
Results from the Box-Behnken design were analyzed by multiple regressions to fit the
following second-order equation to all dependent variables (for example, L parameter, a
parameter, elastic constant, rupture strain, rupture stress, relaxation (300 s) and water-
holding properties):
jn
iiij
n
iiii
n
iii XXbXbXbbY ∑∑∑
===+++=
11
2
10
where b0, bi, bii, and bij are constant regression coefficients of the model and Xi, Xj are the
independent variables (protein concentration, iron concentration and pH). A second-order
model, which included both the interactive and quadratic effects, provided a better
description of geometric shape of the response surface. Statgraphics Plus Professional V 4.1
(Manugistics Inc., Rockville, Md., U.S.A.) was used for all analyses.
2.2.5. Color measurements
The surface reflectance of prepared gels (on 20 mm-high and 25 mm-wide samples) was
measured with a Minolta Chroma Meter CR-200 (Minolta Camera Co. Ltd., Osaka, Japan)
using the CIE color system (CIE, 1996) to determine the color parameters L* = whiteness,
49 a* = green to red, and b* = yellow to blue. For each gel, L* and a* values were recorded in
triplicate from 5 samples.
2.2.6. Mechanical assays
Mechanical assays were carried out using a Texture Analyzer TA-XT2 (Stable Micro
Systems, Texture Technologies Corp., Scarsdale, N.Y., U.S.A.). Cylindrical gels (diameter:
25 mm, height: 20 mm) were placed between a stationary bottom plate and a moving upper
plate (10 mm/min); the plates were sprayed with a silicone lubricant to minimize friction.
The samples were axially compressed to 80% of their original height. The elastic constant
of gels was determined as the slope of the stress-strain curve in the initial linear range. Both
the rupture stress and the rupture strain were determined from the first point of inflection in
the stress-strain curve (Hamann, 1983; Tang et al., 1994).
Assuming that the specimens were essentially incompressible, the stress was calculated as:
LrLLF
2
)(π
σ ∆−=
where F is the compressive force, L is the original sample length, ∆L is the difference at the
corresponding deformation and r is the original radius (Tang et al., 1994).
The strain was calculated as Hencky strain (ε) (Hamann, 1983; Tang et al., 1994) using the
equation:
⎥⎦⎤
⎢⎣⎡ ∆
−−=LL1lnε
50
Results represent the average value for a minimum of 2 determinations for each of the 5
replicate gel preparations.
2.2.7. Relaxation test
Stress relaxation tests were performed with a Texture Analyzer TA-XT2 (Stable Micro
Systems, Texture Technologies Corp., Scarsdale, N.Y., U.S.A.). The samples (diameter: 25
mm, height: 20 mm) were subjected to a 5% deformation. The relaxation was evaluated
during 300 s. Results represent the average values for a minimum of 2 determinations for
each of the 5 replicate gel preparations.
According to the method of Peleg and Normand (Peleg & Normand, 1983), the
experimental stress relaxation curves are first normalized and linearized with:
( )( ) ( ) tkkt
t ⋅+=−⋅
2100σσ
σ
where σ (0) is the initial stress, σ (t) is the decaying stress after time t, and k1 and k2 are
constants. According to this equation, the reciprocal of k1 depicts the initial decay rate and
the reciprocal of k2 represents the hypothetical asymptotic level of the normalized
relaxation parameter. k2 represents the degree of solidity and varies between the value of k2
=1 for a material that is truly a liquid ( where all the stress relaxes) to k2 → ∞ for an ideal
elastic solid, where the stress does not relax at all (Peleg & Normand, 1983). Results
represent the average value for a minimum of 2 determinations for each of the 5 replicate
gel preparations.
51
2.2.8. Water-holding capacity
The water-holding capacity (WHC) was examined using a modified method of Kocher and
Foegeding (Kocher & Foegeding, 1993). Protein gels were formed in an ultrafiltration unit
(Millipore, Ultrafree-CL Filters, Yonezawa-shi, Yamagata-ken, Japan) consisting of a tube
(5 mL) and an inner tube (2 mL) with an ultrafiltration membrane of 5,000 NMWL
(nominal molecular weight limit). After 24 h, the unit was centrifuged at 4,000 g for 20
min. WHC was calculated as:
WHCW W
PT F=
−× 100
where WT is total quantity (g) of water in the sample, WF is quantity (g) of water released,
and P is the total grams of protein in the sample. Results represent the average value for a
minimum of 2 determinations for each of the 5 replicate gel preparations.
2.2.9. Scanning and transmission electron microscopy
Two different microscopy techniques were used to study the gels: transmission electron
microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Briefly, each sample (1x 1 x
2 mm) was fixed in 2% glutaraldehyde + 1% paraformaldehyde in 0.1 M PIPES buffer at
pH 7 for 6 h, rinsed, postfixed in 1% OsO4 overnight, and dried in a graded series of
ethanol. For TEM, the samples were embedded in Epon, thinly sectioned, stained with
uranyl acetate and lead acetate. Samples were viewed at 80 kV using a JEOL 1200EX
(JEOL Ltd., Akishima, Japan ) instrument. For SEM, each sample was critical-point-dried,
sputter-coated with 30 nm of gold/palladium. Samples were viewed at 15 kV using a JEOL
JSM 35CF instrument. The samples were analyzed using an SEM system combined with
52 EDS, also known as energy-dispersive X-ray analysis (EDXA) of Noran Instruments
(Middleton, WI., U.S.A.).
53
2.3. Results and discussion
2.3.1. Statistical analysis
Table 2.2 shows the data obtained for the light reflectance parameters (“L” and “a”), the
elastic constant, the rupture stress and rupture strain, the relaxation, the K2 parameter, and
the water-holding capacity. Table 2.3 displays the analysis of variance for each response.
Table 2.4 shows the regression coefficients of the model for the response analyses, with
these coefficients a second order polynomial equation (Equation 2.1) is obtained that
describes the evolution of each response as a function of the independent variables of the
model.
Equation 2.1
Y b b X b X b X b X X b X X b X Xb X b X b X
= + ⋅ + ⋅ + ⋅ + ⋅ ⋅ + ⋅ ⋅ + ⋅ ⋅
+ ⋅ + ⋅ + ⋅0 1 1 2 2 3 3 12 1 2 13 1 3 23 2
11 12
22 22
33 32
3
where b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b11, b22 and b33 are constant regression coefficients of the
model, and X1, X2 and X3 are the independent variables (protein concentration, iron
concentration, and pH). Each model can describe the interrelationship of the response
evaluated with the variables. In all cases, the lack of fit is not significant and the total
regression is significant (p ≤ 0.05).
2.3.2. Light reflectance and color analysis
The analysis of variance of the L* parameter of light reflectance is presented in Table 2.3;
it shows that the significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron
concentration, the linear of the protein concentration, and cross-product of the iron
concentration with the protein concentration, suggesting that these factors play an important
54 role on L* parameters. The linear, quadratic, and cross-product terms in the second-order
polynomial were used to generate 3-dimensional response surface graphs presented in
Figure 2.1. Internal L* values show that gel opacity increases as a function of iron
concentration in the range 10 to 30 mM, protein concentration in the range 6 to 9%, and
their interactions, indicating that these variables determine the increment in aggregate size.
This suggested that both factors resulted in large aggregate formation within the gel
network. Barbut (Barbut, 1995) showed that increasing [CaCl2] from 10 to 150 mM in 10%
WPI suspensions progressively increased protein strand size, and later aggregate size, as
determined by SEM and TEM; a similar trend of increasing gel opacity was also reported.
Iron addition to the preheated 6% β-lactoglobulin suspensions resulted in the formation of
gels with lower L* values compared to those obtained with higher protein concentrations
(Figure 2.1). This indicates that a finer protein strand network was formed at lower protein
concentration. The fine-strand gel network is usually the result of less aggregation and a
higher order in the gel structure (Hongsprabhas & Barbut, 1997b).
The analysis of variance of the a* parameter in Table 2.3 shows that the significant terms (p
≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the quadratic of the pH, the cross-product
of the iron concentration with the pH, and also the cross-product of the iron concentration
with the protein concentration. It is important to note that the significant terms (p< 0.01)
include the pH, suggesting that this variable plays a very decisive role in this response.
Figure 2.2 shows the response surface graph for the a* values. On one hand, this parameter
increases with the iron concentration at pH 7 and diminishes with higher iron
concentrations at pH 9, with a maximum near pH 8.5. In this particular case, the gel color
can be related to iron oxidation state. It is known that a solution of iron (II) salt is pale
55 green, whereas a solution of iron (III) salt is usually reddish-brown (Melnick, 1962). With
excess alkali (pH ≥ 9), the ferrous solution is oxidized to a dark green oxyhydroxide
compound (Gallais, 1950). The established relationship between the state of iron oxidation
and gel color suggests that the a* value could be used as an indicator of the changes of
oxidation state of the iron inside the gel matrix. The iron oxidation state is also related to
the pH of the medium (Gallais, 1950). Consequently, the changes in the pH, which produce
a variation in the iron oxidation state, modify the color of the gel and thus induce a change
in a* value. This could explain the significance of the crossed product between the iron
concentration and the pH of the statistical model. On the other hand, the a* value
diminishes with higher protein concentrations, suggesting that protein concentration
protects the iron (II) state from the oxidation. From these results, it can be concluded that
certain conditions, such as pH values between 7 to 8 and high protein concentrations, favor
the prevalence of the iron (II) state. Nutritionally speaking, this point is very important,
since iron (II) has been shown to be highly bioavailable (Prasad, 1978; Hurrell, 1997).
2.3.3. Mechanical assays
The behavior of compressed foods is one of the easiest and most important mechanical tests
to perform. The slope of the initial straight-line portion of the test constitutes the elastic
modulus or the apparent Young’s modulus and characterizes the elastic behavior of the
material (Tang et al., 1994; Hongsprabhas & Barbut, 1998; Marangoni et al., 2000).
The analysis of variance of the elastic constant in Table 2.3 shows that the significant terms
(p ≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the protein concentration and pH, the
quadratic of the protein concentration, and the cross-product between the iron concentration
with the pH. Figure 2.3 displays the response surface graph, which shows that the elastic
56 constant increases with protein concentration and with decreasing iron concentration.
Moreover, the polynomial equation (Table 2.4) shows that the elastic constant decreases
with the pH. The effect of the pH suggests that the electrostatic interactions play an
important role in the consolidation of the gel structure.
The analysis of variance of the rupture stress, presented in Table 2.3, shows that the
significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the protein
concentration, and the pH; the quadratic of the iron concentration and the protein
concentration; and the cross-product terms of iron concentration with pH and of iron
concentration with protein concentration. Figure 2.4 displays the response surface graph. It
can be observed that rupture stress increases with protein concentration, and decreases with
iron concentration. Moreover, the polynomial equation (Table 2.4) has shown that the
rupture stress decreases with higher pH values, suggesting that the electrostatic interaction
play an important role in the consolidation of the gel structure. These results show that
rupture stress is more important at higher protein concentrations, at lower iron
concentrations, and at pH 7, suggesting that in these conditions there are greater
interactions between the molecules or particles that form the network.
Table 2.3 presents the analysis of variance of the rupture strain. This analysis shows that
the significant terms (p ≤ 0.05) are the linear and the quadratic of the iron concentration, the
linear protein concentration, and the cross-product between iron concentration and protein
concentration. The main effects plots for this response (not shown) shows that rupture
strain decreases when the iron concentration increases. This indicates that the rupture strain
is more important at low iron concentrations. Errington and Foegeding (Errington &
Foegeding, 1998) have reported that an increment in the rupture strain is related to an
57 increase in the rubber behavior of proteins gels. It is then possible to associate a rubber
behavior of the protein gels to low iron concentrations.
The relaxation can be interpreted as an index of the elastic behavior of the material. A
relaxation of 0% is characteristic of a Hooke solid-like behavior (absolutely elastic
behavior) while a relaxation of 100% is characteristic of liquid-like behavior. Analysis of
this response shows that the significant terms (p ≤ 0.05) are the linear and the quadratic of
the iron concentration, and the linear protein concentration. Figure 2.5 displays the
response surface graph. Relaxation diminishes when the protein concentration increases.
Moreover, it increases with iron concentration until a maximum of 30 mM and then
decreases. These results indicate that the elastic behavior of the material is higher with low
iron and high protein concentrations.
According to the method Peleg and Normand (Peleg & Normand, 1983), the determination
of the k2 parameters results in regression coefficients (R2) that exceed 0.99. Table 2.3
displays the analysis of variance using the k2 parameters. This analysis shows that the
significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron concentration, and
the linear of the protein concentration. Figure 2.6 displays the response surface graph. It
shows that the elasticity (evaluated for k2) increases with higher protein and lower iron
concentrations; this behavior is similar to that obtained for the elastic constant (Figure 2.3).
These results demonstrate that the elastic behavior of the material is essentially influenced
by the iron and protein concentrations.
58
2.3.4. Water-holding capacity
The analysis of variance of the water-holding capacity (WHC) in Table 2.3 shows that the
significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron concentration and
the linear of protein concentration. Figure 2.7 displays the response surface graph. It is
observed that the WHC diminishes with increasing iron and protein concentrations. Higher
protein concentrations seem to induce the expulsion of the water due to an increase of
molecular interaction. Moreover, the observed decrease of WHC with higher iron
concentrations suggests that the latter plays a very important role in the network formation
process.
2.3.5. Microstructure analysis
We have selected different conditions to study microstructures with electronic microscopy
(TEM and SEM). Four samples were produced at pH 7 at two protein concentrations (6 and
9%) and at two levels of iron concentrations (10 and 30 mM ). Three samples (6% protein
and 10 mM iron) were produced at pH 7, 8, and 9.
Figure 2.8 displays TEM micrographs of the four samples analyzed, selected at pH 7.
Figure 2.8a shows the TEM micrograph of a gel with a 6% protein concentration and 10
mM iron concentration. This gel has a homogeneous structure of evenly sized particles and
pores. Figure 2.8b shows the TEM micrograph of a gel with the same protein concentration
(6%) but with 30 mM iron concentration. This gel has a nonhomogeneous structure with
large pores. Figure 2.8c shows the TEM micrograph of a gel with a 9% protein
concentration and a 10 mM iron concentration. This gel presents a homogeneous structure
similar to the one observed in the Figure 2.8a. However, it exhibits a higher density and has
59 smaller pores, mainly due to the increase in protein concentration. Figure 2.8d is the TEM
micrograph of a gel with a 9% protein concentration and 30 mM iron concentration. This
micrograph presents a nonhomogeneous characteristic, with an elevated density due to the
protein concentration and the large pores, which is smaller than in Figure 2.8b. These
results show that increasing protein concentration from 6 to 9% resulted in an elevated gel
density, which, in turn, resulted in a decrease in pore size. An increase in iron concentration
from 10 to 30 mM leads to a decrease in gel homogeneity and an increase in the irregularity
and in pore size.
Figure 2.9 displays SEM micrographs of the 4 analyzed samples selected at pH 7. Figure
2.9a shows the SEM micrograph of a gel with a 6% protein concentration and a 10 mM iron
concentration. This gel has a filamentous structure with large pores. Figure 2.9b presents
the SEM micrograph with a 6% protein concentration but with a 30 mM iron concentration.
This gel has a nonhomogeneous structure of random aggregates with large and irregular
pores. Figure 2.9c displays the SEM micrograph of a gel with a 9% protein concentration
and a 10 mM iron concentration. This gel presents a filamentous structure similar to that
observed in Figure 2.9a. However, it has a more compact structure and smaller pores,
mainly due to the increase in protein concentration. Figure 2.9d is the SEM micrograph of
gels with a 9% protein concentration and a 30 mM iron concentration. This gel presents a
nonhomogeneous structure of random aggregates with large and irregular pores. In this
condition, the aggregates are bigger than in the “2.9b” condition (6% protein concentration
and a 30 mM iron concentration) possibly due to elevated protein concentration. SEM
clearly shows 2 types of gels; one that exhibits chains, forming a true 3-dimensional and
filamentous network (Figures 2.9a and 2.9c), and another having the characteristic of a
structure formed by a random aggregation (Figures 2.9b and 2.9d). The images show a
60 greater number of open microstructures (large pores) when the protein concentration is low
(Figure 2.9a) and greater structure compactness when the protein concentration is high
(Figure 2.9c). Moreover, according to our analysis, increasing the iron concentration from
10 to 30 mM changes the gel structure from filamentous to random aggregates. These
results are obtained by comparing gels with the same protein concentration, this is why we
consider more convenient to establish the analysis as a function of the [iron] / [protein]
ratio. This ratio indicates that, at elevated values (higher iron concentration for protein
molecules), the gel exhibits random aggregation and, at lower values, the gel is more
filamentous and compact.
Figure 2.10 displays TEM and SEM micrographs of the 3 analyzed samples with a 6%
protein concentration, 10 mM iron concentration, and different pH values. Figures 2.10a
and 10b, respectively, show TEM and SEM micrographs of a gel at pH 7. These
micrographs display a homogeneous structure with filamentous characteristics. Figures
2.10c and 10d present, respectively TEM and SEM micrographs of a gel at pH 8. TEM
(Figure 2.10c) does not reveal significant differences with Figure 2.10a. SEM (Figure
2.10d) reveals structure contraction with the formation of needles and the loss of continuity
in the network. These characteristics are intensified at pH 9, they are displayed in
micrograph Figure 2.10e and Figure 2.10f.
The studies carried out with SEM-EDS in the different regions of each gel ensure that the
iron distribution is homogeneous and suggests that the irregularities observed previously
are due to different organizational conformations of the protein molecules alone.
61
2.4. Discussion
In the previous section, it was shown that preheated β-lactoglobulin suspensions could form
gels at room temperature (24oC) by the addition of Fe2+. Results indicate that the
characteristics of cold-set gels in the presence of iron can be modified by changes in the
pH, the protein and /or iron concentration. The data obtained—L* parameter, mechanical
behavior, water-holding capacity, and microstructure characteristic—for Fe2+-induced cold
gels of β-lactoglobulin show similarities with those obtained in different studies for Ca2+-
induced cold gels, suggesting that the mineral-protein interactions are of similar nature, that
is, mainly electrostatic (Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1998;
Bryant & McClements, 1998; Bryant & McClements, 2000a; Marangoni et al., 2000). This
type of interaction is reversible and can be modulated by environmental conditions (Kyte,
1995).
Moreover, data analysis reveals different types of gels. When iron/protein ratios are low
and the pH value is close to 7, gels are homogeneous and filamentous and are characterized
by an elastic behavior and a high resistance to rupture. These results suggest that strong
particle-particle interactions occur. Moreover, the gel opacity is low (low L* parameter)
indicating small aggregate size, in accordance with other mineral-protein systems
(Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Marangoni et al., 2000). The study of the a* parameter
shows that these conditions favor the prevalence of Fe2+. Moreover, the high WHC, due to
the high capillary force (Hongsprabhas & Barbut, 1998), and the low L* parameter, due to
small aggregate size, are indicative of a compact matrix structure with low size of inner
structure space. This could affect iron retention.
62
However, when iron/protein ratios are high and pH values are above 7, gels are
nonhomogeneous with random aggregation and are characterized by lower elastic behavior
and rupture resistance. This suggests that weak particle-particle interactions occur.
Moreover, they have a lower water-holding capacity due to larger and less homogeneous
pore sizes (Barbut, 1995; Hongsprabhas & Barbut, 1998), leading to a less pronounced
elastic behavior of the gels (Tanaka, 1981). Recently Katzhendler and others (Katzhendler
et al., 2000) showed a correlation between the elasticity and gel strength and release
kinetics from proteineous matrices, indicating that the matrices are more elastic and with
higher gel strength retain more strongly the trapped molecules. This information suggests
that the retention of Fe2+ would be less important in the randomly aggregated gels than that
of filamentous gels.
Moreover, the macroscopic properties reveal that, at intermediate iron/protein ratios,
filamentous and random aggregate structures are mixed together. An increase in iron
concentration involves changes in the structure from fine-stranded to random aggregates,
with a concomitant decrease in gel strength, elasticity, and WHC. This suggests that the
iron concentration can control the macroscopic properties of β-lactoglobulin gels.
These results corroborate those obtained by Doi (Doi, 1993) for thermal gelation of
globular proteins such as β-lactoglobulin. The same study also showed that the 2 types of
gel, random aggregates or fine-stranded, are formed depending on the environmental
conditions and showed that an increase in ionic strength is not only accompanied by a
change in the structure from fine-stranded to random aggregates, but by a decrease in gel
strength as well. These results show strong similarities between cold and thermal gelation
of β-lactoglobulin.
63
Moreover, we saw in preliminary experiments that, in the first step of cold-gelation, before
the addition of cation, β-lactoglobulin could form a gel when the protein concentration
reached a limit concentration (10%), which the critical concentration requires to form a gel
matrix (Ross-Murphy, 1991; Foegeding et al., 1999). Consequently, cold and heat gelation
could be intimately related. When the protein concentration is below the critical
concentration, the heat-denatured proteins aggregate upon the addition of cation, while
when the protein concentration is over the critical concentration, the unfolded molecules
aggregate spontaneously and form a 3-dimensional network.
64
2.5. Conclusion
Preheated β-lactoglobulin suspensions can form gels at room temperature (24°C) by the
addition of Fe2+ in all conditions used. The mechanical properties reveal that the elastic
behavior and the strength of rupture increase with higher protein concentration and
decrease wit higher iron concentrations. The water-holding capacity is high for low-iron
concentrations. The microstructure shows that, at low iron/ protein ratios, a homogeneous
filamentous network is obtained, whereas at high iron/ protein ratios, more random
aggregated particles are present.
Different experiments are being conducted to study the formation of gels in the presence of
iron at a molecular level. Recently, using Fourier transform infrared spectroscopy, we
showed molecular differences in the formation and structure of fine-stranded and
particulate hear-induced β-lactoglobulin gels (Lefèvre & Subirade, 2000). This technique
should allow for greater insights into the formation of cold and thermal β-lactoglobulin gels
in the presence and absence of iron.
Acknowledgments
The authors acknowledge Hélène Chamberland and Aristide Pusterla for their collaboration
in electronic microscopy; and Louise Tremblay and Anne-Françoise Allain for their
technical assistance. They also thank the NSERC industrial chair and industrial partners
(Agropur, Novalait Inc. and Parmalat-Canada) for their financial support.
65
Table 2.1: Coded and uncoded level combinations for a 3-variable in Box-Behnken model for β-lactoglobulin gelation.
Variables
Protein concentration
[%]
Iron concentration
(Fe2+)
[mM]
pH Treatement*
Coded
X1
Uncoded
[P]
Coded
X2
Uncoded
[Fe]
Coded
X3
Uncoded
pH
1 -1 6 1 40 0 8
2 1 9 -1 10 0 8
3 0 7.5 -1 10 -1 7
4 0 7.5 1 40 1 9
5 0 7.5 1 40 -1 7
6 0 7.5 0 25 0 8
7 -1 6 -1 10 0 8
8 1 9 0 25 1 9
9 0 7.5 -1 10 1 9
10 -1 6 0 25 -1 7
11 0 7.5 0 25 0 8
12 0 7.5 0 25 0 8
13 -1 6 0 25 1 9
14 1 9 0 25 -1 7
15 0 7.5 0 25 0 8
16 1 9 1 40 0 8
* The experimental runs were performed in a random order
Table 2.2: Results of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, ruture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC) for each condition of experimental design.
Treatment L* a*Elastic Constant
[Pa]
Rupture Stress
[Pa] Rupture Strain
Relaxation
% K2
WHC
%
1 66.05 2.72 1125 2325 0.19 69.1 1.38 89.1
2 43.29
2.65 26964 25262 0.57 47.3 1.87 90.2
3 28.97 0.2 58991 32800 0.63 50.0 1.77 90.4
4 66.06 -2.69 19063 6126 0.11 62.9 1.51 88.6
5 72.08 2.65 8556 731 0.18 66.7 1.46 88.3
6 69.17 4.08 15607 8705 0.13 65.7 1.47 89.6
7 25.34 5.37 16797 14470 0.98 51.1 1.78 92.3
8 66.93 1.5 19819 1161 0.21 59.8 1.57 89.3
9 31.21 4.89 5227 6037 0.77 50.0 1.77 91.0
10 66.35 4.09 5415 8638 0.15 69.5 1.38 89.0
11 71.78 2.81 26738 9335 0.10 65.4 1.49 89.5
12 69.52 3.41 21878 9100 0.11 68.6 1.39 89.1
13 66.35 2.08 1056 496 0.29 64.1 1.50 89.4
14 73.72 2.49 22553 10675 0.18 60.8 1.57 88.0
15 71.59 3.03 20897 7500 0.17 67.2 1.43 89.2
16 62.34 4.08 12203 1595 0.14 65.8 1.47 87.8
67
Table 2.3: Analysis of variance of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC).
Sums of squares Source of
variation Degrees of freedom L* a* Elastic
Constant Rupture
Stress Rupture Strain Relaxation K2 WHC
X1: [Protein] 1 6.15 10 * 1.56 4.08 108 * 2.03 107 * 3.25 10-2 * 4.99 10 * 2.29 10-2 * 2.58 **
X2: [Iron] 1
2.37 10 **3 5.04 * 5.62 108 * 5.74 108 ** 6.78 10-1 ** 5.46 102 ** 2.32 10-1 ** 1.28 10 **
X3: pH 1 1.39 10 1.66 3.17 108 * 1.90 108 ** 7.20 10-3 1.28 10 4.12 10-3 8.45 10-1
X1 . X1 1 6.26 2.72 3.15 10 *8 1.54 107 * 1.62 10-2 5.09 3.17 10-3 5.17 10-2
X1 . X2 1 1.17 10 **2 4.16 * 2.07 105 3.32 107 * 3.24 10-2 * 7.84 10-2 5.52 10-6 1.93 10-1
X1 . X3 1 1.15 10 2.60 10-1 6.60 105 4.71 105 3.02 10-3 4.90 3.22 10-3 1.98 10-1
X2 . X2 1 1.60 10 **3 8.19 10-1 1.40 107 7.11 107 ** 3.11 10-1 ** 2.11 102 ** 8.69 10-2 ** 1.30 *
X2 . X3 1 1.70 10 2.51 10 ** 1.03 109 ** 2.58 108 ** 1.10 10-2 3.49 8.52 10-4 1.82 10-2
X3 . X3 1 3.43 1.04 10 ** 1.46 105 8.45 106 1.06 10-3 1.67 10 3.77 10-3 4.79 10-1
Lack of fit 3 4.74 10 2.68 1.95 108 1.03 107 2.37 10-2 1.12 10 8.09 10-3 7.82 10-1
Error 3 5.55 9.29 10-1 6.24 107 1.99 106 2.87 10-3 6.85 5.94 10-3 1.98 10-1
Total (corr.) 15 4.25 10 3 5.54 10 2.90 109 1.18 109 1.12 8.68 10 2 3.71 10-1 1.95 10
R2 98.75 93.48 91.14 98.95 97.61 97.91 96.21 94.97
* p < 0.05 ; ** p < 0.01.
68
Table 2.4: Regression coefficients of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC).
Regression
Coeffs. L* a* Elastic Constant Rupture Stress Rupture Strain Relaxation K2 WHC
b0 -2.48 102 -8.83 10 5.32 104 -7.11 103 3.05 -7.06 10 3.41 7.81 10
b1 2.52 10 -8.28 6.15 104 1.91 104 -4.21 10-1 -2.03 10-1 5.30 10-4 -1.05
b2 8.50
1.04 -9.62 103 -4.82 103 -8.33 10-2 2.61 -5.15 10-2 -2.48 10-1
b3 2.54 10 2.83 10 -3.20 104 6.69 103 -5.00 10-3 2.74 10 -3.5110-1 4.86
b1 . b1 -5.56 10-1 3.66 10-1 -3.94 103 -8.72 102 2.83 10-2 -5.02 10-1 1.25 10-2 -5.05 10-2
b1. b2 -2.41 10-1 4.53 10-2 1.01 10 -1.28 102 4.00 10-3 6.22 10-3 -5.22 10-5 9.77 10-3
b1 . b3 -1.13 1.70 10-1 2.70 102 -2.28 102 -1.83 10-2 7.38 10-1 -1.89 10-2 1.48 10-1
b2 . b2 -8.89 10-2 -2.01 10-3 8.31 1.87 10 1.23 10-3 -3.22 10-2 6.55 10-4 2.54 10-3
b2 . b3 -1.37 10-1 -1.67 10-1 1.07 103 5.35 102 -3.50 10-3 -6.23 10-2 9.73 10-4 -4.50 10-3
b3 . b3 -9.26 10-1 -1.62 -1.91 102 -1.45 103 1.62 10-2 -2.04 3.07 10-2 -3.46 10-1
Protein [%] Iron [mM]
L*
6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 10 15 20 25 30 35 4023334353637383
Figure 2.1: Response surface graph of the light reflectance (L*) (pH 8)
70
Iron [mM] pH
a*
10 15 20 25 30 35 40 7 7.5 8 8.5 9-2.5
-0.5
1.5
3.5
5.5
Figure 2.2: Response surface graph of the a* parameter ([Protein]= 7.5 %)
71
Protein [%] Iron [mM]
Elas
tic c
onst
ant [
Pa]
66.577.588.5910152025303540
0
1
2
3
4
(X 10000)
Figure 2.3: Response surface graph of the elastic constant (pH 8)
72
Protein [%] Iron [mM]
Rup
ture
stre
ss [P
a]
6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 10 15 20 25 30 35 40048
12162024
(X 1000)
Figure 2.4: Response surface graph of the rupture stress (pH 8)
73
Protein [%] Iron [mM]
Rel
axat
ion
[%]
6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 1015202530354047515559636771
Figure 2.5: Response surface graph of the relaxation (pH 8)
74
Protein [%] Iron [mM]
K2
66.577.588.59 10152025303540
1.31.41.51.61.71.81.9
Figure 2.6: Response surface graph of the k2 parameter (pH 8)
75
Protein [%] Iron [mM]
WH
C [%
]
66.577.588.59 10152025303540
88
89
90
91
92
Figure 2.7: Response surface graph of the water-holding capacity (WHC) (pH 8)
76
ba
dc
1µm
Figure 2.8: Transmission electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin
prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% protein (b); 10
mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d).
77
a b
c d
1µm
Figure 2.9: Scanning electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin
prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% f protein (b);
10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d).
78
a b
dc
1µm
f e
Figure 2.10: Transmission (TEM) and scanning (SEM) electron micrographs of Fe-induced
cold gels of β-lactoglobulin prepared with a 10 mM iron concentration and a 6% protein
concentration at pH 7, TEM (a); pH 7, SEM (b); pH 8, TEM (c); pH 8, SEM (d); pH 9,
TEM (e); pH 9, SEM (f).
Chapitre III
MOLECULAR MECHANISMS OF FE2+-INDUCED β-LACTOGLOBULIN COLD GELATION
The content of this chapter will be published:
Remondetto, G. E. & Subirade, M. 2003.
Biopolymers. In press.
80
Abstract
To get more insight into the mechanisms of cold gelation of β-lactoglobulin (β-lg),
macroscopic and molecular structural changes during Fe2+-induced gelation of β-lg were
investigated using Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy and rheological
methods. The FT-IR spectroscopy results show that, upon the preheating treatment (first
step of gel process), native globular proteins are denatured and aggregated molecules are
found in solution. The spectra are similar to those of gels obtained in the second step of the
process upon incorporation of Fe, which suggests that aggregated molecules formed during
the preheating treatment constitute the structural basis of the aggregation. However, the
rheological data show that the aggregation is achieved via two molecular mechanisms, both
of which are modulated by the iron concentration. At 30 mM of iron, gel formation is
essentially controlled by van der Waals interactions, while at 10 mM of iron, hydrophobic
interactions predominate. At the two concentrations, disulfide bonds contribute to gel
consolidation, the effect being more pronounced at 10 mM of iron. These mechanisms lead
to the formation of gels of different microstructures. At the highest iron concentration, a
strong and rapid decrease in the repulsion forces is produced, resulting in random
aggregation. At the lowest iron concentration, the iron diminishes the superficial charge of
both molecules and aggregated molecules, facilitating the interaction among hydrophobic
regions and leading to the growth of the aggregation in the preferential direction and to
filamentous gel formation. This study provides a comprehensive view of the different
modes of gelation.
81
Keywords: β-lactoglobulin, cold gelation, Fourier transform-infrared spectroscopy,
rheology.
82 Résumé
Les mécanismes de gélification à froid de β-lactoglobuline (β-lg) en présence du fer ont été
étudiés à l’échelle moléculaire par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-
IR) et à l’échelle supramoléculaire par rhéologie. Les résultats de spectroscopie FT-IR
montrent qu’après le pré-traitement thermique (première étape du processus de
gélification), les protéines globulaires natives sont dénaturées et des agrégats moléculaires
sont formés en solution. Les spectres sont identiques à ceux des gels obtenus dans la
deuxième étape du processus après l’incorporation du Fe2+, suggèrant que les agrégats
moléculaires formés après le pré-traitement thermique constituent l’unité de base de
l'agrégation. Cependant, les données de rhéologie montrent que la gélification résulte de
deux mécanismes moléculaires modulés par la concentration en fer. À 30 mM de fer, la
formation du gel est essentiellement contrôlée par des interactions de van der Waals, alors
qu’à 10 mM de fer, les interactions hydrophobes prédominent. Pour ces deux
concentrations, les ponts disulfure contribuent à la consolidation du gel, l'effet étant plus
prononcé à 10 mM de fer. Ces mécanismes conduisent à la formation de microstructures
différentes. Pour la plus forte concentration en fer, une baisse rapide dans les forces de
répulsion est produite, entraînant une agrégation aléatoire. Alors que pour la plus basse
concentration en fer, le fer diminue la charge superficielle des molécules et des agrégats
moléculaires, facilitant l'interaction des régions hydrophobes et favorisant l'agrégation dans
une direction préférentielle conduisant à la formation des gels filamenteux. Cette étude
fournit une vue complète des différents modes de gélification.
83
3.1. Introduction
Gelation of globular proteins has attracted much attention over the years, because of its
physical and industrial significance (Clark & Ross-Murphy, 1987; Clark, 1998; Nishinari,
2000) The gelation of β-lactoglobulin (β-lg), the most abundant protein in whey, has been
the subject of several studies because of the major interests it holds for the food industry.
The β-lg can form three-dimensional gel networks when subjected to alkaline conditions or
heat treatments. The thermal gels are produced from the unfolding of the polypeptide
chains with a concomitant exposure of initially buried hydrophobic residues, and from the
subsequent self-aggregation of the protein molecules (Mulvihill & Kinsella, 1988;
Aguilera, 1995). Forces involved in the aggregation process are van der Waals, electrostatic
and covalent interactions, hydrophobic effects, and hydrogen bonding (Ziegler &
Foegeding, 1990). In salt-free solutions, β-lg forms two gel types called “fined stranded”
and “particulate” with different rheological and microstructural properties that vary with
respect to pH conditions (Stading & Hermansson, 1990; Stading & Hermansson, 1991).
Opaque particulate gels are obtained at pH near the pI of β-lg (pI 5.2) and transparent fine-
stranded gels occur at more extreme pH values. Both gels have been recently differentiated
at a molecular level by FT-IR spectroscopy (Lefèvre & Subirade, 2000).
In recent years, the ability of β-lg to form a gel network under cold conditions has brought
renewed interest to this field because of the possibility of expanding its use in food and
non-food applications (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998;
Marangoni et al., 2000; Bryant & McClements, 2000a). Many studies have been carried out
on calcium-induced cold gelation, but the mechanism involved in this process remains
84 unclear (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1999; Bryant & McClements,
2000a; Marangoni et al., 2000).
In a previous study, we investigated the cold gelation of β-lactoglobulin induced by the
addition of Fe2+, in order to protect iron from environmental conditions (Remondetto et al.,
2002). Our results show that the macroscopic properties obtained for Fe2+-induced β-lg
cold gels exhibit similarities with those obtained in studies with different cations (Ca2+,
Mg2+, Na+)-induced cold gels, suggesting that the cation-protein interactions would be of
similar nature, where electrostatic interaction would play a predominant role (Barbut &
Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998; Hongsprabhas & Barbut, 1998;
Remondetto et al., 2002). Moreover, we demonstrated that different types of gels could be
obtained depending on pH conditions and protein and/or iron concentration. When
iron/protein ratios were low and the pH value close to 7, gels were homogeneous and
characterized by an elastic behavior and a high resistance to rupture, suggesting that strong
particle-particle interactions occurred. Under these conditions, gels are composed of
essentially flexible linear strands, called “fine stranded” producing a “filamentous gel”
(Stading et al., 1992; Stading et al., 1993; Remondetto et al., 2002). When iron/protein
ratios were high and pH values above 7, gels were non-homogeneous, exhibited random
aggregation and were characterized by a lower elastic behavior and a low rupture
resistance, suggesting that weak particle-particle interactions occurred. Gels characterized
by a random association into large and almost spherical aggregates linked together are
called “particulate gels” (Doi, 1993). Finally, at intermediate iron/protein ratios,
filamentous and random-aggregate structures were mixed together that forming gels. An
increase in iron concentration led to changes in the gel structure, which went from fine
85 stranded to random aggregate, with a concomitant decrease in gel strength, elasticity, and
water holding capacity (WHC). This suggested that the iron concentration could control the
macroscopic properties of β-lg gels. Although well characterized at both the macroscopic
and microscopic levels, nothing is known about the molecular mechanism involved in Fe2+-
induced β-lg cold gelation or about the interactions that maintain the network. Since these
points have yet to be resolved, the objective of the current study was to determine the
molecular and supramolecular mechanisms involved in Fe2+-induced β-lg cold gelation.
First, we have used Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy to investigate the
molecular basis of cold-gels formation. This technique is a versatile and powerful proven
tool for monitoring the denaturation (Fabian et al., 1993; Takeda et al., 1995; Subirade et
al., 1998), aggregation, and gelation (Casal et al., 1988; Boye et al., 1997b; Allain et al.,
1999; Subirade et al., 1998) of globular proteins. Recently, successful discrimination of
particulate and fine-stranded β-lg gels has been achieved with this technique (Lefèvre &
Subirade, 2000).
Then, given that covalent bonding, hydrogen bonding, hydrophobic interactions and van
der Waals forces are involved in the formation of gel structures (Clark & Ross-Murphy,
1987; Doi, 1993; Aguilera, 1995), their respective contribution in the formation of gels,
was monitored at a supramolecular level using dynamic viscoelastic measurements. These
measurements were carried out with and without destabilizing agents so as to prevent the
formation of specific interactions: urea was used to block the formation of the hydrogen
bonds, SDS to block the formation of the hydrophobic interactions, and 2-mercaptoethanol
to block the formation of the disulfide bridge.
86
On the basis of the combined FT-IR and rheological data, a model was developed that
explains the different mechanisms involved in the cold-gelation process. This model uses
molecular and supramolecular mechanisms to explain the different macrostructural
properties in relation to interactions involved during gel formation.
87
3.2. Experimental
3.2.1. Materials
β-lg (β-lactoglobulin) was obtained from Davisco International, Inc. (Le Sueur, MN, USA)
[98.2% protein by Semi-micro Kjeldahl (AOAC, 1984) using N-factor 6.38]. Ferrous
sulphate (FeSO4) was of a reagent grade (Analar, BDH Inc., Toronto, Canada). Urea,
Sodium dodecyl sulphate (SDS), and 2-mercaptoethanol were purchased from Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
3.2.2. Methods
3.2.2.1. FT-IR spectroscopy
β-lg was dissolved in D2O solution at the desired concentration and pD adjusted with
NaOD. The pD was measured with a standard pH electrode and the value was corrected
according to pD = pH + 0.4 (Boye et al., 1997b). β-lg was kept 48 h in an aqueous solution
under a nitrogen atmosphere before recording spectra for a complete H/D exchange (Boye
et al., 1996). After 48 h, β-lactoglobulin suspensions (9.5% protein w/v) were heated at
80oC for 30 min, then cooled to room temperature (24oC). With the preheated protein
suspensions, different suspensions were prepared (6% protein w/v), and mixed by vortexing
with different quantities of a 1 M solution in D2O of FeSO4 (10 to 30 mM) at 24oC.
Infrared spectra at a 2-cm-1 resolution were recorded with a Magna 560 Nicolet
spectrometer (Madison, WI) equipped with mercury–cadmium-telluride detector. The
spectrometer was continuously purged with dried air. Samples were placed between two
88 CaF2 windows separated with 13-µm polyethylene terephthalate film spacers. Each
spectrum is the result of an average of 128 scans and apodized with a Happ-Genzel
function. To study the amide I region of the protein (the so-called amide I’ in deuterated
peptide groups), subtractions and Fourier self-deconvolutions were performed with the
software provided with the spectrometer (Omnic software). In order to identify each
overlapping component under the broad amide I’, Fourier self–deconvolution was applied
to the spectra (Kauppinen et al., 1981). The band narrowing was achieved with a full width
at half of 18 cm-1 and with a resolution enhancement factor of 2.
3.2.2.2. Dynamic oscillatory measurements
Protein solutions, at a concentration of 9.5% (w/v), were prepared by adding appropriate
amounts of β-lactoglobulin powder to a portion of deionized water. They were then stirred
for two hours at room temperature. The pH of the solution was adjusted at room
temperature (24oC) to pH 7. β-Lactoglobulin suspensions (9.5% protein w/v) were heated at
80oC for 30 min, then brought to room temperature (24oC) during 4 h. As for the preheated
protein suspensions (9.5 % protein w/v), suspensions of 6% protein w/v were prepared and
mixed by vortexing with two different quantities of a 1 M solution of FeSO4 (10 and 30
mM) at 24oC to obtain different ionic strength according to Equation 3. 1.
Equation 3. 1:
∑=
=×=
ni
iii ZC
1
221µ
where:
89
µ : ionic strength
Ci : active ionic concentration
Zi : ionic charge
Small-deformation oscillatory measurements of gels were performed on a controlled-stress
rheometer (SR-500, Rheometric Scientific, Piscataway, NJ), using parallel plates (40 mm
diameter). Viscoelastic parameters were then measured within the linear region at a
frequency of 1 Hz. Shear storage modulus (G’) and shear loss modulus (G’’) were
evaluated as a function of time for 12 h. At least five determinations of each condition were
made without obtaining significant differences among them.
The analyses were performed in different medium: water (reference) and in the presence of
destabilizing agents, namely 0.2M of 2-mercaptoethanol for disestablishing disulfides
bonds, 2M Urea for disestablishing hydrogen bonds; and 1% SDS for disestablishing
hydrophobic interactions.
90
3.3. Results
3.3.1. FT-IR Study
FT-IR spectroscopy was used to monitor molecular conformational changes taking place
during the gelling process. Figure 3. 1 displays the typical deconvoluted spectra in the
amide I band region (1600-1700 cm-1) of β-lg at 6% in D2O at pD 7 (a), and preheated for
30 min at 80oC (b); both spectra were recorded at 24oC. The deconvoluted band, called
amide I’ in D2O, corresponds mainly to the C=O stretching mode of the peptide backbone
and is sensitive to alterations in secondary structures (Surewicz & Mantsch, 1988;
Goormaghtigh et al., 1994; Lefèvre & Subirade, 2001; Krimm & Bandekar, 1986). The
spectrum of the native protein (Figure 3. 1a) presents seven components, which correspond
to particular secondary structures that are relatively well documented (Casal et al., 1988;
Dong et al., 1996; Byler & Susi, 1986; Jackson & Mantsch, 1992). The most intense band
at 1634 cm-1 is typically observed in proteins in which β-sheets predominate, as
demonstrated by X-Ray data (Papiz et al., 1986). The 1623-cm-1 component is caused by
strongly bonded β-strands. The concomitant presence of both components is characteristic
of β-lg in the dimeric form (Lefèvre & Subirade, 1999). The components located at 1647
and 1660 cm-1 are ascribed to α-helix/unordered structures and turns, respectively. Those
located at 1676 and 1691 cm-1 are both related to β-sheets and turns, while the small
component at 1611 cm-1 is caused by the vibration of amino acid residues (Arrondo et al.,
1993).
91
The deconvoluted spectrum of preheated β-lg (Figure 3. 1b) differs considerably from the
FT-IR spectrum of the native protein. The amide I’ band is mainly composed of two
components, one located at 1614 cm-1 (called aggregation band in the following) and
another one located at 1682 cm-1. The former is assigned to intermolecular β-sheets
resulting from aggregation (Clark et al., 1981), whereas the presence of the latter indicates
that the β-sheets are antiparallel (Bandekar, 1992). The low frequency for the aggregation
component (1614 cm-1) suggests that the intermolecular H bonds involved in the
aggregation process are very strong (Jackson & Mantsch, 1992). This change is
accompanied by a broadening of the amide I’ band suggesting the presence of unfolded
polypeptide segments. However, secondary structure components are not well resolved and
there are still present between 1670 and 1620 cm-1. Moreover, they differ in their location
from those found in the native protein, suggesting a reorganization of the polypeptide chain
within the protein (Lefèvre & Subirade, 2000). The weak components around 1625 cm-1
have already been observed for concanavalin(Dong et al., 1990) and legumin (Subirade et
al., 1994), and were attributed to distorted β-strands (Arrondo et al., 1988). The weak band
at 1669 cm-1 could result from peptide group segments in the turns (Byler & Susi, 1986).
The bands at 1655 and 1647 cm-1 could be caused by unordered segments in the protein,
and the spectral contribution from the α-helical conformation cannot be completely ruled
out at the frequency of 1655 cm-1. The important point from these results is the presence of
aggregated molecules in the preheated solution.
Figure 3.2 presents the deconvoluted spectra of the gels obtained by adding 10 mM (a) or
30 mM (b) of FeSO4 to a preheated solution of β-lg (6% v/w protein in D2O, pD 7),
92 recorded at room temperature. The most striking phenomenon is that the spectra of the gels
at both iron concentrations are very similar to the ones obtained after the preheating
treatment (Figure 3. 1b), suggesting that the molecular structure of β-lg within the gel is
identical to the one obtained after the preheating treatment. They present the same
aggregation components at 1614 and 1682 cm-1 indicating that the aggregates in the
network are similar to the aggregated molecules. There are even no differences in the band
frequency, which means that structures are the same for both types of gels; it is possible to
observed differences in the band intensity. These data show that band intensity increases
with higher ionic force in the gels. This behavior could be explained by an increasing
structural contraction resulting from the effects of the ionic strength that lead to an increase
in the molecular interactions in the aggregates (Rha & Pradipasena, 1985). FT-IR results, as
a whole, suggest that the gels are produced from the association of structural units
constituted by aggregated molecules formed in the preheated step.
Moreover, in a previous study (Remondetto et al., 2002), we showed that the gels obtained
at 10 mM iron (protein concentration 6%) were filamentous, while the gels obtained at
30 mM iron (protein concentration 6%) were made up of random aggregates. The lack of
significant differences between the FT-IR spectra of the filamentous gels and the random-
aggregate gels suggests that the differences observed between both types of gels are not
caused by variations in H-bonding implied in the intramolecular and intermolecular
interactions. However, the absence of any detectable change in the secondary structure of
β-lg does not eliminate the possibility of a conformational change at different
supramolecular structures, which could lead to changes in macroscopic properties (Allain et
al., 1999; Subirade et al., 1998). It was therefore necessary to use a complementary method
93 to investigate the supramolecular properties and to evaluate the remaining interaction types.
Consequently, the rheological method was used as a complementary methodology to the
FT-IR (Clark & Ross-Murphy, 1987).
3.3.2. Reological study
Figure 3.3 illustrates the evolution of the storage modulus (G’), the loss modulus (G”), and
the phase angle as monitored by dynamic rheology. The phase angle indicates the relative
amount of viscous and elastic elements in the gel (i.e., an elastic solid has 0o and a viscous
fluids has 90o) (Steffe, 1992), while G’ indicates the evolution of the solid elements in the
system, and G” indicates the evolution of the viscous elements in the system.
Consequently, the change from a viscoelastic fluid to a viscoelastic solid could be used to
show the gelation’s evolution through time (Barbut & Foegeding, 1993). Results show that
G’, G’’, and phase angle present similar tendencies for all Fe2+-induced gelation conditions,
displaying an increase in both G’ and G”, and a decrease in the phase angle. The gelation
process was followed from 5 min after mixing gels components to 720 min at 24oC.
Because the phase angle was shown to decrease to a minimum value and because G’
increased until it attained its maximum value, G’ was chosen as the best indicator of gel
structure formation and consolidation for all conditions tested.
Figure 3.4 displays the storage modulus (G’) as a function of time at 6% of preheated β-lg
gel forming with 10 mM (Figure 3.4a) and 30 mM (Figure 3.4b) Fe SO4, respectively. This
figure shows that at 10 mM of Fe2+, G’ values are higher than those obtained at 30 mM of
Fe2+, demonstrating the higher elastic behavior at 10 mM Fe2+. These results confirm those
previously obtained using large deformation test, which showed a decrease in the elastic
94 behavior when the iron concentration is increased (Remondetto et al., 2002). This gel
behavior is the result of the formation of a filamentous structure at low iron concentrations
(10 mM Fe2+) and a random-aggregated structure at higher iron concentrations (30 mM
Fe2+) (Remondetto et al., 2002). Given that FT-IR did not show differences at the
molecular level in random-aggregated and filamentous gels, the rheological differences
found in both gels could be explained by different arrangements at a supramolecular level.
To elucidate the different interactions occurring during the formation of random-aggregated
and filamentous gel structures, different destabilizing agents, which prevent the formation
of specific interactions, were used. Covalent bonds, hydrogen bonds, hydrophobic
interactions, and van der Waals forces are known to be involved in the formation of gel
structures (Clark & Ross-Murphy, 1987; Doi, 1993; Aguilera, 1995). The contribution of
each interaction at the supramolecular level has been monitored by dynamic viscoelastic
measurements with and without destabilizing agents: urea was used to prevent hydrogen
bonding, SDS to block hydrophobic interactions, and 2-mercaptoethanol to prevent
disulfide bridge formation.
Figure 3.5 displays the storage modulus (G’) as a function of time of gels formed at pH 7
and 6% of β-lg with 30 mM of Fe2+ without destabilizing agents (Figure 3.5a), with urea
(Figure 3.5b), with 2-mercaptoethanol (Figure 3.5c), and with SDS (Figure 3.5d). Results
show no significant differences in the G’ curve versus time in the presence of destabilizing
agents, except for 2-mercaptoethanol (3.5c). Urea (3.5b) and SDS (3.5d) induce a modest
change in the G’ curve, indicating that neither hydrogen bonding nor hydrophobic
interactions play a crucial role in the formation of the gel structure. In contrast, the presence
95 of 2-mercaptoethanol induces a more pronounced decrease in the G’ effect (Figure 3.5c),
which reveals that even though disulfide bonds are involved in the gel structure, their role
appears to be limited.
Figure 3.6 displays the storage modulus (G’) as a function of time of a gel formed at 6% β-
lg and at pH 7, with a concentration of 10 mM of Fe2+, without destabilizing agents (Figure
3.6a), in the presence of urea (Figure 3.6b), 2-mercaptoethanol (Figure 3.6c), and SDS
(Figure 3.6d). Figure 3.6b shows that urea induces a slight decrease in the G’ parameter
compared to the results without the destabilizing agent (Figure 3.6a). This result suggests
that hydrogen bonding plays a minor role in the formation of both gel structures. These
findings are comparable to those obtained at 30 mM (5b), which means that hydrogen
bonds interactions are not responsible for the microstructural differences in gels at 10 mM
and 30mM Fe2+, respectively. These results are in agreement with the data obtained using
FT-IR spectroscopy, which only revealed the presence of hydrogen bonding (Arrondo et
al., 1988).
On the other hand, the presence of 2-mercaptoethanol (Figure 3.6c) induces an important
decrease in the G’ curve (Figure 3.6a), which suggests that the disulfide bonds are key
elements in the gel structures at the lowest iron concentrations. The more pronounced role
of disulfide bonds in the gel structures at 10 mM of iron compared to the ones formed at 30
mM would explain the biggest elasticity of the former gels compared to the latter one.
However, the most striking effect is observed in the presence of SDS (Figure 3.6d). This
result reveals that hydrophobic interactions are essential for gel formation at 10 mM of
Fe2+.
96
In conclusion, these results show that at 10 mM Fe2+, gel formation (filamentous gels) is
mainly controlled by hydrophobic interactions. In contrast, at 30 mM Fe2+, since neither
hydrogen bonding nor hydrophobic interactions are responsible for gel structure formation,
van der Waals interactions are likely to play a central role in gel structure formation.
Despite the fact that the 2-mercaptoethanol was shown to diminish gel solid behavior
(weakest G’), gel formation did occur, which indicates that disulfide bonds would
essentially contribute to the consolidation of gel structures it effect being more pronounced
in gels formed with 10 mM of iron.
97
3.4. Discussion
In the previous section, the molecular and supramolecular structural changes occurring
during iron-induced cold gelation of β-lg were shown by FT-IR spectroscopy and
rheological methods. Cold gelation of β-lg in the presence of cations is a two-step
mechanism: 1) a preheating step under conditions that prevent gel formation and, 2) gel
formation upon adding cations (Bryant & McClements, 1998).
According to our data, FT-IR spectroscopy showed that, after the preheating treatment, the
proteins molecules form aggregates without gelation. These aggregates present similar
spectra to those obtained in the second step of the gelation process, suggesting that they
make up the structural gel units. These results corroborate the concept proposed by Bauer
(Bauer et al., 2000). These units seem to be the common feature in the formation of cold- or
heat-induced β-lg gels.
In the cation addition step of the gelation process, the absence of significant differences
between FT-IR spectra of the filamentous gels (10 mM of iron concentration) and random-
aggregated gels (30 mM of iron concentration) indicates that the macroscopic and
microscopic differences observed for both types of gels (Remondetto et al., 2002) are not
caused by hydrogen bonding, which means that hydrogen bonding is mostly involved in the
formation of structural units in all types of cold gels. These results suggest therefore that
interactions (except for hydrogen bonding) are involved in the formation and consolidation
of cold gels. The rheological data obtained from experiments with different destabilizing
agents revealed that Van der Walls interactions are responsible for random-aggregated
98 gelation, whereas filamentous gelation is essentially a product of hydrophobic interactions.
Moreover, disulfide bonds play a role in the consolidation step of both gel types.
Figure 3.7 summarizes the succession of steps involved in the formation of the specific
microstructures of cold gelation of β-lg in the presence of iron.
In a first step, a preheating treatment leads to the formation of aggregated molecules that
constitute the structural units responsible for the three-dimensional network for all types of
cold gels. During the second step, iron neutralizes the superficial charges on the structural
units in keeping with the DLVO (Deryagin-Landau-Verwey-Overbeek) theory. This
electrostatic neutralization enables the formation of a three-dimensional network by two
mechanisms, both occurring at different iron concentrations. At high iron concentrations
(30 mM iron, Figure 3.7a), a strong and rapid decrease in the repulsion forces is produced
on the structural units, resulting in a random aggregation that is essentially controlled by
the van der Waals interactions, which in turns favors the formation of clusters (growth in all
directions). The great irregular aggregation can explain the brittleness of the network gel
structure (Remondetto et al., 2002). At low iron concentrations (10 mM iron, Figure 3.7b),
the superficial charges of the structural units diminish gradually favoring interaction among
their hydrophobic regions. This arrangement promotes aggregation growth in a preferential
linear direction leading to filamentous gels.
Figure 3.8 shows a model of filamentous gelation. The linear growth of the aggregation is
du to the hydrophobic patch distribution on the structural units. In this model, the gradual
decrease in the superficial charge, caused by the incorporation of the iron, favors
interaction among aggregates by hydrophobic patches. After the aggregation of the first
99 structural units, the incorporation of additional units can only occur at the extremities of
existing aggregates, because of the steric hindrance they generate. As a result, growth is
achieved in a “preferential” direction and leads to the production of a filamentous network.
In the model presented (Figure 3.7 and Figure 3.8), it is important to keep in mind the main
role of the electrostatic interactions. Indeed, in agreement with the DLVO theory,
increasing the salt concentration would change the distance distribution of the potential
repulsive forces (i.e., mainly electrostatic) and thus the energy barrier, which stabilizes
colloids systems (Friberg et al., 1990). The loss of potential repulsive forces makes it
possible for the incipient aggregates to get close enough to interact via non-covalent forces
with a low-potential energy (Israelachvili, 1985). Divalent cations (such as Fe2+) can cause
a decrease in the potential repulsive force. Two hypothesis may explain this behavior:
either divalent cations act as bridges between the negatively charged carboxylic group on
neighboring β-lg molecules, as previously proposed (Bryant & McClements, 1998;
Marangoni et al., 2000), or cations alter the ionic force. However, if the formation of
bridges is indeed essential to network formation, the increase in the Fe2+ concentration
would result in the rise in the elasticity, which is contrary to our rheological data (Figure
3.4) showing that ionic force plays a major role in the formation (i.e., in support of the
second hypothesis). Moreover, according to Equation 1 (see Material and Methods), the
second hypothesis helps to explain why cold-induced gelation needs to occur at a divalent
cation (e.g., Fe2+) concentration, that is lower (about four times) than that of monovalent
cations (> 100mM) (Bryant & McClements, 2000a; Kitabatake et al., 1996; Kuhn &
Foegeding, 1991).
100
In conclusion, the model presented in this work explains the cold–gelling process in the
presence of divalent cations and it could be extended to different cations independently of
their valence.
Acknowledgments
The authors acknowledge Dr. Thierry Lefèvre for interesting and fruitful discussions about
protein gels. They thank the NSERC – industrial chair and industrial partners (Agropur,
Novalait, Parmalat) and the NSERC-Canada Research Chair program for their financial
support.
101
Abso
rban
ce (a
.u.)
1650 1700 Wavenumbers (cm-1)
1691 1647 1634 1623 1660 1676
(a)
(b)
1669 1655 1647 1636 1625 1682 1614
1611
1600
Figure 3. 1: Deconvoluted spectra of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7: (a) native protein, (b)
pre-heated protein (at 80oC, 30 min).
102
Abs
orba
nce
(a.u
.)
1650 1700 Wavenumbers (cm-1)
(a)
1682 1669 1655 1647 1636 1614
(b)1682 1669 1655 1647 1636 1614 1625
1625
1600
Figure 3.2: Deconvoluted spectra of cold-gels of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7 (a) with 10
mM FeSO4 concentration; (b) with 30 mM FeSO4 concentration.
103
0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
(c)
(b)
(a)G
' (P
a), G
'' (P
a), a
nd tn
_del
ta
time (min)
Figure 3.3: Rheological behavior of cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4
concentration in function time: (a) storage modulus G’, (b) loss modulus G”, and (c) the
phase angle tanδ.
104
0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
(b)
(a)
G' (
Pa)
time (min)
Figure 3.4: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: (a) cold-gels of β-lg
in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration, (b) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v)
with 30 mM of iron concentration.
105
0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
(d)
(c)(b)(a)
G' (
Pa)
time (min)
Figure 3.5: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg
(6% w/v) with 30 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-
mercaptethanol, and (d) 1% SDS.
106
0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
(d)
(c)
(b)(a)
G' (
Pa)
time (min)
Figure 3.6: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg
(6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-
mercaptethanol, and (d) 1% SDS.
107
Native protein
Denatured protein Protein aggregates
Fe2+Heat
(no salt)
Random aggregated gel
Filamentous gel
High [Fe2+]/[Prot]
Low [Fe2+]/[Prot]
-
-
-- -
Fe2+
--
- a
b
Figure 3.7: Mechanisms of denaturation/aggregation and gelation of cold-gels of β-lg: (a)
random-aggregated gels and (b) filamentous gels.
108
+
+
++
+
++
+
+
+
+ +
+
+
+
--
-
-
--
--
--
-
-
-
---
--
-
-
Hydrophobicpatch
Protein aggregates
Figure 3.8: Mechanisms of three-dimensional organization of filamentous cold-gels of β-
lactoglobulin.
Chapitre IV
INFLUENCE OF THE MICROSTRUCTURE OF
BIODEGRADABLE WHEY PROTEIN HYDROGELS IN
CONTROLLED IRON DELIVERY: AN IN VITRO STUDY
The content of this chapter will be published:
Remondetto, G. E.; Beyssac, E. & Subirade, M. 2003.
In preparation.
110
Abstract
The influence of the microstructure of whey protein hydrogels elaborated in the presence of
10 mM (filamentous gels) and 30 mM ( particulate gels) iron, on iron delivery was studied
in different conditions including simulated gastrointestinal conditions. First, experiments
have been conducted to determine the impact of pH and enzymes on iron release. The
results show that different iron release profiles can be achieved from filamentous and
particulate gels. Under acidic pH, the particulate gels release higher levels of iron than
filamentous ones. The opposite is observed at alkaline pH. In the presence of enzymes
(pepsin at pH 1.2 or pancreatin at pH 7.5) the two types of gels show an increase in the
protein degradation but only the filamentous gels display an increase in the iron delivery
suggesting that the matrix structure plays a very important role on the iron delivery. Then, a
dissolution test using medium which simulates gastro-intestinal conditions has been used to
mimic the in vivo dissolution. The data show that the filamentous gels release the biggest
quantity of iron into intestinal level protecting, by this way, iron trapped through the
passage of gastric level. Moreover the use of the caco-2 system to imitate the intestinal wall
and to estimate the intestinal absorption of iron allows to show that the filamentous gels
favour the iron intracellular absorption. These result show that the filamentous gels
constitute a. very good matrix to transport iron and to favour its absorption and as a
consequence its bioavalaibility.
Keywords: Biodegradable hydrogels, In vitro release, whey proteins, Iron
111
Résumé
L'influence de la microstructure d'hydrogels biodégradables de protéines du lactosérum
élaborés en présence de 10 mM (gels filamenteux) et de 30 mM (gels particulaires) de fer,
sur la libération du fer a été étudiée dans différentes conditions incluant les conditions
gastro-intestinales simulées. Dans un premier temps, l'impact du pH et de la présence
d’enzymes sur la libération du fer a été examinée. Les résultats montrent que les gels
filamenteux et les gels particulaires présentent différents profils de libération du fer. À pH
acide, les gels particulaires présentent une plus grande libération de fer que les gels
filamenteux alors que l’inverse est observé à pH alcalin. En présence d'enzymes digestives
(pepsine à pH 1.2 ou pancréatine à pH 7.5), les deux types de gels présentent une
augmentation de la dégradation de la matrice protéique, alors que seuls les gels filamenteux
révèlent une augmentation de la libération du fer, suggérant un impact important de la
microstructure sur la libération du fer. Des tests de dissolution dans un milieu mimant les
conditions du tractus digestif ont permis de montrer que les gels filamenteux libèrent la plus
grande quantité de fer au niveau intestinal, le transportant plus efficacement vers l’endroit
cible d’absorption. De plus, une étude utilisant des cellules de caco-2 pour mimer la paroi
intestinale et estimer l'absorption intestinale du fer, a révélé que les gels filamenteux
favorisaient l'absorption intracellulaire du fer. L’ensemble de ces résultats montre que les
gels filamenteux constituent une excellente matrice pour transporter le fer et favoriser son
absorption intestinale, et à terme sa biodisponibilité.
112
4.1. Introduction
Over the past decade, hydrogels are gaining more attention as drug delivery systems,
especially for the controlled oral drug release (Peppas, 1997). However, many hydrogel
systems are not degradable under physiological conditions. Despite the successful
elaboration of many synthetic polymers as biodegradable hydrogel, natural polymers
remain attractive agents that are extensively investigated (Kamath & Park, 1993). They
have the potential advantages of great availability, low cost, low toxicity, and being easily
modifiable (Bogdansky, 1990). Among the systems investigated, the utilization of proteins
as matrix carriers have recently received considerable attention because they are inherently
biodegradable and they present excellent functional properties. Protein, such as gelatin
(Van Den Bulcke et al., 2000), gliadin (Duclairoir et al., 1999), serum albumin
(Katzhendler et al., 2000), or egg albumin (Katzhendler et al., 2000), have been used with
success as matrix carriers for the release of bioactive molecules.
Whey proteins, also known as the serum proteins of milk by-products of cheese
manufacture, are widely used in food products because of their high nutritional value and
their ability to form gels (Allain et al., 1999; Lefèvre & Subirade, 2000), emulsions
(Dickinson, 1997), or foams. Recently, our research group has investigated opportunities
for utilizing whey protein as substrate for developing biodegradable microspheres and use
them as carrier for poorly-soluble molecules such as retinol (Beaulieu et al., 2002). The
method, based on an emulsifying step followed by a Ca2+-induced gelation of pre-denatured
whey protein, allows the formation of gastroresistant beads that form good matrices to
113 protect fat-soluble bioactive molecules. However the utilization of such matrix as carrier
for soluble molecules is limited.
Another important functional property of whey proteins is their ability to form gel matrices,
capable of holding large amounts of water. Recently, we showed that cold-induced gelation
of β-lactoglobulin, the major whey protein, can be achieved by adding Fe2+ ions to a
preheated protein suspension (Remondetto et al., 2002). This method, adapted from the one
developed by Barbut and Foegeding (Barbut & Foegeding, 1993), requires a heating step
during which whey proteins are denaturated and polymerized into soluble aggregates,
followed by a cooling step and the subsequent ferrous salt addition, which results in the
formation of a network via Fe2+-mediated interactions of soluble aggregates. Depending on
the preparation techniques and specifically on iron/protein ratios, different types of gels
have been obtained: 1) “filamentous” gel composed of more or less flexible linear strands
that constitute a regular network characterized by an elastic behavior and a high resistance
to rupture gels and 2) “particulate gels” composed of large and almost spherical aggregates
and characterized by a lower elastic behavior, and low rupture resistance (Figure 4.1).
These different microstructural properties are strongly related to the intimate structure of
the aggregates (Remondetto & Subirade, 2003). However, being well characterized at a
macroscopic and molecular level, nothing is known on the influence of the microstructure
of these gels in controlled iron delivery. This point presents a great interest in a nutritional
point of view. Indeed, iron deficiency is one of the most important nutritional problems in
the world (Thomas & Frankenberg, 2002) and its incorporation into complex systems such
as foods confronts various problems such as its oxidation and precipitation, resulting in a
reduced bioavailability (Wapnir, 1990a; Hurrell, 1997; Hurrell, 1998). Since, the presence
114 of amino acids in the intestine is required to increase iron bioavailability (Allen, 2002), the
use of protein gels of high nutritional value could be an interesting strategy to protect iron
and to increase dietary iron absorption in the manufacture of techno-functional foods. In
conclusion, it is of primary importance to investigate iron release mechanism from the
matrices in relation with their biodegradation in these environmental gastro-intestinal
conditions.
The objective of this work was to study the influence of the microstructure of gels (i.e.,
filamentous vs. particulate) on iron delivery in different conditions including simulated
gastrointestinal conditions. First, experiments have been conducted to determine the impact
of environmental conditions – pH and enzymes- on iron release in relation to the types of
gels- i.e. filamentous versus particulate gels. Then, a dissolution test using medium which
simulates gastro-intestinal conditions has been used to mimic the in vivo dissolution.
Knowledge of in vivo dissolution is the key to predict the oral performance of any
substance since only what is dissolved can be absorbed and resulted in higher oral
bioavailability. Then, a caco-2 system has been used to imitate the intestinal wall
(Hilgendorf et al., 2000; Nunez et al., 2001) and to estimate the intestinal absorption of
iron. A lot of works indicate a good correlation between the in vitro absorption of
molecules to the caco-2 system and their in vivo absorption after oral administration
(Siddiqi et al., 2001; Swain et al., 2002).
115
4.2. Materials and Methods
4.2.1. Gels preparation
β-Lactoglobulin suspensions (9.5 % protein w/v, Davisco International, Inc., Le Sueur,
MN, USA, 98.2% protein by Semi-micro Kjeldahl using N-factor 6.38) were prepared in
double-distilled water at pH 7 and heated at 80 oC for 30 min, then cooled to room
temperature (24oC) for 4 h. The protein suspensions (6 % protein w/v) were adjusted at pH
7, and mixed with 10 or 30 mM iron concentration of a solution (1 M FeSO4, reagent grade
Analar, BDH Inc., Toronto, Canada) in order to obtain filamentous (with 10mM Fe2+) and
particulate (with 30mM Fe2+) gels. (Remondetto et al., 2002).
4.2.2. Dissolution experiments
Dissolution study was performed according to the official methods described in the
Pharmacopeas (European Pharmacopea, 2002, USP 25, 2002). A dissolution test system,
paddle apparatus II (USP, 2000), with temperature circulator/controller from Distek Inc.
(North Brunswick, NJ) (Figure 4.2a) was used. The agitation of the paddle was of 60 rpm
and the control of the temperature was at 37 ± 0.5 oC.
An extraction cell (Figure 4.2b), made of chemically inert materials (epoxy glass),
consisting of a support, a cover and a membrane, is used with the paddle and vessel
assembly from the paddle Distek apparatus (Figure 4.2a). The central part of the support
forms a cavity with a depth of 2.6 mm and diameter of 32 mm. The cover has a central
opening with a diameter of 32 mm. A membrane is inserted between the support, and the
cover is held in place by screws. The extraction cell is introduced flat, into the bottom of
116 the vessel and a distance of 25 ± 2 mm between the paddle blade and the surface of the disk
assembly, is maintained during the test. 3 g of gel of equal geometric were placed in the
cavity of the support of the cell, covered by a membrane and the cell cover was screwed.
The membrane is used to isolate the dosage form the medium and to maintain the gel in the
cell. The intrinsic gel release properties were not affected by the membrane with the use of
a membrane with large pores dimension. A filter paper, consisting of a single layer of 100%
natural fiber with high strength and large pores dimension was used as membrane
(Papeterie Cascadec, France).
Samples consisting of 15 ml of dissolution medium were withdrawn at precise time
intervals according to the length of the experiment. Volume of dissolution remained
constant at 900 ml with fresh warm medium addition after each withdrawn, these dilutions
have been considerate in the calculus of the concentration. These conditions allow
maintaining the sink conditions.
Gastric acid medium preparation - The gastric fluid simulated TS (USP, 1995) consists of
a mixture of 2.0 g of sodium chloride (Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) with or
without 3.2 g of pepsin (3200 units per mg protein, Sigma Chemical CO., St. Louis, USA)
in 7.0 mL of hydrochloric acid (37 %) (Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) in 1000 mL
of water. The final pH of the dissolution medium is 1.2. Experiments were carried in the
presence and in the absence of pepsin to discriminate the effect of pH and the effect of
enzyme separately. Dissolution of the different gels was followed during 6h.
Intestinal alkaline medium preparation - The intestinal fluid simulated TS (USP, 1995)
consists of 6.8 g of monobasic potassium phosphate (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)
117 in 250 mL of water, mixed, and added in 190 mL of 0.2 N sodium hydroxide (Sigma
Chemical Co., St. Louis, USA) and 400 mL of water. 10.0 g of pancreatin (activity
equivalent to USP specifications, Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) was added or not,
pH was adjusted at 7.5 ± 0.1 with 0.2 N sodium hydroxide solution and volume was
adjusted with water until 1000 mL. Again, experiments were carried out in the presence and
in the absence of enzymes. Dissolution of the different gels was followed during 6h.
In vitro gastrointestinal assays - In order to simulate successive pH and enzymes
encountered after oral administration, the following protocol was applied. The gels were
studied in the gastric condition with pepsin (pH to 1.2) during 30 min, then the pH was
adjusted at 7.5 ± 0.1 with 1 N sodium hydroxide and monobasic potassium phosphate
(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) and pancreatin (activity equivalent to USP
specifications, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) were added in appropriate
concentration mentioned previously, in order to transform the gastric fluid into an
intestinal fluid. In these conditions dissolution of the samples were followed during 6h with
periodically withdrawn.
4.2.3. Dissolution data analysis
Each experiment was performed on 6 cells and the results were expressed as mean,
standard deviation (sd) and variation coefficient (CV%). Analyses of the iron content of the
solution were performed by atomic absorption spectrometer with the techniques standard in
Perkin Elmer 3300 Spectrometer (Perkin Elmer, Shelton, Connecticut). From the samples
assayed, the released iron concentration was expressed which mg/L/g gel. The protein
detection was realized using the measures of elemental nitrogen by the technique of pyro-
118 chemiluminescence (Dechert et al., 1990). This detection was performed in Antek nitrogen
analyzer 7000 ( Antek, Houston, Texas) using the calibration curve with glycine (Dechert
et al., 1990).
ANOVA tests were performed in order to find significantly differences between treatments
and gels structures using Statgraphics Plus Professional V 4.1 program (Manugistics, Inc.
Rockville, MD., USA).
4.2.3.1. Preliminary data
Each experiment was performed on six cell and the study of dissolution data exhibits a
good reproducibility. The variability of the data, estimated from the variation coefficient
(CV) obtained from each experiment at each time, is low. The CV% is lower than 10% in
all experiments for the random aggregated gel. For the filamentous gel, the variability is
increased in gastric media but remain always < 15% and could be related to the influence of
pH and enzyme on gel structure. The sink conditions were maintained during all the
experiment as well as the integrity of the membrane employed.
These results allowed the use of the mean results for the interpretation and the modelization
of the data
4.2.3.2. Release Kinetics
To study the mechanism of iron release from the gels, the release data were fitted to the
following equations.
Equation 4.1 :
119
Zero-order equation: kdtdMt =
where: k is the constant, t is the time, and Mt is the amount of iron release at time t.
Equation 4.2 :
First-order equation ( )tt MMkdtdM −= 0
where: k is the constant, t is the time, M0 and Mt are the amount of iron release at time 0
and t, respectively
For a two period iron release, a biexponential equation, allowing to determine the two
apparent reaction orders, was used, (Tomlinson et al., 1984).
Equation 4.3 :
ee tt
BAMMM t
βα −−
+=−∞
∞
where A and B are constant, and α and β are apparent reaction order , initial and terminal
release rate constants. M∞ represents the initial amount of iron present in the structure and
Mt is the amount of iron release at time t.
4.2.4. Simulated iron intracellular absorption on intestinal wall
4.2.4.1. Culture cell preparation
Caco-2 cells originating from human colorectal carcinoma were obtained from the
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Caco-2 cells were grown at 37
oC in an atmosphere of 5 % CO2 – 95% air at constant humidity and in Dulbecco’s
120 modified Eagle’s medium (DMEM) supplement with 20% fetal calf-serum (Gibco, Grand
island, N.Y., USA) , 1% nonessential amino acids solutions, and 1% streptomycin
/penicillin (Gibco, Grand island, N.Y., USA). The cells were routinely expanded in tissue
culture flasks (75 cm2), and when the cells were 80-90% confluent, they were harvested by
treatment with a solution containing 0.25% trypsin (Gibco, Grand island, N.Y., USA) and 1
mM EDTA, thoroughly washed, and removed in supplemented growth medium.
4.2.4.2. Iron intracellular absorption
Caco-2 cells seeded at a level of 7 x 104 cells/cm2 in tissue culture flasks (75 cm2) were
used in iron intracellular absorption experiments at 20 days post-seeding. Each culture
flasks was washed carefully with PBS and 5 ml of gastrointestinal dissolution medium
(filter for 45 µm) was added. The gastrointestinal dissolution medium was incubated at 37
°C with the cells for 2 h, later the cells were again washed with PBS and 5 ml of DMEM
supplement with 20% fetal calf-serum were added, the culture flasks were then returned to
the incubator for 22 h period at the end of which the cells were harvested for analysis
(Puyfoulhoux et al., 2001). It is preceded to remove cells for the methodology mentioned
previously. The cells removed were sonicated for 20 min at 4 oC. Aliquot of these samples
were used to determine iron and ferritin concentration. Analyses of the iron content of the
solution were performed by atomic absorption spectrometer with graphite electrode (Perkin
Elmer 3300). The Caco-2 cell ferritin content was measured by using microparticle enzyme
immunoassay (MEIA) methods (Abbott AxSYM System for ferritin detection, Abbott
Park, Illinois) on 25 µl samples of the sonicated cells harvested in 2 ml of PBS buffer. An
internal blood standard was used in order to test method precision.
121
4.3. Results and Discussion
4.3.1. Impact of environmental conditions on iron release
4.3.1.1. pH-sensitive iron delivery
It is known that the release rate of molecules from hydrophilic matrices such as proteinous
hydrogels is affected by changing the pH. This is due to the presence of acidic (e.g.
carboxylic acids) or basic (e.g. ammonium salts) groups in the polypeptide chains that
either accept or release protons in response to changes in environmental pH (Qiu & Park,
2001). So, pH-responsive polymeric networks have been extensively studied (Gupta et al.,
2002) and have been most frequently used to develop controlled release formulations for
oral administration. The acidic pH in the stomach (pH 1.2) is quite different from the
neutral pH in the intestine, and such a difference is large enough to induce different release
profiles. Thus, the release of iron from particulate and filamentous gels was investigated in
physiological pH- at gastric pH 1.2 and at intestinal pH 7.5- in relation to the matrices
degradation.
Figure 4.3 presents the iron release and matrix degradation obtained at pH 1.2 (Figure 4.3a
and Figure 4.3b) and pH 7.5 (Figure 4.3c and Figure 4.3d) for both type of gels:
filamentous gels (prepared using 10 mM Fe2+) and particulate ones (prepared using 30mM
Fe2+). In acidic conditions (pH 1.2), the release of iron (Figure 4.3a) shows a significant
statistical difference (α ≤ 0.05) between the two types of gels. The filamentous gels display
a lower release (65 %) after 360 min than the particulate ones (85% at 360 min), suggesting
that the latter gels are more sensitive than the former to the acidic conditions. Since this
122 result could be due to a greater degradation of the particulate gels compared to the
filamentous ones, the degradation of matrices was followed by measuring the elemental
nitrogen in solution as a function of time and is illustrated in Figure 4.3b. This figure
reveals that from 0 to 120 min, no statistical differences occur between the degradation of
the two type of gels whereas from 120 to 360 min, significant statistical differences are
presented. The comparison between Figure 4.3a and Figure 4.3b substantiates that the
difference in the iron release from filamentous and particulate gels is not only due to the
matrix degradation. It can be due to the fact that at pH 1.2 below the isoelectric point of β-
lactoglobulin (pI = 5.2), polypeptide chains are positively charged increasing electrostatic
repulsive force between the ionized backbone chains and decreasing, at the same time,
polypeptide-ionized iron (Fe2+) interactions facilitating the iron diffusion. The higher
cumulative release of iron observed in the case of particulate gels prepared from 30 mM
iron (Figure 4.3a) compared to the one obtained for filamentous gels prepared from 10mM
iron (Figure 4.3a) might be due to their larger pores as observed by microscopy (Figure 4.1)
which result in a better diffusion of iron. Filamentous gels release the Fe2+ according to a
zero order model, with average mean release rate of 0.18 min-1. In this case, the iron
delivery is not controlled by the iron concentration, but by the microstructure of the matrix
represented by the “k parameter” in the mathematic model (Equation 4.1). This may be due
to the presence of very small pores in this microstructure. As opposite, the rate of release
from the particulate gels can be fitted to a first-order equation (Equation 4.2) with a
correlation coefficient r2 = 0.9394 and an average mean release rate of 0.011 min-1. The
particulate gels present one microstructure with very large pores that may be responsible
123 for the fact that the iron delivery is depending on the matrix structure and on iron
concentration in the gels.
An increasing of pH to 7.5 resulted in different release profile illustrated in Figure 3c.
Approximately, 32% of iron was released when filamentous gels was suspended at 37oC for
360 min whereas in the same conditions 10% of iron was released from the particulate gel,
indicating that the former gels are more sensitive to alkaline conditions than latter ones. It
can be notified that for these gels, iron was released in the first 30 min, followed by a very
slow release for the subsequent 330 minutes. As opposite, the matrices degradation (Figure
3d) shows similar behavior to those observed in the acidic conditions (Figure 3b),
indicating that both environmental conditions (pH 1.2 and pH 7.5) produce similar effects
on the degradation of gels. These results reinforce the conclusion that relationship does not
exist between the release of iron and the degradation of gels indicating that iron delivery is
mainly controlled by diffusion mechanisms. In these conditions, the release characteristics
have been fitted using Tomlinson’s model (Equation 4.3). This model allowed to obtain,
two apparent reaction orders, near one for the first release period and near zero in the
second release period.
The different effect of pH on the iron delivery from the two types of gels can be associated
to the fact that theses gels are mainly formed by different physical interactions
(Remondetto & Subirade, 2003). Whereas the particulate gels (prepared with 30mM Fe2+)
are essentially controlled by the van der Waals interactions, in filamentous ones (prepared
with 10 mM Fe2+) the hydrophobic interactions predominate. These interactions lead to
different gel structures with different response to pH stimuli and different iron release
124 profiles. The different pH-sensitive response of hydrogels is a very interesting property that
could be useful for site-specific controlled biomolecules delivery. This concept is largely
used in pharmaceutical field (Jacobs & Mason, 1993; Brannon-Peppas, 1995; Qiu & Park,
2001). However, the use of edible comestible biopolymer such as whey proteins and food
grade components make these hydrogel systems very interesting matrices as pH-responsive
bioactive molecules delivery systems for new applications in the development of functional
foods.
4.3.1.2. Enzymes-sensitive iron delivery
Among the factors that modulate the release properties of hydrogels, those that induce their
biodegradation play a major role. By oral administration, the most important mechanism of
degradation of hydrogels, and specially of protein-based hydrogels, is a hydrolytic
degradation by digestive enzymes encountered in the gastrointestinal tract (GIT). Thus, the
release of iron from particulate and filamentous gels was investigated in the presence of
gastric (pepsin at pH 1.2) or intestinal (pancreatin at pH 7.5) enzyme in relation to the
matrices degradation.
Figure 4.4 presents the iron release (%) and matrix degradation (expressed as nitrogen
concentration (mg/L)) obtained in the presence of pepsin (Figure 4.4a and Figure 4.4b) and
in the presence of pancreatin (Figure 4.4c and Figure 4.4d) for both type of gels:
filamentous gels (prepared using 10 mM Fe2+) and particulate ones (prepared using 30 mM
Fe2+). In the presence of pepsin (pH 1.2), the release of iron (Figure 4.4a) does not show a
significant statistical difference (α ≤ 0.05) between the two types of gels. After 360 min,
125 80-100% of iron was approximately released from the hydrogels whatever their
miscrostructures suggesting a high sensitivity of the hydrogels to gastric enzyme. Figure
4.4b shows an important increase in the degradation of protein matrix for both types of
gels. From 0 to 240 min, gels behaviors are similar, while after 240 min, the particulate gels
are more sensitive to pepsin degradation than filamentous gels. This difference may due to
the fact that pepsin is known to preferentially attack peptide bonds involving hydrophobic
aromatic amino acids such as Trp, Phe, and Tyr and as we showed in a previous work
(Remondetto & Subirade, 2003), they are involved in the hydrophobic interaction that
allow the formation of filamentous gels limitating the action of pepsin. The comparison
between Figure 4.3a and Figure 4.4a (at 6h) shows that, at acidic pH, the release of iron
from particulate gels is similar in the presence and in the absence of pepsin, indicating that
the enzymatic degradation does not play an important effect on the iron release that is
mainly controlled by acidic pH. As opposite, the iron release from filamentous gels is
sensitive to peptic hydrolysis and it represents 70% in the absence and 100% in the
presence of pepsin. This behavior may be due to the location of iron inside the matrices. In
a previous work (Remondetto & Subirade, 2003), we showed that particulate gels resulted
from the random aggregation of aggregates inside which iron is trapped while filamentous
gels resulted from linear aggregation of structural units that form filaments with iron
located at the outer surface and thus more easily released.
The addition of pepsin in the dissolution medium did not affect the release profile of iron
from the particulate gels that can also be characterized by a first-order kinetic, with a rate
constant of 0.011min-1. As opposite, the presence of enzyme modifies the release
126 characteristics of iron from filamentous that could be characterized by a first-order kinetic
until 60 min and by a zero-order kinetic from 60 to 360 min
Figure 4.4c-d displays the behavior of both types of gels (filamentous and random
aggregate gels) in the presence of pancreatin in alkaline conditions (pH 7.5). Again, in
these conditions, the iron release from the particulate gels (Figure 4.4c) is similar to that
obtained in the absence of enzyme (Figure 4.3c) despite difference in the degradation
profiles in the presence (Figure 4.4d) and in the absence (Figure 4.3d) of enzyme. About
10% of iron is released in the first 30 minutes and maintained constant (10%) for the
subsequent 330 minutes. These data show that the presence of enzyme has not a great effect
on the iron release from particulate gels that seems mainly controlled by alkaline
conditions. In the case of the filamentous gel, about 30% of iron was released in the first 30
minutes and this value gradually reaches 50% after 360 minutes. This is accompanied by an
extensive degradation of matrix (Figure 4.4d). We can notify that the two types of gels
presentment different release profiles (Figure 4.4c) despite their similar degradation (Figure
4.4d). This degradation is higher in the presence of pancreatin (Figure 4.4d) than in the
absence of enzyme (Figure 4.3d) but lower in the presence of pancreatin than in the
presence of pepsin (Figure 4.4b). The different actions of two enzymes can be explained by
their pH action. The pancreatin acts at pH 7.5 which is near the gel pH formation, and the
interactions in the matrices are very strong. In opposite, the pepsin acts at pH=1.2 where
the protein is charged, leading to higher protein-protein repulsions facilitating the
penetration and action of enzyme. Moreover, the similar degradation of the two gels in
presence of pancreatin, may be due to the fact that pancreatin is a mix of enzymes mainly
constituted by trypsin, chymotrypsin and carboxypeptidases (A and B) that act at different
127 pH. The trypsin and the chymotrypsin are more efficient at pH = 8 (Garrett & Grishem,
2000) while at the reaction pH (pH=7.5) the carboxypeptidases (A and B) are more
efficient and act on carboxyl terminal groups, producing unspecific degradation (Garrett &
Grishem, 2000), independently of matrix structure allowing the similar degradation.
Moreover, the difference between iron release profiles between the two types of gels may
be due as previously mentioned by the location of iron inside the matrices. In conclusion,
the data deduced from Figure 4.3 (c-d) and Figure 4.4 (c-d) show that for particulate gels
iron delivery is mainly due to alkaline pH whereas for filamentous gels matrix degradation
plays a very important role in iron delivery.
4.3.2. Iron delivery in gastro-intestinal conditions
Because iron should be released as close as possible to its absorption window, i.e. intestinal
wall, it is of primary importance to control its release along the Gastro intestinal (GI) tract.
Thus, hydrogels susceptibility to GI conditions have been studied using a two-step
proteolysis performed at 37°C including a pepsin predigestion (pepsin at pH 1.2 for 30
min) that mimic gastric conditions, followed by a hydrolysis with pancreatic enzymes
(pancreatin at pH 7.5 for 6 h) that imitate intestinal conditions (Germann & Stanfield,
2001).
Figure 4.5 presents the total amount of iron released from the hydrogels (Figure 4.5a) and
the nitrogen content due to the hydrogel degradation (Figure 4.5b) during the gastric step
(first 30min) and intestinal step (the next 6h). After the gastric step, about 20% of the iron
was released in the first 30 min whatever the type of gels -filamentous or particulate
(Figure 4.5a). Then, this burst-release was followed by a plateau release in the case of
128 particulate gel while a linear release of iron was achieved in the case of filamentous gels
that reachs 70% at the end of the intestinal step. The higher release of iron from
filamentous gels compared to particulate gels could be in part explained by the higher
degradation of filamentous gels (Figure 4.5b). However, this is not the only reason since
until 210 min of dissolution test (Figure 4.5b), the degradation of protein matrix are similar
for both types of gels. This difference could be attributed to the location of iron into the
matrices, as previously mentioned. Thus, these data suggest that, in GI tract, iron release
predominantly depends on the type of gels and that the filamentous gel is most efficient to
deliver iron in intestinal step. This result is interesting since it could signify that more iron
is released and available for absorption to intestinal wall in the case of filamentous gels
compared to particulate ones.
However from these experiments, we do not know yet if iron absorption is done by
intestinal wall. Thus, studies on the iron diffusion to the intracellular cellular medium have
been conducted. The product of the gastrointestinal digestion was faced to a mono-layer of
Caco-2 cells, which imitates strongly the behavior of the intestinal wall (Hilgendorf et al.,
2000; Puyfoulhoux et al., 2001). Figure 4.6 displays the intracellular iron concentration for
reference sample, filamentous and particulate gels. Reference sample was the result of
intracellular medium of Caco-2 cells that it was not exposed to gels degradation product. It
is interesting to notify that even though this medium did not contain any product of
digestion, it contains iron present in the culture medium of cells caco-2. Statistical analyses
reveal a significant difference (≤ 0.05) between sample reference and filamentous gel
whereas no difference was obtained with particulate gel. These results indicate that the iron
released from filamentous gels presents cellular absorption significantly more important
129 than iron released from particulate gel. These results could suggest a better bioavailability
of iron released from filamentous gels compared to particulate ones.
However at this stage, it is prematured to anticipate on bioavailability of iron i.e. on the
amount of ingested iron that enters in the body since iron that is absorbed to intestinal cell
can remain there and be excreted during the cell desquamation process, being not
bioavailable (Puyfoulhoux et al., 2001), necessiting to use an other biomaker.
According to Crosby (Crosby, 1963), mucosal synthesis of ferritin is normal in states of
iron repletion; thus iron entering from the lumen is trapped in mucosal ferritin. This
hypothesis led to a possible mechanism by which the ferritin content of the cell could be
controlled by the amount of active iron (possible to be used by the body) in the cell’s
environment. Nevertheless, ferritin is a necessary storage protein to prevent damage and
compile iron reserves. Thus, it can be believed that mucosal ferritin is closely related to
iron bioavailability (Crosby, 1963; Whittaker et al., 1989; Puyfoulhoux et al., 2001).
Figure 4.7 displays the intracellular ferritin (ng/mL) obtained for references, filamentous
and particulate gels, respectively. These results present similar profile to those obtained in
Figure 4.6 with an intracellular ferritin concentration comparable for reference and sample
obtained from particulate gels and different for filamentous ones. These results
demonstrated that the iron delivery from filamentous gels types is bioavailable indicating
the important role of gel structure.
130
4.4. Conclusions
The results of this research show that different iron release profiles can be achieved from
whey protein hydrogels prepared in the presence of 10 and 30 mM of iron. The release
characteristics are noticeable different depending on the microstructure obtained -
filamentous versus particulate gels-. Filamentous gels (prepared in the presence of 10 mM
Fe2+) differed from particulate gels (prepared in the presence of 30 mM Fe2+) with regard to
their response to different stimuli, especially pH- and enzymes-responsive, resulting in the
release of iron in a controlled manner. The results showed that more iron is released and
available for absorption to intestinal wall from filamentous gels compared to particulate
ones indicating that an excessive incorporation of iron is not necessary to increase its
bioavailability. Therefore, filamentous gels contitute an excellence matrix to transport and
to release the iron without reduce its bioavailability. These gels appear as promising
matrices with potential applications in development of functional food systems.
Acknowledgements
The authors acknowledge the Canada Research Chair program for their financial support.
131
a b
Figure 4.1: Scanning electron micrographs of β-lactoglobulin cold gels elaborated in the
presence of: (a) 10 and (b) 30 mM of iron (Remondetto et al., 2002).
.
132 (a)
Extraction cell
Paddle
Dissolution vessel
(b)
Figure 4.2: Schematic representation of the device use in the dissolution test. (a) The paddle
apparatus II and extraction cell. (b) Extraction cell system.
133
(a) (c)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
T ime ( min)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
T ime ( min)
330 360 390
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
Ti me ( mi n)
(b) (d)
330 360 3900.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Ti me ( mi n)
Figure 4.3: Effect of pH on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d) from
filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line) at pH 1.2 (a and b) and pH
7.5 (c and d).
134
(a) (c)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
T ime ( min)
3900.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
T ime ( min)
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
Ti me ( mi n)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
Ti me ( mi n)
(b) (d)
Figure 4.4: Effect of enzyme on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d)
from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line): pepsin pH 1.2 (a and
b) and pancreatin pH 7.5 (c and d).
135
0
5
10
15
20
25
30
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Time (min)
Nitr
ogen
con
cent
ratio
n (m
g/L)
Intestinal phase
Gastricphase
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Time (min)
Iron
conc
entr
atio
n (m
g/g
gel)
Intestinal phase
Gastricphase
(a)
390 420
390 420
(b)
Figure 4.5: Impact of the GI conditions on the iron release (a) and matrix degradation (b)
from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line).
136
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
1
Iron
Con
cent
ratio
n (m
g /L
)
Reference 10 mM 30 mM
Figure 4.6: Iron concentration (mg/L) inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-
intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal
degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+).
137
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
1
Ferr
itin
Con
cnet
ratio
n (n
g/m
L)
Reference 10 mM 30 mM
Figure 4.7: Ferritin concentration in ng/mL inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-
intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal
degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+).
Chapitre V
Conclusion et perspectives
139
Conclusion générale
Au terme de ce travail, nous pouvons apporter de nouvelles informations sur le mécanisme
de gélification à froid de la β-lactoglobuline en présence du fer ionique ainsi que sur ses
propriétés de transport et de libération dans différentes conditions incluant les conditions
gastro-intestinales.
Dans la première étape, il a été montré que les suspensions de β-lactoglobuline
prédénaturées thermiquement peuvent former des gels à température ambiante (20°C) par
l'addition de Fe2+. Les résultats indiquent que les caractéristiques des gels peuvent être
modifiées par les changements de pH, de concentration en protéine ou de concentration en
fer. Quand le rapport fer/protéine est faible et le pH proche de 7, les gels sont homogènes et
filamenteux. Ils sont caractérisés par un comportement élastique et une haute résistance à la
rupture, suggérant la présence d’interactions protéine-protéine importantes. Quand le
rapport fer/protéine est élevé et le pH toujours proche de 7, les gels sont non-homogènes
avec une agrégation aléatoire. Ils sont caractérisés par une faible élasticité et une faible
résistance à la rupture, suggérant que les interactions protéine- protéine sont faibles. De
plus, ces gels particulaires ont une capacité de rétention d'eau inférieure aux gels
filamenteux due à l’existence de pores plus grands et moins homogènes. Les propriétés
macroscopiques révèlent que, pour des rapports fer/protéine intermédiaires, les gels sont
mixtes et constitués d’un mélange de gels filamenteux et particulaires. Une augmentation
de la concentration en fer induit la formation de gels particulaires au détriment des gels
filamenteux avec une baisse concomitante de la force du gel, de l’élasticité et de la capacité
140 de rétention d’eau (WHC). Cela suggère que la concentration du fer peut contrôler les
propriétés macroscopiques des gels à froid de β-lactoglobuline.
Dans la deuxième étape, les changements structuraux de la β-lactoglobuline qui ont lieu
lors de sa gélification à froid en présence de fer ont été étudiés à l’échelle moléculaire par
spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et à l’échelle supra-moléculaire par
rhéologie. La formation des gels à froid est un mécanisme en deux étapes : 1) une
prédénaturation thermique de la β-lactoglobuline dans des conditions qui préviennent la
formation du gel suivie en 2) de la gélification à froid pour l’ajout d’ions Fe2+. Nos résultats
FTIR ont montré qu’après la première étape du processus, les molécules de protéines
forment des agrégats sans gélifier. Ces agrégats présentent des spectres infrarouge
semblables à ceux obtenus pour les gels à froid, suggérant qu'ils constituent les unités
structurales qui serviront de motif initial dans la formation du gel pendant la deuxième
étape. Dans la deuxième étape, l'absence de différences entre les spectres FTIR des gels
filamenteux et des gels particulaires indique que les différences macroscopiques et
microscopiques observées dans la première partie de ce travail ne sont pas dues à des
liaisons hydrogène et que celles-ci sont principalement impliquées dans la formation des
unités structurales de la première étape. Ces résultats ont permis de révéler que d’autres
interactions étaient responsables de la formation et de la consolidation des gels à froid. Les
données rhéologiques obtenues en présence de différents agents bloquants ont révélé que
les interactions de Van der Waals sont principalement responsables de la formation des gels
particulaires alors que les gels filamenteux sont principalement dus à des interactions
hydrophobes. De plus, ces expériences ont montré que la formation des ponts disulfure
141 jouent un rôle important dans la consolidation des deux types du gel. L’ensemble de ces
résultats a conduit à l’élaboration d’un modèle permettant d’expliquer la formation des
différents types de gels et d’interpréter l’impact des conditions environnementales sur leurs
différentes étapes de formation.
La troisième étape de ce travail a permis d’étudier l’impact de la microstructure des gels –
filamenteux versus particulaires- sur la libération de fer. En milieu acide, les gels
particulaires libèrent plus de fer que les gels filamenteux. De plus, les gels particulaires ne
sont pas sensibles à la présence de pepsine alors que les gels filamenteux libèrent une plus
grande quantité de fer en présence de pepsine, suggérant leur plus grande sensibilité à la
dégradation enzymatique. Le comportement inverse est observé à pH alcalin. Ces résultats
montrent que les deux types de structures gélifiées sont sensibles aux conditions
environnementales mais avec un comportement opposé. L'analyse des résultats obtenus
dans des conditions gastro-intestinales simulées montre que les gels filamenteux libérent
une plus grande quantité de fer au niveau intestinal. Ce résultat est intéressant d’un point de
vue pratique. En effet, il montre que les gels filamenteux formés à partir d’une plus petite
concentration en fer (10mM) que les gels particulaires (30mM) présentent une plus grande
libération du fer pendant la phase intestinale et démontre, de facon plus large, qu'une
incorporation excessive de molécules bioactives dans un système complexe ne garantit pas
que la molécule en question soit libérée en quantité suffisante à son site d’absorption. Ces
résultats ont été renforcés par les études de la diffusion intracellulaire du fer et de la
production de ferritine au niveau cellulaire qui démontrent que les gels filamenteux
favorisent l’absorption du fer et à terme sa biodisponibilité.
142
Perspectives du travail
Déjà largement utilisées dans l’industrie alimentaire en raison de leurs propriétés
nutritionnelles et fonctionnelles, les protéines du lactosérum peuvent, grâce à leurs
propriétés gélifiantes, servir de véhicules pour le transport de molécules bioactives. Cette
caractéristique peut être judicieusement exploitée pour libérer de façon contrôlée ces
molécules vers des cibles spécifiques de l’organisme. L’élaboration à froid de ces réseaux
permet d’envisager le transport de molécules thermosensibles seules ou en mélange afin
d’augmenter leur effet synergique. Ces systèmes protéiques peuvent servir de base pour le
développement de nouveaux aliments fonctionnels ayant un impact santé sur la population
et contribuer au développement de ce secteur en pleine émergence.
BIBLIOGRAPHIE
144
Bibliographie : Aguilera, J. M. 1995. Gelation of whey proteins. Food Technology, 49, 83-89.
Allain, A.-F.; Paquin, P. & Subirade, M. 1999. Relationships between conformation of β-
lactoglobulin in solution and gel state as revealed by attenuated total reflection
Fourier transform infrared spectroscopy. International Journal of Biological
Macromolecules, 26, 337-344.
Allen, L. H. 1997. Pregnancy and iron deficiency: unresolved issues. Nutrition Reviews, 55,
91-101.
Allen, L. H. 2002. Advantages and limitations of iron amino acid chelates as iron
fortifications. Nutrition Reviews, 60, S18-S21.
AOAC. 1984. Official Methods of Analysis, 7th ed ed.; Assoc. of Official Analytical
Chemists: Arlington, VA.
Arrondo, J. L. R.; Young, N. M. & Mantsch, H. H. 1988. The solution structure of
concanavalin A probed by FT-IR spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta, 952,
261-268.
Arrondo, J. L. R.; Muga, A.; Castresana, J. & Goni, F. M. 1993. Quantitative studies of the
structure of proteins in solution by Fourier-transform infrared spectroscopy.
Progress in Biophysics and Molecular Biology, 59, 23-56.
Aymard, P.; Durand, D. & Nicolai, T. 1996. The effect of temperature and ionic strength on
dimerisation of β-lactoglobulin. International Journal of Biological
Macromolecules, 19, 213-221.
Bae, Y. H. & Kwon, I. C. Stimuli-sensitive polymers for modulated drug release. In
Biorelated Polymers and Gels; T. Okano, Ed.; Academic Press: New York, 1998;
pp 93-134.
Bandekar, J. 1992. Amide modes and protein conformation. Biochimica et Biophysica Acta,
1120, 123-143.
Barbut, S. & Foegeding, E. A. 1993. Ca2+- Induced gelation of pre-heated whey protein
isolate. Journal of Food Science, 58, 867-871.
Barbut, S. Protein gel ultrastructure and functionality. In Protein Functionality in Food
Systems, 1994; pp 383-433.
145Barbut, S. 1995. Effect of sodium level on the microstructure and texture of whey protein
isolate gels. Food Research International, 28, 437-443.
Bauer, R.; Carrotte, R.; Rischel, C. & Ogendal, L. 2000. Characterization and isolation of
intermediates in β-lactoglobulin heat aggregation at high pH. Biophysical Journal,
79, 1030-1038.
Beaulieu, L.; Savoie, L.; Paquin, P. & Subirade, M. 2002. Elaboration and characterization
of whey protein beads by an emulsification/cold gelation process: application for the
protection of retinol. Biomacromolecules, 3, 239-248.
Benito, P. & Miller, D. 1998. Iron absorption and bioavailability: an update review.
Nutrition Research, 18, 581-603.
Bogdansky, S. Natural polymer as drug delivery systems. In Biodegredable polymers as
drug delivery systems; M. Chasin; R. Langer and J. Swarbrick, Eds.: New York,
1990; pp 231-259.
Bothwell, T. H. 2000. Iron requirements in pregnancy and strategies to meet them.
American Journal of Clinical Nutrition, 72 (suppl), 257S-264S.
Box, E. L. & Draper, N. 1987. Empirical model building and response surfaces; John
Wiley and Sons: New York.
Boye, J. I.; Alli, I.; Ismail, A. A.; Gibbs, B. F. & Konishi, Y. 1995. Factors affecting
molecular characteristics of whey protein gelation. International Dairy Journal, 5,
337-353.
Boye, J. I.; Ma, C.-Y.; Ismail, A. & Alli, I. J. 1996. Effects of physico-chemical factors on
the secondary structure of β-lactoglobulin. Journal Dairy Research, 63, 97-109.
Boye, J. I.; Alli, I.; Ramaswamy, H. & Raghavan, V. G. S. 1997a. Interactive effects of
factors affecting gelation of whey proteins. Journal of Food Science, 62, 57-65.
Boye, J. I.; Ma, C.-Y.; Ismail, A.; Harwalkar, V. R. & Kalab, M. 1997b. Molecular and
microstructural studies of thermal denaturation and gelation of β-lactoglobulins A
and B. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 1608-1618.
Bradley, J. & Xu, X. 1996. Diet, age, and the immune system. Nutrition Reviews, 54, S43-
S50.
146Brannon-Peppas, L. Controlled release in the food and cosmetics industries. In Polymeric
Delivery Systems; M. A. El-Nokaky; D. M. Piatt and B. A. Charpentier, Eds.;
American Chemical Society: Washington, 1993; pp 42-52.
Brannon-Peppas, L. 1995. Recent advances on the use of biodegradable microparticles and
nanoparticles in controlled drug delivery. International Journal of Pharmaceutics,
116, 1-9.
Brownlow, S.; Morais-Cabral, J. H.; Cooper, R.; Flower, D. R.; Yewdall, S. J.; Polikarpov,
I.; North, A. C. T. & Sawyer, L. 1997. Bovine β-lactoglobulin at 1.8Å resolution-
still an enigmatic lipocalin. Current Biology, 5, 481-495.
Bryant, C. M. & McClements, D. L. 1998. Molecular basis of protein functionality with
special consideration of cold -set gels derived from heat-denatured whey. Trends in
Food Science and Technology, 9, 143-151.
Bryant, C. M. & McClements, D. L. 1999. Ultrasonic spectrometry study of the influence
of temperature on whey protein aggregation. Food Hydrocolloids, 13, 439-444.
Bryant, C. M. & McClements, D. L. 2000a. Influence of NaCl and CaCl2 on cold-set
geltion of heat-denatured whey protein. Journal of Food Science, 65, 801-804.
Bryant, C. M. & McClements, D. L. 2000b. Optimizing preparation conditions for heat-
denatured whey protein solutions to be used as cold-gelling ingredients. Journal of
Food Science, 65, 259-263.
Byler, D. M. & Susi, H. 1986. Examination of the secondary structure of proteins by
deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 25, 487-496.
Casal, H. L.; Köhler, U. & Mantsch, H. H. 1988. Structural and conformational changes of
β-lactoglobulin B: an infrared spectroscopic study of effect of pH and temperature.
Biochimica et Biophysica Acta, 957, 11-20.
CIE “Recommendations on uniform color spaces-color difference equations, psychometric
color terms.,” Comission internationale de l'eclairage, Paris,1996.
Clark, A. H.; Saunderson, D. H. P. & Suggett, A. 1981. Infrared and laser-raman
spectroscopic studies of thermally-induced globular protein gels. International
Journal Peptide Protein Research, 17, 353-364.
147Clark, A. H. & Lee-Tuffnell, C. D. Gelation of globular proteins. In Functional Properties
of Food Macromolecules; J. R. Mitchell and D. A. Ledward, Eds.; Elsevier Applied
Science Publishers: London, 1985; pp 203-272.
Clark, A. H. & Ross-Murphy, S. B. 1987. Structural and mechanical properties of
biopolymer gels. Advanced in Polymers Science, 83, 57-192.
Clark, A. H. 1993. Biopolymer gelation-comparaison of reversible and irreversible cross-
link descriptions. Polymer Gels and Networks, 1, 139-158.
Clark, A. H. 1998. Functional properties of food macromolecules, 2nd ed.; Aspen:
Gaithersburg.
Cork, S. C. 2000. Review: iron storage diseases in birds. Avian Pathology, 29, 7-12.
Crosby, W. H. 1963. The control of iron balance by the intestinal mucosa. Blood, 22, 441-
449.
Damodaran, S. 1988. Refolding of thermally unfolded soy proteins during the cooling
regime of the gelation process: effect on gelation. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 36, 262-269.
Damodaran, S. & Anand, K. 1997. Sulfhydryl-disulfide interchange-induced interparticle
protein polymerization in whey protein-stabilized emulsion and its relation to
emulsion stability. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 3813-3820.
Dary, O. 2002. Staple food fortification with iron: a multifactorial decision. Nutrition
Reviews, 60, S34-S41.
De Andrada, I.; Castillo, M. & Walter, T. 1997. Psychomotor development and behavior in
iron-deficient anemic infants. Nutrition Reviews, 55, 125-132.
Dechert, R. E.; Cerny, J. C. & Bartlett, R. H. 1990. Measurement of elemental nitrogen by
chemiluminescence: an evaluation of the Antek Nitrogen Analyzer System. Journal
of Parenteral and Enteral Nutrition, 14, 195-197.
Dickinson, E. 1997. Properties of emulsions stabilizided with milk proteins: overview of
some recent developments. Journal Dairy Science, 80, 2607-2619.
Doi, E. 1993. Gels and gelling of globular proteins. Trends in Food Science and
Technology, 4, 1-5.
Dong, A.; Huang, P. & Caughey, W. S. 1990. Protein secondary structures in water from
second-derivative amide-I infrared spectra. Biochemistry, 29, 3303-3308.
148Dong, A.; Matsuura, J.; Allison, S. D.; Chrisman, E.; Manning, M. C. & Carpenter, J. F.
1996. Infrared and circular dichroism spectroscopic characterization of structural
differences between beta-lactoglobulin A and B. Biochemistry, 35, 1450-1457.
Dreosli, I. E. 1996. Bioactive ingredients: antioxidants and polyphenols in tea. Nutrition
Reviews, 54, S51-S58.
Duclairoir, C.; Irache, J. M.; Nakache, E.; Orecchioni, A.-M.; Chabenat, C. & Popineau, Y.
1999. Gliadin nanoparticles: formation, all-trans-retinoic acid entrapment and
release, size optimization. Polymers International, 79, 327-333.
Edwards, P. J. B.; Jameson, G. B.; Palmano, K. P. & Creamer, L. K. 2002. Heat-resistant
structural features of bovine [beta]-lactoglobulin A revealed by NMR H/D exchange
observations. International Dairy Journal, 12, 331-344.
Elofsson, C.; Dejmek, P.; Paulsson, M. & Burling, H. 1997. Characterization of a cold-
gelling whey protein concentrate. International Dairy Journal, 7, 601-608.
Erkkola, M.; Karppinen, M.; Järvinen, A.; Knip, M. & Virtanen, S. M. 1998. Folate,
vitamine D, and iron intakes are low among pregnant finnish women. European
Journal of Clinical Nutrition, 52, 742-748.
Errington, A. D. & Foegeding, E. A. 1998. Factors determining fracture stress and strain of
fine-stranded whey protein gels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46,
2963-2967.
Fabian, H.; Schultz, C.; Naumann, D.; Landt, O.; Hahn, U. & Saenger, W. 1993. Secondary
structure and temperature-induced unfolding and refolding of ribonuclease T-1 in
aqueous solution: A Fourier transform infrared spectroscopic study. Journal of
Molecular Biology, 232, 967-981.
Ferry, J. D. 1948. Protein gels. Advances in Protein Science, 4, 1-76.
Foegeding, E. A.; Li, H. & Bottcher, S. R. Gelation of globular proteins. In IFT Basic
Symposium Series; N. S. Hettiarachchy and G. R. Ziegler, Eds.; Institut of Food
Technology: New York, 1992; pp 709-712.
Foegeding, E. A.; Lowe, R.; Boland, M. J. & Hill, J. P. 1999. Effect of genetic
polymorphism on the gelation of β-lactoglobulin. Macromolecules Symposium, 140,
137-143.
149Friberg, S. E.; Goubran, R. F. & Kayali, I. H. 1990. Emulsion stability, 2nd ed.; Marcel
Dekker, Inc: New York.
Gallais, F. Première triade horizontale du groupe VIII: Fer, Cobalt, Nickel, généralités sur
les complexes. In Chimie Minérale Théorique et Expérimentale (Chimie
électronique); Masson et Cie: Paris, 1950; pp 708-808.
Garrett, R. H. & Grishem, C. M. Les protéines: fonctions biologiques et structure. In
Biochimie; R. H. Garrett and C. M. Grishem, Eds.; DeBoeck Université: Paris,
2000; pp 107-157.
Germann, W. J. & Stanfield, C. L. The digestive system. In Principles of human
physiology; W. J. Germann and C. L. Stanfield, Eds.; Benjamin Cummings: San
Francisco, 2001; pp 601-638.
Goormaghtigh, E.; Cabiaux, V. & Ruysschaert, J.-M. Determination of soluble and
membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. II.
Experimental aspects, side chain structure, and H/D exchange. In Subcellular
Biochemistry; H. J. Hilderson and G. B. Ralston, Eds.; Plenum Press: New York,
1994; pp 363-403.
Guesry, P. 1998. The role of nutrition in brain development. Preventive Medicine, 27, 189-
194.
Gupta, P.; Vermain, K. & Garg, S. 2002. Hydrogels: from controlled release to pH-
responsive drug delivery. Drug Discovery Today, 7, 569-579.
Hamann, D. D. Structural failure in solid foods. In Physical Properties of Foods; M. Peleg
and E. B. Bagley, Eds.; AVI Publishing Company, Inc: Westport, Connecticut,
1983; pp 351-383.
Hercberg, S.; Galan, P.; Preziosi, P. & Aissa, M. 2000. Consequences of iron deficiency in
pregnant women: Current issues. Clinical-Drug-Investigation., 19, 1-7.
Hertrampf, E. 2002. Iron fortification in the americas. Nutrition Reviews, 60, S22-S25.
Hilgendorf, C.; Spahn-Langguth, H.; Regardh, C. G.; Lipka, E.; Amidon, G. L. &
Langguth, P. 2000. Caco-2 versus caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines:
permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.
Journal of Pharmaceutical Sciences, 89, 63-75.
150Hilliam, M. 1998. The market for functional foods. International Dairy Journal, 8, 349-
353.
Hoffman, A. S. A commentary on the advantages and limitations of synthetic polymer-
biomolecule conjugates. In Biorelated Polymers and Gels; T. Okano, Ed.;
Academic Press: New York, 1998; pp 231-248.
Hoffman, A. S. 2002. Hydrogels for biomedical applications. Advanced Drug Delivery
Reviews, 43, 3-12.
Hongsprabhas, P. & Barbut, S. 1997a. Protein and salt effects on Ca2+ -induced cold
gelation of whey protein isolate. Journal of Food Science, 62, 382-385.
Hongsprabhas, P. & Barbut, S. 1997b. Structure-forming processes in Ca2+-induced whey
protein isolate cold gelation. International Dairy Journal, 7, 827-834.
Hongsprabhas, P. & Barbut, S. 1998. Ca2+-Induced cold gelation of whey protein isolate:
effect of two-stage gelation. Food Research International, 30, 523-527.
Hongsprabhas, P. & Barbut, S. 1999. Effect of pre-heated whey protein level and salt on
texture development of poultry meat batters. Food Research International, 32, 145-
149.
Hongsprabhas, P.; Barbut, S. & Marangoni, A. G. 1999. The structure of cold-set whey
protein isolate gels prepared with Ca++. Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie,
32, 196-202.
Hurrell, R. F. 1997. Bioavailability of iron. European Journal of Clinical Nutrition, 51, S4-
S8.
Hurrell, R. F. 1998. Improvement of trace element status through food fortification:
technological, biological and health aspects. Nutrition Dieta, 54, 40-57.
Ikeda, S. & Nishinari, K. 2001. Structural change during heat-induced gelation of globular
protein dispersions. Biopolymers, 59, 87-102.
Ikeda, S. & Morris, V. 2002. Fine-stranded and particulate aggregates of heat-denatured
whey protein visualized by atomic forcemicroscopy. Biomacromolecules, 3, 382-
389.
Israelachvili, J. N. 1985. Intramolecular and surface forces; Academic Press Inc.: London.
Jackson, M. & Mantsch, H. H. 1992. Halogenated alcohols as solvents for proteins FTIR
spectroscopic studies. Biochimica et Biophysica Acta, 1118, 139-143.
151Jacobs, I. C. & Mason, N. S. Polymer delivery systems concepts. In Polymeric Delivery
Systems; M. A. El-Nokaky; D. M. Piatt and B. A. Charpentier, Eds.; American
Chemical Society: Washington, 1993; pp 1-17.
Jameson, G. B.; Adams, J. J. & Creamer, L. K. 2002. Flexibility, functionality and
hydrophobicity of bovine [beta]-lactoglobulin. International Dairy Journal, 12,
319-329.
Ju, Z. Y. & Kilara, A. 1998. Gelation of pH-aggregated whey protein isolate solution
induced by heat, protease, calcium salt, and acidulant. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 46, 1830-1835.
Kamath, K. R. & Park, K. 1993. Biodegradable hydrogels in drug delivery. Advanced Drug
Delivery Reviews, 11, 59-84.
Kaneko, Y. & Sakai, K. Temperature-responsive hydrogels as intelligent materials. In
Biorelated Polymers and Gels; T. Okano, Ed.; Academic Press: New York, 1998;
pp 29-69.
Katzhendler, I.; Priev, A. & Friedman, M. 2000. Correlation between drug release kinetics
from proteineous matrices and protein folding: elasticity and compressibility study.
Journal of Controlled Release, 67, 261-274.
Kauppinen, J. K.; Moffat, D. J.; Mantsch, H. H. & Cameron, D. 1981. Fourier self-
deconvolution: a method for resolving intrinsically overlapped bands. Applied
Spectroscopy, 35, 271-276.
Kavanagh, G. M.; Clark, A. H. & Ross-Murthy, S. B. 2000. Heat-induced gelation of
globular proteins: part 3. Molecular studies on low pH β-lactoglobulin gels.
International Journal of Biological Macromolecules, 28, 41-50.
Kikuchi, A. & Okano, T. 2002. Pulsatile drug release control using hydrogels. Advanced
Drug Delivery Reviews, 54, 53-77.
Kitabatake, N.; Fujita, Y. & Kinekawa, Y.-I. 1996. Viscous sol and gel formation from
process whey protein below 25 oC. Journal of Food Science, 61, 500-503.
Kocher, P. N. & Foegeding, E. A. 1993. Microcentrifuge-based for measuring water-
holding of protein gels. Journal of Food Science, 58, 1040-1046.
Krimm, S. & Bandekar, J. 1986. Vibrationnal spectroscopy and conformation of peptides
and proteins. Advanced Protein Chemistry, 38, 181-364.
152Kuhn, P. R. & Foegeding, E. A. 1991. Mineral salt effects on whey protein gelation.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 39, 1013-1016.
Kyte, J. 1995. Structure in Protein Chemistry; Garland Publishing, Inc.: New York.
Langton, M. & Hermansson, A.-M. 1992. Fine-stranded and particulate gels of β-
lactoglobulin and whey protein at varying pH. Food Hydrocolloids, 5, 523-539.
Le Bon, C.; Nicolai, T. & Durand, D. 1999. Kinetics of aggregation and gelation of
globular proteins after heat-induced denaturation. Macromolecules, 32, 6120-6127.
Lefèvre, T. & Subirade, M. 1999. Structural and interaction properties of β-lactoglobulin as
studied by FTIR spectroscopy. International Journal of Food Science and
Technology, 34, 419-428.
Lefèvre, T. & Subirade, M. 2000. Molecular differences in the formation and structure of
fine-stranded and particulate β-lactoglobulin gels. Biopolymers, 54, 578-586.
Lefèvre, T. & Subirade, M. 2001. Molecular structure and interaction of biopolymers as
viewed by Fourier transform infrared spectroscopy: model studies on β-
lactoglobulin. Food Hydrocolloids, 15, 365-376.
Li-Chan, E. & Nakai, S. Effect of molecular changes (SH groups and hydrophobicity) of
food proteins on their functionality. In Food Proteins; J. E. Kinsella and W. G.
Soucie, Eds.; The American Oil Chemists' Society: Champaign, Illinios, 1989.
Lips, A.; Campbell, I. J. & Pelan, E. G. Aggregation mechanisms in food colloids and the
role of biopolymers. In Food Polymers, Gels, and Colloids; E. Dickinson, Ed.; Food
Science Departement, University of Leeds, England: Leeds, UK, 1990.
Liu, T. X.; Relkin, P. & Launay, B. 1994. Thermal denaturation and heat-induced gelation
properties of β-lactoglobulin. Effects of some chemical parameters. Thermochimica
Acta, 246, 387-403.
Lynch, S. R.; Hurell, R. F.; Dassenko, S. A. & Cook, J. D. 1989. The effect of dietary
proteins on iron bioavailability in man. Advances in Experimental Medical Biology,
249, 117-132.
Lynch, S. R. 2000. The effect of calcium on iron absorption. Nutrition Research Reviews,
13, 141-158.
Lynch, S. R. 2002. Food iron absortion and its importnce for the design of food fortification
strategies. Nutrition Reviews, 60, S3-S15.
153Lysionek, A.; Zubillaga, M.; Salgueiro, M.; Caro, R.; Weill, R. & Boccio, J. 2001.
Biovailability study of dried microencapsulated ferrous sulfate SFE 171 - by means
of the prophylactic-preventive method. Journal of Trace Elements in Medicine and
Biology, 15, 255 - 259.
Lysionek, A.; Zubillaga, M.; Salgueiro, M.; Caro, R.; Segal, M.; Shafran, N.; Shapira, N. &
Boccio, J. 2002. Bioavailability of Petit-Suisse cheese as food vehicle for iron
fortification estimated by the prophylactic method. Journal of Nutritional Science
and Vitaminology, 48, 315 - 317.
Mai, K. & Tan, B. 2000. Iron methionine (FeMet) and iron sulfate (FeSO4) as sources of
dietary iron for juvenile abalone, Haliotis discus hannai ino. Journal of Sellfish
Research, 19, 861-868.
Malaspina, A. 1996. Functional foods: overview and introduction. Nutrition Reviews, 54,
S4-S5.
Marangoni, A. G.; Barbut , S.; McGauley, S. E.; Marcone, M. & Narine, S. S. 2000. On the
structure of particulate gels-the case of salt-induced cold gelation of heat-denatured
whey protein isolate. Food Hydrocolloids, 14, 61-74.
Mason, R.; Gunst, R. & Hess, J. Response-surface designs. In Statistical desing and
analysis of experiments.; R. Mason; R. Gunst and J. Hess, Eds.; John Wiley & Sons,
inc.: New York, 1989; pp 204-233.
Meisel, H. 2001. Bioactive peptides from milk proteins: a perspective for consumers and
producers. The Australian Journal of Dairy Technology, 56, 83-92.
Melnick, L. M. Iron. In Treatise on Analytical Chemistry; I. M. Kolthoff and P. J. Elving,
Eds.; Interscience Publishers: New York, 1962; pp 247-309.
Miyata, T.; Uragami, T. & Nakamae, K. 2002. Biomolecules-sensitive hydrogels. Advanced
Drug Delivery Reviews, 54, 79-98.
Moy, R. J. D. 2000. Iron fortification of infant formula. Nutrition Research Reviews, 13,
215-227.
Mulvihill, D. M. & Kinsella, J. E. 1988. Gelation of β-lactoglobulin: effects of sodium
chloride on the rheological and structural properties of gels. Journal of Food
Science, 53, 231-236.
Nishinari, K. 2000. Hydrocolloids, Part 1; Elsevier: Amsterdam.
154Nunez, M. T.; Osorio, A.; Tapia, V.; Vergara, A. & Mura, C. V. 2001. Iron-induced
oxidative stress up-regulates calreticulin levels in intestinal epithelial (caco-2) cells.
Journal of Cellular Biochemistry, 82, 660-665.
Otte, J.; Zakora, M. & Qvist, K. B. 2000. Involvement of disulfide bonds in bovine β-
lactoglobulin B gels set thermally at various pH. Journal of Food Science, 65, 384-
389.
Papiz, M. Z.; Sawyer, L.; Eliopoulos, E. E.; North, A. C. T.; Findlay, J. B. C.;
Sivaprasadarao, R.; Jones, T. A.; Newcomer, M. E. & Kraulis, P. J. 1986. The
structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein.
Letters to Nature, 342, 383-385.
Park, H. & Park, K. Hydrogels in bioapplications. In Hydrogels and Biodegradable
Polymers for Bioapplications; R. M. Ottenbrite; S. J. Huang and K. Park, Eds.;
American Chemical Society: Washington, 1996; pp 2-9.
Park, K. 2002. Hydrogels. Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 1.
Peleg, N. & Normand, M. D. 1983. Comparaison of two methods for stress relaxation data
presentation of solid foods. Rheologica Acta, 22, 108-113.
Peppas, N.; Huang, Y.; Torres-Lugo, M.; Ward, J. & Zhang, J. 2000a. Physicochemical,
foundations and structural design of hydrogels in medicine and biology. Annual
Review of Biomedical Engineering, 2, 9 - 29.
Peppas, N. A. 1997. Hydrogels and drug delivery. Current Opinion in Colloid and
Interface Science, 2, 531-537.
Peppas, N. A.; Bures, P.; Leobandung, W. & Ichikawa, H. 2000b. Hydrogels in
pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, 50, 27-46.
Philipon, P. 1997. Des médicaments libérés sur commande. Biofutur, 171, 25-27.
Phillips, L. G.; Whitehead, D. M. & Kinsella, J. E. 1994. Structure-function properties of
food protein; Academic Press: San Diego.
Pollitt, E. 1997. Iron deficiency and educational deficiency. Nutrition Reviews, 55, 133-
140.
Pothakamury, U. R. & Barbosa-Canovas, G. V. 1997. Fundamental aspects of controlled
release in foods. Trends in Food Sciences and Technology, 397-406.
155Prasad, A. S. Iron. In Trace elements and iron in human metabolism; A. S. Prasad, Ed.;
Plenum Medical Book Company: New York, 1978; pp 77-157.
Puyfoulhoux, G.; Rouanet, J.-M.; Besançon, P.; Baroux, B.; Baccou, J.-C. & Caporiccio, B.
2001. Iron availability from iron-fortified spirulina by an in vitro digestion/caco-2
cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 1625-1629.
Qi, X. L.; Brownlow, S.; Holt, C. & Sellers, P. 1995. Thermal denaturation of β-
lactoglobulin:effect of protein concentration at pH 6.75 and 8.05. Biochimica et
Biophysica Acta, 1248, 43-49.
Qiu, Y. & Park, K. 2001. Environment-sensitive hydrogels for drug delivery. Advanced
Drug Delivery Reviews, 53, 321-339.
Raja, K.; Jafri, S.; Dickson, D.; Acebron, A.; Cremonesi, P.; Fossati, G. & Simpson, R.
2000. Involvement of iron (ferric) reduction in the iron absorption mechanism of a
trivalent iron-protein complex (iron protein succinylate). Pharmacology &
Toxicology, 87, 108 - 115.
Remondetto, G. E.; Paquin, P. & Subirade, M. 2002. Cold gelation of β-lactoglobulin in the
presence of iron. Journal of Food Science, 67, 586-595.
Remondetto, G. E. & Subirade, M. 2003. Molecular mechanisms of Fe2+-induced β-
lactoglobulin cold gelation: an interactions story. Biopolymers, In press.
Renard, D. Etude de l'agrégation et de la gélification des protéines globulaires: application
à la beta-lactoglobuline. These de doctorat, Université de Nantes, 1994.
Rha, C.-K. & Pradipasena, P. Viscosity of proteins. In Functional Properties of Food
Macromolecules; J. R. Mitchell and D. A. Ledward, Eds.; Elsevier Applied Science
Publishers: New York, 1985; pp 371-433.
Rivera, R.; Ruiz, R.; Hegenauer, J.; Saltmen, P. & Green, R. 1982. Bioavailability of Fe-
and copper-supplemented milk for Mexican school children. American Clinical
Nutrition, 32, 1162-1169.
Robin, O.; Turgeon, S. & Paquin, P. Functional properties of milk proteins. In Dairy
Science and Technology Handbook; H. Hui, Ed.; VCH ublishers: New York, 1993;
pp 277-353.
Roff, C. F. & Foegeding, E. A. 1996. Dicationic-induced gelation of pre-denatured whey
protein isolate. Food Hydrocolloids, 10, 193-198.
156Ross-Murphy, S. B. Concentration dependence of gelation time. In Food polymers, Gels
and Colloides; E. Dickinson, Ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge,
1991; pp 357-368.
Sawyer, W. H. 1968. Heat denaturation of bovine β-lactoglobulin and relevance of
disulphide aggregation. Journal Dairy Science, 51, 323-329.
Schmidt, R. H.; Illingworth, B. L.; Ahmed, E. M. & Richter, R. L. 1978. The effect of
dialysis on heat-induced gelation of whey protein concentrates. Journal of Food
Process and Preservation, 2, 111-121.
Schrooyen, P. M. M.; van der Meer, R. & de Kruif, C. G. 2001. Microencapsulation: its
application in nutrition. Proceedings of the Nutrition Society, 60, 475-479.
Schümann, K. 2001. Safety aspects of iron in food. Annals of Nutrition and Metabolism,
45, 91-101.
Shahidi, F. & Han, X.-Q. 1993. Encapsulation of food ingredients. Critical Reviews in
Food Science and Nutrition, 33, 501-547.
Shimada, K. & Cheftel, J. C. 1988. Sulfhydryl group/disulphide bond interchange reactions
during heat induced gelation of whey protein isolate. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 37, 161-168.
Siddiqi, S.; Kumar, N.; Nutting, D. & Mansbach, C. 2001. Nutrient absorption. Current
Opinion in Gastroenterology, 17, 110 - 117.
Stading, M. & Hermansson, A. M. 1990. Viscoelastic behaviour of β-lactoglobulin gel
structures. Food Hydrocolloid, 4, 121-135.
Stading, M. & Hermansson, A. M. 1991. Large deformation properties of β−lactoglobulin
gel structure. Food Hydrocolloid, 5, 339-352.
Stading, M.; Langton, M. & Hermansson, A.-M. 1992. Inhomogeneous fine-stranded β-
lactoglobulin gels. Food Hydrocolloids, 6, 455-470.
Stading, M.; Langton, M. & Hermansson, A.-M. 1993. Microstructure and rheological
behaviour of particulate β-lactoglobulin gels. Food Hydrocolloids, 7, 195-212.
Steffe, J. F. 1992. Rheological methods in food process engineering; Freeman Press: East
Lansing, Michigan.
157Subirade, M.; Gueguen, J. & Pézolet, M. 1994. Conformational changes upon dissociation
of a globular protein from pea: a Fourier transform infrared spectroscopy study.
Biochimica et Biophysica Acta, 1205, 239-247.
Subirade, M.; Loupil, F.; Allain, A. F. & Paquin, P. 1998. Effect of dynamic high pressure
on the secondary structure of β-lactoglobulin and on its conformational properties as
determined by Fourier transform infrared spectroscopy. International Dairy
Journal, 8, 135-140.
Surewicz, W. K. & Mantsch, H. H. 1988. New insight into protein secondary structure from
resolution-enhanced infrared spectra. Biochimica et Biophysica Acta, 952, 115-130.
Swain, J.; Tabatabai, L. & Reddy, M. 2002. Histidine content of low-molecular-weight beef
proteins influences nonheme iron Bioavailability in Caco-2 cells. Journal of
Nutrition, 132, 245 - 251.
Takeda, N.; Kato, M. & Taniguchi, Y. 1995. Pressure and thermally-induced reversible
changes in the secondary structure of ribonuclease A studied by FT-IR
spectroscopy. Biochemistry, 34, 5980-5987.
Tanaka, T. 1981. Gels. Scientific American, 244, 110-123.
Tang, J.; Lelievre, J.; Tung, M. A. & Zeng, Y. 1994. Polymer and ion concentration effects
on gellan gel strength and strain. Journal of Food Science, 59, 216-220.
Tang, Q.; McCrthy, O. J. & Munro, P. A. 1995. Effects of pH on whey protein concentrate
gel properties: comparations between small deformation (Dynamic) and large
deformation (Failure) testing. Journal Texture Studies, 26, 255-272.
The Micronutrient Initiative “Iron deficiency,” Raport of The Micronutrient Initiative,
Otawa,1998.
Thomas, D. & Frankenberg, E. 2002. Health, nutrition and properity:a microeconomic
perspective. Bulletin of the World Health Organization, 8, 106-113.
Tomlinson, E.; Burger, J. J.; Schoooderwoerd, E. M. A. & McVie, J. G. 1984. Human
serum albumin microspheres for intra-arterial drug targeting of cytostatic
compounds; Elsevier: Amsterdam.
Totosaus, A.; Montejano, J.; Salazar, J. & Guerrero, I. 2002. A review of physical and
chemical protein gel induction. International Journal of Food Science and
Technology, 37, 589-601.
158Twomey, M.; Keogh, M. K.; Mehra, R. & O'Kennedy, T. 1997. Gel characteristics of β-
lactoglobulin, whey protein concentrate and whey protein isolate. Journal of
Texture Studies, 28, 387-403.
Uauy, R.; Hertrampf, E. & Reddy, M. 2002. Iron fortification of foods: Overcoming
technical and practical barriers. Journal of Nutrition, 132, 849S - 852S.
USP. 1995. The national formulary 18: Rockville, MD, Vol. XXIII.
USP. 2000. The national formulary 19: Rockville, MD, Vol. XXIV.
Van Den Bulcke, A. I.; Bogdanov, B.; De Rooze, N.; Schacht, E. H.; Corneluissen, M. &
Berhmans, H. 2000. Structural and rheological properties of methacrylamide
modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules, 1, 31-38.
Van Der Meer, R.; Bovee-Oudenhoven, I. & Kleibeuker, J. 1998. Milk products and
intestinal health. International Dairy Journal, 8, 163-170.
Verheul, M. & Roefs, S. P. F. M. 1998. Structure of particulate whey protein gels: effect of
NaCl concentration, pH, heating temperature, and protein composition. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 46, 4909-4916.
Viteri, F. E.; Alvarez, E.; Batres, R.; Torun, B.; Pineda, O.; Mejia, L. A. & Siluy, J. 1995.
Fortification of sugar with Fe sodium ethylenediaminotetracetate (NaFeEDTA)
improves Fe status in semirural Guatemalan populations. American Journal
Nutrition, 61, 1153-1163.
Walter, T.; Olivares, M.; Pizarro, F. & Munoz, C. 1997. Iron, anemia, and infection.
Nutrition Reviews, 55, 111-124.
Wang, C.-H. & Damodaran, S. 1990. Thermal gelation of globular proteins: weight-average
molecular weight dependence of gel strength. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 38, 1157-1164.
Wang, C.-H. & Damodaran, S. 1991. Thermal gelation of globular proteins: Influence of
protein conformation on gel strength. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
39, 433-438.
Wapnir, R. A. Effect of food sources and processing on protein and mineral absorption. In
Protein nutrition and mineral absorption; R. A. Wapnir, Ed.; CRC Press: New
York, 1990a; pp 61-76.
159Wapnir, R. A. Nutritional factors, proteins and the absorption of iron and cobalt. In Protein
nutrition and mineral absorption; R. A. Wapnir, Ed.; CRC Press: New York, 1990b;
pp 99-129.
Whittaker, P.; Skikne, B. S.; Covell, A. M.; Flowers, C.; Cooke, A.; Lynch, S. R. & Cook,
J. D. 1989. Duodenal iron proteins in idiopathic hemocromatosis. Journal Clinical
Investigation, 83, 261-267.
Whittaker, P. G.; Barrett, J. F. R. & Lind, T. 2001. The erythrocyte incorporation of
absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition, 86, 323-
329.
WHO “Report of the WHO informal consultation on hookworm infection and anemia in
girls and women,” World Health Organisation, Geneva,1994.
WHO “Indicators and strategies for iron deficiency and anemia programmers.,”
WHO/UNICEF/FAO, Geneva,1996.
WHO “Life in the 21 st. century: A vision for all.,” WHO/UNICEF/FAO., Geneva,1998.
Xiong, Y. L. & Kinsella, J. E. 1990. Mechanism of urea-induced whey protein gelation.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38, 1887-1891.
Yip, R. 2000. Significance of an abnormally low or high hemoglobin concentration during
pregnancy: special consideration of iron nutrition. American Journal of Clinical
Nutrition, 72 (suppl), 272S-279S.
Zhu, H. & Damodaran, S. 1994. Effects of calcium and magnesium ions on aggregation of
whey protein isolate and its effects on foaming properties. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 42, 856-862.
Ziegler, G. R. & Foegeding, E. A. 1990. The gelation of proteins. Advances in Food and
Nutrition Research, 34, 203-298.