"ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ [Cu(dppzdppe)]BF₄. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕ DNA ΚΑΙ ΠΙΘΑΝΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΣΤΗ ΦΩΤΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ

ΚΑΡΚΙΝΟΥ".

Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Χ. Μητσοπούλου, Καθηγήτρια Ε.Κ.Π.Α.

ΚΡΟΚΙΔΑΣ ΝΙΚΟΣ (1111200900139)ΤΣΟΥΒΑΛΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ (1111200900128)

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΟΡΓΑΝΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

University of AthensDepartment of Chemistry

Σκοπός:• Σύνθεση του [Cu(Dppz)(Dppe)](BF4)

• Μελέτη της αλληλεπίδρασης με DNA

• Χρήση στη φωτοδυναμική θεραπεία.

Θεωρητικό Μέρος

Δομή του DNA.➢Το DNA είναι ένα επίμηκες, γραμμικό πολυμερές.

➢Με τη βοήθεια κρυσταλλογραφικών κυρίως μελετών, οι Watson και Crick το 1953 δημοσίευσαν

ένα μοντέλο που χαρακτήριζε το DNA ως μία δεξιόστροφη διπλή έλικα.

➢Οι βάσεις του DNA διέπονται από τον κανόνα της συμπληρωματικότητας.

Ο ρόλος του DNA

➢Το DNA αποτελεί την έδρα των γενετικών πληροφοριών όλων των κυττάρων και των

περισσότερων ιών.

➢Ως φορέας της γενετικής πληροφορίας το DNA αποτελεί την αιτία όλων των

γενετικών ασθενειών καθώς και της δημιουργίας καρκίνου.

Κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας.

Δομικές μορφές DNA.

➢Το DNA είναι ένα δομικά δυναμικό

μόριο το οποίο μπορεί να υπάρχει σε

ποικίλες ελικοειδείς μορφές.

Οι Watson και Crick στήριξαν το

μοντέλο τους, γνωστό ως έλικα του Β-DNA,

σε πρότυπα σκέδασης ακτίνων Χ σε ίνες

DNA, τα οποία έδωσαν πληροφορίες για τις

ιδιότητες της διπλής έλικας που

υπολογίστηκαν κατά μέσον όρο από τα

συστατικά τους νουκλεοτιδικά κατάλοιπα

➢.

➢Πολλές δομικές διαφορές μεταξύ του Β-DNA και του Α-DNA προκύπτουν από τη

διαφορετική πτύχωση των μονάδων της ριβόζης.

ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ

ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΕΣ

ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ

ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΕΣ

ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ

Ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις

➢H cisplatin συμπλέκεται με το DNA

μέσω των ατόμων αζώτου (Ν) των

βάσεων με πουρινική δομή (αδενίνη και

γουανίνη), τα οποία αντικαθιστούν τα

δύο μόρια ύδατος τουσυμπλόκου

[Pt(NH3)2(H2O)2]2+.

➢Η συμμετοχή των νουκλεϊκών οξέων σε χημικές αντιδράσεις έχει πολλές φορές ως

αποτέλεσμα την ομοιοπολική τροποποίηση των δομών τους, εξαιτίας κάποιας

αλκυλίωσης ή αντίδρασης τους με μέταλλα.

➢Οι πολύχρονες έρευνες έδειξαν ότι οι ενώσεις προσθήκης DNA-cisplatin

παρεμποδίζουν τον αναδιπλασιασμό και τη μεταγραφή του DNA, καθώς και την ενζυμική

επιδιόρθωσή του.

Μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις

Βασικοί μη ομοιοπολικοί δεσμοί

Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις Δεσμοί υδρογόνου Αλληλεπιδράσεις Van der Waals

ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ

Στις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις περιλαμβάνονται:

➢ η παρεμβολή (intercalation)➢ η συναρμογή στις αύλακες (groove binding)➢ η εξωτερική συναρμογή (external binding)

Μοντέλο Παρεμβολής (INTERCALATION)

● Η παρεμβολή είναι μια μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση που προκύπτει από την εισαγωγή μιας επίπεδης ετεροκυκλικής αρωματικής ένωσης μεταξύ των ζευγών των βάσεων της διπλής έλικας του DNA. Το 1961, o Lerman διατύπωσε το κλασσικό πρότυπο της παρεμβολής (intercalation).

Η παρεμβολή:

σταθεροποιεί

επιμηκύνει

σκληραίνει και

ξετυλίγει τη διπλή έλικα του

DNA.

ΜΟΝΤΕΛΟ ΣΥΝΑΡΜΟΓΗΣ (GROOVE BINDING)Ένα μοντέλο συναρμογής αύλακας (groove binder) περιλαμβάνει δύο στάδια στα

οποία έχουμε υδρόφοβη μετακίνηση του υποκαταστάτη από το διάλυμα που ακολουθείται

από μη ομοιοπολικές μοριακές αλληλεπιδράσεις όπως δημιουργία δεσμού υδρογόνου με

τα ζεύγη αδενίνης-θυμίνης και δεσμούς Van deer Waals με τα τοιχώματα της αύλακας.

Μοντέλο εξωτερικής συναρμογής-External Binding

➢Αυτός ο τρόπος συναρμογής είναι ηλεκτροστατικής φύσης.

➢Η συναρμογή του συμπλόκου με το DNA εξαρτάται έντονα από τις ιοντικές δυνάμεις

που αναπτύσσονται μεταξύ των αντιθέτων φορτίων.

ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΜΕΤΑΛΛΩΝ

Τα μεταλλικα σύμπλοκα έχουν βρεί ευρεία εφαρμογή στην πρόληψη και τη θεραπεία

πολλών ασθενειών.

Μπορούν να απομακρύνουν από τον οργανισμό βαρεά μέταλλα( Hg(II), Pb(II),

Cd(II) χρησιμοποιώντας διάφορους χηλικούς παράγοντες οι οποίοι σχηματίζουν

χηλικά σύμπλοκα με τα μέταλλα αυτά και στη συνέχεια τα σύμπλοκα αποβάλλονται

από τον οργανισμό.

Κάποια από τα σύμπλοκα:

του Pt(II) είναι αντικαρκινικά

του Au(II) χρησιμοποιούνται ως αντιαρθριτικά φάρμακα

του Cu(II) είναι αντιρευματικά και αντιφλεγμονώδη.

Υποκαταστάτες του Χαλκού Cu(I)

● dppz➢Ο υποκαταστάτης dppz διαθέτει πέντε

αρωματικούς

δακτυλίους.

Σύμπλοκα με υποκαταστάτες dppz, μπορούν

να χρησιμοποιηθούν ως:

● ενώσεις εκπομπής ηλεκτροφωταύγειας,

σε ηλεκτρονικές συσκευές εκπομπής

φωτός

● υποστρώματα για τη σύνθεση

πολυμερών.

●dppe➢Ο υποκαταστάτης dppe ή το αιθάνο-1,2-διυλοδις(διφαινυλφωσφάνιο) κατά IUPAC

είναι ένας συχνά χρησιμοποιούμενος υποκαταστάτης.

➢Είναι ένας δισχιδής χηλικός υποκαταστάτης και η παρασκευή του διεξάγεται μέσω

της αλκυλίωσης του NaPPh₂.

Φωτοδυναμική Θεραπεία➢Η Φωτοδυναμική Θεραπεία περιλαμβάνει τη χορήγηση του φωτοευαισθητοποιητή

και το φωτισμό του όγκου με κατάλληλη ακτινοβολία ώστε να ενεργοποιηθεί η ένωση-

φάρμακο.

Φωτοευαισθητοποιητές➢Ο ιδανικός φωτοευαισθητοποιητής είναι μία καθαρή ουσία με προτίμηση την

πρόσδεσή της στον όγκο προς άμεση εκκαθάριση του και με την απορρόφηση

να εμφανίζεται σε μήκος κύματος λ>630 nm.

Οι φωτοευαισθητοποιητές ταξινομούνται σε τρείς γενεές.

● Πρώτης γενιάς: Παράγωγα αιματοπορφυρίνης (HpD) και τα ανάλογα της.

● Δεύτερης γενιάς: Δομικά διακριτά σύμπλοκα με απορρόφηση μεγάλου μήκους

κύματος

● Τρίτης γενιάς: Είναι φωτοευαισθητοποιητές δεύτερης γενιάς που δεσμεύονται

στους μεταφορείς για την επιλεκτική συσσωμάτωση με τους όγκους.

Φωτισμός➢Οι συμβατικές, ευρέως φάσματος, πηγές φωτός μειονεκτούν στο ότι δε μπορεί να

μετρηθεί η απόδοσή τους.

➢Σήμερα στην PTD χρησιμοποιείται λέιζερ που έχει την ιδιότητα να εκπέμπει φως σε

ακριβή μήκη κύματος.

➢Τα λέιζερ μπορούν να ακτινοβολούν σε μήκη κύματος από 350-1100nm.

Πειραματικό Μέρος

Υλικά και ΔιαλύματαΤα κύρια υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα

εξής: Το σύμπλοκο του χαλκού [Cu(CH3CN)4](BF4)

το οποίο παρασκευάστηκε σύμφωνα με την αντίδρασηCu2O + HBF4 + CH3CN → [Cu2O(CH3CN)4](BF4)

Φυσικό DNA από θύμο αδένα βοοειδούς Πλασμίδιο pΒR322 Αγαρόζη

Τα διαλύματα τα οποία παρασκευάσαμε για την μελέτη του συμπλόκου με το DNA ακολουθούν:

● Διάλυμα Ct-DNA

● Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl(5mM) με NaCl(50mM), pH=7,0

● Ρυθμιστικό διάλυμα «φόρτωσης» TBE 10x (Tris – Borate –EDTA) 100mL (Loading buffer)

Σύνθεση του συμπλόκου [Cu(Dppz)(Dppe)](BF4)

Το σύμπλοκο έχει ως κεντρικό μέταλλο το Cu(I).

Για να καταφέρουμε να πάρουμε το επιθυμητό προϊόν θα πρέπει να ξεκινήσουμε από το εξής σύμπλοκο του χαλκού [Cu(MeCN)4](BF4), το οποίο συνθέσαμε σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση

CuI2O + HBF4

MeCN[CuI(CH3CN)4](BF4)

Το σύμπλοκο [Cu(MeCN)4](BF4) είναι: Στερεό Λευκού χρώματος Ευαίσθητο στην υγρασία και το O2

[CuI(CH3CN)4](BF4)

P

P

Ph Ph

PhPh

+MeCl2 [CuI(CH3CN)2(dppe)](BF4)

N

NN

N

BF4

[CuI(CH3CN)2(dppe)](BF4) +MeCl2

P

P

Ph Ph

PhPh

N

NN

N

Cu

Χαρακτηρισμός του συμπλόκου [Cu(Dppz)(Dppe)](BF4)

Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήσαμε για τον χαρακτηρισμό του συμπλόκου είναι οι εξής:

Φασματοσκοπία Ορατού-Υπεριώδους (UV-Vis) Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού

Συντονισμού (NMR) Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR)

Φασματοσκοπία Ορατού-Υπεριώδους (UV-Vis).

425 nmεMeCN = 0,49607*104 M cm-1

εCH2Cl2 = 0,28092*104 M cm-1

Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR).

N

N N

N

BF4Cu

P

P

dppe

dppz dppz

dppzdppe

Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR).

τάσεις αρωματικού C-C

τάσεις C-N

λόγω BF4-

Μέθοδοι παρακολούθησης της αλληλεπίδρασης σύμπλοκων

ενώσεων με το DNAΟι τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν: τιτλοδότηση UV-Vis ιξωδομετρία Και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.

Τιτλοδότηση UV-Vis

300 400 500 600 700 800 9000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abs

nm

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10

Η σταθερά σύνδεσης υπολογίστηκε ίση με Κb=2,7(±1,3)×104M-1 στα 377nm.

Ιξωδομετρία• Το σχετικό ιξώδες υπολογίζεται απο την

σχέση:

• Η αύξηση του μήκους της έλικας του DNA

υπολογίστηκε από τα πειραματικά δεδομένα,

σύμφωνα με την προσεγγιστική σχέση:

• Οι υδροδυναμικές μέθοδοι, στις οποίες

συγκαταλέγεται η ιξωδομετρία, είναι

ευαίσθητες στις μεταβολές της δομής και του

μήκους των αλυσίδων των μακρομορίων.

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης•Τα δείγματα ακτινοβολούνται με λάμπα Xe

1000W και μήκος κύματος ακτινοβόλησης λ>335

nm.

•Για τα πειράματα της

ηλεκτροφόρησης

χρησιμοποιήθηκε

υπερελικωμένο (supercoiled)

pBR322 πλασμίδιο DNA.

Συμπεράσματα● Το σύμπλοκο αλληλεπιδρά με το CT-DNA πιθανόν μέσω παρεμβολής σε χαμηλούς

λόγους ενώ όσο αυξάνονται οι λόγοι συνδέεται στις αύλακες του DNA.

● Η σταθερά σύνδεσεως υπολογίστηκε και ισούται με 2,7 (±1,3)×104 M-1 στα 377nm και

λόγω βιβλιογραφίας είναι πιθανή η σύνδεση μέσω της αύλακας (groove binding).

● Και τέλος, το σύμπλοκο επιδρά με το DNA και το καθιστά γραμμικό, πράγμα που

σημαίνει ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω φωτοχημική μελέτη.

Ευχαριστούμε για την

προσοχή σας