UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASIL Nigella...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASILEKSTRAKSI DARI JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)

TERHADAP TOTAL LEUKOSIT, JUMLAH LIMFOSITDAN MONOSIT, SERTA INTERLEUKIN-1 PADA

MENCIT BALB/C

Skripsi

Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)

TEGUH PRIYANTO

NIM : 108102000074

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1436 H/2015

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASILEKSTRAKSI DARI JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)

TERHADAP TOTAL LEUKOSIT, JUMLAH LIMFOSITDAN MONOSIT, SERTA INTERLEUKIN-1 PADA

MENCIT BALB/C

Skripsi

Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)

TEGUH PRIYANTO

NIM : 108102000074

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1436 H/2015

v

ABSTRAK

Judul : Uji imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi dari jinten hitam(nigella sativa L.) terhadap total leukosit, jumlah limfosit dan monosit, serta interleukin-1 pada mencit BALB/C

Nigella sativa L merupakan tanaman yang banyak mengandung zat-zat yang sangatampuh dalam mengobati penyakit. Bahkan tanaman ini direkomendasikan olehRasulullah SAW penggunaanya terutama dalam hal medisinal. Penelitian inibertujuan untuk menguji efek imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi Nigellasativa L. melalui pengukuran total leukosit, jumlah limfosit dan monosit, sertakadar Interlekuin 1 pada mencit Balb/c. Sebanyak 20 mencit yang diuji dibagimenjadi 4 kelompok: kontrol, dosis rendah (1,25 mg/BB mencit ), dosis sedang (2,5mg/BB mencit), dan dosis tinggi ( 5 mg/BB mencit). Polisakarida diberikan secaraoral selama 14 hari dan sampel darah diambil pada hari ke-7, ke-14 dan ke-21.Hasil rata-rata analisis statistik ANOVA menunjukan bahwa pemberian ekstrakpolisakarida pada ketiga dosis mampu meningkatkan total leukosit dan jumlahlimfosit secara signifikan dibandingkan kontrol, namun tidak mampumempengaruhi jumlah monosit. Dosis tinggi 5 mg / BB mencit memiliki aktifitasimunomodulator terbaik. Sedangkan pada uji interlekuin 1, mencit diberikanpolisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. secara oral selama 5 hari. Pada harikelima, dua jam setelah pemberian hasil ekstraksi Nigella sativa L. disuntikansecara i.p LPS 20 ug / BB mencit lalu diambil sampel darahnya setelah 6 jam. Hasiluji statistik kruskal Wallis menunjukan bahwa pemberian polisakarida Nigellasativa L. tidak mempengaruhi kadar interleukin -1 secara signifikan (p >0.05)

Kata kunci : Nigella sativa L., polisakarida, imunomodulator, mencit Balb/C.

vi

ABSTRACT

Title : The immunomodulator assay of polysaccharide, the result extraction ofblack seed (Nigella sativa L.) toward the total number of leukocytes,lymphocytes and monocytes, and interleukin 1 on mice BalB/C

Nigella sativa L. is a plant that contains many substances that very effective to treatthe disease. Moreover this plant was recommended by Rasulullah SAW to useespecially in medicinal treatment. This research is aim to test the effect ofimmunomodulator polysaccharide, the result extraction of black seed (Nigellasativa L.) through measuring the total number of leukocytes, lymphocytes andmonocytes, and the level of interleukin 1 on mice BALB/C. as many as 20 micethat have to test were divided into 4 groups : control, low doses (1,25 mg/BW mice),medium doses (2,5 mg/BW mice), and high doses (5 mg/BW mice). Polysaccharideextract was given orally during 14 days and the blood sample was taken in day 7th,14th, and 21th. The average result of statistical analysis ANOVA indicate that thegiving of polysaccharide extract on high doses can increase the total number ofleukocytes and lymphocytes significantly (P>0,05) if compared with control group,however it can not give effect to total number of monocytes. The high doses (5mg/BW mice) have the best immunomodulator activity. While for The test ofinterleukin-1, mice was given polysaccharide the result extraction Nigella sativaL. orally during 5 days. In day 5th, two hours after giving the result extractionNigella sativa L. that have been injection by i.p LPS 20 g/BW mice then the bloodsample was taken after 6 hours. The result of statistical Kruskal Wallis showed thatthe treatment of polysaccharides Nigella sativa L. not affect levels of interleukin1 significantly. (P>0,05).

Keyword : Nigella sativa L., Polysaccharide extract, Immunomodulator, Balb/Cmice.

vii

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah Subhanahu wa taala, yang telah memberikan

pertolongan dan kasih sayang-Nya sehingga kami penulis dapat menyelesaikan

penulisan skripsi ini. Makalah skripsi yang berjudul Uji Imunomodulator

Polisakarida hasil ekstraksi Jinten Hitam (Nigella sativa L.) Terhadap Total

Leukosit, Jumlah Limfosit, Jumlah Monosit, Dan Jumlah Interleukin-1 Pada

Mencit Balb/C dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah Skripsi, salah satu syarat

untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada penulisan ini, penulis juga ingin mengucapkan penghargaan dan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

(1) Farida Sulistiawati M.Si,Apt selaku dosen pembimbing pertama yang telah

menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran dalam menuntun penulis dalam

penyusunan skripsi ini.

(2) Drs. Umar Mansur M.Sc selaku dosen pembimbing kedua sekaligus Kepala

Program Studi Farmasi UIN Syarif hidayatullah Jakarta

(3) Zilhadia M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik selama pendidikan.

(4) Para dosen Farmasi UIN yang telah memberikan ilmu, pengalaman dan

wawasannya.

(5) Kementrian Agama dan pemerintah kabupaten Musi banyuasin yang telah

memberikan dukungan moril dan materil selama pendidikan. Ucapan beribu

terimakasih, semoga ilmu yang saya terima dapat bermanfaat.

(6) Orangtua, kakak, adik dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan,

semangat dan doa, Love you all.

(7) Rekan penelitian Zikriah, Sinti ayesa, Nia yuliani dewi, dan Azhari zikro yang

telah bersama dalam suka dan duka. Sahabat-sahabat Sukron, Farhan, Lukman

dll, yang telah memberikan dukungan dan keceriaan sehingga saya

bersemangat dan bisa menyelesaikan tugas akhir ini.

(8) Teman-teman seangkatan Farmasi 2008 yang telah menempuh pendidikan

bersama selama empat tahun, Semoga semangat dan kesuksesan bersama-sama

dengan kita semua.

viii

(9) Semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu

kelancaran pembuatan skripsi, Saya ucapkan terimakasih.

Saya menyadari bahwa dalam makalah skripsi ini masih terdapat banyak

kekurangan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang membangun

sehingga dapat menyempurnakan skripsi ini dan melaksanakan perbaikan di masa

yang akan datang. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan bagi

dunia pendidikan dan ilmu pengetahuan.

Ciputat, 3 April 2015

TEGUH PRIYANTO

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................HALAMAN PERNTAAN ORISINALITAS .............................................HALAMAN PERSETUJUAN PPEMBIMBING......................................LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................ABSTRAK ................................................................................xABSTRACT .............................................................................. xiKATA PENGANTAR................................................................................ iDAFTAR ISI .............................................................................. iiiDAFTAR GAMBAR ................................................................................vDAFTAR TABEL .............................................................................. viDAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... vii

BAB I PENDAHULUAN.........................................................................11.1 Latar Belakang ................................................................................11.2 Perumusan Masalah .......................................................................31.3 Tujuan Penelitian ............................................................................31.4 Manfaat Penelitian ..........................................................................3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................42.1 DESKRIPSI TANAMAN JINTAN HITAM (Nigella sativa L.).....4

2.1.1 Klasifikasi Tanaman.............................................................42.1.2 Nama Daerah .......................................................................42.1.3 Ciri-ciri tanaman ..................................................................42.1.4 Kandungan tanaman ............................................................52.1.5 Khasiat dan Kegunaan .........................................................7

2.2 EKSTRAK ................................................................................72.3 METODE EKSTRAKSI .................................................................8

2.3.1 Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut..............................82.3.2 Metode Ekstraksi Lainnya ..................................................9

2.4 IMUNOMODULATOR.................................................................102.5 LEUKOSIT ...................................................................................11

2.5.1 Limfosit ...........................................................................132.5.2 Monosit ...........................................................................132.5.3 Neutrofil ..........................................................................14

2.6 Interleukin 1 .................................................................................152.7 ELISA .....................................................................................162.8 HEWAN UJI (MENCIT/ Mus Muskulus) .....................................17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................193.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN.....................................193.2 BAHAN DAN ALAT ..................................................................19

3.2.1 Bahan ...................................................................................19a. bahan uji ..............................................................................19b. bahan kimia ........................................................................19

x

c. hewan uji ............................................................................193.2.2 Alat .....................................................................................19

3.3 PROSEDUR PENELITIAN ........................................................203.3.1 Optimasi Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L................20

a. Metode Ekstraksi Pertama (Hailat, et al. 1998 ) ..........20b. Metode Ekstraksi Kedua (Toneli, et al. 2008 )

3.3.2 Preparasi sampel ................................................................201. Pembuatan Larutan Na-CMC 5 % ...............................202. Penentuan Dosis (hussein el-taher, et al. 2006) ...........20

3.3.3 Perlakuan Hewan Uji .........................................................21a. Perlakuan Untuk Uji Total Leukosit, persentase Limfosit

Dan Persentase Monosit ..................................................21b. Perlakuan Untuk Uji Interlekuin 1 .................................22c. Pengambilan Darah (permatasari, 2012) ..........................23

3.3.4 Metode Uji ..........................................................................23a. Uji Total Leukosit, persentase limfosit, dan persentase

Monosit ..........................................................................23b. uji kadar Uji Interlekuin 1 ..............................................25

3.4 ANALISA DATA .........................................................................25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................264.1 HASIL OPTIMASI EKSTRAKSI ................................................264.2 TOTAL LEUKOSIT .....................................................................294.3 JUMLAH LIMFOSIT ...................................................................334.4 JUMLAH MONOSIT ...................................................................374.5 KADAR INTERLEUKIN 1 ........................................................40

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................425.1 KESIMPULAN ..............................................................................425.2 SARAN ..............................................................................42

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................43LAMPIRAN ..............................................................................47

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2. 1 Bentuk batang dan bunga Nigella sativa L .............................. 5Gambar 2.2 Komponen terbesar Nigella sativa L. (Paarrakh M, 2010) ........ 7Gambar 2.3 Beberapa jenis penampakan mikroskop dari leukosit

(Anonim, 2013) ......................................................................... 11Gambar 2.4 Bagan Pembentukan Sel Darah Dari Stema Sel (Theml, et al, 2004).

................................................................................................... 12Gambar 2.5 Limfosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 13Gambar 2.6 Monosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 14Gambar 2.7 Monosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 15Gambar 2.8 Skema Ilustrasi Uji ELISA (Sino biological.inc, 2015)........... 16Gambar 2.9 Mencit Balb/C (Sino biological.inc, 2015) .............................. 17Gambar 3.1 Kamar hitung neubauer (Eki Putra, 2008) ............................... 24Gambar 3.2 Alur pengamatan microskop pada gelas objek ........................ 24Gambar 4.1 Hasil Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L metode pertama ...

................................................................................................ 24Gambar 4.2 Hasil uji Barfoed polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L ..

........................................................................................................ 27Gambar 4.3 Hasil uji benedict polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L

(terbentuk warna merah bata pada tabung tengah).................... 27Gambar 4.4 Hasil ekstraksi polisakarida metode kedua ............................. 28Gambar 4.5 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-7............................. 30Gambar 4.6 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-14........................... 31Gambar 4.7 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-21 .......................... 32Gambar 4.8 Grafik peningkatan jumlah hari ke-7 ...................................... 34Gambar 4.9 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-14 ...................... 34Gambar 4.10 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-21 .................... 35Gambar 4.11 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-7...................... 38Gambar 4.12 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-14.................... 38Gambar 4.13 Grafik Peningkatan Monosit hari ke-21 ................................. 39Gambar 4.14 Grafik hasil uji interleukin 1 ................................................ 41

xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Konstituen Umum Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al 2006).......................................................................................................... 6

Tabel 2.2 Konstituen Minyak Nigella sativa (Hussein El- taher, et al 2006)................................................................................................................... 6

Tabel 3.1. Perlakuan kelompok uji total leukosit, limfosit, dan monosit................................................................................................................. 21

Tabel 3.2 Perlakuan Kelompok Uji Interlekuin 1 ..................................... 22Tabel 4.1 Hasil perhitungan total leukosit ................................................... 29Tabel 4.2 Rataan Jumlah Limfosit. .............................................................. 33Tabel 4.3 Rataan Jumlah Monosit................................................................ 37Tabel 4.4 Rata-rata Jumlah Nilai Il-1........................................................ 40

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kerangka Konsep Penelitian ...........................................................47Lampiran 2. Bagan ekstraksi pertama ....................................................................... 48Lampiran 3. Bagan ekstraksi kedua .....................................................................49Lampiran 4. Surat keterangan mencit ...................................................................50Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Abu Dan Kadar Air. ...............................................51Lampiran 6. Kegiatan Pengukuran Kadar Abu Dan Kadar Air ............................52Lampiran 7. Hasil Uji Karbohidran Total ekstraksi pertama ..............................53Lampiran 8: Hasil Uji Karbohidran Total ekstraksi kedua ..................................54Lampiran 9. Penentuan Besar Dosis .....................................................................55Lampiran 10. Pembuatan Larutan Induk................................................................56Lampiran 11. Kegitan penelitian : Pengambilan Darah .........................................57Lampiran 12. Kegitan penelitian : Pembuatan sediaan apus..................................60Lampiran 13. Kegitan penelitian : Penghitungan Leukosit....................................62Lampiran 14. Metode Uji ELISA .............................................................................63Lampiran 15. Hasil Pengamatan Mikroskop................................................................... 65Lampiran 16. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan

Limfosit hari ke -7................................................................................... 68Lampiran 17. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan

Limfosit hari ke-14 .........................................................................69Lampiran 18. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan

Limfosit hari ke-21 .........................................................................70Lampiran 19. Hasil uji interleukin 1-beta .............................................................71Lampiran 20. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit hari ke-7......................72Lampiran 21. Hasil Uji ANOVA Total Leukosit hari ke-7 ..................................73Lampiran 22. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) total leukosit

hari ke-7..........................................................................................74Lampiran 23. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit hari ke-14....................75Lampiran 24. Hasil Uji ANOVA Total Leukosit hari ke-14 .................................76Lampiran 25. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) total leukosit

hari ke-14........................................................................................77Lampiran 26. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit pada hari ke-21. .........78Lampiran 27. Hasil Uji non parametrik kruskal wallis Total Leukosit Hari ke-

21 ....................................................................................................79

Lampiran 28. Uji homogenitas perbandingan uji total leukosit perminggu...........80Lampiran 29. Uji ANOVA total leukosit per minggu...........................................81Lampiran 30. Uji Turkey HSD total leukosit perbandingan antar kelompok

perminggu ......................................................................................82Lampiran 31. Hasil uji homogenitas data jumlah limfosit hari ke-7......................83Lampiran 32. Hasil Uji ANOVA jumlah limfosit hari ke-7 ..................................84Lampiran 33. Hasil uji turkey HSD jumlah limfosit hari ke-7 ..............................85Lampiran 34. Hasil uji homogenitas data limfosit hari ke-14................................86Lampiran 35. Hasil uji Anova jumlah limfosit hari ke-14 ....................................87Lampiran 36. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) jumlah

limfosit hari ke-14 .........................................................................88Lampiran 37. Hasil uji homogenitas jumlah limfosit hari ke-21. ..........................89

xiv

Lampiran 38. Hasil uji kruskal wallis jumlah limfosit hari ke-21 .........................90Lampiran 39. Uji homogenitas data rata-rata limfosit perminggu.........................91Lampiran 40. Uji ANOVA data rata-rata perminggu limfosit. ..............................92Lampiran 41. Uji Turkey HSD rata-rata perminggu limfosit. ..............................93Lampiran 42. Uji homogenitas data monosit hari ke-7..........................................94Lampiran 43. Uji ANOVA Monosit hari ke-7 .......................................................95Lampiran 44. Uji kruskal walis monosit hari ke-7 ................................................96Lampiran 45. Uji Homogenitas Hari Ke-14 .........................................................97Lampiran 46. Uji ANOVA monosit hari ke-14 .....................................................98Lampiran 47. Uji kruskal walis monosit ke-14......................................................99Lampiran 48. Uji homogenitas data monosit hari ke-21......................................100Lampiran 49. Uji ANOVA monosit hari ke-21 ..................................................101Lampiran 50. Uji kruskal walis monosit hari ke-21.............................................102Lampiran 51. Uji homogenitas interleukin 1 .....................................................103Lampiran 52. Uji kruskal wallis interleukin 1 ...................................................104

1UIN Syarif hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Tubuh manusia memiliki suatu sistem keamanan yang melindungi

tubuh dari bahaya lingkungan luar tubuh. Lingkuangan di sekitar manusia

banyak mengandung berbagai jenis patogen, seperti : jamur, bakteri, virus,

protozoa, dan, parasit yang dapat menyebabkan infeksi pada manusia.

Infeksi yang terjadi pada manusia pada umumnya terjadi dalam waktu yang

singkat dan jarang menimbulkan kerusakan permanen. Hal ini disebabkan

karena adanya sistem imun yang melindungi tubuh dari unsur-unsur patogen

tersebut.

Imunomodulator adalah obat yang dapat mengembalikan dan

memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan

yang fungsinya berlebihan (Handayani, 2010). Penggunaan

imunomodulator sering digunakan saat tubuh terserang suatu infeksi.

Senyawa ini diharapkan dapat membantu sistem imun tubuh dalam

mengatasi patogen yang masuk kedalam tubuh manusia.

Nigella sativa L. yang telah dikenal dengan nama jinten hitam

termasuk dalam family Ranunculaceae, telah banyak digunakan di berbagai

negara sebagai imunomodulator, termasuk negara-negara barat maupun

negara-negara timur (Haq A. et al, 1995). Berdasarkan sejarah, penelitian

mendalam mengenai jinten hitam (Nigella sativa L.) pertama kali

dikemukakan oleh Grenish melalui publikasi jurnalnya pada tahun 1880.

Dalam Nigella sativa L. terkandung 37 % minyak dan 4,1 % abu (garam

kalsium) (Hussein, et al., 2006).

Penggunaan jinten hitam (Nigella sativa L.) sebagai bahan obat

memang sudah tidak diragukan lagi, bahkan dalam suatu hadits Nabi

Muhammad SAW disebutkan bahwa jinten hitam (Nigella sativa L.) dapat

mengobati berbagai macam penyakit, kecuali kematian. Disebutkan di

dalam kitab Ath-thibun Nabawi, karya Ibnu Qayyim Al-Jauziyyah dari

riwayat Ibnu Umar, bahwasannya Rasulullah SAW bersabda :

2

UIN Syarif hidayatullah Jakarta

.Hendaklah kalian mengkonsumsi jinten hitam, karena

sesungguhnya terkandung obat penyembuh dari segala macam penyakit,

kecuali kematian (HR. Ibnu Majah dan Nasai) (Ibn Qayyim Al-Jauziyah.

2003).

Jinten hitam (Nigella sativa L.) dapat meningkatkan jumlah, mutu,

kualitas dan aktivitas sel yang berfungsi sebagai imun tubuh. Sebagai

contoh pada pengujian tiga macam frase jinten hitam (Nigella sativa L.)

(ekstrak etanol, polisakarida, dan, volatil oil) terhadap respon antibodi tikus

yang telah divaksinasi dengan vaksin Brucella menunjukkan hasil yang

signifikan sebagai bahan tambahan vaksin Brucella Melitensis. Dari

percobaan tersebut ketiga fraksi memiliki peran yang signifikan

meningkakan titer antibodi, meskipun sebagai bahan tambahan dalam

vaksin. Hasil dari penelitian tiga frase diperoleh polisakarida sebagai fraksi

hasil ekstraksi yang paling paling efektif (Hailat, et al 1998).

Penelitian Nabil Hailat pada tahun 1998 menunjukkan bahwa

polisakarida jinten hitam (Nigella sativa L.) sebagai adjuvan memiliki

kemampuan yang lebih signifikan dibanding ekstrak lain. Sejauh ini

penelitian imunomodulator frase polisakarida tunggal belum pernah

dilakukan.

Polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)

diharapkan dapat berkhasiat sebagai imunomodulator yang dapat

meningkatan sistem respon imun secara humoral maupun selular dan

menurunkan reaksi sistem imun yang berlebih sehingga sistem imun tubuh

berada dalam kondisis seimbang. Peningkatan jumlah leukosit total

menunjukkan respon imun secara humoral dan selular dalam mengatasi

adanya zat asing (Erlinger, 2004). Pada penelitian Camalia G Michael dkk

tahun 2010 juga menyebutkan bahwa jinten hitam (Nigella sativa L.) juga

dapat menurunkan kadar interleukin-1 yang diinduksi CCl4. Senyawa ini

3


merupakan salah satu turunan sitokin yang berfungsi sebagai mediator

inflamasi.

Pada penelitian ini kami akan mencoba mengetahui efektifitas

imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa

L.) terhadap mencit Balb/C melalui penghitungan total leukosit, jumlah

limfosit dan monosit serta pengukuran kadar IL-1.

1.2 PERUMUSAN MASALAH

1. Apakah polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)

mempengaruhi total leukosit, jumlah limfosit, jumlah monosit dan IL-

1?

2. Dosis polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)

manakah yang akan memberikan efek imunomodulator yang lebih baik?

1.3 TUJUAN PENELITIAN

Tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Mengetahui kemampuan polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam

(Nigella sativa L.) sebagai imunomodulator.

2. Mengetahui dosis polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella

sativa L.) yang memiliki efek imunomodulator terbaik.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

Mengetahui gambaran umum tentang manfaat jinten hitam (Nigella sativa

L.) terhadap respon imun melalui total leukosit, jumlah limfosit dan

monosit, serta kadar IL-1.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. DESKRIPSI TANAMAN JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)

2.1.1. Klasifikasi Tanaman

Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi tanaman jinten hitam

adalah sebagai berikut (Junaidi, et al 2011):

Kingdom : Plantae

Sub Kingdom : Traceabionta

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Magnoliopsida dicotyledon

Subkelas : Magnolidae

Ordo : Ranunculales

Famili : Ranunculaceae

Genus : Nigella L.

Spesies : Nigella sativa L.

2.1.2. Nama Daerah

Jinten hitam dikenal dengan banyak nama, beberapa negara

mengenalnya dengan sebutan Black cummin atau Black caraway seed. Nabi

Muhammad SAW menyebutnya dengan sebutan Habbat Al-Baroka,

sedangkan di Rusia dan Rumania dikenal dengan sebutan Charmuska. Di

India dan Pakistan jinten hitam dikenal dengan nama Kalonji (Goreja,

2003). Bahasa yang akan digunakan agar tidak membingungkan dalam

bahasan ini adalah Nigella sativa L.

2.1.3. Ciri-Ciri Tanaman

Nigella sativa L. merupakan tanaman terna setahun berbatang tegak.

Batang tanaman biasanya berusuk dan berbulu kasar, rapat atau jarang-

jarang dan disertai dengan bulu. Daun bulu berkelenjar. Bentuk daun lanset

terbentuk garis panjang 1,5 cm sampai 2 cm. Ujung lancip terdapat tulang

daun. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas duduk. Daun

5


pembalut bunga kecil. Kelopak bunga 5, bundar telur ujungnya agak

melancip sampai agak tumpul pangkal mengecil membentuk sudut yang

pendek dan besar. Mahkota bunga pada umumnya berjumlah 8, agak

memanjang lebih kecil dari kelopak bunga, berbulu jarang dan pendek;

berbibir dua, bibir bagian atas pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk

benang. Ujung bibir bunga bagian bawah tumpul, benang sari banyak,

gundul; kepala sari jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat

telur atau agak bulat. Biji hitam, jorong bersudut tiga tak beraturan dan

sedikit berbentuk kerucut, panjang 3 mm berkelenjar (Junaidi, et al 2011).

Gambar 2. 1 Bentuk batang dan bunga Nigella sativa L.

2.1.4. Kandungan Tanaman

Nigella sativa L. mengandung banyak sekali zat-zat aktif

yang sangat berguna dalam kehidupan manusia. Zat-zat tersebut

termasuk golongan antioksidan, imunomodulator, antikanker,

antihistamin dan zat-zat lainnya. Berdasarkan penelitian Greenish

melalui publikasi jurnalnya pada tahun 1880, dalam Nigella sativa L.

terkandung 37 % minyak dan 4,1 % abu / garam kalsium. Komposisi

secara umum Nigella sativa L. adalah sebagai berikut:

6


Tabel 2.1 Konstituen Umum Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al

2006).

Konstituen % Range (w/w)

Oil 31 35,5

Protein 16 - 19,5

Karbohidrat 33 34

Fibrate 4,5 6,5

Ash 3,7 7

Saponin 0,013

Moisture 5 7

Sedangkan komposisi minyak dari Nigella sativa L. termasuk

senyawa volatilnya adalah sebagai berikut :

Tabel 2.2 Konstituen Minyak Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al

2006).

Konstituen % range (w/w)

Linoleic acid 44,7 56

Oleic acid 20,7 24,6

Linolenic acid 0,6 1,8

Arachidic acid 2 3

Palmitoleic acid 3

Eicosadic Acid 2 2,5

Palmitic acid 12 14,3

Stearic acid 2,7 3

Myristic acid 0,16

Sterol 0,5

7


Nigella sativa L. juga dilaporkan mengandung nigellone, Struktur

dari konstituen terbesar yang terisolasi seperti yang terlihat pada gambar

struktur di bawah ini :

Gambar 2.2 Komponen terbesar Nigella sativa L. (Paarrakh M,

2010).

2.1.5 Khasiat dan Kegunaan

Penelitian tentang manfaat Nigella sativa L. telah banyak dilakukan

dan banyak juga yang telah dipublikasikan. Dari sekian jurnal yang telah

dipublikasikan membuktikan efek positif yang menunjukkan betapa

besarnya potensi kegunaan dari Nigella sativa L.

Biji dari Nigella sativa L. yang telah dibuat bubuk yang diberikan

ke beberapa volunter pada dosis 1 g dua kali sehari selama 4 minggu

memberikan efek peningkatan rasio dari sel T helper ke sel T supressor

hingga 72 % dan meningkatkan fungsi dan jumlah dari Sel T Killer (Hussein

El- taher, et al 2006).

2.2. EKSTRAK

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati dan simplisia hewani menggunakan

pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan

dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga

memenuhi baku yang ditentukan, Sedangkan ekstraksi adalah kegiatan

penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan

8


yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Depkes RI, 2010). Senyawa aktif

yang terdapat dalam simplisia dapat di golongkan dalam golongan minyak

asiri, alkaloid, flavanoid, dan lain-lain.

2.3. METODE EKSTRAKSI

Ekstraksi memiliki banyak metode tergantung pada sifat-sifat ekstrak

yang akan diambil.

2.3.1 Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut

1. Maserasi

Maserasi adalah metode ekstraksi simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur ruangan.

2. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhause extraction) yang umumnya dilakukan pada

temperatur ruangan. Proses biasanya terdiri dari tahapan pengembangan

bahan tahap maserasi antara tahap perkolasi sebenarnya, terus menerus

hingga diperoleh ekstrak yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

3. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut dengan titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang terbatas yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan

pengulangan proses pada residu pertama sampai 3 -5 kali sehingga dapat

termasuk proses ekstraksi sempurna.

4. Sokhlet

Sokhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru

yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstaksi

kontinu. Dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya

pendingin balik.

9


5. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik pada temperatur yang lebih tinggi

dari temperatur ruangan yaitu biasanya dilakukan pada temperatur 40

500C.

6. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur pemanas

air (bejana infus tercelup dalam bejana mendidih, temperatur terukur 96-

98o C) selama waktu tertentu. Selama waktu tertentu (15-20 menit).

7. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (> 30 menit) dan

temperatur sampai pada titik didih air.

2.3.2 Metode Ekstraksi Lainnya

Beberapa cara ekstraksi dengan menggunakan cara-cara yang telah

dibahas di atas, ada juga ekstraksi yang lain sebagai cara penarik zat aktif

dari simplisianya, cara-cara yang digunakan diantaranya adalah: destilasi

uap, ekstraksi energi listrik, ekstraksi ultrasonik,dan superkritikal

karbondioksida.

Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak

asiri) dari bahan (segar atau simplisianya) dengan uap air berdasarkan

peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air

dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi

fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi

destilat air bersama kandungan senyawa yang memisah sempurna atau

memisah sebagian. Simplisia benar benar tidak larut dalam air namun benar-

benar dilalui uap air sehingga senyawa kandungan ikut terdestilasi (Depkes

RI, 2000).

Ekstraksi energi menggunakan medan listrik, ultrasonik dan

superkritikal karbon dioksida memiliki tujuan untuk memberikan tekanan

dan peningkatan permeabilitas dinding sel dari simplisia sehingga sehingga

zat aktif dari simplisia dapat di ambil.

10


2.4 IMUNOMODULATOR

Sistem imun dibagi atas dua jenis, yaitu sistem imun kongenital atau

non spesifik dan sistem imun didapat atau adaptif atau spesifik. Mekanisme

pertahanan tubuh oleh sistem imun kongenital bersifat spontan, tidak spesifik,

dan tidak berubah baik secara kualitas maupun kuantitas bahkan setelah

paparan berulang dengan patogen yang sama. Sedangkan sistem imun didapat

muncul setelah proses mengenal oleh limfosit (clonal selection), yang

tergantung pada paparan terhadap patogen sebelumnya. Adanya sistem imun

kongenital memungkinkan respons imun dini untuk melindungi tubuh selama

4-5 hari, yang merupakan waktu yang diperlukan untuk mengaktifkan limfosit

(Bratawidjaja, 2002).

Imunomodulator adalah obat yang dapat mengembalikan dan

memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang

fungsinya berlebihan. Obat golongan imunomodulator bekerja menurut 3 cara,

yaitu melalui:

Imunorestorasi

Imunorestorasi adalah suatu cara mengembalikan fungsi sistim

imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistim imun,

seperti : imunoglobulin dalam bentuk immune serum globulin (ISG),

hyperimmune serum globulin (HSG), plasma, transplantasi sumsum tulang,

jaringan hati, timus, plasmaferesis, dan leukoferesis (Djajakusumah, 2010).

Imunostimulasi

Imunostimulasi adalah cara memperbaiki fungsi sistim imun dengan

menggunakan bahan yang merangsang sistim tersebut. Bahan yang

termasuk imunostimulator itu dapat dibagi sebagai berikut :

1. Biologik, seperti hormon timus, limfokin, interferon, antibodi

monoklonal, transfer factor/ekstrak leukosit, sel LAK, bahan biologik

asal bakteri dan asal jamur.

2. Sintetik seperti levamisol, isoprinosin, muramil dipeptid (MDP),

biological respons modifier (BRM), hidroksiklorokuin, arginin,

antioksidan dan bahan-bahan lain seperti bahan yang masih dalam

11


percobaan klinik antara lain azimekson, siamekson, bestati, tuftsin,

maleic anhydride,divynil ether copolymer, dan 6-phenyl-pyrimidinole

(Djajakusumah, 2010).

Imunosupresi

Merupakan suatu tindakan untuk menekan respons imun.

Kegunaannyadi klinik terutama pada transplantasi untuk mencegah reaksi

penolakan dan pada berbagai penyakit inflamasi yang menimbulkan

kerusakan atau gejala sistemik, seperti autoimun atau auto-inflamasi

(Bratawidjaja, 2002).

Imunorestorasi dan imunostimulasi disebut imunopotensiasi atau up

regulation, sedangkan imunosupresi disebut down regulation (Bratawidjaja,

2002).

2.5 LEUKOSIT.

Leukosit adalah sel darah yang mengandung inti, disebut juga sel

darah putih. Di dalam darah manusia, normal didapati jumlah leukosit rata-

rata 5000-9000 sel/mm3 (Efendi,Z 2003). Jika dilihat dalam mikroskop

cahaya maka akan terlihat inti dalam sitoplasmanya yang mempunyai bentuk

inti bermacam-macam, Ada kalanya tidak mempunyai granula,

sitoplasmanya homogen dengan inti bentuk bulat atau bentuk ginjal.

Gambar 2.3 Beberapa jenis penampakan mikroskop dari leukosit (Anonim,

2013)

12


Menurut dr Zurkesti Efendi, leukosit terbagi menjadi 2 jenis yaitu

granular (memiliki granula) dan agranular (tidak memiliki granula).

Leukosit granular terbagi menjadi 3 macam turunan leukosit (diferensial

leukosit) yaitu: neutrofil, basofil dan eusinofil. Sedangkan leukosit agranular

Terdapat dua: limfosit sel kecil, sitoplasma sedikit; monosit sel agak besar

mengandung sitoplasma lebih banyak.

Pada dasarnya seluruh sistem darah dalam tubuh manusia berasal

dari turunan stema sel. Dengan adanya faktor tempat terbentuknya dan faktor

humoral, stema sel berubah menjadi beberapa bentuk sel. erythropoiesis dan

thrombopoiesis dibentuk secara tersendiri setelah fase stema sel, sedangkan

monocytopoiesis dan granulocytopoiesis berkaitan antara keduanya.

Pembentukan limfosit tidak terkait dengan pembentukan sel-sel lainnya.

Granulosit, monosit dan limfosit secara bersamaan membentuk sel leukosit

(Theml, H et al, 2004).

Gambar 2.4 Bagan pembentukan sel darah dari stema sel (theml, H

et al, 2004).

13


2.5.1 Limfosit

Limfosit merupakan sel yang sferis, garis tengah 6-8 um, 20-30%

leukosit darah. Normal, inti relatif besar, bulat sedikit cekungan pada satu

sisi, kromatin inti padat, anak inti baru terlihat dengan elektron mikroskop.

Limfosit dalam sirkulasi darah normal dapat berukuran 10-12 um ukuran

yang lebih besar disebabkan sitoplasmanya yang lebih banyak (Efendi,Z

2003).

Gambar 2.5 Limfosit (Theml, H et al, 2004)

Leukosit mempunyai peran dalam pertahanan seluler dan humoral

organisme terhadap zat-zat asing. Leukosit dapat melakukan gerakan

amuboid dan melalui proses diapedisis leukosit dapat meninggalkan kapiler

dengan menerobos antara sel-sel endotel dan menembus jaringan

penyambung. Jumlah leukosit pada manusia permikroliter adalah 4000-

11000, waktu lahir 15000-25000, dan menjelang hari keempat turun sampai

12000. Pada usia 4 tahun jumlah leukosit akan sesuai kadar normal

(Efendi,Z 2003).

2.5.2 Monosit

Merupakan sel leukosit yang besar 3-8% dari jumlah leukosit

normal, diameter 9-10 um tapi pada sediaan darah kering diameter mencapai

20 um atau lebih. Inti biasanya eksentris, adanya lekukan yang dalam

berbentuk tapal kuda. Kromatin kurang padat, susunan lebih fibriler, ini

merupakan sifat tetap monosit Sitoplasma relatif banyak dengan pulasan

wrigh berupa bim abu-abu pada sajian kering. Granula azurofil, merupakan

lisosom primer, lebih banyak tapi lebih kecil. Ditemui retikulim endoplasma

14


sedikit. Juga ribosom, pliribosom sedikit, banyak mitokondria. Aparatus

Golgi berkembang dengan baik, ditemukan mikrofilamen dan mikrotubulus

pada daerah identasi inti (Efendi,Z 2003).

Gambar 2.6 Monosit (Theml, H et al, 2004)

Monosit dapat ditemukan di dalam darah, jaringan penyambung, dan

rongga-rongga tubuh. Monosit tergolong mononuklear fagosit (sistem

retikuloendotel) dan mempunyai tempat-tempat reseptor pada permukaan

membrannya untuk imunoglobulin dan komplemen. Monosit memfagosit

mikroorganisme, sel mati, partikel asing (contohnya debu yang masuk ke

dalam paru-paru). Monosit beredar melalui aliran darah, menembus dinding

kapiler kemudian masuk ke dalam jaringan penyambung.

Monosit dalam sistem imun berfungsi sebagai makrophage, yaitu

menelan dan menghancurkan sel, mikroorganisme dan benda asing yang

bersifat patogen dengan cara menelan dan menghancurkannya. Monosit

akan merespon adanya tanda-tanda inflamasi dengan cara bergerak cepat

(kira-kira 8-12 jam) ke tempat yang terinfeksi, mengirimkan makrofag

untuk merangsang respons imun, dan mengeluarkan substansi yang

mempengaruhi terjadinya proses peradangan kronik (Lestari, et al, 1993).

2.5.3 Neutrofil

Neutrofil berkembang dalam sumsum tulang dikeluarkan dalam

sirkulasi, sel-sel ini merupakan 60 -70 % dari leukosit yang beredar. Garis

tengah sekitar 12 um, satu inti dan 2-5 lobus (Efendi, Z, 2003).

15


Gambar 2.7 Neutrofil (Theml, H et al, 2004)

Neutrofil berfungsi untuk fagositosis yaitu menghancurkan benda

asing dari luar tubuh. Proses ini dibagi menjadi 4 tahap yaitu kemotaksis,

perlekatan, penelanan, dan pencernaan. Apabila ada infeksi neutrofil akan

bergerak menuju tempat infeksi. Pergerakan ini dinamakan proses

kemotaksis. Respons terjadi apabila ada substansi yang dihasilkan oleh

bakteri sehingga merangsang neutrofil untuk mendekat, selain itu opsonin

atau antibodi juga akan merangsang proses kemotaksis.

2.6 INTERLEUKIN 1

Interleukin-1 secara umum pada mulanya dikenal sebagai polipeptida

yang merupakan derivat dari fagosit mononuklear yang meningkatkan

respons dari timosit terhadap aktivator poliklonal khususnya sebagai ko-

stimulasi dari aktifasi sel T (Syamhudi, et la 2005). IL-1 diproduksi

terutama antara lain oleh : makrofag, sel endotel, limfosit granuler, sel B,

fibroblas, sel epitel, astrosit, dan osteoblas. IL-1 juga dapat disintesis oleh

hampir semua sel berinti. IL-1 bekerja terutama sebagai mediator pada

imunitas non-spesifik bersama interferon dan tumor necrosis factor. IL-1

termasuk dalam golongan Sitokinin.

Saat ini telah jelas bahwa fungsi IL-1 secara umum adalah sebagai

mediator dari respons inflamasi imunitas natural yaitu mengaktifkan sel T,

merangsang sel T untuk memproduksi limfokin, co-factor untuk haemoptik

16


growth factor, menimbulkan panas, pelepasan ACTH, neutrofil dan respons

akut sistemik lainnya, merangsang sintesis limfokin kolagen dan

kolagenase, mengaktifkan sel endotel dan makrofag, perantara dalam

inflamasi, proses katabolik dan resistensi non spesifik terhadap bakteri.

2.7 ELISA

ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay) merupakan metode

analisis yang diguanakan untuk menganalisa sitokin dan sejenisnya secara

spesifik dan mempunyai sensitifitas yang tinggi. Metode ini pertam kali

diterapkan pada tahun 1971 dan semenjak tahun tersebut metode ini banyak

digunkan secara luas.

Uji ini menyertakan monoclonal antibody yang digunakan sebagai

pelapis microtiter plate. Setelah penambahan sampel, antibodi yang spesifik

yang ada di plate akan menangkap protein yang yang sesuai. (misal : sitokin)

lalu monoclonal antibody yang digunakan sebagai pendeteksi akan mengikat

epitop yang lain pada protein tersebut. Deteksi antibodi diberi label dengan

biotin, yang memungkinkan ikatan subsquen enzim streptavidin-terkonjugasi.

reagen yang tidak berikatan akan terbuang saat proses washing. Setelah

penambahan substrat, reaksi warna yang terbentuk berbanding lurus dengan

jumlah protein terikat. Konsentrasi protein dalam sampel ditentukan denagn cara

dibandingkan dengan kurva standar konsentrasi protein yang telah dibuat

berdasarkan standar (Sino biological.inc, 2015).

Gambar 2.8 Skema ilustrasi uji ELISA (Sino biological.inc, 2015).

Ada beberapa macam jenis ELISA yang biasa digunakan dalam analisis,

diantaranya yaitu :

17


1. Direct ELISA

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik

ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi

antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik

(monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada

sampel yang diuji.

2. Indirect ELISA

ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta

antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan

antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

3. Competitive ELISA

Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor

ke dalam lubang mikrotiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat

diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi.

4. Sandwich ELISA

Teknik ELISA yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada

teknik ELISA ini, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan

enzim yang berfungsi sebagai signal.

2.8 HEWAN UJI ( Mencit / Mus Muskulus )

Penggunaan hewan uji dalam penelitian terus digunakan hingga massa

sekarang, penggunaannya bertujuan sebagai model dari subjek yang

sebenarnya. Dalam penelitian ini hewan yang akan digunakan sebagai objek

percobaan adalah mencit.

Gambar 2.9 Mencit Balb/C (Sino biological.inc, 2015)

18


Mencit adalah hewan pengerat, yang termasuk golongan mamalia. Hal

tersebut akan lebih jelas pada taksonomi mencit berikut :

Kingdom : Animalia

Phylum : Cordata

Sub phylum : Vertebrta

Class : Mamalia

Ordo : Rodentin

Sub ordo : Myomorpha

Family : Muridae

Sub family : Murinae

Genus : Mus

Spesies : Musculus

Morfologi mencit yang kecil memiliki panjang tubuh 75 100

milimeter dan luas permukaan tubuh 36 cm2 pada berat badan 20 gram

sehingga dalam ruangan yang relatif kecil dapat dipelihara atau digunakan

untuk penelitian dalam jumlah yang banyak (Harkness, 1983).


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 WAKTU DAN TEMPAT PELAKSANAAN

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Animal House FKIK UIN

Jakarta, laboratorium Bioavaibility & Bioequivalensi (PBB) UIN Jakarta dan

laboratorium Drugs Research & Development (PDR) UIN Jakarta pada Bulan

Oktober sampai Bulan Desember 2013.

3.2 BAHAN DAN ALAT

3.2.1 Bahan

a. Bahan Uji

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji

Nigella sativa L yang diperoleh dari PT. Lantabura Internasional, Depok,

berasal dari negara Etiopia.

b. Bahan Kimia

n-heksan, etanol p.a 96 %, eter, larutan NaCl, pewarna giemsa,

minyak emersi, metanol, pewarna gentian violet, asam asetat glasial,

aquadest, Na-CMC, LPS (lipopolysacharide) dari bakteri E coli (Sigma

aldrich).

c. Hewan Uji

Sebanyak 20 Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah

mencit galur balb/c berumur 6 8 minggu dengan berat badan 25 30 gram

yang diperoleh dari laboratorium terpadu UGM dan diberikan makan berupa

berupa butiran (pelet) dan minuman ad libitum.

3.2.2 Alat

Alat yang digunakan adalah perangkat gelas yang biasa digunakan

dalam laboratorium, Elysa kit (Foster biological Technology.,LTD),

timbangan analitik (wiggen hauser), mikroskop (nikon), kamar hitung

(hematocyte) (mariendfeld germany), pipet Micro, timbangan hewan,

kandang hewan uji, pipa kapiler (hematokrit), Rotary evaporator (eyela),

sentrifugator (ependorf centrifuge 5417 R), blender, tabung EDTA, tabung

ependorf.

20


3.3 PROSEDUR PENELITIAN

3.3.1 Optimasi Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L

a. Metode Ekstraksi pertama (Hailat, et al. 1998 ).

Sebanyak 500 mg biji jinten hitam (Nigella sativa L.) yang telah

dikeringkan diblender (dihaluskan) kemudian diekstraksi dengan

menggunakan sodium bicarbonat 5% (perbandingan pelarut dan serbuk

jinten hitam adalah 3 : 1) pada suhu ruangan selama 24 jam. Larutan

hasil ekstraksi 24 jam disaring dan hasil saringanya di endapkan dengan

etanol 96 % sebanyak 3 liter (perbandingan larutan dan etanol adalah 1

: 1)

b. Metode Eksraksi kedua (Toneli, et al 2008)

Polisakarida diperoleh dengan cara 30 gram serbuk Nigella

sativa L. (telah dihilangkan lemaknya dengan n-heksan) dipanaskan

dengan 2,1 L aquadest (1 :70) dalam waterbath suhu 800C selama 1 jam

dan biarkan semalam. Larutan disentrifus pada 5000 rpm selam 20

menit dan disaring. Supernatan ditambahkan etanol 90 % (1 : 1) dan

dibiarkan semalam hingga terbentuk endapan. Endapan kemudian

diuapkan dengan evaporator.

3.3.2 Preparasi sampel

1. Pembuatan Larutan Na CMC 5 %

Sebanyak 500 mg Na CMC ditimbang dan dilarutkan dengan

aquadest hangat. Kemuadian larutan terus diaduk dan ditambahkan

aquadest hingga diperoleh volume 100 ml.

2. Penentuan Dosis (Hussein El- taher, et al 2006)

Penentuan besar dosis polisakarida Nigella sativa L. Diperoleh

dari penelitian terhadap rasio sel limposit T helper. Serbuk Nigella sativa

L. diberikan kepada beberapa volunter pada dosis 1 g dua kali sehari

yang diberikan selama 4 minggu. Hasil dari penelitian tersebut Nigella

sativa L terbukti dapat meningkatkan rasio sel limposit T helper. Dari

hasil penelitian tersebut dijadikan dasar penentuan dosis. Dosis manusia

2 gram sehari diubah kedalam dosis mencit, kemudian setelah diperoleh

21


dosis mencit lalu disesuaikan dengan hasil rendemen polisakarida hasil

ekstraksi (Lampiran 10).

3.3.3 Perlakuan Hewan Uji Dan Metode Uji

Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, mencit balb/c

diaklimatisasi terlebih dahulu selama 30 hari agar dapat beradaptasi dengan

lingkungan laboratorium hewan dan dapat dikontrol kondisi kesehatannya.

a. Perlakuan Untuk Uji Total Leukosit, Limfosit, Dan Monosit

Jumlah sampel setiap kelompok berdasarkan Research Guidelines

For Evaluation The Safety And Efficiacy Of Herbal Medicines dari WHO

tiap kelompok adalah 5 ekor, sehingga mencit balb/c yang digunakan untuk

penelitian uji leukosit, limfosit dan monosit adalah 5 ekor perkelompok.

Mencit yang telah diaklimatisasi ditimbang berat badanya dan

dicatat untuk ditentukan besar dosis ekstrak yang diberikan. Setelah data

berat badan mencit diperoleh, mencit diberi polisakarida hasil ekstraksi

Nigella sativa L berdasarkan kelompok dosis dan berat badannya selama 14

hari percobaan. Setelah itu dilakukan pengambilan darah pada hari ke-7, ke-

14, dan ke-21.

Tabel 3.1. Perlakuan kelompok uji total leukosit, limfosit, dan monosit

No Kelompok Perlakuan

1 Kontrol negatif Hanya diberi Na Cmc

2 Dosis rendah Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L

dengan dosis 1,25 mg / g BB mencit selama

14 hari. Kemudian diambil darahnya hari ke-

7, ke-14, dan ke-21

3 Dosis sedang Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L

dengan dosis 2,5 mg / g BB mencit selama 14

hari. Kemudian diambil darahnya pada hari

ke-7, ke-14, dan ke-21

4 Dosis tinggi Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L

dengan dosis 5 mg / g BB mencit selama 14

22


hari. Kemudian diambil darahnya pada hari

ke-7, ke-14, dan ke-21

b. Perlakuan untuk uji interlekuin 1

Untuk uji interlekuin 1 jumlah mencit untuk tiap kelompok jumlah

sampel 5. Setelah diaklitimasi selama 1 minggu, mencit diberikan ekstrak

polisakarida secara oral selama 5 hari. Pada hari ke-5 mencit disuntik

dengan LPS 20 g/mencit setelah 2 jam pemberian ekstrak, kemudian 6

jam sesudahnya diambil darahnya untuk diambil plasmanya. Tabung yang

digunakan untuk menampung darahnya adalah tabung EDTA. Kemudian

ditentukan nilai Il-1 menggunakan ELISA kit.

Tabel 3.2. Perlakuan Kelompok Uji Interlekuin 1.

No Kelompok Perlakuan

1 Normal Hanya diberi Na Cmc secara oral, pada hari

ke-5 diambil darahnya.

2 Kontrol negatif Diberi Na Cmc secara oral disuntikan secara

i.p LPS. setelah 6 jam diambil darahnya.

2 Dosis rendah Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L


hari. Pa da hari ke-5 disuntikkan i.p LPS lalu

setelah 6 jam diambil darahnya.

3 Dosis sedang Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L




4 Dosis tinggi Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L

dengan dosis 5 mg / g BB mencit selama 5



23


c. Pengambilan Darah (Permatasari, 2012 )

1. Sebelum pengambilan darah persiapkan terlebih dahulu eter, handscon,

kapas dan tisu.

2. Mencit yang akan diambil darahnya dianestesi menggunakan eter.

3. Posisikan mencit dengan nyaman dengan memegang tengkuk dan

kepala agar tidak banyak bergerak, kemudian Mikrohematokrit

digoreskan pada medial canthus mata di bawah bola mata ke arah

foramen opticus.

4. Mikrohematokrit diputar sampai melukai plexus, jika diputar 5 kali

maka harus dikembalikan 5 kali.

5. Tampung darah yang keluar melalui kapiler di tabung EDTA hingga

mencapai 500ul. Setelah mikrohematokrit dilepas mata mencit dilap

dengan tisu agar darah yang masih keluar segera berhenti.

3.3.3 Metode Uji

a. Uji Total Leukosit, Persentase Limfosit, dan Presentase Monosit

Darah dihisap dengan pipet leukosit sampai pada tanda 0,5 pada

pipet dan disusul dengan larutan turk sampai pada tanda 11, kemudian

salah satu ujung pipet ditutup dengan menggunakan satu ibu jari dan

yang lain dengan telunjuk selama 1- 3 menit, satu sampai dua tetes

pertama dibuang kemudian pipet ujung mikro ditempelkan pada salah

satu sisi bilik hitung yang telah diberi gelas penutup dan kertas tisu pada

sisi lawannya. Darah yang ada pada 4 bilik W (white) diamati di bawah

microskop dengan perbesaran 400. Perhitungan terhadap leukosit yang

terdapat dalam persegi 1, 2, 3, 4 atau kamar hitung hemacytometer.

Jumlah leukosit tersebut dihitung per mm3 dengan ketentuan rumus yang

telah ditentukan rumus untuk menghitung jumlah leukosit per mm3 darah

dengan ketentuan :

Luas persegi panjang : 4 mm2

tinggi kamar hitung : 0,1 mm

pengenceran : 20 kali

N : Jumlah Total Leukosit

24


jumlah leukosit per mm3 adalah , x 20 x N = 50 N (Suharti,et al 2010)

Gambar 3.1 Kamar hitung neubauer (Eki putra, 2008)

Untuk uji limfosit dan monosit Sampel darah segar diteteskan pada

gelas obyek dan dibuat preparat hapus dengan menggunakan tangan kanan

diletakkan gelas obyek lain di depan tetesan darah tersebut dengan sudut 30

- 400 C. Gelas obyek kedua didorong ke depan hingga membentuk hapus

tipis. Setelah kering preparat hapus tersebut difiksasi dengan metanol

selama 3-5 menit, dibiarkan mengering di udara. Preparat kemudian

diwarnai dengan larutan Giemza dengan pengenceran 1 : 9 selama 30 menit

(pH bufer fosfat 6,8 - 7,2). Selanjutnya preparat dicuci dengan aquades dan

dibiarkan mengering di atas rak. Setelah kering preparat diperiksa di bawah

mikroskop dengan perbesaran 100x dihitung setiap jenis leukosit

menggunakan blood counter tabulator. Sel yang dihitung paling sedikit 100

sel dan dilakukan perhitungan jumlah monosit dan limfosit (Suharti, et al

2010).

Gambar 3.2 Alur pengamatan mikroskop pada gelas objek

25


b. Uji Kadar Il-1

Untuk menentukan kadar Interlekuin-1 dalam penelitian ini

digunakan ELISA Kit (Mouse IL-1 ELISA Kit, Foster biological

Technology.,LTD). Prosedur ELISA pada tahap ini mengikuti Protokol For

ELISA Kit yang disertakan pada paket ELISA Kit.

3.4 ANALISA DATA

Untuk mengetahui efektivitas imunomodulator polisakarida Nigella

sativa L melalui pengukuran jumlah Interleukin 1 , jumlah total leukosit,

limfosit, dan monosit mencit balb/c digunakan uji analisa varian (ANOVA)

satu arah. Sebelum diuji menggunakan ANOVA data terlebih dahulu diuji

tingkat kenormalan homogenitas data dan varian datanya terlebih dahulu.

Kemudian dilihat tingkat signifikan datanya menggunakan uji turkey HSD

(Pratisto, 2010).

Hipotesis :

Ho : Tidak ada perbedaan yang signifikan antar tiap kelompok

Hi : Terdapat perbedaan yang signifikan antar tiap kelompok

Kriteria Pengujian :

Bila nilai sig < 0,05 Ho ditolak, berarti terdapat perbedaan yang signifikan

Bila nilai sig > 0,05 Ho diterima, berarti tidak terdapat perbedaan yang

signifikan.

26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL OPTIMASI EKSTRAKSI

Bahan Nigella sativa L. yang digunakan untuk penelitian ini telah diuji

pada penelitian sebelumnya dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense,

pusat penelitian biologi LIPI, Bogor Jawa barat. Hasil determinasi menunjukan

bahwa sampel yang digunakan adalah jinten hitam (Nigella sativa L.) famili

Ranunculae (Alawiyah, 2012 ).

Metode ekstraksi pertama dilakukan dengan menggunakan metode

penelitian Nabil Hailat tahun 1998. Dari 500 gram Nigella sativa L yang

digunakan untuk proses ekstraksi didapat rendemen sebanyak 200 gram

polisakarida. Hasil ekstraksi polisakarida hitam pekat dengan bau khas Nigella

sativa L.

Gambar 4.1 Hasil ekstraksi polisakarida Nigella sativa L metode pertama.

Identifikasi awal polisakarida hasil ekstraksi ini adalah dengan uji

kualitatif. Uji pertama yang digunakan adalah metode reaksi Barfoed. Uji ini

dilakukan dengan cara menambahkan 1 ml larutan polisakarida dengan larutan

Barfoed sebanyak 2 ml, kemudian dipanaskan hingga beberapa saat. Jika

terdapat kandungan sakarida akan terbentuk endapan warna merah bata.

Semakin lama terbentuknya lapisan merah bata menunjukan semakin komplek

susunan sakarida yang ada di dalam larutan. Hasil uji ini menunjukan bahwa

ada warna merah bata pada lapisan ekstrak. Hal ini menunjukan adanya

karbohidrat jenis tertentu.

27

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 4.2 Hasil uji Barfoed polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.

Warna merah bata terbentuk karena adanya gugus aldehid atau keton

(gula pereduksi) bebas dalam molekul karbohidrat. Umumnya yang

teridentifikasi dengan uji ini adalah golongan monosakarida dan disakarida.

Selain uji Barfoed dilakukan juga uji Benedict. Uji ini tidak berbeda

jauh hasilnya dengan uji barfoed. Hasil uji ini juga menunjukan hasil warna

merah bata pada hasil ekstraksi polisakarida yang diperoleh.

Gambar 4.3 Hasil uji Benedict polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.

(terbentuk warna merah bata pada tabung tengah)

Uji selanjutnya dengan metode kuantitatif. Pengujian ini dilakukan di

laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech, Bogor. Metode yang digunakan

untuk mengetahui kadar polisakarida terutama karbohidratnya adalah dengan

menggunakan metode luff schoorl. Hasil uji menunjukan kadar karbohidrat

total yang diperoleh dari metode ekstraksi ini adalah sebesar : 3,81 %,

28


sedangkan kadar inulin sebesar : 0,08 % yang diperoleh dengan metode

pengukuran dengan alat HPLC.

Metode ekstraksi polisakarida yang kedua menggunakan metode

penelitian Toneli pada tahun 2008. Ekstraksi polisakarida Nigella sativa L.

dilakukan sebanyak 3 kali (90 gram) ekstraksi, hasil dari ekstraksi sebanyak

14,5 gram polisakarida (rendemen hasil ekstraksi sebesar16,5 %). Polisakarida

hasil ekstraksi yang dihasilkan berwarna putih keabu-abuan memiliki bau

khas Nigella sativa L.

Gambar 4.4 Hasil Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L.

Pengukuran kadar air yang diperoleh dari hasil percobaan ini adalah

18,12 %. Pengujian kadar air dilakukan untuk menetapkan residu air setelah

proses pengentalan atau pengeringan. Kadar air merupakan standar acuan

sebagai indikasi mutu ekstrak. Hasil ekstraksi polisakarida Nigella sativa L ini

merupakan ekstrak kental sesuai dengan kriteria dari VOIG yaitu 5 30 %.

Kadar abu polisakarida yang diperoleh dari hasil ekstraksi ini

adalah sebesar 6,8 %. Kadar abu dilakukan bertujuan untuk memberi gambaran

kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari Kadar abu yang

diperoleh dari proses awal sampai akhir terbentuknya ekstrak. Pada proses ini

ekstrak dipanaskan pada suhu senyawa organik terdekstruksi hingga tersisa

unsur mineral dan anorganik saja. Data ini menunjukkan bahwa kadar abu

polisakarida jinten hitam (Nigella sativa L.) dibawah kadar maksimal

persentase kadar abu untuk ekstrak berdasarkan materia medika indonesia

sebesar 14 % (Depkes, 1980).

29


Dari hasil uji analisa di laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech

bogor diperoleh hasil kadar karbohidrat dari metode ekstraksi kedua ini adalah

sebesar 3,98 %, sedangkan inulin sebesar 3,19 %. Hasil ini lebih besar

dibandingkan dengan metode ekstraksi pertama, sehingga dalam penelitian ini

metode yang kedua digunakan sebagai metode baku yang dipakai untuk

ekstraksi polisakarida karena diduga inulin merupakan zat aktif yang

berkhasiat sebagai imunomodulator.

4.2 TOTAL LEUKOSIT

Setelah dilakukan penelitian selama 21 hari maka diperoleh data

sebagai berikut:

Tabel 4.1 Hasil perhitungan total leukosit

Setelah dilakukan penghitungan, jumlah total leukosit berkisar antara

3,8 + 0,4 hingga 8,6 + 3,0 x 103 per mm3. Jumlah terkecil terlihat pada

kelompok kontrol pada hari ke-7, sedangkan nilai tertinggi terlihat pada

kelompok dosis tinggi hari ke-21. Peningkatan tersebut sesuai dengan

peningkatan dosis yang diberikan dan lamanya pemberian ekstrak.

Berdasarkan penelitian Arrington tahun 1972, kisaran normal jumlah total

leukosit pada mencit Balb/C adalah 4 12 x 103 per mm3.

Hasil penghitungan jumlah total leukosit hari ke-7 dianalisa dengan

menggunakan program SPSS 16. Hasil uji homogenitas data menunjukkan

bahwa homogenitas data hari ke-7 memenuhi syarat untuk dilakukan uji

ANOVA (p>0,05). Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

yang bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok uji p=0,000

(p

30


menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok

kontrol dengan dosis rendah (p=0,049), kelompok kontrol dengan dosis sedang

(p=0,016), dan kelompok kontrol dengan kelompok dosis tinggi (p=0,000).

Gambar 4.5 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-7

Jumlah total leukosit pada hari ke-14 pemberian polisakarida hasil

ekstraksi Nigella sativa L. pada dosis rendah, dosis sedang, dan dosis tinggi

yang dibandingkan dengan kelompok kontrol berada dalam kisaran jumlah

normal total leukosit. Kenaikan jumlah total leukosit sejalan dengan

peningkatan dosis polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. yang diberikan

ke mencit. Pada kelompok dosis tinggi menghasilkan jumlah total leukosit

tertinggi dibanding kelompok dosis lainya.

Hasil uji homogenitas data untuk analisa hari ke-14 menunjukkan nilai

probabilitas lebih besar dari 0,05 (p=0,602). Hasil ini menunjukkan bahwa

semua kelompok uji memiliki varian yang sama sehingga memenuhi syarat

untuk uji ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitasnya lebih

kecil dari 0,05 (p=0,000). Hasil uji ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

yang bermakna antara kontrol dengan kelompok uji. Kemudian untuk

mengetahui tingkat kemaknaan antar kelompok dilakukan uji turkey HSD.

Hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna antar kelompok

3830

5400 5705

7030

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

hari ke 7

per m

m3

perbandingan kelompok dosis

kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi

31


kontrol dengan dosis rendah (p=0,015), kelompok kontrol dengan dosis sedang

(p=0,001), dan kelompok kontrol dengan dosis tinggi (p=0,000).


Pemberian ekstrak diberikan selama 14 hari, setelah itu pemberian

ekstrak dihentikan. Namun pengambilan darah dilakukan hingga hari ke 21.

Jumlah total leukosit pada hari ke 21 memiliki kisaran yang masih normal. Jika

diperhatikan jumlah total leukosit meningkat berdasarkan besar dosis dan lama

hari pemberian. Kelompok dosis tinggi memiliki jumlah total leukosit paling

tinggi dibanding kelompok lainya.

Hasil uji total leukosit hari ke-21 dianalisa menggunakan uji

homogenitas data. Hasil uji menunjukkan nilai homogenitas hari ke-21

memiliki nilai lebih kecil dari 0,05 (p=0,022). Nilai probabilitas uji

homogenitas data hari ke-21 tidak memenuhi syarat untuk uji ANOVA. Uji

analisa dilakukan dengan metode kruskal wallis agar diketahui kemaknaan

nilai total leukosit kontrol dengan dosis uji. Hasil Uji Kruskal Wallis

menunjukkan nilai dibawah 0,05 (p=0,037). Hasil uji ini menunjukkan bahwa

pemberian kelompok dosis pada hari ke-21 memiliki efek yang bermakna

terhadap kelompok kontrol mencit Balb/C.

4120

61856890

7975

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

hari ke 14

per m

m3


32



Perbandingan rata-rata kelompok total leukosit pada hari ke-7 hari ke-

14 dan hari ke-21 yang di analisa dengan uji ANOVA memiliki nilai bermakna

tiap minggunya (p=0,001). Setelah dilakukan analisa tingkat kemaknaan rata-

rata antar kelompok menggunakan turkey HSD diketahui bahwa terdapat

perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dengan dosis rendah

(p=0,025), kelompok dosis rendah dengan kelompok dosis tinggi (p=0,045),

dan kelompok kontrol dengan dosis tinggi (p=0,001).

Dari pemaparan data diatas menunjukkan bahwa pemberian

polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L pada mencit Balb/C mampu

meningkatkan jumlah total leukosit, dan semakin tinggi dosis pemberian

ekstrak jumlah total leukosit semakin meningkat. Peningkatan jumlah sel ini

tidak melebihi rentang jumlah sel leukosit normal untuk mencit Balb/C.

Leukosit merupakan mekanisme pertahanan imun non spesifik tubuh.

Umumnya sel ini berperan dalam mempertahankan tubuh dari penyusupan

benda asing (Sadikin, 2002). Jumlah total leukosit yang berada pada batas

tertinggi normal menunjukkan sistem imun memproduksi jumlah total leukosit

yang cukup dalam sirkulasi darah untuk melawan infeksi. Peningkatan jumlah

total leukosit menunjukkan kemampuan sistem imun untuk melawan infeksi

atau benda asing (Viera, 2011 ).

4170

6695 6935

8640

0100020003000400050006000700080009000

10000

hari ke 21

per m

m3

perbandingan perlakuan kelompok dosis


33


4.3 JUMLAH LIMFOSIT

Setelah penghitungan total leukosit penelitian dilanjutkan dengan

menghitung kembali jumlah limfosit. Dari pengamatan didapatkan hasil dalam

bentuk persentase lalu dikalikan dengan jumlah total leukosit. Sehingga

didapatkan data jumlah limfosit dalam bentuk rata-rata perkelompok sebagai

berikut:

Tabel 4.2 Rata-rata Jumlah Limfosit.

Hasil uji menunjukkan bahwa nilai limfosit mencit Balb/C pada tabel

diatas berada pada kisaran normal jumlah limfosit pada mencit Balb/C. yaitu

3.300 - 14.250 per mm3 (research animal resources university of minnesota).

Jumlah limfosit hari ke-7 dianalisa menggunakan SPSS 16. Analisa

dimulai dengan uji homogenitas. Uji ini untuk mengetahui uji yang sesuai

dipakai untuk melihat kemaknaan antara kontrol dengan kelompok pemberian

dosis.

Hasil uji homogenitas data hari ke-7 menunjukkan nilai

probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=0,449). Hal ini menunjukkan dari

setiap kelompok uji memiliki varian yang sama, sehingga bisa dilakukan uji

ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa nilai probabilitas data yang

diperoleh lebih kecil dari 0,05 (p=0,000). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat

perbedaan yang bermakna antara kelompok uji dengan kelompok kontrol.

Kemudian untuk mengetahui kemaknaaan antar kelompok masing masing hasil

penelitian dianalisa menggunakan uji Turkey HSD. Hasil uji ini menunjukkan

bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dengan

kelompok dosis renda (p=0,043), kontrol dengan dosis sedang (p=0,039), dan

kontrol dengan dosis tinggi (p=0,000).

DosisRata-rata jumlah total limfosit (x 103 per mm3)

Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21

Kontrol 3,4 + 0,5 3,8 + 0,5 4,4 + 0,6

Dosis rendah 4,8 + 0,7 5,5 + 1,4 6,6 + 0,8

Dosis sedang 4,8 + 1,2 5,5 + 1,08 6,8 + 2,5

Dosis tinggi 6,2 + 1,1 7,0 + 1,2 8,5 + 4,3

34


Gambar 4.8 Grafik peningkatan jumlah hari ke-7

Pada uji homogenitas data hari ke-14 diperolah nilai probabilitas

data sebesar 0,935, sehingga bisa dilakukan Uji ANOVA. Setelah dilakukan

uji ANOVA didapatkan hasil nilai probabilitas datanya lebih kecil dari 0,05

(p=0,003). Hasil ini menunujukan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna

antara kelompok kontrol dengan kelompok dosis. Kemudian uji dilanjutkan

dengan uji Turkey HSD untuk mengetahui tingkat kemaknaan antar

kelompoknya. Hasil analisis Turkey HSD yang diperoleh menunjukkan bahwa

kelompok kontrol berbeda secara bermakna dengan kelompok dosis tinggi

(p=0,001).

Gambar 4.9 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-14

3416,4

4827,6 4894,9

6256,7

0,0

1000,0

2000,0

3000,0

4000,0

5000,0

6000,0

7000,0

hari ke 7

per m

m3

perbandingan antar kelompok dosis limfosit


3807

5542 5526

7114

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

hari ke 14

per m

m3



35


Hasil uji homogenitas data hari ke-21 menunjukkan bahwa nilai

homogenitas datanya dibawah 0,05 (p=0,039), hal ini menunjukkan bahwa

hasil pengamatan hari ke-21 tidak dapat diuji menggunakan Uji ANOVA,

alternatif uji yang digunakan untuk mengetahui kemaknaan suatu analis setelah

Uji ANOVA adalah uji Krusskal Wallis. Hasil uji kruskal wallis menunjukkan

bahwa nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=0,063). Data hasil uji

ANOVA dan Kruskal Wallis tidak menunjukkan hasil yang signifikan untuk

pengamatan hari ke-21, namun jika diamati hasil grafiknya hasil uji hari ke-21

memiliki grafik yang meningkat.

Gambar 4.10 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-21

Perbandingan rata-rata peningkatan limfosit tiap kelompok hari ke-

7, hari ke-14 dan hari ke-21 diuji menggunakan ANOVA menunujukan hasil

yang signifikan (p=0,011). Dari beberapa dosis yang diberikan ke mencit

Balb/C, dosis tinggi (5mg/g BB mencit) memberikan efek yang paling

signifikan (p=0,007). Peningkatan efek imunostimulan tersebut berbanding

lurus dengan besar dosis yang diberikan.

Limfosit adalah sel yang menghasilkan antibodi terhadap berbagai

benda atau senyawa asing (Sadikin, 2002). Sel-sel limfosit ini mempunyai

peran yang sangat penting dalam mekanisme pertahanan atau imunitas spesifik.

4119,96

6641,44 6879,52

8588,16

0100020003000400050006000700080009000

10000

hari ke 21

per m

m3



36


Sel limfosit tubuh terdiri dari tiga macam sel yaitu: natural killer cell, limfosit

T, dan limfosit B (lichman, et al. 2007). Sel-sel ini dihasilkan di sumsum

tulang, namun tempat pematangan selnya berbeda. Limfosit T dimatangakan

di timus setelah keluar dari sumsum tulang. Sel ini akan bekerja secara selular

dan akan menyerang antigen yang ada di sel. Berdasarkan fungsinya limfosit T

dibedakan menjadi 3 macam : sel T helper,sel T killer, dan supresor sel T. Sel

B yang dimatangkan di susmsum tulang mempunyai fungsi imunitas secara

humoral. Sel ini menghasilkan antibodi serta dapat menyimpan memori untuk

mengenali antigen yang pernah masuk dalam tubuh. Sedangkan sel natural

killer memiliki sifat yang tidak spesifik, sel ini kan mendestruksi sel sel yang

terinfeksi.

Pada penelitian ini polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.

dapat meningkatkan jumlah dari sel limfosit secara signifikan. Dari pemaparan

sebelumnya peningkatan sel limfosit terlihat mulai dari pengamatan hari ke-7.

Hal ini menunjukan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. sangat

efektif dalam peningkatan imun spesifik. Pada pengamatan hari ke-14 jumlah

limfosit terus meningkat berbanding lurus dengan jumlah dosis yang diberikan.

Sedangakan pada hari ke-21 jumlah limfosit terus meningkat namun secara

statistik nlainya tidak bermakna. Hal ini disebabkan karena jumlah limfosit

pada beberapa individu mencit mulai mencapai jumlah maksimal nilai normal

limfosit, sedangkan limfosit memiliki rentang umur yang panjang yaitu

berkisar antara 1 minggu hingga beberapa bulan (Britanica, 2015). Nilai

limfosit terus berada pada kisaran normal karena jumlah limfosit dijaga

kestabilanya oleh limfosit T supresor, jumlah limfosit akan terus pada kondisi

normal selama tidak ada paparan patogen.

37


4.4 JUMLAH MONOSIT

Penghitungan jumlah monosit yang dilakukan dengan metode yang sama

pada penghitungan limfosit didapatkan hasil sebagai berikut:

Tabel 4.3 Rata-rata Jumlah Monosit.

Hasil perhitungan jumlah monosit dari pengamatan hari ke-7, hari ke-

14, dan hari ke-21 menunjukkan bahwa Jumlah monosit terkecil terlihat pada

kelompok dosis tinggi hari ke-21, sedangkan nilai tertinggi terlihat pada

kelompok dosis tinggi hari ke-14. Rata-rata jumlah monosit mencit normal

berada pada kisaran antara 0,060 0,600 x103 per mm3 (Research animal

resources, University Of Minnesota). Untuk mengetahui pengaruh aktifitas

polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. terhadap jumlah monosit mencit

Balb/C maka dilakukan analisa uji statistik. Uji ini diawali dengan uji

homogenitas data kemudian jika memenuhi syarat dilakukan uji ANOVA, dan

jika nilai homogenitas data tidak memenuhi syarat uji ANOVA, maka

dilakukan uji kruskal wallis (Sopiyudin, 2001).

Hasil uji honogenitas data hari ke-7 menunjukkan nilai probabilitas uji

homogenitas data hasil pengamatan lebih besar dari 0,05 (p=0,166), nilai ini

memenuhi untuk uji ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai

probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=380). Karena nilai probabilitas data

lebih besar dai 0,05 uji dilanjutkan ke uji non parametrik kruskal wallis. Hasil

uji kruskal wallis menunjukkan nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05

(p=0,555). Hal ini menunjukkan tingkat dosis hari ke-7 tidak mempengaruhi

jumlah monosit.

Dosis

Rata-rata jumlah jumlah monosit (x 103 per

mm3)

Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21

Kontrol 0,25 + 0,08 0,26 + 0,23 0,05 + 0,08

Dosis rendah 0,51 + 0,28 0,50 + 0,283 0,053 + 0,156

Dosis sedang 0,45 + 0,27 0,52 + 1,174 0,055 + 0,08

Dosis tinggi 0,49 + 0,314 0,54 + 0,527 0,034 + 0,034

38


Gambar 4.11 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-7

Uji homogenitas data hari ke-14 menunjukkan nilai probabilitas

datanya lebih besar dari 0,05 (p=0,075). Kemudian dilanjutkan uji ANOVA.

Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih besar dari

0,05 (p=0368). Karena nilai uji anova tidak memenuhi syarat, maka uji

dilanjutakn ke uji non parametrikKruskal wallis. Hasil uji kruskal wallis

menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih besar dari 0,05 (p=0,128). Hasil

uji ini menunjukkan bahwa Variasi dosis yang diberikan ke mencit Balb/C

tidak mempengaruhi kadar jumlah monosit.

Gambar 4.12 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-14

252,78

518,4456,4

492,1

0

100

200

300

400

500

600

hari ke 7

per m

m3

perbandingan antar kelompok dosis monosit


263,68

507,17 523,64542,3

0

100

200

300

400

500

600

hari ke 14

per m

m3



39


Uji homogenitas data hari ke-21 menunjukkan bahwa nilai

probabilitas datanya lebih besar dari 0,243. Hasil uji ini memenuhi syarat uji

ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih

besar dari 0,05 (p=0,910). Karena hasil uji ANOVA nilai probabilitasnya

terlalu besar, maka uji dilanjutkan ke uji non parametrik kruskal wallis. Hasil

uji kruskall wallis menunjukkan nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05

(p=0,128). Hai ini menunjukan bahwa pengujian polisakarida hasil ekstraksi

Nigella sativa L. pada hari ke-21 tidak memiliki pengaruh yang signifikan

terhadap jumlah monosit mencit Balb/C.

Gambar 4.13 Grafik Peningkatan Monosit hari ke-21

Monosit berfungsi sebagai fagosistik mononuklear. Sel ini

dimatangkan di sum-sum tulang selama 1 sampai 3 hari, kemudian bersirkulasi

di darah sangat singkat (kurang lebih 1,5 hari) dan akhirnya berpindah ke

jaringan untuk mengambil peranya sebagai makrofag (Nicholis, et al 1971).

Sel makrofag memiliki peran melakukan fagositosis dan menghancurkan

partikel asing dan jaringan mati serta mengolah bahan asing tersebut untuk

dapat merangsang sistem tanggap kebal di tubuh sehingga terbentuk komplek

antigen antibodi (Eki Putra, 2008). Hal inilah yang diindikasikan mengapa

jumlah leukosit pada hari ke-21 mengalami penurunan. Sel-sel monosit yang

ada di darah telah berpindah ke jaringan karena siklus hidup monosit memang

sangat pendek ada di darah. Selain itu, lamanya penelitian (selama 21 hari)

50,0453,56 55,48

34,56

0

10

20

30

40

50

60

hari ke 21

per m

m3



40


memicu mencit menjadi lemah sehingga mempercepat proses perpindahan

monosit ke jaringan.

4.5 KADAR INTERLEUKIN 1

Analisa Interlekuin 1 tidak dilakukan pengulangan seperti pada uji

total leukosit. Pengujian hanya dilakukan pada hari ke 5 saja.

Tabel 4.4 Rata-rata Jumlah Nilai Il-1

Hasil uji ELISA menunjukan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella

sativa L. terlihat meningkatkan kadar interleukin 1 dalam darah mencit.

Peningkatan ini berbanding lurus dengan bertambah besarnya dosis yang

diberikan. Kelompok kontrol negatif yang telah diinduksi dengan LPS

menunjukan peningkatan jumlah interleukin-1 sebesar 71,3 % (27,2 g/ml)

dari jumlah total interleukin kelompok kontrol (7,8 g/ml). Peningkatan ini

karena pemberian lipopolisakarida dari dinding sel yang memicu terjadinya

inflamasi dalam tubuh mencit. Pada reaksi inflamasi dalam sistem imun terjadi

pelepasan sitokin pro inflamasi (TNF dan IL 1). Pelepasan sel-sel ini dalam

tubuh dimaksudkan untuk memacu vasodilatasi, melonggarkan hubungn sel-

sel endotel, meningkatkan adhesi neutrofil dan migrasi sel-sel ke jaringan

sekitar untuk memakan mikroba (bratawijaya, 2010). Meskipun perkembangan

respon inflamasi efektif berperan penting pada pertahanan tubuh namun respon

tersebut menimbulkan kerusakan. Alergi, penyakit auto imun, infeksi mikroba,

transplantasi dan luka bakar dapat mengawali respon inflamasi kronis

(Bratawijaya, 2010). Dalam penelitian ini diharapkan pemberian ekstrak

DosisRata-rata jumlah total Interleukin 1

(g/ml)

Normal 7,8 (+ 0,0)

Kontrol negatif 27,2 ( + 25,9)

Dosis rendah 33,8 ( + 22,0)

Dosis sedang 158,4 ( + 136,2)

Dosis tinggi 262,5 ( + 264,1)

41


polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. diharapkan dapat menekan

produksi interleukin 1 pada mencit balb/c yang telah diinduksi dengan LPS.

Pada pemberian polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. kelompok

dosis rendah menunjukkan bahwa ekstrak ini tidak dapat menurunkan jumlah

kadar interleukin-1. Hasil pengamatan pada dosis rendah ini justru

menunjukan hasil sebaliknya. Hasil pengamatan menunjukan peningkatan

kadar sebesar 33,8 (g/ml). Peningkatan kadar interleukin-1 juga terjadi pada

kelompok dosis sedang dan pada dosis tinggi sebesar 158,4 (g/ml) dan 262,5

(g/ml).

Gambar 4.14 Grafik hasil uji interleukin 1.

Jika dianalisa berdasarkan hasil uji statistika, nilai homogenitas data

uji kadar interleukin 1 memiliki nilai lebih kecil dari alfa (p=0,000). Hal ini

mengindikasikan bahwa data tidak dapat dilakukan uji ANOVA. Uji statistik

untuk data yang homogenitasnya tidak normal adalah menggunakan krusial

Wallis. Namun setelah dilakukan uji statistik krusial-Wallis nilai

probabilitasnya lebih besar dari alfa (P=0,319), sehingga dapat diambil

kesimpulan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. tidak memiliki

pengaruh yang bermakna terhadap jumlah kadar interleukin 1.

7,827,2 33,8

158,4

262,5

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

(g/

ml)

kadar interleukin

normal kontrol negatif dosis 1 dosis 2 dosis 3


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN

1. polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. dosis 1,25 mg/BB mencit,

2,5 mg /BB mencit dan 5 mg /BB mencit mampu mempengaruhi jumlah

total leukosit dan jumlah limfosit dan tidak mempengaruhi jumlah

monosit.

2. Dosis polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. yang memiliki efek

imunomodulator paling baik adalah dosis tinggi (5 mg/BB mencit).

3. Pada uji interleukin 1 belum bisa disimpulkan datanya, karena

berdasarkan analisa statistika datanya tidak sigifikan.

5.2 SARAN

Perlu dilakukan uji lanjutan terhadap hewan percobaan yang lebih

besar seperti tikus guna melihat terjadinya penurunan jumlah total leukosit

dan limfosit setelah pemberian polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.

43


DAFTAR PUSTAKA

Alawiyah arifiani, Aulina. 2012. Karakterisasi Simplisia Dan Standardisasi

Ekstrak Etanol Biji Jinten Hitam (Nigella Sativa L.). Program Studi

Farmasi, Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta

Bratawidjaja, Imunologi dasar. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit FKUI ;2002.

Bratawidjaja, Immunologi Dasar. Edisi 9 Jakarta: Balai Penerbit FKUI ;2010.

Britanica, Ensikl

UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASIL Nigella...

Documents

Transcript of UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASIL Nigella...