С.А.Кибардин, К.А.Макаров

ТОНКОСЛОЙНАЯХРОМАТОГРАФИЯВ ОРГАНИЧЕСКОЙ

ХИМИИ

МОСКВАИЗДАТЕЛЬСТВО «> "1ИЯ»

1978

УДК 543 544:547

Кибардин С. Α., Макаров К. А.

Тонкослойная хроматография в органической химии. — М.: Хи-мия, 1978 г. — 128 с, ил.

В книге сделан обзор современного состояния использованияметода тонкослойной хроматографии в некоторых областях орга-нической химии: для анализа пестицидов, консервантов, антиокси-дантов, органических соединений, содержащих серу, и др.

Книга предназначена для широкого круга специалистов, инте-ресующихся проблемами использования тонкослойной хроматогра-фии в области органической и биологической химии, микроанали-за, радиохимии, пищевой и химической промышленности. Книгаможет представить интерес для преподавателей высших учебныхзаведений.

128 с, 28 табл., 10 рис., список литературы 205 ссылок.

К 2 0 5 0 4 - 0 2 9 29-78050(01)-78

© Издательство «Химия», 1978 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие 4

Введение 5

Г л а в а 1. Техника эксперимента, материалы и оборудова-ние для тонкослойной хроматографии органиче-

ских соединений 13

Г л а в а 2. Сорбенты, применяемые в тонкослойной хромато-графии органических соединений 23

Г л а в а 3. Элюирование хроматограмм органических соеди-нений 28

Г л а в а 4. Тонкослойная хроматография органических

кислот , 48

Г л а в а 5. Разделение изомеров органических соединений . 59

Г л а в а 6. Тонкослойная хроматография пестицидов . . 72Г л а в а 7. Тонкослойная хроматография консервантов, пи-

щевых красителей и антиоксидантов . . . . 92

Г л а в а 8. Тонкослойная хроматография органических со-единений серы 101

Г л а в а 9. Тонкослойная хроматография азотсодержащихсоединений 111

Литература 119

ПРЕДИСЛОВИЕ

Метод хроматографии в тонких слоях в настоящеевремя широко используется в различных областях нау-ки и техники. Широкое применение и развитие этогометода обусловлено рядом его преимуществ: быстротойвыполнения анализа, относительной простотой метода,экономичностью и универсальностью. Метод используютдля разделения и анализа микроколичеств веществ раз-нообразного происхождения, определения примесей ворганических соединениях, качественной и количествен-ной оценки примесей в продуктах пищевой и химичес-кой промышленности.

Возникнув первоначально как качественный метод,хроматография в тонких слоях начинает с успехом ис-пользоваться для полуколичественного и количественно-го определения и анализа органических соединений.

Описания экспериментальных работ по применениютонкослойной хроматографии в различных разделах ор-ганической химии разбросаны по многочисленным пе-риодическим журналам и сборникам.

Монографии на русском языке, посвященные общимвопросам тонкослойной хроматографии и опубликован-ные еще в 1964—1965 гг., в настоящее время стали биб-лиографической редкостью, а приведенные в них методи-ки подверглись значительным модификациям. В связи сэтим авторы ставили своей задачей обобщить имеющий-ся в литературе экспериментальный материал по приме-нению тонкослойной хроматографии в различных обла-стях органической химии и дать представление о совре-менном состоянии этого метода.

В главе 1 раздел «Оборудование для тонкослойнойхроматографии» написан сотрудниками СКВ аналити-ческого приборостроения АН СССР Р. Г. Виноградовой,Ф. И. Романовым. Глава «Тонкослойная хроматографияорганических соединений серы» написана доктором хи-мических наук Е. Н. Карауловой.

Авторы примут с благодарностью критические заме-чания и пожелания по данной работе.

4

ВВЕДЕНИЕ

Тонкослойная хроматография или, как ее часто на-зывают, метод хроматографии в тонком слое адсорбен-та к настоящему времени получила всеобщее признание.Тонкослойную хроматографию с успехом применяют вразличных областях органической, аналитической ибиологической химии для анализа примесей в различныхтехнических смесях и материалах, в фармацевтическойи нефтеперерабатывающей промышленности, технологиипластических масс, сельском хозяйстве.

Метод тонкослойной хроматографии был предложенв 1938 г. Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер для раз-деления и анализа в тонком слое окиси алюминия не-которых алкалоидов из экстракта лекарственных расте-ний [1]. Потребовалось, однако, еще более двадцати лет,прежде чем этот метод получил всеобщее признание.С выходом в свет работы Шталя [2] начинается новыйэтап в развитии хроматографии в тонких слоях. Тонко-слойная хроматография становится одним из основныхметодов органической химии для анализа самых разно-образных органических соединений.

Хроматографический процесс в тонком слое адсор-бента обеспечивается динамическим передвижениемподвижной фазы (.растворитель) через стационарную не-подвижную фазу (адсорбент). В результате передвиже-ния смеси растворителя и исследуемых веществ проис-ходит разделение анализируемой смеси на компоненты,основанное на различной скорости их перемещения вслое адсорбента.

Механизм хроматографического разделения в усло-виях тонкого слоя в принципе не отличается от меха-низма хроматографии на колонках, Существенная раз-

5

ница, однако, заключается в том, что при тонкослойнойхроматографии разделяемые соединения имеют возмож-ность диффундировать не только в продольном, но и впоперечном направлении.

При хроматографии на колонках анализируемое ве-щество в обычных условиях движется вниз по колонкепод действием гравитационных сил. Основными силами,действующими в тонкослойной хроматографии (при наи-более часто используемом варианте — восходящей хро-матографии), являются капиллярные силы, которые пре-обладают над гравитационными силами. Благодаря этимсилам и обеспечивается передвижение разделяемых ком-понентов смеси. Помимо этих сил в тонкослойной хро-матографии действуют также и силы диффузии, влияю-щие на перемещение хроматографируемого вещества какв продольном, так и в поперечном направлении. Посравнению, например, с хроматографией на бумаге диф-фузия в тонком слое в значительно меньшей степениобусловливает возможность расширения пятна, что улуч-шает качество разделения компонентов смеси. Тонко-слойная хроматография может быть восходящей, нисхо-дящей, горизонтальной, круговой, двумерной.

Движение подвижной фазы в тонкослойной хрома-тографии может быть ступенчатым, прерывным или не-прерывным. Тонкослойную хроматографию можно ком-бинировать с тонкослойным электрофорезом, тонкослой-ным изоэлектрическим фокусированием, тонкослойнойгель-фильтрацией и т. д.

Тонкослойная хроматография была использована дляанализа многих органических соединений: одно- и мно-гоатомных спиртов, карбонильных соединений, одно- имногоосновных карбоновых кислот и их производных,ароматических соединений, аминов, органических соеди-нений, содержащих серу, а также различных красителей[3], пептидов, белков [4], фосфолипидов [5], антибиотиков.

Хроматографическое поведение органических соеди-нений зависит от их химического строения: наличия не-предельных связей, различных функциональных группи радикалов, их числа и положения в молекуле [3]. Нахроматографическое поведение органических молекулможет сильно влиять конформационное состояние моле-кулы. Изомеры многих органических соединений, разде-ление которых с помощью других методов является до-

6

вольно трудной задачей, могут быть легко разделеныпри хроматографии их в тонких слоях.

Особое значение имеет применение тонкослойной хро-матографии для решения ряда задач прикладного значе-ния, например для определения остаточных количествпестицидов в окружающей среде. Большой интерес дляопределения пестицидов представляет сочетание методовтонкослойной хроматографии и ингибирования действияферментов. Это в значительной степени увеличиваетчувствительность метода.

Весьма перспективно оказалось также применениеметода тонкослойной хроматографии для анализа раз-личных консервантов и антиоксидантов, при разработкеметодов анализа продуктов и полупродуктов нефтехими-ческого производства, а также для анализа органическихсоединений серы в различных фракциях нефти [6,с. 76—94].

Тонкослойная хроматография, возникшая как преи-мущественно аналитический метод, в последующем бы-ла широко использована и в качестве препаративногометода. Одной из первых работ в этом направлении бы-ла работа Кирхнера и Миллера [7]. В дальнейшем пре-паративная техника начинает довольно широко приме-няться в тонкослойной хроматографии, однако следуетпризнать, что препаративная хроматография в тонкихслоях все же не может полностью конкурировать с хро-матографией на колонках.

В последние годы были предложены различные но-вые приемы препаративной хроматографии в тонкихслоях, в том числе применение более толстых слоев, чемобычно [8]. Следует, однако, отметить, что увеличениетолщины слоя [8] более чем до 750 мкм значительноухудшает разделение анализируемой смеси. Таким об-разом, ограничение в толщине слоя ставит определен-ный предел препаративным возможностям тонкослойнойхроматографии.

Одним из путей дальнейшего развития тонкослойнойхроматографии будет, очевидно, применение ультрами-кротонкослойной хроматографии, что позволит работатьс микроколичествами вещества. Развитие тонкослойнойхроматографии в этом направлении потребует разработ-ки новой техники и, по-видимому, специальной аппара-туры. Другим возможным направлением развития тон-

7

кослойной хроматографии будет комбинирование хрома-тографии в тонких слоях с другими методами анализа.Получат дальнейшее развитие, по-видимому, методыэлектрофореза в тонких слоях, техника изоэлектричес-кого фокусирования. Представляется перспективнымизучение влияния магнитных полей на хроматографичес-кий процесс в условиях тонкого слоя. Новые возможно-сти откроет, по-видимому, разработка техники градиен-та в тонкослойной хроматографии [9]. Это направлениетонкослойной хроматографии за последние годы начина-ет все шире развиваться [9].

Развитие тонкослойной хроматографии, по-видимому,пойдет также в направлении разработки аппаратурыдля улучшения регистрации результатов хроматографи-ческого анализа. В настоящее время, например, ужепредложены для этой цели спектроденситометр, а такжефлуороденситометр.

Представляет существенный интерес также перспек-тива дальнейшего использования тонкослойной хромато-графии в новых производственных процессах, напримерв текстильной промышленности [10].

Целесообразно кратко рассмотреть опубликованные к настоя-щему времени (март 1976 г.) книги и монографии по хроматографиив тонких слоях, появившиеся за последние 10—15 лет. Общим вопро-сам хроматографии в тонких слоях посвящены монографии [11, 12].

Технические вопросы использования тонкослойной хроматогра-фии и характеристика многих органических соединений, которые под-вергались разделению в тонких слоях, подробно разобраны в моно-графии А. А. Ахрема и А. И. Кузнецовой [13], много сделавших дляпопуляризации метода тонкослойной хроматографии в нашей стране.

Следует также отметить обстоятельную монографию Рандерата[14] по тонкослойной хроматографии различных органических соеди-нений, в основном биологически активных соединений.

Много сделали для развития и внедрения метода тонкослойнойхроматографии в практику аналитических исследований Шталь[2, 15] и Кирхнер [16]. Монографии Шталя и Кирхнера являютсякапитальным трудом по тонкослойной хроматографии, почти энцик-лопедического характера, и могут служить своего рода справочнымпособием. Из других представляющих интерес монографий по тонко-слойной хроматографии следует отметить книги [17, 18].

Вопросам количественной оценки результатов тонкослойной хро-матографии посвящены книга под редакцией Шелларда [19], а так-же монография Тоугстона [20], в которой рассматриваются количе-ственные аспекты тонкослойной хроматографии с использованиемдля оценки результатов современных спектроденситометров и флуо-роденситометров. Специальная часть монографии в основном посвя-щена обзору по тонкослойной хроматографии биологически и физио-

логически активных соединений, а также контролю фармацевтичес-кой продукции.

Вопросам жидкостной хроматографии с использованием различ-ных градиентов посвящена книга Литяну и др. [9], в одной из главкоторой детально разбирается применение градиента для тонкослой-ной хроматографии. В 1974 г. опубликована монография [21] поприменению тонкослойной хроматографии для анализа неорганичес-ких соединений.

Во многих из названных выше монографий и руководств потонкослойной хроматографии помимо методических вопросов и воп-росов обзорного характера обсуждаются вопросы теории хромато-графии в тонких слоях. Следует, однако, отметить, чго по сравнениюс хроматографией на колонках теория тонкослойной хроматографииразработана еще недостаточно, и во многих случаях условия разде-ления смесей приходится подбирать эмпирически. Для разработкитеории тонкослойной хроматографии много сделано Б. Г. Беленькими его сотрудниками [22—24].

Основной задачей хроматографического процесса яв-ляется разделение исследуемой смеси на отдельные ком-поненты. Для того чтобы судить об эффективности хро-матографического процесса, в колоночной хроматогра-фии применяется величина, равная числу теоретическихтарелок.

Понятие теоретической тарелки пришло в хромато-графию из теории ректификации, где теоретическая та-релка соответствует определенному участку колонки, вкоторой пар и жидкость находятся в равновесии. В ко-лоночной хроматографии эффективность работы колонкихарактеризуется как числом теоретических тарелок, таки высотой, эквивалентной теоретической тарелке(ВЭТТ), которая позволяет сравнивать колонки различ-ной длины. Число теоретических тарелок пропорциональ-но длине колонки.

В тонкослойной хроматографии для характеристикиэффективности разделения на пластинках также исполь-зуются указанные величины. Здесь число теоретическихтарелок N определяется, как

N = 16 (п/т)2

где η — расстояние от линии старта пятна на пластинке до нижнейграницы пятна; т — расстояние между нижней и верхней границамипятна на пластинке (рис. 1).

Величина Н, равная высоте, эквивалентной теорети-ческой тарелке в тонкослойной хроматографии, выража-ется, как

Я=т2/Ш/г

В тонкослойной хроматографии эффективность раз-деления может достигать 2000 теоретических тарелок.

Величина, эквивалентная теоретической тарелке, ха-

Линияфронта

Линия/старта

Рис. 1. Определение числа теоретиче-ских тарелок N и величины Rf при

хроматографии в тонком слое:η — расстояние от линии старта до ниж-ней границы пятна; т — расстояние междунижней и верхней границами хроматогра-фического пятна; χ — расстояние от линиистарта до центра пятна; (/ — расстояние отлинии старта до линии фронта раствори-

теля.

рактеризует степень разделения хроматографируемыхсоединений в данной системе. Она зависит от объемаудерживания (объем подвижной фазы, необходимыйдля полного элюирования данного соединения), а такжеот времени удерживания (время, которое требуется дляэлюирования данного соединения).

В данной хроматографической системе время удер-живания и объем удерживания являются постояннымидля данного соединения и могут служить для оценкиразделительной способности системы.

В тонкослойной хроматографии важной характери-стикой степени разделения хроматографируемых соеди-нений является величина Rf — отношение расстояния отцентра пятна на пластинке до линии старта (х), к рас-стоянию (у), пройденному растворителем (от линиистарта до линии фронта) (см. рис. 1):

Rf = х/у

Величина Rf может служить и для оценки степениудерживания данного соединения в слое сорбента. Иног-да величину Rf и объем удерживания в тонкослойнойхроматографии используют для идентификации разде-ляемых компонентов хроматографируемой смеси. Вели-чина Rf является характеристикой данного соединения,хроматографируемого на данном сорбенте в данном рас-творителе и в данных условиях опыта.

Величина Rf может быть выражена также отноше-нием скорости движения исследуемого вещества (Von)10

на пластинке к скорости передвижения фронта раство-рителя (Ураств):

Rf = Уоп/^раств

Иногда подвижность соединений при хроматографиив тонких слоях оценивают по отношению к подвижностивещества, выбранного в качестве стандарта или свидете-ля. Тогда

RCT = Rf (ощ/R; (свид)

Подвижность опытного пятна (Rx) можно также вы-разить как отношение пройденного пятном расстояния напластинке (/Оп) к расстоянию, пройденному на той жепластинке соединением, выбранным в качестве свидете-ля (/свид).

Rx = 'оп/'свид

В этом случае в отличие от Rf значение Rx можетбыть больше единицы.

Величины Rf η Ν связаны между собой уравнением:

где R — величина, характеризующая степень разделения компонен-тов смеси при хроматографии в тонких слоях, может быть названакоэффициентом разделения; Rf и Rf —значения Rf, соответствую-щие двум компонентам смеси.

Как и при хроматографии на колонках, механизмразделения опытной смеси веществ при хроматографиив тонких слоях может быть различным.

Различают следующие типы тонкослойной хромато-графии: адсорбционная хроматография, основанная наразличной сорбции испытуемых веществ твердой фазойсорбента, характеризуется константой сорбции; распре-делительная хроматография, основанная на распределе-нии разделяемых веществ между подвижной и непод-вижной жидкими фазами, характеризуется коэффициен-том распределения; ионообменная хроматография,основанная на обмене ионами между растворенным ве-ществом и ионогенными группами сорбента, характери-зуется константой обмена. Необходимо отметить, что всеэти виды хроматографических процессов обычно редкопротекают в изолированном виде, однако один из нихпри этом обычно является основным.

И

Наконец, необходимо указать еще на один вид хро-матографии, получивший развитие сравнительно позднеедругих разновидностей хроматографии. Это гель-хрома-тография или, как ее часто называют, ситовая хромато-графия или гель-фильтрация. В основе гель-хроматогра-фии лежит распределение компонентов разделяемой сме-си веществ между подвижной фазой — растворителем,находящимся в свободном состоянии, и неподвижнойфазой — жидкостью, находящейся ЕО внутренних порахили полостях полимерных гелей. Разделение зависит отразмеров молекул разделяемой смеси. Большие молеку-лы, которые не могут проникать в поры геля, первымивымываются из неподвижной фазы. Полимерные гели вэтом виде хроматографии играют роль сита, разделяю-щего смесь в соответствии с размерами составляющихее молекул.

В ситовой хроматографии наряду с фильтрацией оп-ределенную роль играют также адсорбционные процес-сы, протекающие между поверхностью геля и молекула-ми разделяемых веществ.

Коэффициент распределения в распределительнойхроматографии, так же как константа сорбции в адсорб-ционной, характеризуется отношением концентрации ана-лизируемого соединения, находящегося в неподвижнойфазе, к концентрации этого соединения в подвижнойфазе.

Между величиной Rf и коэффициентами распределе-ния и адсорбции существует зависимость, выражаемаяуравнением:

где q — отношение объемов подвижной (Vm) и неподвижной (Vs)фаз, q=VmIVs (в тонкослойной хроматографии Vm определяетсяэкспериментально на стандартной пластинке); Vs — объем твердойфазы.

Глава 1

ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА, МАТЕРИАЛЫИ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОЙ

ХРОМАТОГРАФИИ ОРГАНИЧЕСКИХСОЕДИНЕНИЙ

Техника метода хроматографии в тонких слоях со-стоит в последовательном выполнении ряда приемов иопераций. Сначала производят подборку пластинок илиподложек соответствующего размера, являющихся носи-телями сорбционного слоя. На подготовленную соответ-ствующим образом пластинку наносят слой адсорбента,который является неподвижной фазой в тонкослойнойхроматографии. Сорбционный слой, если необходимо,высушивают и иногда подвергают активированию.

Следующий этап — нанесение на нижний край пла-стинки с адсорбентом проб испытуемого вещества. Про-бы наносят, как правило, на расстоянии 1,5 см от ниж-него края пластинки.

Подготовленную таким образом пластинку помеща-ют в камеру для хроматографии, куда предварительноналивают нужный растворитель или элюирующий ра-створ. Свободный перемещающийся растворитель играетздесь роль подвижной фазы. Неподвижной фазой слу-жит адсорбционный слой сорбента с пленкой раствори-теля, удерживаемого частицами сорбента.

В процессе хроматографии растворитель под дейст-вием капиллярных сил (в случае наиболее часто приме-няемой восходящей хроматографии) поднимается вверхпо пластинке, достигает места нанесения анализируемыхвеществ и перемещает их. По мере продвижения раство-рителя происходит разделение анализируемой смесивеществ в зависимости от их сродства к сорбенту.

После окончания хроматографического процесса пла-стинку с сорбентом вынимают из камеры, отмечают ли-нию фронта, до которой поднялся растворитель, и обра-батывают специальными реагентами для обнаруженияпятен.

13

Приготовление хроматографических пластинок и на-несение сорбционной массы на пластинки. В тонкослой-ной хроматографии органических соединений в качествепластинок-подложек чаще всего употребляют стеклян-ные пластинки различных размеров, удобные тем, чтоих можно легко очищать и использовать многократно.

Наиболее употребительные размеры стеклянных пла-стинок: 5X15, 10X20, 20X20, 20X40 см и другие. В по-следнее время для микротонкослойной хроматографиииспользуют пластинки размером 3,0X8,0 или 2,5X7,5 см.Размер пластинок определяется задачей, которая стоитперед экспериментатором, и количеством вещества, под-вергаемого хроматографии.

Помимо стеклянных пластинок в тонкослойной хро-матографии органических соединений применяют такжепластинки из алюминиевой фольги, пластика и другихматериалов.

Выбирая пластинки для эксперимента, необходимоучитывать, что для воспроизводимости результатов не-обходимо употреблять пластинки одинаковых размеров,полученные из одного и того же материала.

Стеклянные пластинки перед нанесением на них сорб-ционной массы должны быть тщательно обезжиреныобработкой свежеприготовленной хромовой смесьюобычно в течение суток или 1%-ным раствором детер-гента с последующей промывкой пластинок дистиллиро-ванной водой.

Обезжиренные, промытые и высушенные пластинкинеобходимо предохранять от пыли и различных пароворганических соединений, находящихся в воздухе; хра-нить пластинки можно в эксикаторе или в полиэтилено-вых мешочках. Брать пластинки необходимо за ребра,не* касаясь их поверхности.

Ответственной операцией является нанесение на пла-стинки массы сорбента. От качества нанесенного слояв значительной мере зависит успех хроматографическо-го разделения.

Подготовленная сорбционная масса наносится ров-ным слоем на горизонтальную поверхность пластинкипри помощи специального прибора или ручным спосо-бом. Чтобы добиться строго горизонтального положенияпластинки, рекомендуется пользоваться уровнем. Удобен

14

также для этой цели небольшой специальный столик,высоту и наклон которого можно легко регулировать.

Существуют различные способы нанесения сорбцион-ной массы на пластинки: намазывание массы с помо-щью специального прибора или ручным способом, наливсуспензии сорбента на пластинку, погружение пластинкив суспензию с сорбентом, опрыскивание пластинки раз-бавленной суспензией сорбента.

Наибольшее распространение получил способ нама-зывания сорбента на пластинку (в случае густой массы)и способ поливки (при наличии жидкой суспензии сор-бента). В последнем случае при ручном нанесении сус-пензию наливают на пластинку, окружая иногда краяпластинки небольшой полоской лейкопластыря для пред-отвращения сливания суспензии с пластинки.

Установлено, что оптимальная толщина сорбционно-го слоя составляет 0,15—0,25 мм. Однако в том случае,когда опыт проводится с препаративной целью, толщи-ну слоя необходимо увеличить до 0,50—0,75 мм.

Сорбент, нанесенный на пластинки в виде водной сус-пензии, обычно содержит избыточное количество воды,которую необходимо удалить. Сушку пластинок с сор-бентом осуществляют на воздухе при комнатной темпе-ратуре или в токе воздуха. Затем пластинки с сорбен-том сушат в вертикальном положении при 383 К (110°С)в течение 30 мин.

В процессе сушки необходимо избегать загрязненияпластинок пылью или парами летучих соединений, кото-рые могут находиться в воздухе, появления трещин вповерхностном слое сорбента. Иногда пластинки с сили-кагелем или окисью алюминия подвергают активирова-нию — дополнительно нагревают в течение 3—4 ч при423 К (150 °С).

В тонкослойной хроматографии органических соеди-нений слой сорбента может быть закрепленным и неза-крепленным, в зависимости от задач, которые возника-ют перед экспериментатором. При использовании неза-крепленного слоя сорбент находится на пластинке всвободном состоянии, без добавления каких-либо свя-зующих веществ. Закрепленный слой сорбента содержитсвязующие вещества, добавленные в сорбционную мас-су с целью придания большей прочности слою. В каче-стве связующих веществ в тонкослойной хроматографии

15

часто используют медицинский гипс или очищенныйкрахмал. Крахмал отмывают многократно водой, к ко-торой добавлено небольшое количество четыреххлорис-того углерода или хлороформа, отфильтровывают наворонке Бюхнера и сушат на воздухе.

6 8 10 12 74I, СП

Рис. 2. Зависимость дли-ны пути, пройденного ра-створителем (ССЦ) напластинках с силикаге-лем различных марок, от

времени:/ — 2ΡΪ-1; 2 —2Р-2; 3—2N-1;

4 —D2H-1.

Существенно важным при хроматографии в тонкихслоях является необходимость добиваться по возможно-сти стандартных и однородных по качеству адсорбци-онных слоев на пластинке. Воспроизводимость резуль-татов в значительной степени зависит от характера иструктуры адсорбционных слоев.

Недавно была предложена простая методика дляоценки стандартности слоев адсорбента на пластинке поопределению скорости потока подвижной фазы на пла-стинке с адсорбентом [25]. Длина пути (/), пройденногорастворителем за время (£), является функцией временидля стандартного растворителя на разных адсорбентах(рис.2):

Пользуясь такой зависимостью, можно быстро про-водить оценку различных адсорбционных слоев на пла-стинках, добиваясь их максимальной унификации истандартизации.

Изучению вопроса применения различных типов ад-сорбентов при хроматографии в тонких слоях посвяще-на также работа [26]. Использовались различные формысиликагелей, окись алюминия, кизельгур, полиамиды инекоторые другие сорбенты, изучалось поведение неко-торых соединений на адсорбционных слоях, обладающихразличными поверхностными свойствами.

16

Оборудование для тонкослойной хроматографии*.Комплект оборудования для тонкослойной хроматогра-фии (ТСХ) наряду с аналитическими весами, рН-мет-ром, ИК-спектрометром, газовым или жидкостным хро-матографом должен входить в стандартное оборудова-ние любой аналитической лаборатории. Этот комплектпозволяет стандартизировать метод ТСХ, что очень важ-но при сравнении методик и результатов анализов, по-лученных различными исследователями.

Описаны [27] различные комплекты оборудования,выпускаемые более чем 100 фирмами.

Первым отечественным набором оборудования дляТСХ является комплект КТХ-01, разработанный СКБаналитического приборостроения АН СССР совместно сИнститутом высокомолекулярных соединений АН СССР[28, 29].

Комплект КТХ-01 включает оборудование для приго-товления хроматографических пластин; для нанесенияпробы; для хроматографирования восходящим, нисхо-дящим, горизонтальным, проточным и градиентным ме-тодами; для проявления хроматограмм химическим спо-собом; для просмотра хроматограмм в ультрафиолето-вом свете и их фоторегистрации.

Для проведения качественного и количественного-анализа веществ, меченных изотопами, дополнительнопредусмотрена сцинтилляционная хроматографическаяустановка УСХ-1.

О б о р у д о в а н и е д л я п р и г о т о в л е н и я хро-м а т о г р а ф и ч е с к и х п л а с т и н (рис. 3). Оборудо-вание, входящее в комплект КТХ-01, позволяет исполь-зовать стеклянные пластины размером 60X60 и 60XX 100 мм для микрохроматографии и пластины разме-ром 100x100, 100X200 и 200X200 мм для аналитичес-кой и полупрепаративной хроматографии.

Суспензию сорбента наносят на пластины с помощьюаппликатора 3. Толщину наносимого слоя сорбента мож-но регулировать в пределах 0,05±0,02 мм. Неравномер-ность толщины слоя на каждой пластине и воспроизво-димость толщины слоя в одной серии пластин не превы-шает 10%.

Суспензию сорбента готовят при помощи мешалки 2,укомплектованной стаканами емкостью 50, 250 и 500 см3.

* Раздел написан Р. Г. Виноградовой и Ф. И. Романовым.17

Рис. 3. Оборудование для приготовления хроматографическихпластин:

1 — коробка с пластинами; 2 — мешалка; 3— аппликатор; 4 — столик длясушка пластин, 5 — камера сушки и активации; 6 — стойка для пластин;

7 — шкафчик для хранения пластин.

После нанесения суспензии пластины укладываютв горизонтальном положении на столик для предвари-тельной сушки на воздухе.

Дальнейшая сушка и активация хроматографичес-ких пластин осуществляется в камере 5 при температу-рах 308—498 К (35—225 °С). Готовые пластины хранятв герметичном шкафу 7.

О б о р у д о в а н и е д л я н а н е с е н и я п р о б нах р о м а т о г р а ф и ч е с к и е пластины (рис. 4). Нанесе-ние пробы на тонкослойные пластины может осущест-вляться шприцевым дозатором 1, сильфонным дозирую-щим устройством 2 или автоматическим дозатором 3.Шприцевым дозатором можно одновременно нанести напластину от одного до пяти анализируемых веществ. Принеобходимости нанесения на хроматографическую пла-стину ядовитых или радиоактивных жидкостей исполь-зуют сильфонное дозирующее устройство, которое состо-

18

Рис. 4. Оборудование для нанесения пробы:• шприцевый дозатор; 2 — сильфонное дозирующее устройство; 3 — автома-

тический дозатор.

ит из сильфонного насоса и набора пипеток. Для точеч-ного нанесения сильно разбавленных растворовприменяют автоматический дозатор.

Размер пятен пробы на хроматографической пласти-не зависит от установленного расстояния между игламишприцев и слоем сорбента, нанесенного на пластину.При минимальном расстоянии можно получить пятноразмером не более 3 мм при объеме пробы 100 мкл.

О б о р у д о в а н и е д л я п р о в е д е н и я т о н к о -с л о й н о й х р о м а т о г р а ф и и (рис. 5). Хроматогра-фирование пластин с незакрепленным слоем сорбентанисходящим и проточным методами осуществляется вспециальных камерах.

19

Рис. 5. Оборудование для проведения хроматографии:/ — сосуд для хранения пластин; 2 — к а м е р а для проведения хроматографиина пластинах с незакрепленным слоем сорбента; 3 — С-камера; 4 — автомати-ческое устройство для получения градиентных растворов- 5 — проточная каме-

ра с устройством для подачи элюента на хроматографическую пластину.

При хроматографировании пластин с закрепленнымслоем сорбента без насыщения объема камеры парамирастворителя используют С-камеры, позволяющие про-изводить одновременное хроматографирование восходя-щим методом двух пластин.

Для проведения тонкослойной хроматографии мето-дом градиентной элюции в комплекте КТХ-01 предусмот-рены автоматическое устройство для создания градиен-та (автоград) с капиллярными резервуарами для хране-ния градиентных растворов 4 и проточная камера 5.

О б о р у д о в а н и е д л я п р о я в л е н и я х р о м а -т о г р а м м х и м и ч е с к и м м е т о д о м (рис. 6). Тон-кослойные пластины помещают для проявления в специ-альные камеры / и опрыскивают из распылителя 2 хи-мическими реагентами, дающими цветные реакции сразделенными веществами. Если химическое воздействиереагента с разделенными веществами происходит толь-ко при повышенной температуре, то пластину после оп-рыскивания помещают в камеру проявления, которая поконструкции идентична камере сушки и активации (см.рис. 3) и отличается только меньшими размерами.20

Рис. 6. Оборудование для проявления и обнаружения в ультрафио-летовом свете и фоторегистрации хроматограмм:

/ — камера для опрыскивания; 2 — распылитель; 3 — ручной УФ-осветитель;4 — УФ-осветитель с фотографической приставкой.

О б о р у д о в а н и е д л я п р о с м о т р а х р о м а т о -г р а м м в у л ь т р а ф и о л е т о в о м с в е т е и их фо-т о р е г и с т р а ц и я . Для обнаружения хроматографи-ческих пятен, флуоресцирующих в УФ-свете или погло-щающих УФ-излучение, в комплекте К.ТХ-01 имеютсядва источника света 3 на 254 и 365 нм. Блок осветителяоборудован фотоприставкой 4 с фотоаппаратом «Зенит».

Фотоприставкой осуществляется репродукционная фо-тосъемка хроматограмм. Возможно осуществление до-кументации хроматограмм контактным методом в беломи УФ-свете, а также методом контактной люминисцент-ной адсорбционной фотопечати.

О б о р у д о в а н и е д л я а н а л и з а в е щ е с т в ,м е ч е н н ы х и з о т о п а м и . Для регистрации веществ,меченных тритием, радиоактивным углеродом и други-ми изотопами, в комплекте имеется хроматографическаяустановка УСК-1, в которой используется сцинтилляци-онный метод измерения радиоктивности (рис. 7).

Для регистрации радиоактивности этой установкой впроцессе приготовления тонкослойных пластин в сорбент

21

Рис. 7. Сцинтилляционная хроматографическая установка УСХ-1.

вводят неорганические сцинтилляторы — светосоставына основе цинка (К-60, К-67, К-71 и др.). Порог чувст-вительности установки УСК-1 составляет 10~8 Ки потритию и 10~9 Ки по 14С.

Установка УСК-1 состоит из сканирующей стойки,измерительной стойки и стойки самопишущего потенцио-метра.

Сканирующее устройство установки позволяет про-сматривать хроматограммы размером до 200X200 ммв двух направлениях со скоростями 1,0; 4,0; 10 и30 мм/мин.

В сканирующей стойке помещается датчик радиоак-тивности — одноканальный сцинтилляционный счетчикс малошумящим фотоумножителем ФЭУ-97, на фотока-тоде которого устанавливается диафрагма размером5 x 5 или 2,5X5 мм.

Вывод информации производится либо в виде анало-говой записи в логарифмическом масштабе, либо на фо-топленку для получения масштабной карты распределе-ния радиоактивности. Фотозапись производится спомощью неоновой лампы, число вспышек которой соот-ветствует числу импульсов, полученных с фотоумножи-теля.

Предусмотрена также возможность вывода информа-ции на вычислитель — интегратор «Вихрь».

Глава 2

СОРБЕНТЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ВТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Для успешного проведения хроматографического ана-лиза существенное значение имеет выбор и подготовканеобходимых сорбентов.

Из многочисленных сорбентов в тонкослойной хро-матографии органических соединений наибольшее упо-требление получили силикагели и окись алюминия.Кроме этих адсорбентов используют природные и синте-тические полимеры органического и неорганическогопроисхождения.

Общие требования к сорбентам, используемым в тон-кослойной хроматографии, обычно сводятся к следую-шему. Сорбент должен быть устойчив по отношению ксреде, в которой он будет использован, обладать макси-мальной способностью к сорбции данного вещества идостаточной механической прочностью, быть доступными относительно дешевым материалом. В настоящее вре-мя общее количество сорбентов, используемых в хрома-тографии, достаточно велико [30].

Ниже приведены краткие характеристики сорбентов,наиболее часто используемых в тонкослойной хромато-графии для анализа и разделения органических соеди-нений.

Силикагель. Силикагель — гидрофильный сорбент,часто применяемый для хроматографии органическихсоединений.

Химические свойства силикагеля обусловлены нали-чием на его поверхности функциональных групп. Нали-чие групп Si—ОН было подтверждено с помощью ИК-спектроскопии [31—39]. Считают, что ОН-группы нахо-дятся на вершинах тетраэдров, выходящих наповерхность скелета силикагеля. При прокаливании при

23

высокой температуре за счет гидроксильных групп у со-седних тетраэдров образуется силоксановая связь. Таккак этот процесс сопровождается изменением взаимнойориентации тетраэдров, то на поверхности возникают на-пряженные «активные кислородные мостики», которыеслужат активными центрами в каталитических реакци-ях. На поверхности могут существовать как удаленныедруг от друга на расстояние, большее 0,3 нм, и поэтомуне взаимодействующие друг с другом «свободные»гидр-оксильные группы, так и расположенные на расстоянии,меньшем 0,3 нм, связанные водородной связью гидр-оксильные группы [31].

Вследствие этого кроме адсорбционных свойств сили-кагель обладает также ионообменными свойствами. Яв-ляясь гидрофильным сорбентом, силикагель обычно ма-ло пригоден для сорбции веществ из водных растворов.Нейтральный силикагель употребляется для разделениянейтральных и основных соединений. Силикагель, обра-ботанный уксусной или щавелевой кислотой, использу-ется для хроматографии соединений кислотного харак-тера.

Структура и пористость силикагеля зависят от спо-соба и условий его получения. Силикагели, выпускаемыеразными промышленными фирмами, обычно довольносильно отличаются по свойствам и размерам пор, рНповерхности и, следовательно, обладают различнымисорбционными свойствами, что делает необходимым про-водить оценку каждой новой партии силикагеля.

Силикагель, применяемый в тонкослойной хромато-графии, имеет обычно размер частиц 0,07—0,10 мм. Та-ким условием удовлетворяет силикагель КСК отечест-венного производства, образующий прочный слой сор-бента на пластинке.

В настоящее время выпускаются сорта силикагеляспециально для тонкослойной хроматографии.

Очень удобны готовые, с нанесенным тонким слоемсиликагеля пластинки для хроматографии в тонких сло-ях (camag D-0, DS-0, DF-0 и другие) с размерами10X10, 20X20, 20X40 см.

В качестве основы чаще всего используют стекло илиалюминиевую фольгу, могут быть использованы и поли-мерные материалы.

24

Толщина слоя сорбента обычно составляет 0,1 —0,2 мм. В качестве связующего вещества для полученияоднородного прочного слоя к сорбенту иногда добавля-ют гипс (5—20%) или крахмал (2—5%), для идентифи-кации разделяемых соединений в слой часто добавляютразличные флуоресцирующие вещества.

Активность силикагеля зависит от содержания в немводы. Чем меньше содержание воды, тем выше актив-ность силикагеля. Ниже приведена шкала активностисиликагеля по Брокману:

АктивностьКоличество воды, % .

I0

II10

III12

IV15

V20

Окись алюминия. В тонкослойной хроматографииорганических соединений окись алюминия как сорбентиспользуется достаточно широко и применяется для ана-лиза различных соединений. Применяют выпускаемуюнашей промышленностью «окись алюминия для хрома-тографии», образующую на пластинке прочный слойсорбента.

Окись алюминия может быть в различных формах:основной, нейтральной и кислой. Основную окись алю-миния употребляют для хроматографии соединений ос-новного характера, таких как амины, основные амино-кислоты и т. п. Кислую окись алюминия используют дляхроматографии веществ кислотного характера, напри-мер карбоновых кислот, кислых аминокислот и других.Нейтральную окись алюминия обычно применяют дляхроматографии из неводных растворов органическихсоединений, таких как предельные углеводороды, альде-гиды, кетоны, спирты, фенолы, зфиры.

По сравнению с органическими сорбентами, напри-мер с целлюлозой, окись алюминия имеет большую тер-моустойчивость. Перед употреблением окись алюминиячасто активируют нагреванием при 130 °С. Активностьокиси алюминия зависит от содержания воды в сор-бенте. Ниже приведена шкала активности окиси алюми-ния по Брокману:

Активность . . I II III IV VКоличество воды 0 3 6 10 15

Активность неизвестного образца окиси алюминияможно определить при помощи хроматографии в тонкихслоях, используя стандартный набор красителей и в ка-

25

честве растворителя — четыреххлористый углерод. Ак-тивность опытного образца определяют, сравнивая полу-ченные значения Rf красителей со значениями, приве-денными в табл. 1.

Т а б л и ц а 1. Значения Rf стандартных красителейв тонком слое окиси алюминия

Краситель

Активность по Брокману

Ш IV

Азобензоли-МетоксиазобензолСудан 1Судан 4/i-Аминоазобензол .

0,590,160,010,000,00

0,740,490,250,100,03

0,850,690,570,330,08

0,950,890,780,560,19

Многие зарубежные фирмы выпускают пластинки стонким слоем окиси алюминия, готовые к употреблениюв тонкослойной хроматографии. В качестве подложкииспользуют обычно силикатное стекло. Толщина слоясорбента составляет 0,10—0,15 мм.

Иногда в слой окиси алюминия добавляют в качест-ве связующего вещества крахмал или гипс.

Кизельгур. Кизельгур — сильнопористый сорбент,довольно часто используемый в качестве носителя прихроматографии. Это вещество дает прочный нейтраль-ный слой сорбента и употребляется для хроматографиикетокислот, оксикислот, лактонов и других органическихсоединений. Иногда кизельгур используют в смеси с си-ликагелем или гипсом.

Целлюлозные порошки. Из органических полимеровприродного происхождения довольно часто используютпорошки целлюлозы.

Удобны и просты в употреблении выпускаемые раз-личными фирмами пластинки с целлюлозами, специаль-но предназначенные для хроматографии в тонких слоях.Наиболее часто используют ДЭАЭ-целлюлозу, эктеола-целлюлозу, PEI-целлюлозу, целлюлозы MN-300 и многиедругие.

В настоящее время известно до 57 разновидностейразличных целлюлоз, используемых в тонкослойной хро-матографии.

26

Порошки целлюлозы образуют обычно достаточнопрочные слои в ряде случаев и без добавления связую-щего материала. В качестве подложки обычно исполь-зуют стекло или алюминиевую фольгу, толщина слоясорбента 0,10—0,20 мм.

Полиамидные сорбенты. В последнее время поли-амидные сорбенты с упехом применяются в тонкослой-ной хроматографии самых различных органических со-единений. Полиамидные сорбенты могут быть полученыв виде белого гигроскопического порошка. Отечествен-ная промышленность выпускает полиамидный сорбенттипа «капрон». За рубежом выпускаются полиамидныесорбенты как в виде порошков, так и в виде готовыхк употреблению пленок или листов.

Полиамидные сорбенты устойчивы к действию мно-гих органических растворителей, но гидролизуются поддействием концентрированных минеральных кислот ищелочей, разрушаются под воздействием окислителей.

Сорбционные свойства полиамидных сорбентов, какотечественных, так и зарубежных, колеблются в доволь-но широких пределах (от 0,31 до 1,15 мг сорбируемоговещества на 100 мг сорбента). Сорбция на полиамидныхсорбентах полностью обратима. Недостатком этих сор-бентов является полидисперсность исходных смол и на-личие примесей.

Техника хроматографии в тонких слоях на полиамид-ных сорбентах существенно не отличается от общепри-нятой.

Для приготовления суспензии сорбента используютразличные органические растворители (этиловый илиметиловый спирт, этилацетат, бензол и другие).

Более подробно техника работы с полиамиднымисорбентами (в том числе и на тонких слоях) описана вмонографии [33], а также в работе [34].

Глава 3

ЭЛЮИРОВАНИЕ ХРОМАТОГРАММОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

После нанесения опытных проб на пластинку с ад-сорбентом последнюю помещают в камеру для хромато-графии, на дно которой предварительно наливают не-большое количество растворителя (подвижная фаза);высота жидкости ~0,5 см.

К настоящему времени предложено много разновид-ностей камер для хроматографии в тонких слоях [2, 13,14, 16, 27]. Удобной в работе оказалась так называемаясэндвич-камера или С-камера, для которой необходимонебольшое количество растворителя. Задней стенкой вС-камере служит пластинка с адсорбентом, а переднейстенкой — стекло такого же размера. При употребленииС-камер не требуется предварительного насыщения ка-меры растворителем и обеспечивается экономия элюи-рующего раствора.

При работе с камерами другого типа необходимопредварительное насыщение камеры парами раствори-теля. Степень насыщения камеры парами растворителяв значительной мере влияет на величину Rf.

При хроматографии органических соединений в тон-ких слоях используют как смешивающиеся, так и несмешивающиеся с водой растворители:

Растворитель Т. кип., °С Смешиваемость

с водой*Метиловый спирт . . . . 67,7 +Этиловый спирт 78,4 -("Ацетон . 56,5 -|-Пиридин 115,3 +Этилацетат 77,1 слабоХлороформ 61,3 —Четыреххлористый углерод 76,8 —Бензол 80,1 —Циклогексан 81,0 —Гептан 98,4 —Гексан 69,0 —

• -\ смешивается; не смешивается.

28

Необходимо обращать внимание на чистоту раство-рителей. Иногда требуется проводить дополнительнуюочистку растворителей.

В зависимости от направления движения раствори-теля и от положения пластинки с сорбентом различаютвосходящую, горизонтальную и нисходящую тонкослой-ную хроматографию, В методе восходящей хроматогра·фии растворитель поднимается по пластинке снизу вверхпод действием капиллярных сил. Пластинку ставят вкамеру и погружают в растворитель приблизительно на0,5—1,0 см.

При работе с закрепленным слоем продвижение рас-творителя на пластинке обычно не должно превышать10—12 см, так как в противном случае наблюдается за-медление движения фронта растворителя, диффузия пя-тен и большие колебания Rf. При работе с незакреплен-ными слоями пластинку обычно ставят под углом 10—15°, длина продвижения растворителя на пластинкеобычно не вызывает больших колебаний Rf.

Метод нисходящей хроматографии характеризуетсяподачей растворителя на пластинку сверху вниз. В этомслучае в верхнюю часть камеры над пластинкой с сор-бентом помещают лоток, содержащий растворитель. Ло-ток соединяют с пластинкой при помощи фильтроваль-ной бумаги. Скорость подачи растворителя при этомможно регулировать, используя фильтровальную бумагуразличной толщины.

При горизонтальной хроматографии в тонких слояхпластинка в камере расположена строго горизонтально.В зависимости от способа подачи растворителя и прие-ма, применяемого для нанесения пробы, могут быть сле-дующие разновидности метода.

1. Метод круговой хроматографии, когда исследуе-мую пробу наносят в центр пластинки с адсорбентом итуда же по каплям добавляют растворитель. После раз-деления получаются кольцевые концентрические зоныразделяемых веществ.

2. Горизонтальная хроматография в камерах; раство-ритель подается в виде полосы.

3. Метод свободного испарения растворителя [35].При этом способе растворитель после прохождения не-которого расстояния (на пластинке) в закрытой камерепереходит в открытое пространство или в открытую ка-

29

меру, где имеет возможность свободно испаряться. Приэтом может быть осуществлено и принудительное испа-рение растворителя, например при помощи вентилятора.

Двумерная хроматография. Иногда при хроматогра-фии в тонких слоях применяют специальную технику сцелью получать лучшее разделение испытуемых веществи добиться концентрирования хроматографируемых сое-динений, например, проводят разделение сначала в од-ном направлении, а затем в другом, перпендикулярномпервому.

Интересен также другой прием, позволяющий скон-центрировать и затем препаративно выделить хромато-графические пятна, полученные после разделения опыт-ной смеси на тонких слоях [36]. Сначала проводитсяобычное разделение в одном направлении. Затем хрома-тографические пятна (видимые, например, в ультрафио-лете) оставляют на пластинке в виде небольших высту-пов, удаляя адсорбент с части пластинки. После этогона выступы с пятнами накладывают небольшие полоскифильтровальной бумаги и производят разделение в на-правлении, перпендикулярном первоначальному (рис. 8).

В некоторых случаях для лучшего разделения смесипроводят двумерную хроматографию, используя плас-тинку с двумя различными адсорбентами. Таким спосо-бом на пластинке с кремневой кислотой и активирован-ным углем была разделена смесь кетонов [16]. Хромато-графию кетонов в одном направлении осуществляли припомощи системы растворителей бензол — этиловый

Бумажныеполосни

Рис. 8. Концентрирование пятен и перевод их на полоски бумаги:а — пластинка с частично удаленным после разделения в одном направлении

слоем сорбента;б — разделение в направлении, перпендикулярном первому, и перевод пятен

на полоски бумаги.

30

эфир — уксусная кислота ( 8 2 : 9 : 9 ) , во втором направ-лении — бензол — этиловый эфир (85 : 15).

Градиентная хроматография. В последнее время втонкослойной хроматографии все шире начинает исполь-зоваться метод градиентной жидкостной хроматогра-фии [9]. По сравнению с обычными условиями хромато-графии использование различных видов градиентапозволяет значительно улучшить разделение анализи-руемой смеси и расширяет возможности этого метода.

В тонкослойной хроматографии могут быть примене-ны следующие типы градиента.

1. Градиент подвижной фазы может быть вызван из-менением концентрации элюирующего раствора (гради-ент концентрации), изменением полярности элюирую-щих растворов (градиент полярности), изменением рНвпроцессе хроматографии (градиент рН).

2. Градиент стационарной неподвижной фазы можетбыть вызван изменением структуры и состава применяе-мых сорбентов; введением в сорбент импрегнирующеговещества с изменением его концентрации; изменениемхарактера активности сорбента (градиент активности).

3. Градиент среды может быть обусловлен изменения-ми температуры, толщины слоя сорбента, изменениямилетучести растворителей при хроматографии, а такженекоторыми другими причинами.

При хроматографии в тонком слое можно использо-вать также и различия в направлении этих градиентовна пластинке по отношению к направлению потока элю-ирующего раствора.

Г р а д и е н т п о д в и ж н о й ф а з ы . В этом случаев процессе хроматографии происходит непрерывное из-менение концентрации (или полярности, или рН) под-вижной фазы.

Градиент концентрации подвижной фазы был исполь-зован [37] для разделения нуклеотидов на ДЭАЭ-целлю-лозе. Для создания градиента концентрации элюирую-щего раствора (раствор бикарбоната аммония) исполь-зовали двухкамерный аппарат, перемешивание раствораосуществляли при помощи магнитной мешалки. На кон-це пластинки находилась бумажная масса для удаленияизбытка элюента, поступающего на пластинку (рис. 9).

Для разделения смеси красителей, а также липидов[38] использован иной тип прибора для обеспечения гра-

31

Рис. 9. Схема градиента концентрации при тонкослойной хромато-графии с использованием подвижной фазы:

/ — камеры для создания градиента; 2 — пластинка с адсорбентом- 3 — бу-мажная масса, для удаления избытка подвижной фазы.

диента концентрации подвижной фазы. Элюирующийраствор из камер (от 3 до 7) через капиллярную трубкуподавался на пластинку с адсорбентом. Используя такойприбор, можно осуществлять градиентную элюцию какна горизонтальной пластинке, так и на пластинке, по-вернутой на некоторый угол, т. е. восходящую хромато-графию.

Г р а д и е н т н е п о д в и ж н о й ф а з ы был приме-нен для разделения смеси кетонов [16]; при этом в ка-честве стационарной фазы были использованы одновре-менно два различных адсорбента (активированный угольи кремневая кислота) на одной и той же пластинке.Примером использования градиента неподвижной фазыявляется также разделение смеси красителей [39] напластинке с силикагелем и кизельгуром, растворитель-бензол.

Градиент неподвижной фазы был применен и дляразделения стероидов [40]. В качестве адсорбента былиспользован силикагель, импрегнированный нитратомсеребра.

Другим примером использования градиента непод-вижной фазы является сочетание на одной пластинкекислых и щелочных слоев адсорбента (рН-градиент) [41].

Г р а д и е н т с р е д ы [42—44]. Для разделения ана- t

лизируемых смесей (в основном, различных красителей)была использована разница в летучести многокомпо- ,нентных растворителей. Различие в скорости испарения 'растворителей в этих условиях и создает градиент. Пла- '»стинку при этом помещают в камеру слоем адсорбентавниз над рядом лотков, содержащих систему раствори-телей с заранее заданным градиентом испарения этихрастворителей; хроматография горизонтальная; адсор-бент — силикагель.32

К этому же типу градиента можно отнести и способтак называемой полизональной хроматографии [45, 46]В этом случае элюирующий раствор состоит из дву>или более растворителей. При хроматографии происхо-дит образование отдельных зон хроматографирования,обусловленное различным сродством растворителей ьадсорбенту. Растворители, обладающие меньшей гид-рофильностью, проходят на пластинке с адсорбентомбольшее расстояние, чем растворители с большой гид-рофильностью.

При этом происходит расслаивание многокомпонент-ной смеси растворителей и опытные пробы поочередноподвергаются воздействию каждого из растворителей.При известной затрате времени можно подобрать наибо-лее оптимальный состав растворителей и осуществитьразделение смеси.

Различные способы хроматографии в тонких слояхнеобходимо оценивать с точки зрения их простоты, бы-строты выполнения и тех результатов, которые можнос их помощью получить. В этом отношении наибольшейпопулярностью пользуется метод восходящей хромато-графии. Нисходящая хроматография применяется гораз-до реже, требует специального устройства, сравнительносложна, трудоемка и поэтому не имеет каких-либо преи-муществ перед восходящей хроматографией. Горизон-тальная круговая хроматография используется редко,обычно для быстрого подбора необходимого раствори-теля.

Определенный интерес представляет хроматографияс непрерывным испарением растворителя. При помощиэтого метода удается проводить разделение соединенийс весьма близкими значениями Rf, метод этот весьмаперспективен.

Применение метода градиентной хроматографии взначительной мере расширяет возможности хроматогра-фии в тонких слоях. Дальнейшее развитие тонкослойнойхроматографии возможно пойдет в этом направлении попути разработки и применения соответствующей техни-ки и аппаратуры. Однако следует отметить, что этот ме-тод более сложен.

Обнаружение и идентификация органических соеди-нений при хроматографии в тонких слоях. Для иденти-фикации органических соединений после разделения2-80 33

методом тонкослойной хроматографии чаще всего прово-дят опрыскивание пластинки с адсорбентом различны-ми реагентами при помощи пульверизаторов различнойконструкции [2, 13, 16].

Опрыскивание пластинок реагентами, как правило,должно проводиться в вытяжном шкафу или в особойкамере, куда помещают пластинку.

После опрыскивания пластинку с сорбентом иногданеобходимо нагревать обычно до 80—110 °С для того,чтобы выявить действие реагента.

Соединения, поглощающие в УФ-области спектра,после разделения их на пластинке могут быть обнару-жены путем опрыскивания пластинки раствором флуо-ресцирующего вещества. Иногда флуоресцирующее ве-щество добавляют к сорбенту.

В качестве реагентов для определения в тонкослой-ной хроматографии органических соединений использу-ют различные вещества [2, 16].

Реагенты общего характера, дающие окраску с мно-гими типами органических соединений, приведены втабл. 2.

Т а б л и ц а 2. Реагенты для обнаружения и идентификацииорганических соединений в тонкослойной хроматографии

Реагент

10%-ный раствор бихро-мата натрия в 50% нойсерной кислоте

10%-ный спиртовой рас-твор фосфорно-молиб-деновой кислоты

0,25%-ный раствор рода-мина Б в этаноле

5%-ный раствор хлорногожелеза в метаноле

Пары иода*

Раствор 50 мг флуорес-цеината натрия в 100 мл50%-ного метанола

Окраска пятен

Светло-голубая наоранжевом фоне

Темно-голубая на жел-том фоне

Розово-лиловая

Темные пятна на беломфоне

Коричневая на бледно-желтом фоне

Флуоресцирующиепятна, обнаруживае-мые при помощикварцевой лампы

Обнаруживаемыесоединения

Органические кис-лоты

Органические кис-лоты, фенолы

Органические кис-лоты

Фенолы

Многие органиче-ские соединения

Ароматические и ге-тероциклическиесоединения

1

* Хромаюграмму на 15 мни помещаюткристаллы иода и вода

34

закрытии сосуд, в котором находятся [

Препаративная хроматография, Техника препаратив-ного выделения из тонких слоев в основном сводится кследующим операциям.

После элюирования хроматограммы на пластинке садсорбентом и идентификации полученных при этом пя-тен или полос интересующий экспериментатора участоксорбента с пятном тем или иным способом переноситсяв сосуд-приемник, где вещество элюируется с сорбента.Сорбент отделяют фильтрованием или центрифугирова-нием, а элюент с веществом после концентрированияподвергается анализу.

Самая ответственная операция в данном случае этоперенос участка сорбента с анализируемым веществомс пластинки в приемник. При этом могут быть потерисорбента, а следовательно, и опытного вещества.

Наиболее простой способ переноса — соскоб Пятнос веществом тщательно, обычно шпателем, соскаблива-ют в приемник. Второй способ — использование различ-ного типа вакуум-перегонки. Для этого участок сорбен-та, подлежащий переносу, предварительно обводят кон-чиком иглы. Затем стеклянный аспиратор или воронкус пористым фильтром одним концом подключают к во-доструйному насосу, а другим концом с насаженной уз-кой трубкой, согнутой под углом, собирают участоксорбента с пятном. Для летучих соединений можно при-менять отгонку в вакууме при нагревании [47].

Предложено также использовать промывание хрома-тограмм растворителем [48].

При использовании гибких пластинок с готовым сло-ем адсорбента один из концов пластинки заостряют. Нарасстоянии 3 см от верхнего (не заостренного) краяпластинки делают сгиб, на расстоянии 1,5 см от первогосгиба делают второй сгиб; адсорбент при этом долженнаходиться на внутренней стороне согнутой пластинки.Пластинку с адсорбентом устанавливают (по сгибам) нанаправляющие стержни. Вся конструкция помещаетсяв камеру для хроматографии с верхним положением лот-ка для растворителя (хроматография нисходящая). Крайпластинки, расположенный ниже первого сгиба, опуска-ют в лоток с растворителем. Растворитель, перемещаясьпо пластинке, элюирует нанесенное на пластинку веще-ство и перемещает его к заостренному концу пластинки.Фракции собирают, передвигая пластинку вдоль направ-

2* 35

ляющих так, чтобы заостренный конец пластинки по-следовательно располагался вдоль ряда пробирок, на-ходящихся на дне камеры.

По другому способу препаративного выделения раз-деляемых веществ промыванием хроматограмм (нисхо-дящий метод) на стеклянную пластинку с адсорбентом,помещенную в камеру, растворитель при помощи бумаж-ного фитиля поступает из сосуда, расположенного вверхней части камеры. Нижний край пластинки опуска-ют в узкий стеклянный желоб, из которого пипеткой со-бирают фракции растворителя для анализа.

По сравнению с колоночной хроматографией препа-ративная хроматография в тонких слоях обладает сле-дующими преимуществами: быстротой выполнения ана-лиза, небольшими объемами растворителей, возможно-стью быстрого подбора систем растворителей, четкостьюи быстротой определения хроматографических зон исравнительной легкостью изоляции выделяемых компо-нентов из пластинок.

К недостаткам препаративной тонкослойной хромато-графии относится сравнительно меньшее количествоопытного материала, которое может быть использованопри хроматографии на пластинках, по сравнению с ко-лонками. Мешает также возможная лабильность хрома-тографируемых соединений, которые могут подвергатьсяизменениям вследствие большой поверхности адсорбци-онного слоя.

Иногда для препаративных целей используют значи-тельно более толстые слои адсорбента, чем при обычнойхроматографии в тонких слоях, от 1,25 до 2,00 см, чтопозволяет существенно увеличить количество хромато-графируемых на такой пластинке веществ [8]. Такойметод был использован для разделения красителей [8].В качестве адсорбента применяли силикагель с добав-кой 20% гипса. Была сконструирована специальная ап-паратура для поддержания пластинок с толстым слоемв вертикальном положении, необходимом для того, что-бы растворитель проникал сквозь слой адсорбента с оди-наковой скоростью.

Был предложен интересный вариант цилиндрическойпрепаративной хроматографии в тонких слоях [49, 50].Хроматографию проводят на наружной поверхностипробирок размером 3,8X30 или 5x50 см. Пробирки

36

погружают в суспензию адсорбента, например смесь си-ликагеля с хлороформом или метиловым спиртом (2 : 1).На 50 г силикагеля обычно требуется 170—180 мл хло-роформа. К адсорбенту в качестве связующего добав-ляют поливинилпирролидон. Вместо силикагеля могутбыть использованы также и порошки целлюлозы. Затемпробирку, покрытую адсорбентом, вынимают, сушат иставят вертикально вверх дном. На поверхность дна про-бирки, покрытую адсорбентом, точно в центр наносяткаплями опытную пробу анализируемого вещества, даютпробе распространиться до сгиба пробирки и опускаютзатем нижний конец пробирки в сосуд с элюирующимраствором. По окончании хроматографии полосы разде-ленных веществ переносят в приемник при помощи со-скоба, держа при этом пробирку с адсорбентом в гори-зонтальном положении.

В препаративной тонкослойной хроматографии боль-шое значение имеет качество применяемого адсорбента,степень его загрязнения. Показано, что возможным ис-точником загрязнений может быть тара, в которую упа-кованы адсорбенты. Так, в хлороформенных вытяжкахиз адсорбентов, упакованных в прорезиненную или пла-стиковую тару, методом спектроскопии обнаружены ор-ганические радикалы. Предпочтительнее использоватьадсорбенты, упакованные в стеклянную тару.

В табл. 3 приведены некоторые из применяемых впрепаративной тонкослойной хроматографии адсорбен-тов. Указано количество воды, требуемое для получения

Т а б л и ц а 3. Характеристики адсорбентов, используемыхв препаративной тонкослойной хроматографии [51]

Адсорбент

Силикагель для ТСХ GF . .Силикагель HFКизельгель DFКизельгур WСиликагель (ТСХ)

Тол

щин

асл

оя, м

м

1,90,91,42,20,9

Мас

са с

лоя,

г

5030205030

Кол

иче

ство

воды

, м

л

7278488135

Кол

иче

ство

мет

ило

вого

спи

рта,

мл

5

39

Тем

пер

атур

асу

шки

, °С

105105105105

комн.

Вре

мя

суш

ки,

мин

45454580

1 день

• Добавка метилового спирта к адсорбционной массе предохраняет слой отрастрескивания при высушивании.

37

адсорбционной массы, время сушки слоя и температура(размер пластинок 6X12 см).

Влияние различных факторов на воспроизводимостьрезультатов тонкослойной хроматографии. По сравне-нию с хроматографией на бумаге Rf в тонкослойной хро-матографии в значительно большей степени зависит отусловий опыта [16]. Поэтому в тонкослойной хромато-графии органических соединений часто применяют сви-детели — эталонные вещества с заранее известной под-вижностью на данном сорбенте, т. е. с известным значе-нием Rf. Свидетели наносят на пластинку рядом с пят-ном опытного вещества. Даже при условии строгой стан-дартизации опытов Rf является относительной величи-ной и сильно зависит от условий эксперимента.

Отмечалось [52], что для получения воспроизводимыхрезультатов при хроматографии в тонких слоях при опи-сании экспериментов желательно указывать вид и типхроматографических камер, материал, из которого этикамеры сделаны, способ приготовления адсорбционныхслоев, тип и качество адсорбента, вид и размер подлож-ки (стекло, пластик и т. п.), толщину слоя сорбента,способ его активации, условия сушки сорбционного слоя,количество хроматографируемых пластинок в камере,способ и метод нанесения на пластинку с сорбентоманализируемого вещества (пятно, полоса), количествоиспытуемого вещества и положение стартовой линии,способ хроматографирования (восходящая, нисходящаяили горизонтальная хроматография), состав применяе-мых растворителей, степень насыщения камеры раство-рителем, температуру и влажность, при которых прово-дится разделение, способ идентификации анализируемыхвеществ на пластинке (погружение, опрыскивание илидр.), использованные для этой цели реагенты, цвет иустойчивость окрашенных пятен, чистоту и квалифика-цию химических реактивов, а также другие детали экс-перимента.

Выполнение этих требований в значительной мереувеличит воспроизводимость опытов и стабильность зна-чений Rf. В этом случае Rf будет являться важной ха-рактеристикой хроматографируемых соединений.

Существенное значение при хроматографии в тонкихслоях имеет качество адсорбента.

Обычно тонкослойную хроматографию органических

38

соединений проводят при комнатной температуре (18—20°С). При прочих равных условиях температура обыч-но не оказывает заметного влияния на разделение опыт-ной смеси. Однако, показано [53], что между изменениемвлажности при хроматографии и изменением температу-ры существует связь: с увеличением относительной влаж-ности от 45 до 65% в интервале температур 20—60 °С сростом температуры и степени влажности повышаетсятакже и Rf хроматографируемых соединений.

На подвижность хроматографируемых соединений втонких слоях может оказать влияние также и толщинаслоя адсорбента [54, 55].

Количественный анализ в тонкослойной хроматогра-фии органических соединений. В настоящее время коли-чественная хроматография в тонком слое сорбента явля-ется общепринятым методом анализа различных смесейвеществ.

Существуют два основных способа количественногоанализа в тонкослойной хроматографии органическихсоединений.

Первый способ — это оценка результатов хромато-графии непосредственно на пластинке, второй — пере-нос пятна с пластинки в приемник с последующей элю-цией вещества с сорбента и определением его при помо-щи общепринятых методов количественного анализа —·колориметрических, спектрофоюметрических и других.

М е т о д ы о п р е д е л е н и я а н а л и з и р у е м ы хс о е д и н е н и й н е п о с р е д с т в е н н о на п л а с т и н -к е. Определение площади пятен. В этом методе обычнос контрастных пятен снимают фотокопии и площадь пят-на измеряют при помощи планиметра или же переносятконтуры пятна на прозрачную бумагу (наложением)и измеряют площадь при помощи миллиметровой бу-маги.

Для оценки площади пятен строят калибровочнуюкривую. Зависимость между площадью пятна и логариф-мом количества искомого вещества связана уравнени-ем {12]:

где g—количество вещества; Q — площадь пятна; а и 6 — кон-станты.

Эта зависимость справедлива при содержании веще-ства в пятне 1—80 мкг.

39

Помимо методов, основанных на измерении площадипятна, существуют способы количественной оценки сое-динений по размерам пятен [56]. В этих способах учиты-вают только ширину и длину пятен или же максималь-ный и минимальный диаметры пятен и оптическую плот-ность в центре пятна [57].

Расчет проводят по формулеg = KADd

где g — количество измеряемого вещества; К — коэффициент про-порциональности; А — оптическая плотность в центре пятна; D и d —максимальный и минимальный диаметры пятна.

Способ обладает хорошей чувствительностью и по-зволяет определять соединения с количеством веществадо 1СН1—10"9 мкг. Он основан на допущении, что макси-мум оптической плотности в центре пятна прямо про-порционален количеству измеряемого вещества. Дляизмерения пятен по этому методу [57] используют спект-рофотометр, соединенный с источником света и микро-скопом.

Следует, однако, отметить, что использование специ-альной аппаратуры существенно повышает чувствитель-ность метода, однако увеличивает сложность метода иделает его мало экономичным для единичных анализов.

В целом, пределы ошибок, допускаемых при исполь-зовании методов с измерением площади или размеровпятен обычно составляют 5—6%· На размер ошибки мо-жет, например, оказывать влияние неравномерностьраспределения вещества в пятне и некоторые другиепричины.

ДенетΌметрический метод. Денситометрический ме-тод связан с определением интенсивности проходящегоили отраженного света, пропускаемого через пластин-ку. Этот метод требует применения особых приборов —денситометров. Между количеством определяемого ве-щества и величиной и плотностью окраски пятна должнабыть линейная зависимость.

Существенное значение при денситометрии имеет рав-номерная окраска пятен, стандартизация условий хро-матографии, соответствие размеров пятен длине щелиденситометра и т. д.

Достоинствами метода являются быстрота измере-ний, отсутствие каких-либо дополнительных операций,

40

которые могут привести к загрязнению измеряемого ве-щества, относительная точность метода. К недостаткамотносятся необходимость соблюдения различных требо-ваний к подготовке хроматографируемых веществ, пос-кольку воспроизводимость опытов в значительной степе-ни зависит от характера и интенсивности окраски пят-на. На результатах опытов отражаются также тип итехнические данные прибора, используемого для ден-ситометрии.

Обычно ошибки при использовании денситометриче-ского метода при хроматографии в тонких слоях лежатв пределах 5—8%. Ошибки эти могут быть вызваны ря-дом причин, например различием в скорости перемеще-ния пластинки с сорбентом в приборе (при замедленномпередвижении пластинки площадь вычерчиваемого пи-ка больше), а также тем, что невозможно учесть коли-чество рассеянного света, попадающего на пластинку.Кроме того, в зависимости от метода измерения (в про-ходящем или отраженном свете) показания денситометрамогут быть различны в зависимости от типа прибора.

Ошибки при денситометрии могут возникнуть такжев процессе самой хроматографии в тонких слоях, нап-ример при измерении объемов опытного вещества принанесении его на пластинку Точность определения за-висит и от толщины слоя адсорбента на пластинке,влажности слоя, присутствия посторонних веществ, ха-рактера растворителей и ряда других факторов.

Т а б л и ц а 4. Зависимость площади пика от толщины слоясорбента и метода измерения [55]

Толщина слоясорбента, мм

0,130,300,390,470,52

Площадь пика, см2

метод отражения

13,1311,3810,5410,01

9,66

метод пропускания

15,0818,5020,5322,0522,31

Зависимость между толщиной слоя сорбента и пло-щадью пика, вычерчиваемого денситометром при раз-личных методах измерения, показана в табл. 4.

41

При работе по методу пропускания света через плас-тинку с увеличением толщины слоя адсорбента площадьпика, вычерчиваемого денситометром, увеличивается,тогда как при использовании метода отражения с уве-личением толщины слоя площадь пика уменьшается (см.табл. 4).

Влажность адсорбционного слоя также может ска-зываться на площади пиков при денситометрии. Изме-нение относительной влажности на 3% вызывает изме-нение площади пика приблизительно на 1%.

Наконец, наличие посторонних примесей в опытнойсмеси также может вызывать изменение формы и разме-ра пятна и, следовательно, отразиться на показанияхденситометра.

Оценка площади пятен при помощи денситометрии[58] использована при разделении пентапептидов в тон-ком слое силикагеля на микропластинках размером 7,5 χХ7,5 см.

Прямая спектрофотометрия на пластинках. Прямыеспектрофотометрические измерения опытных веществ не-посредственно на пластинках с адсорбентом после хро-матографического разделения в значительной степениувеличивают возможности тонкослойной хроматографии.

Прямая спектрофотометрия на пластинке являетсябыстрым и чувствительным методом оценки. Следует од-нако заметить, что для этого метода необходимы специ-альные спектрофотометры, желательно с автоматиче-ским отсчетом измерений. В современных спектрофото-метрах такого типа измерения пятен могут проводитьсякак при помощи метода пропускания, так и методом от-ражения волн.

Пластинки, подвергаемые спектрофотометрии, по-мещают горизонтально на специальную подставку, кото-рая может передвигаться с постоянной скоростью по нап-равлению к щели, пропускающей свет определеннойдлины волны на слой сорбента на пластинке.

В настоящее время для количественной оценки ре-зультатов тонкослойной хроматографии выпускают спе-циальные приборы — спектроденситометры, обеспечива-ющие непосредственное количественное сканирование ре-зультатов хроматографического процесса в тонких слоях.Более подробное изложение количественных аспектов42

спектроденситометрии в тонкослойной хроматографииможно найти в работе [59].

По сравнению с денситометрией, где пятна на плас-тинке необходимо предварительно окрашивать специ-альными реагентами, при спектрофотометрии пятна напластинке обычно невидимы.

Спектрофотометрические измерения можно с успехомиспользовать для количественного определения всех сое-динений, поглощающих в УФ-области спектра при дли-нах волн, соответствующих их максимуму поглощения.Чувствительность метода прямого спектрофотометриче-ского измерения по сравнению с методом экстрагирова-ния вещества с адсорбента приблизительно в десять разбольше, сам метод требует значительно меньшего вре-мени.

Ошибки в методе прямого спектрофотометрированияна пластинках составляют 4—6%.

Прямая количественная флуорометрия на пластин-ках. Непосредственное количественное определение напластинках пятен флуоресцирующих соединений можетпроводиться как методом измерения флуоресценции, таки методом гашения флуоресценции, основанным на га-шении флуоресценции вещества, предварительно нанесен-ного на сорбционный слой. Ошибки первого метода на-ходятся приблизительно в пределах 3—5%, второго —5-8%.

Для измерений флуоресценции исследуемого вещест-ва на пластинке применяют специальные приборы —флуорометры. В последнее время начинают использо-вать аппараты, сочетающие флуорометрический методопределения с техникой денситометрии, — флуороденси-тометры, обеспечивающие непосредственную флуоромет-рическую оценку результатов хроматографии в тонкихслоях.

К о л и ч е с т в е н н а я х р о м а т о г р а ф и я в тон-ких с л о я х с и с п о л ь з о в а н и е м м е т о д а э л ю -и р о в а н и я . Метод количественного переноса сорбентас анализируемым веществом с пластинки в приемник споследующим элюированием вещества довольно широ-ко применяется в тонкослойной хроматографии.

Считают [14], что этот метод дает наиболее верныерезультаты при количественном анализе в тонком слое.

43

Однако метод элюирования очень трудоемок и связанс неизбежными потерями исследуемого вещества.

После окончания хроматографического процесса напластинке и проявления пятен, анализируемые пятнавместе с адсорбентом количественно переносят в прием-ник. Затем вещество вымывают с адсорбента соответст-вующим растворителем и после центрифугирования ко-личественно переносят в кювету для измерения.

При применении этого метода необходимо учитыватьряд факторов, которые могут вызвать ошибки в изме-рении опытной пробы.

Важное значение в методе элюирования имеет чис-тота адсорбента. Примеси в адсорбенте могут перейтив измеряемый раствор и повлиять на результаты коло-риметрических или спектрофотометрических измерений.

Следы железа в силикагеле удаляют, обрабатываяадсорбент кипящим этиловым спиртом, содержащим сер-ную кислоту, или пропуская раствор, содержащий мети-ловый спирт и концентрированную соляную кислоту(9:1). Иногда примеси удаляют, пропуская через плас-тинку с адсорбентом 20- или 80%-ные растворы этило-вого или метилового спирта и потом высушивая плас-тинку при 110°С.

Определенное значение имеет также качество ад-сорбционных слоев на пластинке. Слои должны бытьоднородными и по возможности плотными. Поврежде-ние слоев адсорбента, например при нанесении проб,вызывает обычно значительное изменение размеров пят-на при хроматографии, затрудняет количественный пере-нос пятен с пластинки.

Применяемые в тонкослойной хроматографии рас-творители должны быть свободными от примесей. Суще-ственное значение имеет и полнота удаления летучихрастворителей при сушке пластинок после хроматогра-фии.

После извлечения соединение подвергают анализу.Чаще всего для этого используют спектрофотометриче-ские, колориметрические, а также флуорометрическиеметоды.

Влияние различных факторов (толщины слоя, разме-ра зерен сорбента, способа нанесения проб и т. д.) наточность измерений хроматографируемых соединений

44

спектрофотометрическими методами изучено в работе[60].

Ошибки, возникающие вследствие переноса сорбентас веществом, обычно зависят от того, каким способомпроизводится измерение: при помощи спектрофотомет-рии, колориметрии или методом флуоресценции. При ко-лориметрических способах измерения элюированного ве-щества колебания ошибки измерений составляют 1,0—5,2% [21], для спектрофотометрии — в среднем около5,3%, тогда как для флуорометрического метода изме-рений при переносе вещества с тонких слоев — 3,5—9%,а в некоторых случаях 15%.

Ошибки при методе переноса пятен могут вызывать-ся самыми различными причинами: неодинаковым объе-мом проб вещества, наносимого на пластинку с адсор-бентом, повреждением поверхностного слоя сорбента,неполным элюированием анализируемых соединений садсорбента.

При хроматографии в тонких слоях к адсорбентучасто добавляют различные вещества для получения бо-лее прочных закрепленных слоев. Присутствие таких ве-ществ, если они переходят в элюирующий раствор, так-же может быть причиной дополнительных ошибок.

Учет всех факторов, влияющих на количественное оп-ределение анализируемых соединений при примененииметода элюирования в тонком слое, может в значитель-ной степени способствовать успеху эксперимента.

Большинство экспериментаторов в настоящее время,по-видимому, отдает предпочтение методу непосредст-венного количественного определения соединений напластинке. Этот метод позволяет получать более точныерезультаты и в относительно более короткое время.

Комбинированное использование тонкослойной хро-матографии в сочетании с некоторыми другими метода-ми. Весьма интересные перспективы открываются прииспользовании метода тонкослойной хроматографии всочетании с различными другими методами и способа-ми идентификации соединений.

Хорошие результаты дает сочетание методов тонко-слойной и колоночной хроматографии [61], так назы-ваемая пилот-техника. Благодаря быстроте определенияисследуемых компонентов, экономичности, наглядностихроматография в тонких слоях может быть использова-

46

на для предварительного подбора и оценки сорбентов,элюирующих растворов — растворителей, а также длявыбора условий работы с последующим применениемих в колоночной хроматографии.

Удачное сочетание тонкослойной и газовой хромато-графии было продемонстрировано в ряде работ [62—64].Тонкослойная хроматография может быть использованав качестве дополнительного метода для оценки и иден-тификации хроматографических пиков, получающихсяпри газо-жидкостной хроматографии.

Значительный интерес представляет также техникаидентификации различных хроматографических зон натонких слоях и корреляция этих зон с точками кипениясоединений при газовой хроматографии.

Интересные результаты дает сочетание тонкослой-ной хроматографии с электрофорезом [65]. Метод при-меним также и в колоночной хроматографии. В качест-ве адсорбента был использован кизельгель. Сочетаниеэтих методов при разделении смеси ароматических угле-водородов дает значительный выигрыш во времени. Так,при обычной тонкослойной хроматографии на разделе-ние смеси пиренов затрачивается 60 мин, тогда как приналожении на пластинку электрического поля достаточ-но всего 4 мин

Недавно был предложен новый метод сканированиятрубчатых тонкослойных хроматограмм [66]. Кварце-вые трубки покрывались изнутри слоем силикагеля илисмеси силикагеля и окиси меди с толщиной слоя 0,01 —0,04 мм. После хроматографирования на таких трубкахисследуемых соединений через трубку пропускали токочищенного воздуха или смеси азота и кислорода (в от-ношении 4:1) и проводили сжигание, последовательноперемещая трубки через кольцевую печь при 600—800 °С.

Окончательный анализ продуктов проводили хрома-тографическим методом с использованием плазменно-ионизационного детектора. Установка, по-видимому, мо-жет быть использована в условиях промышленного про-изводства.

Безусловно перспективным оказалось сочетание тон-кослойной хроматографии с радиоизотопным методом.В этом случае высокая чувствительность радиоизотоп-ного метода удачно сочетается с большой избиратель-

46

ностью тонкослойной хроматографии. На одной пластин-ке можно успешно разделить с помощью однократногохроматографирования достаточное количество смеси ис-следуемых веществ для анализа.

Для обнаружения радиоактивных веществ на плас-тинке чаще всего используют метод радиоавтографии.Недавно была предложена [67] интересная комбина-ция хроматографической камеры со счетчиком Гейге-ра—Мюллера в качестве детектора для счета радиоак-тивных частиц при анализе радиоактивных соединенийна тонкослойных хроматограммах.

Глава 4

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

Разделение смесей органических кислот связано сзначительными экспериментальными трудностями. Хими-ческие способы разделения органических кислот слож-ны, в достаточной степени трудоемки и не всегда при-водят к положительным результатам.

В последнее время для анализа органических кислотразличных классов начинает с успехом применяться ме-тод хроматографии в тонких слоях. Он отличается отдругих методов разделения органических кислот быст-ротой выполнения анализа и высокой чувствительностью,особенно если использовать ультрамикрохроматографию.

Несмотря на перспективность метода тонкослойнойхроматографии для анализа и разделения органическихкислот общее количество экспериментальных работ вэтом направлении пока еще сравнительно невелико.

Одноосновные предельные карбоновые кислоты. Ме-тодами хроматографии в тонких слоях исследовали сле-дующие алифатические карбоновые кислоты: муравьи-ную (Ci), уксусную (С2), пропионовую (С3), масляную(С4), валериановую (Сб), гексановую (С6), энантовую(С7), октановую (С8), пеларгоновую (Сэ), декановую(Сю), ундекановую (Сц), лауриновую (С12), миристино-вую (Си), пальмитиновую (Ci6), стеариновую (С]8),арахиновую (Сго).

В качестве адсорбентов для анализа и разделениямонокарбоновых органических кислот использовали си-ликагель, кизельгур, а также окись алюминия, в отдель-ных случаях были применены полиамидные сорбенты.

В большинстве случаев на таких адсорбентах, каксиликагель и окись алюминия, при увеличении числа уг-леродных атомов в молекуле кислоты увеличивается зна-

48

чение Rf, т. е. подвижность кислот увеличивается с рос-том их молекулярной массы.

Следует, однако, отметить, что подобная зависи-мость наблюдается не для всех адсорбентов [68, 69].Так, на полиамидных сорбентах значение Rf уменьша-ется с увеличением числа углеродных атомов в молеку-ле кислоты.

Т о н к о с л о й н а я х р о м а т о г р а ф и я на сили-к а г е л е . При тонкослойной хроматографии предельныходноосновных карбоновых кислот с числом углеродныхатомов в молекуле от двух до двенадцати на силикаге-ле наблюдалось увеличение подвижности кислоты с уве-личением числа углеродных атомов в молекуле. В каче-стве элюирующих растворов применяли различные сис-темы растворителей.

Значения Rf эфиров некоторых кислот при разделе-нии на силикагеле в системе бензол—этилацетат (20:1)[70] приведены ниже:

Кислота Rt Кислота Rt

Муравьиная 0,20 Валериановая 0,40Уксусная 0,19 Гексановая 0,43Пропионовая 0,22 Октановая · 0,45«-Масляная 0,32 Пеларгоновая 0,46

Для разделения кислот в качестве растворителя бы-ла использована [71] также система метилацетат—ам-миак (2,5%-ный) (95:5), причем в одном случае рас-творитель использовали сразу после приготовления (I),а в другом — спустя 24 ч (II). Значения Rf, полученныепри этом, приведены ниже:

Кислота

Муравьиная 0,05Уксусная 0,10Пропионовая 0,15н- Масляная 0,24м-Валериановая 0,39Гексановая 0,52Энантовая 0,55Октановая 0,58

Отчетливо видно увеличение значения Rf с ростомчисла углеродных атомов в молекуле кислоты; четковидно и влияние растворителя. Метод достаточно чувст-вителен. Может быть определено до 5 мкг вещества.

49

«t

00000000

II,07,13,30,40,50,57,60,66

Т о н к о с л о й н а я х р о м а т о г р а ф и я на ки-з е л ь г у р е . Кизельгур, импрегнированный диэтиленгли-колем (I) и триэтиленгликолем (II) был использован вкачестве адсорбента для хроматографии в тонком слоеорганических насыщенных кислот с числом атомов угле-рода от 2 до 12 [72]. В качестве смешанного раствори-теля использовали диизопропиловый эфир — петролей-ный эфир — четыреххлористый углерод — муравьинаякислота — вода (50:20:20:8:1). Ниже приведены значе-ния Rf.

RtКислота '

Уксусная 0,15 0,09Пропионовзя 0,25 0,13Масляная 0,34 0,19Валериановая 0,43 0,26Гексановая 0,52 0,33Энантовая 0,63 0,43Октановая 0,73 0,53Пеларгоновая 0,84 0,63Декановая 0,92 0,76Ундекановая 0,94 0,87ЛауриноЕая 0,96 0,96

Из приведенных данных видно, как изменение в об-работке одного и того же адсорбента отражается назначении Rf.

Для разделения жирных кислот (муравьиной, уксус-ной, пропионовой, масляной и капроновой) был предло-жен метод разделения амидов этих кислот в тонком слоеокиси алюминия [73] на пластинках размером 2,6ХХ7,6 см.

Для получения амидов жирные кислоты при помощи хлористоготионила переводили в хлорангидриды, а затем обрабатывали арома-тическим амином. Из-за летучести низших жирных кислот для полу-чения амидов использовали их соли.

Лучшие результаты были получены при использова-нии в качестве растворителя смеси бензола с изоамил-ацетатом (4:1). Продолжительность разделения 7—10 мин. Наименьшая длина пробега на пластинке былау муравьиной кислоты (Ci), затем шла уксусная кисло-та (Сг), пропионовая (Сз), масляная (С4). Наибольшейдлиной пробега обладала гексановая кислота (С6).

Т о н к о с л о й н а я х р о м а т о г р а ф и я на по-л и а м и д н ы х с м о л а х . Для разделения высших жир-ных карбоновых кислот с числом углеродных атомов отСю до Сго были использованы полиамидные смолы [68],

50

а в качестве растворителей — смесь метанол—ацетон—вода (40:40:20).

В качестве объектов для анализа использовали дека-новую (Сю), лауриновую (С12), миристиновую (Сн),пальмитиновую (Ci6), стеариновую (Cis) и арахиновуюкислоты (С2о)·

Здесь также наблюдалась определенная зависимостьмежду положением пятна на пластинке с полиамиднымсорбентом и числом атомов углерода исследуемой кис-лоты. Наименьшая длина пробега на пластинке отмеча-лась для арахиновой кислоты, т. е. для кислоты с наи-большим числом углеродных атомов, наибольшейдлиной перемещения обладала декановая кислота, со-держащая наименьшее число углеродных атомов (Сю).

Таким образом, хроматография на полиамидных сло-ях позволяет также осуществить успешное разделениесмеси ряда высших жирных кислот. Однако на полиа-мидном сорбенте с увеличением числа углеродных ато-мов в молекуле подвижность кислот уменьшается [69].

Ниже приведены значения RCT ДЛЯ ОДНООСНОВНЫХ на-сыщенных карбоновых кислот при хроматографии в тон-ком слое полиамида [в системе метанол—вода (9:1)],окиси алюминия [метанол—хлороформ—диэтиламин(1:99:0,5)] и силикагеля [метанол—хлороформ—диэтил-амин (2:98:0,5)]:

Кислота

Уксусная . .ПропионоваяМасляная . .ВалериановаяГексановая .Энантовая . .Октановая . .ПеларгоноваяДекановая .Лауриновая .МиристиноваяПальмитиноваяСтеариновая .

2,102,00

1,501,401,301,101,000,840,660.460,35

0,080,150,200,230,270,290,310,340,350,370,390,420,45

0,050,140,220,290,350,400,420,450,470,480,510,520,55

51

Как видно из приведенных данных, на силикагеле иокиси алюминия подвижность кислот растет с увеличе-нием молекулярной массы, на полиамидном сорбентенаблюдается обратная зависимость.

Сравнительная оценка способов разделения одноос-новных карбоновых кислот (пальмитиновой, линолевой,олеиновой, стеариновой, арахиновой) методами тонко-слойной (на силикагеле) и газо-жидкостной хроматогра-фии показала, что оба метода дают близко совпадаю-щие результаты [74]; таким образом, метод тонкослой-ной хроматографии может быть использован вместоболее сложного метода газо-жидкостной хроматографии.

Двухосновные предельные карбоновые кислоты. Этикислоты были успешно разделены при помощи тонко-слойной хроматографии на кизельгеле. Значения Rf дляразличных систем растворителей приведены ниже: [I —бензол—метанол—ледяная уксусная кислота (45:8:4),II — бензол — диоксан — ледяная уксусная кислота(90:25:4)]:

R;Кислота '

Щавелевая 0,0 0,0Малоновая 0,13 0,05Янтарная 0,28 0,23Глутаровая 0,35 0,28Адипиновая 0,42 0,34Пимелиновая 0,47 0,36Азелаиновая 0,53 0,43Себациновая 0,55 0,47

Проводилось также разделение двухосновных карбо-новых кислот в тонких слоях кизельгура [76]. ЗначенияRf приведены ниже:

Кислота R j Кислота R,

Щавелевая 0,14 Пимелиновая 0,55Малеиновая 0,21 Азелаиновая 0,82Глутаровая 0,36 Себациновая . . . . . . 0,92Адипиновая 0,43

Как на кизельгеле, так и на кизельгуре подвижностьдвухосновных карбоновых кислот увеличивается с рос-том длины углеродной цепи и увеличением молекуляр-ной массы кислоты.

Оксикислоты, кетокислоты и непредельные карбоно-вые кислоты. Оксикислоты, кетокислоты и непредельные

52

кислоты могут быть легко разделены при помощи дву-мерной хроматографии в тонких слоях. В качестве сор-бента использовали целлюлозу MN-300 [77] и целлюло-зу СС-41 [78].

При хроматографии на целлюлозе MN-300 в направ-лении I были использованы системы растворителей: про-панол — цинеол — муравьиная кислота — вода (50:50::20:5), а в перпендикулярном направлении II — 96%-ныйэтанол — вода — 25%-ный раствор аммиака (100:12:16).Значения Rf в обоих системах растворителей приведеныниже:

R;Кислота '

Фумаровая 0,89 0,27Янтарная 0,77 0,22Молочная 0,71 0,46α-Кетоглутаровая 0,54 0,23Яблочная 0,43 0,15Лимонная 0,32 0,06

Тонкослойная двумерная хроматография этих жекислот на целлюлозе СС-41 при помощи систем раство-рителей: фенол — вода — муравьиная кислота (75:25:1)в направлении I и диэтилового эфира — муравьиной кис-лоты — воды (7:2:1) в направлении II дает следующиезначения Rf [78]:

Кислота «fI II

Фумаровая 0,96 0,66Янтарная 0,81 0,71α-Кетоглутаровая 0,70 0,59Яблочная 0,54 0,54Лимонная 0,38 0,42

Для двумерной хроматографии карбоновых кислотна силикагеле использованы следующие системы раство-рителей: в направлении I — эфир (водн.) — муравьи-ная кислота (7:1), в направлении II — хлороформ — ме-танол—муравьиная кислота (80:20:1) [79]. ЗначенияRf приведены ниже:

RfКислота I II

Фумаровая 0,95 0,60Янтарная 0,87 0,59Молочная 0,82 0,55Яблочная 0,56 0,31Лимонная 0,44 0,14

53

В целом, поведение рассмотренных выше карбоновыхкислот при хроматографии в тонких слоях на силикаге-ле и порошках целлюлозы, в разных системах раство-рителей может быть, по-видимому, связано с длиной ихуглеродных цепей.

Увеличение длины углеродной цепи приводит к уве-личению сорбируемости, уменьшению подвижности кис-лот и уменьшению Rf. За исключением отдельных случа-ев, общая тенденция к уменьшению Rf для кислот сбольшой длиной углеродной цепи выражена, по-видимо-му, в достаточной степени.

К е т о к и с л о т ы . Была показана возможность ус-пешного разделения кетокислот на окиси алюминия[80]. Обычно для анализа α-кетокислот используют хро-матографию на бумаге; при этом разделение а-кетокис-лот представляет определенные трудности. Часто дляэтой цели применяют также газовую хроматографию ке-токислот в виде их метиловых эфиров, получение кото-рых трудно осуществить с количественным выходом.

Принцип данного метода основан на хроматографииα-кетокислот в виде производных хиноксалона, образу-ющихся при взаимодействии α-кетокислот с о-фенилен-диамином [81].

В качестве объектов были использованы смеси глиок-силовой, пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот.

Хиноксалон, полученный из глиоксиловой кислоты,на хроматограммах дает два пятна: хиноксалон (пятнос большим значением Rf) и хиноксалин (пятно с мень-шим значением Rf).

Были использованы различные системы растворите-лей: ацетонитрил — аммиак (5:1), диэтиловый эфир —пропанол — аммиак (3:10:8), четыреххлористый угле-род— изопропанол — аммиак (1:1,5:1), изопропанол —бензол (1:7), бензол — изопропанол·—уксусная кисло-та (12:10:1), н-амиловый спирт — муравьиная кислота(30:1). Во всех системах растворителей наибольшимзначением Rf обладала пировиноградная кислота, наи-меньшим — α-кетоглутаровая кислота.

В качестве подложек для сорбционной массы ис-пользовали предметные микроскопические стекла.

Микротонкослойная хроматография хиноксалонов да-ет возможность анализировать кетокислоты даже в та-54

ких смесях, где они находятся в микроколичествах, неприбегая к их выделению.

Предложенная методика может быть использованаи для количественного определения кетокислот. Воспро-изводимость метода ± 5 % .

Поведение пировиноградной, глиоксиловой и а-кето-глутаровой кислот при хроматографии в тонком слое си-ликагеля в смеси эфир (водн.) — муравьиная кислота(7:1) имеет несколько иной характер. Ниже приведеныдля сравнения значения Rf для этих кислот при хрома-тографии в тонких слоях окиси алюминия (четыреххло-ристый углерод—изопропанол — аммиак, 1:2,5:1) [73]и силикагеля [эфир (водн.) —муравьиная кислота, 7:1],[79]:

,. Окись _Кислота алюминия Силикагель

Пировиноградная . . . . 0,65 0,86а-К.етоглутаровая . . . . 0,41 0,74Глиоксиловая 0,53 0,37

Разделение изомеров некоторых ненасыщенных орга-нических кислот. При помощи хроматографии в тонкихслоях оказалось возможным успешное разделение цис-и транс-изомеров некоторых ненасыщенных дикарбоно-вых кислот, например фумаровой и малеиновой, крото-новой и изокротоновой, цитраконовой и мезаконовой[82]:

НООС—С—Η Η—С-СООН

Η—С—СООНфумаровая

кислота

сн3—с-нН—С—СООН

кротоноваякислота

СН3—С—СООН

Н—С—СООНцитраконовая

кислота

Н—С—СООНмалеиновая

кислота

н—с—сн3

Н—С-СООНизокротоновая

кислота

СН 3 -С—СООНII

НООС—С—Ηмезаконовая

кислота

Значения Rf этих кислот при тонкослойной хромато-графии на силикагеле в различных .системах растворите-лей [I — бензол — метанол — ледяная уксусная кислота

55

(45:8:4) и II — бензол — диоксан — ледяная уксуснаякислота (90:25:1)] приведены ниже:

Кислота I 11

Фумаровая 0,43 0,22Малеиновая 0,13 0,06Кротоновая 0,73 0,73Изокротоновая 0,70 0,71Мезаконовая 0,55 0,53Цитраконовая 0,18 0,07

Как видно из приведенных данных, при хроматогра-фии в тонких слоях транс-формы карбоновых кислогимеют большие значения Rf, чем цыс-формы.

Ароматические карбоновые кислоты. Существуютсравнительно немногочисленные данные по тонкослой-ной хроматографии ароматических карбоновых кислот.В качестве адсорбентов использовали силикагель иокись алюминия.

На силикагеле удалось отделить бензойную кислотуот ее метилированных производных — толуиловых кис-лот [83]. В качестве элюирующего раствора использова-ли бензол — пиридин (85:15); хроматография восходя-щая. После разделения кислот избыток растворителяудаляли в течение 1 ч при 115°С. Для проявления пятенпластинки обрабатывали 1%-ным раствором бромкрезо-лового зеленого в 90%-ном этаноле. Значения RCT ЭТИХкислот (по отношению к бензойной кислоте, подвиж-ность которой принята за единицу) приведены ниже:

Кислота ст Кислота ^ с т

п-Толуиловая 1,22 о-Толуиловая 1,18м-Толуиловая 1,19 Бензойная 1,00

При хроматографии на тонких слоях силикагеля изо-меры толуиловой кислоты имеют довольно близкие под-вижности, но хорошо отделяются от бензойной кислоты.

При помощи тонкослойной хроматографии на сили-кагеле в системе растворителей бензол — пиридин (85::15) были разделены изомерные оксибензойные кислоты[83].

Значения RCT ДЛЯ ЭТИХ КИСЛОТ (ПО отношению к бен-зойной) кислоте приведены ниже:

56

Кислота Кст

о-Оксибензойная (салициловая) . 0,37Λΐ-Оксибензойная 0,50п-Оксибензойиая 0,60

На тонких слоях окиси алюминия хорошо происхо-дит разделение дикарбоновых ароматических кислот(фталевая кислота и ее изомеры), а также а- и β-наф-тойных кислот [84]. Значения Rf этих кислот при ис-пользовании системы растворителей метанол — диметил-формамид — 25%-ный раствор аммиака (1:2:2) приве-дены ниже:

Фгалевая кислота 0,0'Изофталевая кислота 0,ЦТерефталевая кислота 0,2α-Нафтойная кислота 0,5^β-Нафтойная кислота 0,4°

Салициловая кислота, широко применяющаяся в ря-де отраслей народного хозяйства, в частности для полу-чения консервантов, а также в фармацевтической про-мышленности, часто содержит примеси, например сали-циловый эфир. Такие примеси могут быть легко иденти-фицированы при помощи тонкослойной хроматографиина окиси алюминия в системе растворителей петролей-ный эфир — этилацетат — уксусная кислота (85:10:5)[85]:

Сачициловая кислота 0,63Эфир салициловой кислоты . . . 0,72

Успешное разделение некоторых ароматических окси-карбоновых кислот проведено в тонких слоях кремневойкислоты [16] в различных системах растворителей: I —эфир — целлозольв В (7:3), II — этилацетат — целло-зольв В (3:1), III — ацетон — целлозольв В (1:3)].Значения Rf этих кислот приведены ниже.

*tКислота I II III

Салициловая 0,72 0,88 0,48β-Резорциловая 0,57 0,85 0,19Ванилиновая 0,46 0,76 0,29Протокатеховая 0,32 0,55 0,10α-Резорциловая 0,21 0,61 0,73у-Резорциловая 0,10 0,15 0,10

57

Во всех трех системах растворителей ароматическиеоксикарбоновые кислоты легко могут быть разделены.Особенно хорошо разделяются α-, β- и γ-изомеры резор-циловой кислоты.

2Рис. 10. Схема прибора для тонкослойной хроматографии под ма-

лыми углами:1 — пластинка с сорбентом; 2 — стеклянная вата, пропитанная растворителем;

3 — бумажная спираль; 4 —бумажная масса.

Для разделения соединений, близких по своим хи-мическим свойствам, недавно был предложен метод тон-кослойной хроматографии под малыми углами. Этот спо-соб дает возможность разделения на хроматограмме сое-динений с близкими значениями Rf [86]. В качествеадсорбента использовали коммерческий препарат микро-структурной целлюлозы с крахмалом. Растворителемслужила система толуол — уксусная кислота — вода(125:72:3).

По этому методу в специальный сосуд, имеющийочень небольшой угол подъема (около 10°) над горизон-тальной плоскостью, помещают пластинку с адсорбен-том, на нижний конец которой предварительно наносятпробы анализируемых веществ (10—50 мкг) (рис. 10).На верхний конец пластинки накладывают сухую бу-мажную ленту, другой конец которой свернут в спираль.Бумажная спираль может быть развернута для удли-нения пути растворителя. Такое устройство позволяетразделять соединения, имеющие близкие значения R/(в пределах 0,02—0,10/?/) и обеспечивает возможностьдополнительного продвижения опытного пятна на плас-тинке с адсорбентом. Максимальная длина пути, кото-рый может быть пройден пятном, достигает 55 см, про-должительность анализа 16—72 ч.

58

Глава 5

РАЗДЕЛЕНИЕ ИЗОМЕРОВ ОРГАНИЧЕСКИХСОЕДИНЕНИЙ

Применение тонкослойной хроматографии для раз-деления и анализа изомеров различных соединений нача-лось сравнительно недавно. Во многих случаях с по-мощью тонкослойной хроматографии могут быть легкоразделены изомеры органических соединений, которыеобычно трудно разделить другими методами.

Карбоциклические соединения. В литературе имеют-ся данные об успешном разделении в тонких слоях раз-личных алициклических (главным образом терпенов) иароматических соединений.

С т е р е о и з о м е р ы м е н т о л а и к а м ф о р н о йк и с л о т ы [87]. Ментол С10Н19ОН является спиртом,производным циклогексана, и широко применяется, нап-ример, в фармацевтической промышленности.

Известны следующие стереоизомеры ментола: ( + ) -и (—)-ментолы, ( + ) - и (—)-изоментолы, ( + ) - и (—)-неоментолы и ( + ) - и (—)-неоизоментолы

IСН(СН3)2

На хроматографическое поведение стереоизомеровментола большое влияние оказывает положение гидро-ксильной группы. Если гидроксильная группа находитсяв экваториальном положении (ментол и изоментол), топри хроматографии на кизельгеле G для таких молекулнаблюдается более высокое адсорбционное сродство, чем

59

для молекул, у которых гидроксильиая группа находит-ся в аксиальном положении.

Влияние метильной группы на хроматографическоеповедение стереоизомеров ментола выражено в значи-тельно меньшей степени.

Ниже приведены значения Rf при хроматографиистереоизомеров ментола на кизельгеле; в качестве рас-творителей использовали: I — бензол, II — бензол—мета-нол (95:5), III — бензол — метанол (75:25), IV — ме-танол:

«fI II III IV

Ментол 0,16 0,36 0,67 0,90Неоментол 0,28 0,51 0,73 0,85Изоментол 0,17 0,37 0,62 0,91Неоизоментол 0,29 0,55 0,76 0,80

Тонкослойная хроматография позволяет легко отде-лить ментол и изоментол от неоментола и иеоизоменто-ла [87]. Несколько сложнее обстоит дело при разделе-нии ментола и изоментола, а также иеомеитола и нео-изоментола, значения Rf которых сравнительно малоотличаются друг от друга. Однако подбором соответству-ющих растворителей эта задача, по-видимому, можетбыть решена. Так, можно добиться удовлетворительно-го разделения стереоизомеров ментола и изоментола, ис-пользуя систему бензол — метанол (75:25), а для сте-реоизомеров неоментола и неоизоментола — метанол.

Из других производных терпенов хорошие результа-ты были получены при разделении хроматографией втонких слоях структурных изомеров N-алкиламида ( ± ) -камфорной кислоты [88]:

Н 3 С Ч /СООН Н 3 С ,CONHCH2CH=CH2

ЦАсн3CONHCH2CH=CH2 С ООН

В качестве сорбента был использован кизельгель.Пластинки с кизельгелем (20x20 см) активировали наг-реванием до 100 °С в течение 30 мин. Ниже приведенызначения Rf для этих изомеров в различных системахрастворителей: I — н-бутанол — вода (100:20), II —н-бу-танол — 7%-ный раствор аммиака (100:20):

60

α-Изомер 0,80 0,31 (0,50)*β-Изомер 0,58 0,30 (0,40)*

• В скобках показаны значения Re после трехкратнойхроматографии на пластинках с кизельгелем.

Хроматографическое разделение различных изоме-ров терпенов и бициклических углеводородов при помо-щи тонкослойной хроматографии описано в работе [89].В качестве адсорбента использовали силикагель G, им-прегнированный нитратом серебра (адсорбционнуюмассу наносили на пластинку и нагревали при 100—110°С в течение 60 мин), в качестве растворителя —бензол. Оказалось, что адсорбционное сродство различ-ных терпенов в значительной степени зависит от содер-жания нитрата серебра в силикагеле (табл. 5).

Т а б л и ц а 5. Значения R; терпенов при ТСХ на пластинкахс различным содержанием AgNO3

Соединение

Содержание AgNO3, %

6,25 12,50 18,75 25,0

α-Терпиненγ-ТерпиненТерпиноленЛимонен .α-Пинен . .β-Пинен . .Камфен . .Д3-Карен .Сабинен . .

0,700,710,710,720,710,700,680,730,71

0,580,720,720,520,710,590,600,730,38

0,510,660,690,420,720,500,560,720,30

0,450,580,610,350,660,460,530,660,27

0,430,500,530,310,600,420,510,600,25

Отчетливо видно изменение хроматографического по-ведения терпенов с увеличением содержания азотнокис-лого серебра в сорбционной массе.

Таким образом, тонкослойная хроматография на си-ликагеле с включением в гель нитрата серебра позволя-ет провести хорошее разделение ненасыщенных терпе-нов как циклического, так и бициклического типа, обычнодовольно трудно разделяемых. При этом с увеличе-нием количества нитрата серебра в сорбционной массестепень разделения терпенов улучшается (исключениесоставляет только пара α-пинен и карен).

61

Разделение некоторых терпенов, например сабиненаи β-пинена, которое трудно осуществить при помощи га-зовой хроматографии, может быть легко достигнуто ме-тодом тонкослойной хроматографии на силикагеле сразличным содержанием нитрата серебра.

Ароматические соединения. Силикагель, импрегниро-ванный нитратом серебра, оказался также хорошим ад-сорбентом для разделения некоторых ароматических сое-динений. Таким способом, например, осуществлено раз-деление сафрола и его изомера изосафрола [90], чтообычно сопряжено с известными трудностями

О СН 2 О СН2

СН.2 СН=СН 2 СН=СНСН3

сафрол изосафрол

Различие в поведении сафрола и изосафрола, по-ви-димому, вызвано различной силой связи их молекул сионом серебра, присутствующим в сорбенте.

При помощи тонкослойной хроматографии на силика-геле G удается легко разделить изомеры оксимов аро-матических альдегидов и кетонов.

Значения Rf для этих соединений при разделении втонком слое силикагеля G в системе растворителей бен-зол— этилацетат (50:10) [91] приведены ниже:

Оксим α-Изомер β-Изомер

бензальдегдоа 0,50 0,32бензоина 0,14 0,37анизоина 0,05 0,23

Представляет интерес возможность разделения в тон-ких слоях орто-, мета- и ηαρα-изомеров замещенных аро-матических углеводородов.

Так, была показана возможность разделения на ки-зельгеле орто-, мета- и яара-изомеров нитрофенола, ами-нофенола, фенилендиамина, нитроанилина, толуидина,нитробензальдегида, а также а- и β-аминонафталинов[92]. В качестве растворителей были использованы бензол(I) и смесь (II) бензол — метанол (80:20). ЗначенияRf для этих соединений приведены ниже:

62

I IIо Нитрофенол 0,56 0,79ж Нитрофенол 0, 12 0 55η Нитрофенол 0,07 0,53о Нитроанилин 0,34 0,61м Нитроанилин 0,19 0,53η Нитроачилин 0,16 0,50о Фенилендиамин 0 0,49ж Фенилендиамин 0 0,40η Фенилендиамин 0 0,33о Аминофеноч 0 0,50ж-Аминофеноч 0 0 47η Аминофенол 0 0,41о Толуидин 0,19 0,65ж Толуидин 0,17 0,62η Толуидин 0,15 0 59о Нитробензальдегид 0,36 0,66ж Нитробензальдегид 0,31 0,69η Нитробензальдегид . 0,33 0,68α Амиионафталин 0,20 0,68β Аминонафталиι 0,17 0,66

Таким образом, используя предложенные системырастворителей, можно добиться удовлетворительногоразделения орто-, мета- и яара-изомеров для ряда про-изводных ароматических углеводородов

В большинстве случаев наибольшей подвижностьюобладают ортоизомеры, наименьшей — яара-изомеры

Однако при тонкослойной хроматографии хлорнитро-бензолов на силикагеле хотя удается провести разделе-ние орто-, мета- и лара-изомеров, но характер подвиж-ности изомеров здесь иной наибольшим адсорбционнымсродством, а следовательно, наименьшей подвижностьюобладает орто-изомер [93]

Значения Rf при хроматографии на тонких слоях си-ликагеля орто-, мета- и «αρα-изомеров хлорнитробензолав различных системах растворителей [I — циклогек-сан — диизопропиловый эфир (2 1 1), II — петролейныйэфир — этилацетат (95 5), III — петролейный эфир —этилацетат — диизопропиловый эфир (6 2 2)] приведе-ны ниже

I II IIIорто-Изомер 0,38 0,24 0,45мета Изомер . 0,47 0,34 0,54пара Изомер . 0,52 0,41 0,57

63

цис- и транс-Изомеры органических соединений. До-вольно подробно изучено поведение на тонких слояхсоединений, обладающих цнс-транс-изомерией. Отмече-но, что, как правило, при тонкослойной хроматографиитранс-изомеры обладают значительно большей подвиж-ностью и, -следовательно, меньшим адсорбционным срод-ством, чем соответствующие им цмс-изомеры.

Как уже указывалось выше (см. гл. 4), ненасыщен-ные дикарбоновые кислоты, имеющие одно и то же хи-мическое строение, но различное пространственное рас-положение карбоксильных групп, обладают и различ-ной подвижностью при хроматографии в тонких слоях.

Аналогично ведут себя цис- и транс-изомеры трикар-боновых, а также ароматических кислот. Так, цис- итранс-аконитовые кислоты при хроматографии на тонкихслоях кизельгеля в системе растворителей бензол — ме-танол— ледяная уксусная кислота (45:8:4) характери-зуются следующими значениями Rf:

транс-Аконитовая кислота . . . 0,12Чис-Аконитовая кислота . . . . 0,03

Значения Rf цис- и гранс-изомеров азобензола прихроматографии на тонких слоях кизельгеля в системерастворителей циклогексан — бензол (80:20) составля-ют:

транс -Изомер 0,60цис-Изомер 0,07

Таким образом, цис-формы ароматических соедине-ний также имеют значительно большее сорбционноесродство и, следовательно, меньшую подвижность прихроматографии на тонких слоях, чем соответствующиеим транс-формы.

Однако этот вывод не может быть распространен навсе соединения, обладающие цис-тракс-изомерией. Так,при хроматографии цис- и гранс-изомеров аналогов (Аи Б) мецкалина (алкалоид) [94]

СНО

с н 3 о — ( \ -сн=с

сн3с/R R'

А Η COOCHgБ Η СН2ОН

64

на силикагеле Η большей подвижностью обладают цис-изомеры:

Соединение Ι Π III IV V

А, цис- 0,69 0,70 0,86 0,49 0,42А, транс- 0,66 0,68 0,86 0,40 0,35Б , цис- 0,28 0,09 0,49 — —Б, транс- 0,23 0,09 0,46 — —

• Растворители: 1—петролейный эфир (30—60 °С)—ацетон (3:1); II—бензол—этилацетат (4:1); III—бензол—этилацетат (3:2); IV—петролейный эфир (30—60 °С)—ацетон (7:1); V—петролейный эфир (30—60 °С)—метанол (6:1).

В некоторых случаях метод тонкослойной хромато-графии может быть использован для разделения эритро-и грео-изомеров, причем эрмгро-изомеры имеют болеевысокие значения Rf, чем соответствующие им трео-пзо-меры.

Разделение приведенных ниже пар диастереомеровАг' Аг'

Y - C - H H - C - Y

χ — С — Η X—С—Η

L Lapumpo- mpeo-

осуществляли в тонком слое силикагеля, используя раз-личные системы растворителей (табл. 6).

Влияние конформационного состояния молекулы наее хроматографическое поведение в тонких слоях. Подконформациями обычно понимают различные неиден-тичные пространственные формы молекулы, имеющие оп-ределенное строение и определенную конфигурацию.

На примере альдрина и изодрина было показано[90] влияние конформации на поведение молекул прихроматографии в тонких слоях (в качестве адсорбентаиспользован кизельгель, в качестве растворителя —циклогексан).

Cl Cl Cl CI

изодрия3-80 6 5

Т а б л и ц а 6. Тонкослойная хроматография стереоизомеров [95]I — этиловый эфир — гептан ( 2 : 1 ) ; II — гептан — этилацетат — м е т а н о л — аммиак ( 1 2 : 1 0 — 1 , 5 : 1 , верхний слой); III '—этю-ловый эфир — петролейный эфир ( 2 : 1 ) ; I V — этиловый эфир — гептан ( 1 : 5 ) ; V — б е н з о л — этилацетат — этанол — аммиак( 5 0 : 4 0 : 5 : 5 , верхний слой); VI — этиловый эфир — гептан ( 1 : 1 ) ; V I I — этиловый эфир; VIII — этиловый эфир — петролей-ный эфир; IX — этиловый эфир — ацетон (3 • 2); X — этиловый эфир — ацетон ( 4 : 1 ) ; XI — этиловый эфир — ацетон ( 9 : 1 ) ;XII—этиловый эфир — ацетон ( 7 : 3 ) ; XIII—этиловый эфир — метанол ( 1 7 : 3 ) ; XIV — этиловый эфир — метанол ( 1 : 1 ) ; XV —этилацетат — метанол — уксусная кислота ( 1 6 : 4 : 2 ) ; XVI — бензол — метанол — уксусная кислота ( 6 0 : 6 : 1 ) ; XVII — бензол —

метанол — уксусная кислота (30 : 1 : 1).

Аг

СН3О,

сн3о-/^уН 2 С—0,

с в н 6

СН30—/ Л—\==/

(

сн

;н3о^

•°-о-

Аг'

с6н5

с6н5

с6н5

с6н5

с6н5

с6н5

X

NH2

NH2

NH2

NHCH3

NHCH3

NHCH3

у

СООСНз

COOCHg

СООСНз

СООСНз

СООСНз

СООСНз

трео-

0 , 3 0

0 , 4 8

0 , 2 7

0 , 3 9

0 , 4 8

0 , 2 7

эритро-

0 , 3 9

0 , 5 5

0 , 4 1

0 , 5 5

0 , 6 0

0 , 3 9

Системарастворителей

I

I I

I

I

1

•

Н2С-0

Q 6с6н5

с6н5с„н5

свн5

с6н5с6н5

с6н5с6н5

QH»

G.H.

с9н5с6н5с6н6с6н5сен6свн5с6н5QCeH5

с в н 5

с 6 н 5с 6 н 5

с 6 н 5

с 6 н 5

с 6 н 3

с 6 н 5с 6 н 5

с 6 н 5

О н ,

NHCH,

N(CH3)2NHC6H5NHCONH2NHCHgNHCONH2

NHCH3CON(CH3)2CON(C2H5)2

CON. оCON(CH3)2CON(C2H5)2

CON OCON(CH3)3CON(CH3)2CON(CH3)2

CON(C2H5)2CON(C2H5)2CON(C2H5)2

CON'

СООСНз

COOCHsСООСНзCOOCHsсоонсоон

СН2ОНСН2ОН

СН2СООСН3

СН2СООСН3

СН2СООСН3

СН2СООС2Н 5

СН,СООС2Н5

CH2CON(CH3)2

CH2CON(C2H5)2

CH2CON

CH2CON(CH3)2

CH2CON(C2H5)2

CH.CON'

CH2CON(CH3)2

0,31

0,340,270,250,460,150,440,450,520,32

0,43

0,600,40

0,52

0,610,49

0,45

0,520,31

0,32

0,32

0,51

0,420,340,300,520,210,540,570,620,39

0,52

0,700,46

0,58

0,700,66

0,60

0,580,43

0,43

0,44

IIIIVV

XVXVIXIIIXIIIVII

VIII

VII

VIIVIII

VII

IXX

IX

XVII

XI

X

Продолжение табл. 6

Аг

с 6 н 5

с 6 н 5

с 6 н 5

с 6 н 5

с 6 н 6

с в н 5

с в н 6

Аг'

с в н 6

с 6 н 6

с в н 6

-ό-^2

елс6н5

свн5

с6н6

X

C O l s / ^ 0

C O N ^ ^ O

он

он

снмещ,

/ \СН2ОН

он

У

CH 2 CON(C 2 H 5 ) 2

C H . C O N ^ ^ O

СООСНз

СООСНз

СН2СН2ОН

СН2СН2ОН

СН2СН2ОН

соон

Rf

трео·

0,59

0,38

0,51

0,38

0,35

0,15

0,64

0,22

эршпро-

0,70

0,54

0,59

0,47

0,52

0,46

0,85

0,31

Системарастворителей

X

X I I

VI

II

XIV

VII

V I I

XVII

Альдрин 0,60Изодрин 0,50

Другой пример влияния конформации на различие вхроматографическом поведении молекул на тонких сло-ях может быть продемонстрирован на примере антраце-на и дигидроантрацена. В качестве адсорбента был ис-пользован кизельгель. Антрацен имеет более высокоезначение Rf, чем дигидроантрацен, и вследствие этогоможет быть легко отделен от дигидросоединения [96].Еще более высокой подвижностью обладает октагидро-антрацен, получаемый каталитическим гидрированиемантрацена.

Аналогично ведут себя фенантрен СмНю и его ди- иоктагидропроизводные.

Ниже приводятся значения Rf, полученные при хро-матографии на тонких слоях кизельгеля для антраце-на, дигидроантрацена и октагидроантрацена, а такжедля фенантрена, дигидрофенантрена и октагидрофенант-рена:

*/Антрацен 0,309, Ю-Дигидроантрацен 0,21Октагидроантрацен 0,43Фенантрен 0,289,10-Дигидрофенантрен 0,25Октагидрофенантрен 0,37

Различие в их адсорбционном поведении является,по-видимому, результатом конформационных изменениймолекул, вызванных процессом гидрогенизации арома-тических углеводородов.

Гетероциклические соединения. На адсорбционноеповедение производных пиридина при тонкослойной хро-матографии оказывают влияние как различные замеща-ющие группы в молекуле пиридина (СООН, ОН, NH2,СНО, СН3 и др.), так и их положение в молекуле [90,97, 98].

Значения Rf для пиридина и его различных произ-водных на кизельгеле в хлороформе (I), этилацетате(II) и ацетоне (III) приведены ниже [97]:

69

1 II III

Пиридин 0,04 0,29 0,54α-Пиколин (2-метилпиридин) . . 0,03 0,30 0,54β-Пиколин ^-метилпиридин) . . 0,06 0,35 0,55γ-Пиколин (4-метилпиридин) . . 0,04 0,27 0,482,4-ЛутиДин (2,4-диметилпири-

дин) 0,04 0,28 0,492,6-Лутидин (2,6-диметилпири-

дин) 0,06 0,36 0,59Коллидин (2,4,6-триметилпири-

дин) 0,02 0,26 0,51Конирин (2-пропилпиридин) . . 0,12 0,47 0,642-Оксипиридин — 0,06 0,20З-Оксипиридин — 0,23 0,534-Оксипиридин — 0,00 0,022-Аминопиридин — 0,27 0,50З-Аминопиридин — 0,18 0,454-Аминопиридин — 0,05 0,142-Формилпиридин — 0,51 0,67З-Формилпиридин — 0,33 0,584-Формилпиридин — 0,36 0,562-Пиридинкарбоновая кислога — 0,02 0,04З-Пиридинкарбоновая (никоти-

новая) кислота — 0,06 0,064-Пиридинкарбоновая (изонико-

тиновая) кислота — 0,05 0,05

Как видно, монометилпроизводные пиридина — пи-колины в тонких слоях кизельгеля имеют сравнительноблизкие значения Rf, однако а- и γ-пиколины имеютбольшее адсорбционное сродство и меньшую подвиж-ность на хроматограммах, чем β-пиколин. Подвижностидиметил- и триметилпиридинов различаются более силь-но.

Увеличение в пиридиновом кольце длины боковойуглеродной цепи (конирин) приводит к уменьшению ад-сорбционного сродства и увеличению подвижности моле-кулы.

Изучено поведение хинолина, изохинолина, а такжеих производных при помощи хроматографии в тонкихслоях на кизельгеле [98]; в качестве растворителя былиспользован хлороформ:

*fХинолин 0,11Изохинолин ..... 0,122-Метилхинолин (хинальдин) . . . . . . 0,164-Метилхинолин (легшдин) 0,13

70

6-Метилхшюлии 0,187-Метилхинолин 0,168-Метилхинолин 0,312,4-Диметилхинолин 0,084,6-Диметилхинолин 0,112,8-Диметилхинолин 0,47

Наиболее сильно влияние метильной группы сказы-вается в случае 8-метилхинолина, а также 2,8-диметил-хинолина.

Интересно поведение при хроматографии в тонкихслоях гетероциклических соединений, содержащих серу,типа:

R—С—CS

R'—С—S

Показано [99], что подвижность этих соединений за-висит от природы заместителей R и R'. Разделение осу-ществляли в тонком слое кизельгеля с предварительнойактивацией пластинок в течение 30 мин при 120—130 °С,в качестве элюента использовали петролейный эфир —бензол (1:1) (I) и сероуглерод (II). Полученные значе-ния Rf приведены ниже:

R

ΗΗΗΗ

СНзСНзСНз

с 2 н 5

С<-Н5

СООС 2 Н 5

R'

ΗС 6 Н Б

С В Н 5 О С Н 3

С 6 Н 5 ВгΗ

сн3

ΗΗ

свн5NHCOCH3

Rf

I

0,190,320,150,370,290,270,380,350,020,310,07

II

0,140,170,050,220,230,210,290,330,300,140,0

Таким образом, изменения в структуре молекулы се-русодержащего гетероциклического соединения непосред-ственно отражаются на его подвижности в тонких сло-ях. Тонкослойная хроматография, особенно в сочетаниис другими методами, например спектроскопией, можетбыть использована для разделения, характеристики иидентификации таких соединений.

1Глава 6

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯПЕСТИЦИДОВ

В настоящее время для борьбы с вредителями, воз-будителями заболеваний различных культурных расте-ний и сорняками очень широко применяют пестициды,производство которых непрерывно возрастает.

Чрезвычайно актуальной стала задача контроля надостаточными количествами пестицидов в окружающейсреде, что потребовало разработки высокочувствитель-ных методов определения пестицидов [100]. Среди ме-тодов определения пестицидов широкое применение по-лучили различные хроматографические методы: жид-костная хроматография на колонках, газо-жидкостнаяхроматография и, в последнее время, метод тонкослой-ной хроматографии. Большой интерес представляет но-вая модификация этого метода — метод тонкослойно-хроматографического ингибирования ферментов дляопределения пестицидов, позволяющий сочетать хромато-графию в тонких слоях с ферментативными реакциями.

Тонкослойная хроматография довольно широко и ус-пешно применялась для анализа и идентификации фос-форсодержащих пестицидов. Используя различныекомбинации растворителей, а также осуществляя соот-ветствующий подбор сорбентов, можно разделить и иден-тифицировать очень большое число фосфорорганическихпестицидов.

Успешное применение тонкослойной хроматографиидля анализа пестицидов продемонстрировано [101] приопределении остаточных количеств различных фосфор-органических соединений. В качестве адсорбентов ис-пользовали различные марки силикагеля.

В табл. 7 приведены значения Rf для этих пестици-дов (растворители — хлороформ и метанол).

72

Т а б л и ц а 7. Значения Rf некоторых пестицидовпри тонкослойной хроматографии на силикагеле К.СК.

Фталофос .

Бутифос , .Малатион .

Фозалон . .

Цидиал . .

Фенкаптон . . . .

Трихлорметафос 3

Сайфос

Кильваль

Рогор

Хлорофос . . . .

(ί?) N C H 2 S P ( O C H 3 ) 2

^ > Ч . / IIСО S

(C4H9S)3P=O(CH3O)2PSCHCOOC2H6

S СН,-Ν—С

2COOC2H5

iCH3O)2PSCHCOOC2H5

II Is свн5

(C2H5O)2PSCH2S-/\IIs

N — л .( C H 3 O ) 2 P S C H 2 - ( / * N

s \ N H 2

( C H 3 O ) 2 P S ( C H 2 ) 2 S C H C H 3

II I

О CONHCH3

(CH3O) 2PSCH2CONHCH3

IIs

(CH3O)2P CHCClgII IООН

0

00

0

0

0

1

0,

0,

0,

0,

,36

,41,59

,72

80

85

00

0

0

0

0

0,38

0,57

0,75

1,00

73

На значение Rf влияет как характер адсорбента[на крупнопористом силикагеле (КСК) сорбционноесродство пестицидов меньше, чем на среднепористом(КСС-3)], так и полярность растворителя (Rf увеличи-вается с увеличением диэлектрической постоянной раст-ворителя).

Чувствительность обнаружения пестицидов при про-явлении пятен на хроматограммах при помощи бромфе-нолового реактива составляет 0,2—0,5 мкг.

Т а б л и ц а 8. Значения R; некоторых фосфорсодержащихпестицидов при тонкослойной хроматографии на кизельгеле

Пестицид

Этион

Дистион . . .

Тимет

Малатион . . .

Роннел . . . .

Бутонат . . . .

Малаоксон . .

Фосдрин . . .

Структурная формула

СН2рР(ОС2Н6)2-|

I s J ,(C2H5O)2PS(CH2)2SC2H5

πII

s

( C 2 H 6 O ) 2 P S C H 2 S C 2 H 5

Μ11

s

( C H 8 O ) 2 P S C H C O O C 2 H 5

S C H 2 C O O C 2 H 5

( C H 3 O ) 2 P O C e H 2 C l 3 - 2 , 4 , 5

ηII

s

( C H , O ) 2 P — C H O C O C 3 H 7

II 1II 1

О СС!3

(CH3O)2P—CHCOOC2H5

II 1о сн2соос2н5

(CHaO)2POC=CHCOOCH3

II 1II 1о сн3

I

0,88

0,72

0,61

0,12

0,07

0

0

π

0,97

0,95

0,95

0,68

0,43

0,29

0,23

0,05

Осуществлено разделение около 20 фосфорорганиче-ских пестицидов [102]; в качестве растворителей были74

Т а б л и ц а 9. Значения Rf некоторых пестицидов при тонкослойной хроматографиина окиси алюминия и силикагеле

Пестицид Структурная формулаОкись алюминия

I II III

Силикагель

I II III

Бромофос

Метатион

Цидиал

Дикаптон

Байтекс

(CH3O)2PO

S

: - / V-Hr

Cl

(CH3O)2PSCHCOOC2H5II IS C6H5

с

(CH3O)2PO—•.s \ C H

0,55

0,55

0,52

0,50

0,31

0,83

0,77

0,85

0,85

0,74

0,47

0,41

0,35

0,03

0,18

0,73

0,73

0,82

0,50

0,78

0,96

0,90

0,89

0,85

0,70

0,70

0,55

0,79

использованы: I — w-гексан — бензол — ацетон (15:10::1), II — бензол — ацетон (19:1); адсорбент — кизель-гель.

Значения Rf для некоторых из этих пестицидов при-ведены в табл. 8.

Для разделения фосфорорганических пестицидов бы-ли использованы также силикагель и окись алюминия[103]. Растворителями служили: I — н-гексан — ацетон(3:1), II — хлороформ — ацетон (9:1) и III — н-гек-с а н — ацетон (5:1) (см. табл. 9).

В работе [104] приведена общая схема экстракциифосфорсодержащих пестицидов из пищевых продук-тов с последующим разделением вытяжки из хлоро-форма при помощи тонкослойной хроматографии в со-четании с газовой хроматографией. В работе приведенызначения Rf почти для 40 фосфорорганических пести-цидов.

Двумерная тонкослойная хроматография фозалонаиз экстракта яблок проведена на силикагеле КСК всистеме растворителей гексан—ацетон (4:1) [105].

Осуществлено [106] успешное разделение смеси че-тырех фосфорсодержащих пестицидов в тонких слояхсиликагеля в системе растворителей бензол—петролей-ный эфир (6:4):

*fФозалон 0,55

Метатион 0,65

Цидиал 0,70 (0,25)*Трихлорметафос 3 0,95 (0,25)*

• В этой системе растворителей цидиал и трихлормета-фос 3 образуют два пятна.

Для определения остаточных количеств фталофоса впищевых продуктах в качестве сорбента использовалисиликагель марки КСК в различных системах раство-рителей [107]. Экстракт из пищевой массы обычно со-держит вместе с фталофосом продукт его разложения —оксиметилфталимид, который может быть легко отде-лен от фталофоса тонкослойной хроматографией в бен-золе, хлороформе или смеси бензола и этанола (50:1):

76

Соединение

ФталофосОксиметилфталимид

Бензол

0,340,0

Хлороформ

0,450,07

Бензол —этанол(50:1)

0,460,08

Тонкослойная хроматография является весьма перс-пективным методом определения и разделения азотсо-держащих гербицидов. Описано разделение таких пре-паратов в тонких слоях окиси алюминия, закрепленныхгипсом (см. табл. 10).

Т а б л и ц а 10. Значения R; некоторых гербицидовв различных системах растворителей:

Препарат

Солан

Монурон

Линурон

Диурон

Пропанид

Структурная формула

СН3—ζ~ J—NHCOCHC3H7

СН3

С1—ζ~)—NHCON(CH3)2

С1—ζ}—NHCONOCH3

С1/ сн3

с1~\\ /)—NHCON(CH3)2\_J/с /

С1-(^~Л—NHCOC2HS

cv

0,65

0,43

0,42

0,41

0,35

Растворитель

Эфир — четырех-хлористый уг-

лерод (1 : 1)

Хлороформ

Эфир—четырех-хлористый уг-лерод (3 :2)

Хлороформ

Эфир—четырех-V П П П И Р Т М Й

углерод (1:1)

Пестициды, относящиеся к классу дитиокарбаматовтакже подвергали хроматографическому разделению втонких слоях. Так, на окиси алюминия в системе раст-

77

Т а б л и ц а 11. Значения, Rj некоторых пестицидов в различных системах растворителей:

I—вода—метанол (5:5); И—вода—этанол—метанол (-5:1:4); III—вода—ацетон (5: 5); IV—вода—муравьиная кислота-метанол (4:1:5); V—вода—26%-ный аммиак—метанол (3:1:6); VI—циклогексан—ацетон (8:2)

Соединение Структурная формулаι Ι π I ш I iv | ν Ι νΐ

а-Нафтил-И-метилкарбамат (севин)

2-Хлорфенил-Ы-метилкарбамат (хопцид)

OCONHCH3

I

OCONHCH3

С1

0,42

0,62

OCONHCH,

2 -Изопропоксифенил- N -метилкарбамат(байгон)

4-Этилтиофеннл-К-метилкарбамат

(СН3)2СНО.

ОСОШСНз

II

0,73

0,52

SCoHc

0,52

0,68

0,78

0,61

0,57

0,67

0,74

0,59

0,63

0,75

0,81

0,70

0,61

0,82

0,82

0,72

0,51

0,54

0,60

0,60

4-Диаллиламино-3,5-диметилфенил-N-метилкарбамат (гидрол)

•3,4-Диметилфенил-М-метилкарбамат(меобал)

3,5-Диметилфенил- N-метилкарбамат(макбарль)

2-згор-Бутилфенил-1Ч-метилкарбамат

З-Метилфенил-И-метилкарбамат (ТМК)

OCONHCH30,32 0,71 0,40 0,90 0,62 0,78

уN(CH2CH=CH2)2OCONHCH3

I сн3СН3

OCONHCH3

0,60 0,70 0,65 0,74 0,74 0,61

Н3С

ОСОШСНз

сн.OCONHCH3

сн3

0,58

0,58

0,67

0,69

0,67

0,76

0,65

0,59

0,70

0,74

0,73

0,78

0,73

0,73

0,76

0,67

0,74

0,63

gСоединение

Изопропил-N- (3-хлорфенил) -карбамат (ИФК)

4-Хлорбутин-2-ил-Ы- (3-хлорфенил) -карбамат (карбин)

Метил-N- (3,4-дихлорфенил) -карбамат (НИА 2995)

Метил-М-фенилкарбамат

Метил-1М-а-нафтилкарбамат

Структурная формула

NHCOOCH(CH 3 ) a

СNHCOOCH2CESCCH2C1с1-е,Nl·

Г[СООСН3

1

С1

NHCOOCH3

1

с'\NHCOOCH3

*f1

0,28

0,22

0,20

0,56

0,39

II

0,39

0,33

0,29

0,66

0,51

III

0,40

0,35

0,34

0,64

0,53

IV

0,50

0,47

0,41

0,71

0,58

V

0,54

0,50

0,44

0,70

0,59

VI

0,79

0,67

0,60

0,61

0,58

Метил-1Ч-фенилтиокарбамат

S- (4-Хлорбензил) -Ν,Ν-диэтил-тиокарбамат (сатурн)

S -Бензил-Г\Г,Г\Г-диэтил-дитиокарбамат

"2-Метилвалериановая кислота,З-хлор-4-метиланилид (солан)

NHCSOCH3 0,35 0,41 0,41 0,48 0,58 0,65I

CH2SCON(C2H5)2 0,34 0,40 0,36 0,53 0,62 0,95

Cl

CH2SCSN(C2H5)2 0,19 0,24 0,27 0,38 0,49 0,93

NHCOCHC3H7 0,21 0,33 0,32 0,48 0,50 0,72

S С Н з

Соединение Структурная формулаIII IV VI

Пропионовая кислота, 3,4-дихлор-анилид (пропанид)

М-Циклооктил-Ы',Ы'-диметил-мочевина (ОМУ)

N- (3,4-Дихлорфенил) -Ν',Ν'-диметил-мочевина (диурон)

NHCOC2H5

С1

0,23 0,33 0,36 0,47 0,47 0,50

С1

— ЛЩСОЫ(СН3)2

NHCON(CH3)2

Cl

0,71

0,33

0,77

0,45

0,72 0,80

0,56

0,81 0,61

0,45

ворителей н-гексан — бензол — ацетон (10:1:2,5) разде-лены цирам и ТМТД [109]:

Цирам, Г (CH3)aN — С — S — 1 Zn 0,22

2ТМТД, Г (CH3)2N — С — S — 1 0,65

Применение тонкослойной хроматографии дает воз-можность определить качественно, а также и количест-венно дитиокарбаматы и продукты их распада.

Помимо окиси алюминия в качестве сорбента дляразделения пестицидов — производных карбаминовойкислоты были использованы также полиамиды. Натонких слоях полиамида марки Wako В-10, содержащихв качестве связующего вещества безводный сульфаткальция, были успешно разделены некоторые такие пес-тициды [ПО] (см. табл. 11).

Метод идентификации пестицидов в тонком слое по-лиамида оказался достаточно чувствительным. Так, прииспользовании пинакриптола желтого [111] в сочета-нии с облучением УФ-светом предел чувствительностиопределения таких пестицидов составляет от 0,01—0,05до 0,5 мкг.

Отмечают, что метод определения пестицидов в тон-ком слое полиамида обладает значительно большейчувствительностью, чем, например, в слое силикагеля.

Для анализа остатков хлорорганических пестицидовв пищевых продуктах был предложен метод хромато-графии в тонких слоях алюминия, импрегнированногонитратом серебра (30 г сорбента, 45 мл 0,4%-ного вод-ного раствора AgNO3) [112, 113]. Пластинки передхроматографией предварительно активировали в тече-ние 2 ч при 1QO°C [112]; в качестве растворителя при-меняли гексан (см. табл.12).

ДДТ и его аналоги были разделены при помощидвумерной хроматографии на тонких слоях кизельгеляG-HR в системе растворителей гептан — ацетон (98:2)[114], а также на окиси алюминия [115]. При этом внекоторых системах растворителей удалось получитьдостаточно хорошее разделение (см. табл. 13).

83

Таблица 12. Значения Rj некоторых хлорсодержащих пестицидов

Пестицид Структурная формула

Альдрин

Гептахлор

Эндрин

дат

ддд

84

С1

CI

а

аа а

а а

а

а

С1Я

СНС1 2

Т а б л и ц а 13. Значения R[ производных ДДТ на окисиалюминия в различных системах растворителей:

I—«гептан, II—к-гексан, III—н гексан—уксусная кислота (9 I), IV—н гек-сан—эфир—уксусная кислота (100 1 1)

ПестицидIII IV

ДДТДДЕДДДДДА

0,670,850,390,00

0,740,890,470,00

0,850,940,850,32

0,920,950,750,03

Определенный интерес представляет сопоставлениеметода тонкослойной хроматографии пестицидов с био-логическим методом определения последних [116].Сравнительная чувствительность этих методов приведе-на ниже:

Пестицид

Чувствительность метода·

биологич.

3

6

7

7

1

2

6

3

11

1

1,

1,

4,

со

,4

,6

2

Ь

4·

2·

6·

2·

4·

2·

3

1

6

9

6

10~5

ю-4

ю-4

10" 3

ю-2

ю-2

Ι Ο " 2

ю-2

ю-'ю-'

тех

2225

105

10222

2555,2,2,

,5ел

ел

000005000000

Цидиал . . . .

Метилэтилтиофос

Метафос . . . .

Метатион . . . .

Малатион . . . .

Хлорофос . . . .

Дихлорофос . . .

Фталофос . . . .

Севин

Фозалон . . . .

Метилмеркаптофос

Антио

Рогор

Кильваль

Фитиос

• Чувствительность метода оценивается в мг/л вытяжки.

85

Таким образом, оказывается, что для метилмеркап-тофоса, кильваля, фитиоса, рогора и антио метод тон-кослойной хроматографии по степени чувствительностианализа близок к биологическому методу, тогда какдля метилэтилтиофоса, метафоса, метатиона, малатио-на, цидиала, хлорофоса и дихлорофоса биологическийметод по чувствительности значительно превосходитметод тонкослойной хроматографии. В этом случаенеобходимо предварительное концентрирование анали-зируемых пестицидов обычными методами органиче-ской химии [117].

Применение для опрыскивания пластинок в тонко-слойной хроматографии пестицидов, содержащих серу,1,2-дихлор-4,5-дицианобензохинона в сочетании с флу-орометрией позволило повысить чувствительность этогометода [118]:

ПределПестицид чувствитель-

ности, мкгРогор 0,050Этион 0,010Гузатион 0,050Малатион 0,025Прометрин 0,100Тимет 0,040

Оценка пестицидов на тонкослойных хроматографахпри помощи ингибирования ферментативных реакций.Этот метод может быть с успехом использован не толь-ко для оценки остаточных количеств пестицидов в окру-жающей среде и продуктах питания, но и для изученияпутей метаболизма пестицидов в организме, а также вобласти криминологии и судебной химии.

Экстракт, содержащий исследуемый пестицид, нано-сят на хроматографическую пластинку и подвергаютхроматографии. Затем эту пластинку последовательнообрабатывают раствором фермента и раствором суб-страта. В результате на хроматографической пластинкепроисходит ферментативная реакция. Присутствие впятне пестицида ингибирует эту реакцию. Для иденти-фикации пятен на пластинке в том случае, если они бес-цветны, применяют соответствующие индикаторы.Иногда бесцветные пятна контрастируют с окрашеннымфоном пластинки. Такова, в общих чертах, техника

86

метода тонкослойно-хроматографического ингибирова-ния ферментов.

При помощи этого метода были идентифицированыразличные хлорсодержащие пестициды; в качествефермента использовали фосфатазы, субстратом служилнафтил- или нитрофенилфосфат [119].

Чувствительность метода зависит от использованно-го субстрата, пестицида и предварительной подготовкиматериала (см. табл. 14).

Т а б л и ц а 14. Чувствительность (в мкг) метода тонкослойно-хроматографического ингибирования ферментов

НФФ — нитрофенилфосфат; НФ — нафтилфосфат

Пестицид

Кислая фосфатаза

НФФ НФ

Щелочная фосфатаза

НФФ НФ

ДДТдддДДЕКельтан . . . .МетоксихлорПер фан . . . .ГексахлорбензолЛиндан . . . .Изодрин . . .Эндрин . . . .Альдрин . . .Дильдрин . . .Гептахлор . . .Октахлор . . .ЭндосульфанОктафеп . · .

703020302030

1004040302040505040

loo

301010772

Ю030302020201071080

5060502030201501507080608050605050

866262

7070403030108820

Как видно из приведенных в табл. 14 данных, наф-тилфосфат оказался более чувствительным субстратом,чем нитрофенилфосфат.

В работе [120] для оценки хлорорганических пе-стицидов в качестве фермента применяли трипсин, суб-стратом служил гидрохлорид я-нитроанилида N-бензо-иларгинина.

По чувствительности метод тонкослойно-хроматогра-фического ингибирования ферментов может с успехомконкурировать с токсикологическим определением пе-стицидов по индексу летальности (LD50) и может быть

87

использован для токсикологической оценки пестици-дов [121].

Представляют интерес работы, показывающие воз-можность применения этого метода в области судебнойхимии [121—123]. В качестве ферментов использовалиэстеразу печени быка, субстратом служил β-нафтил-ацетат.

Показано [121, 123], что метод тонкослойно-хромато-графического ингибирования ферментов по чувстви-тельности значительно превосходит метод химическогоопределения пестицидов и не уступает трудоемкомубиологическому методу.

В цифровом исчислении предел чувствительностиопределения пестицидов методом ТСХ-ФИ составляетЮч-50 иг.

Т а б л и ц а 15. Тонкослойно-хроматографическое определениепестицидов ингибированием ферментов

+ наличие ингибирования; — отсутствие ингибирования

Пестицид

Пределчувстви-тельно-

сти*,нг

Эстеразы, полученные из печени

Севин 1 -f- -f- + + ( — ) * *Дихлорофос . . . . 8 -j- + + +Этион 10 + + 4- +Метасистокс-И . . . 50 -j- -j- + -j-Меркаптофос . . . . 50 -j- -j- -j- -j-Метасистокс-Р . . . . 50 + + + +Porop 10 000Диметоксон 10 000 -j- + + +

* Наименьшее количество пестицида, при котором происходит ингибиро-вание фермента пестицидом.

** При использовании водной вытяжки из печени ингибирование ферментане происходит, тогда как при использовании фермента, экстрагированногос помощью трисбуфера, осуществляется ингибирование.

Показана [124] успешная возможность сочетанияметодов тонкослойно-хроматографического ингибирова-ния ферментов и полярографии для анализа фосфорор-ганических пестицидов —• метатиона и его аналогов.Сорбентом служит силикагель; для проявления хрома-тограммы использовали систему петролейный эфир(фракция, перегоняющаяся при 60—80°С) — ацетон(3:1); ферменты — препараты эстераз. После опры-

88

Т а б л и ц а 16. Значения R; для пестицидов на различных адсорбентахв разных системах растворителей:

I — ацетон — бензол — пентан (20:10:70); II — ацетон— гексан (20.80)

Пестицид

Кизельгель Силикагель СиликагельD-5

СиликагельΗ

СиликагельAR

Окисьалюминия

DS-5

II

Темик . .

Карбоьалат

Байгон . .

Фурадан .

Аминокарб

Мезурол .

Мобам

Орто-5353

Тринид .

Цектран .

0,62

0,89

0,77

0,80

0,70

0,80

0,69

0,89

0,86

0,21

0,35

0,30

0,20

0,28

0,35

0,25

0,39

0,37

0,43

0,64

0,57

0,45

0,45

0,54

0,45

0,65

0,12

0,64

0,14

0,26

0,22

0,18

0,18

0,22

0,14

0,25

0,03

0,24

0,38

0,55

0,42

0,33

0,33

0,47

0,33

0,61

0,07

0,61

0,08

0,18

0,14

0,12

0,12

0,18

0,09

0,19

0,01

0,19

0,43

0,63

0,49

0,51

0,51

0,60

0,51

0,68

0,16

0,71

0,17

0,28

0,22

0,21

0,21

0,27

0,20

0,32

0,04

0,30

0,47

0,52

0,47

0,62

0,47

0,60

0,15

0,60

0,27

0,23

0,26

0,21

0,33

0,26

0,35

0,05

0,39

0,60

0,73

0,63

0,57

0,57

0,63

0,52

0,73

0,03

0,73

0,20

0,42

0,20

0,20

0,22

0,27

0,16№0,30I

0,0

0,30

скивания пластинки раствором фермента ее помещаютво влажную камеру, насыщенную парами воды, и вы-держивают в течение 30 мин. Затем опрыскивают про-являющим реагентом. Пятна переносят в небольшую ко-лонку и элюируют минимальным количеством ацетона;полученный элюат оценивают полярографически.

При тонкослойно-хроматографическом ингибирова-нии ферментов были использованы {125] также эсте-разы, полученные из печени быка, свиньи, овцы, обезьяныи курицы. Показано, что, во-первых, ферментативныереакции обладают разным пределом чувствительно-сти по отношению к ингибированию различными пести-цидами, а во-вторых, в зависимости от природы полу-ченной ферментативной вытяжки ингибирование фер-мента может и не осуществляться (см. табл. 15).

Т а б л и ц а 17. Пределы чувствительности ингибированияфермента пестицидами (фермент — эстераза из печени свиньи)

Пестицид

Темик . .КарбоналатБайгонФураданАминокарбМезуролМобамОрто-5353ТринидЦектран

Предел чувствительности,нг

Кизельгель

50,00,5

10,01,0

10,00,10,51,0

100,050,0

Силикагель G

30,00,5

10,01,05,00,10,11,0

50,00,5

Окисьалюминия

10,00,5

10,01,01,00,10,51,05,05,0

Следует отметить, что недостатком данной работыявляется использование не очищенных препаратов фер-ментов, а экстрактов из печени.

Метод тонкослойно-хроматографического ингибиро-вания ферментов был тщательно изучен [126] длягруппы пестицидов — производных карбаминовой кисло-ты. Проведено сравнение различных типов адсорбентов(кизельгель, силикагели разных марок, окись алюми-ния), систем растворителей, дана оценка чувствитель-ности метода. В качестве ферментов были использова-

90

ны эстеразы из печени быка. Значения Rf для этихпестицидов на различных адсорбентах при использова-нии разных систем растворителей приведены в табл.16.

В табл. 17 приведены наименьшие количества пести-цидов, которые могут быть определены методом фер-ментативного ингибирования в тонких слоях. Интерес-но, что чувствительность метода в значительной мерезависит от типа применяемого адсорбента.

Сочетание методов тонкослойной хроматографиипестицидов и ингибирования ферментативных реакцийв тонких слоях адсорбента еще более расширяет воз-можности метода тонкослойной хроматографии.

Анализу пестицидов при помощи метода тонкослой-ной хроматографии посвящена монография [127,с. 190].

Глава 7

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯКОНСЕРВАНТОВ, ПИЩЕВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ И

АНТИОКСИДАНТОВ

Консерванты. В настоящее время широкое распро-странение получило применение различных консервиру-ющих веществ (консервантов) для увеличения срокагодности пищевых продуктов.

Расширение применения консервантов, увеличениеих количества, а также потребность в их стандартиза-ции — все это привело к необходимости разработки повозможности простых и экономичных способов анализаи определения консервантов в пищевых продуктах.

Хорошие результаты дало использование для анализаконсервантов метода тонкослойной хроматографии.

Значения Rf для некоторых консервантов на смесикизельгеля и кизельгура (1:1) (I) в системе раствори-телей петролейный эфир — хлороформ — муравьинаякислота (100:40:10) [128] и на целлюлозе (II) всистеме растворителей н-бутанол — 35%-ный аммиак —вода (70:20:10) [129] приведены ниже:

*!Консервант j j j

Бензойная кислота 0,77 0,50Сорбиновая кислота 0,72 0,58Салициловая кислота 0,63 0,56Дегидроацетовая кислота 0,57 0,09Бромацетоуксусная кислота 0,41 —Пропил-п-оксибензоат 0,29 0,90Этил-п-оксибензоат 0,24 0,86Метил-и-оксибензоат 0,19 0,75n-Оксибензойная кислота 0,10 —

В табл. 18 приведены значения Rf для некоторыхконсервантов при использовании в качестве адсорбентовсиликагеля, полиамида и их смеси.92

Т а б л и ц а 18. Значения Rf для некоторых консервантовна различных адсорбентах:

I—я-гексан—бензол—ледяная уксусная кислота (1:1:1) [130];II— вода— 28%-ный аммиак (20:5)

Консервант

Сорбиновая кислота . . . .Бензойная кислотаДегидроацетовая кислота . .Салициловая кислота . . . .Изобутил-п-оксибензоат . .м-Бутил-л-оксибензоат . . .Изопропил-п-оксибензоат . .м-Пропил-/г-оксибензоат . .Этил-п-оксибензоат . . . .Метил-и-оксибензоат . . . .

Смесь сили-кагеля и

полиамида

I

0,880,840,740,660,530,490,440,410,350,30

II

0,730,640,630,490,210,240,320,340,460,55

Силикагель

I

0,870,890,960,840,800,790,780,780,770,73

II

0,950,960,950,960,690,690,720,790,880,91

Полиамид

I

0,980,980,800,620,810,780,740,740,690,61

11

0,940,880,850,740,500,490,600,590,700,78

При использовании смеси адсорбентов удается раз-делить бензойную и сорбиновую кислоты, а также про-пил- и изопропил-я-оксибензоаты.

Успешное разделение смеси консервантов осуществ-лено [131] при использовании в качестве адсорбентасмеси целлюлозы и силикагеля (7,5 г целлюлозы ,ΜΝ-300и 15 г силикагеля G в 70 мл дистиллированной воды).Пластинки (20X20 см) предварительно активировалипри 110°С в течение 30 мин. Растворитель: петролей-ный эфир (т. кип. 40—60 °С) — четыреххлористый уг-лерод— хлороформ — муравьиная кислота — уксуснаякислота (50 :40: 20 : 8 : 2). Значения Rf приведеныниже:

Бензойная кислота . . . 0,70

Сорбиновая кислота . . . 0,63

Салициловая кислота . . 0,56

Дегидроацетовая кислота 0,50

Бромацетоуксусная кис-лота 0,30

Пропил-п-оксибензоат . . 0,24

Этил-л-оксибензоат . . . 0,20

Метил-л-оксибензоат . . 0,13

n-Оксибензойная кислота 0,06

Идентификация соединений после хроматографии втонких слоях проводилась в ультрафиолетовых лучах

93

после опрыскивания пластинки различными реаген-тами:

Соединение РеагентБензойная кислота . . . Смесь 4,5 мл 30%-ной Н2О2, 1 мл насы-

щенного раствора MnSO4, 4,5 мл Н2ОСалициловая кислота . . 0,1%-ный водный раствор FeCl3

Дегидроацетовая кислота 3%-ный водный раствор TiCl3 или 0,1%-ный водный раствор FeCl3

Сорбиновая кислота . . . 0,5%-ный раствор К2СГ2О, в 0,3 н. HaSO4

с последующей обработкой насыщеннымраствором тиобарбитуровой кислоты

Бромацетоуксусная кисло-та Смесь (3:1, по объему) растворов фено-

лового красного (24 мг в 2,4 мл 0,1 н.NaOH, ацетон до 100 мл) и ацетатанатрия $ г в 3 мл СН3СООН, водадо 100 мл)

Эфиры оксибензойнойкислоты Смесь 10%-ного раствора NaOHv 2%-ного

спиртового раствора аминоантипиринаи 8%-ного водного раствора K3Fe(CN)6

Данные по хроматографии в тонком слое наиболеечасто используемых пищевых консервантов в различ-ных системах растворителей на полиамиде марокWoelm и Wako В-10 [132] приведены в табл. 19.

Во всех использованных системах растворителей втонком слое полиамида может быть достигнуто удов-летворительное разделение приведенных выше пищевыхконсервантов [132]. Во всех случаях для полиамидамарки Woelm наблюдается значительно более сильноеадсорбционное сродство по отношению к испытаннымконсервантам, чем для полиамида Wako B-10.

Авторы отмечают, что обнаружение пятен на пла-стинках с полиамидным сорбентом при помощи ультра-фиолетовой спектрофотометрии оказалось почти в два-дцать раз более чувствительным, чем на слоях силика-геля. По-видимому, тонкослойная хроматография на по-лиамидных сорбентах может быть использована длямикроанализа пищевых консервантов.

Окраска пятен, возникающих в результате реакциймежду консервантами и реагентами, используемыми дляидентификации их, при хроматографии на тонких слояхкизельгеля — кизельгура приведена в табл. 20.

Пищевые красители. Наряду с различными консерви-рующими веществами в пищевые продукты с цельюпридания им товарного вида добавляют красители.94

Т а б л и ц а 19. Значения Rf некоторых консервантов на слоях полиамидов марок

Woelm и Wako B-10

I—метанол—вода (6:4); II—ацетон—вода (5:5); Ш—метанол—ацетон—вода (5 :1 :4) ;IV—метанол—25%-ный аммиак—вода (2:1:7); V—ацетон—вода (3:7); VI—н-гексан—ацетон (8:2)

Консервант

Полиамид Woelm

III IV VI

Полиамид Wako B-10

II III IV VI

Этил-л-оксибензоат

н-Пропил-п-оксибензоат . . . .

н-Бутил-п-оксибензоат

Сорбиновая кислота

Дегидроацетовая кислота . . .

Бензойная кислота

n-Оксибензойная кислота . . .

Салициловая кислота

0,32

0,27

0,22

0,20

0,18

0,14

0,13

0,05

0,41

0,37

0,32

0,29

0,25

0,21

0,18

0,05

0,38

0,32

0,29

0,56

0,73

0,46

0,30

0,18

0,64

0,55

0,44

0,92

0,79

0,85

0,96

0,56

0,16

0,10

0,07

0,32

0,54

0,23

0,16

0,14

0,11

0,15

0,19

0,64

0,45

0,56

0,04

0,25

0,53

0,49

0,44

0,43

0,45

0,34

0,31

0,12

0,63

0,58

0,54

0,44

0,40

0,33

0,34

0,16

0,61

0,56

0,52

0,72

0,83

0,66

0,53

0,25

0,76

0,68

0,58

0,93

0,86

0,91

0,95

0,75

0,34

0,25

0,18

0,55

0,73

0,43

0,33

0,29

0,15

0,21

0,28

0,68

0,59

0,62

0,06

0,40·

Т а б л и ц а 20. Окраска пятен, образующихся при проявлении тонкослойныххроматограмм ряда консервантов различными реагентами

Реагент и условияприменения

Салици-ловая

кислота

Бензой-ная кис-

лота

Сорбино-вая кис-

лота

2-Оксиби-фенил

Дегидро-ацетоваякислота

л-Оксибен-зойнаякислота

Метил-л-оксибен-зойная

кислота

Этил-п-оксибен-

зойнаякислота

Пропил-п-оксибен-зойная

кислота

Родамин В — Н аО2:0,05%-ный растворродамина В с после-дующей обработкой3%-ным раствором

Бромкрезоловый зеле-ный

Тиобарбитуровая кис-лота (насыщенныйраствор)

Тимол (20%-ный спир-товый раствор), за-тем нагревание 10 минпри 90 СС, обработка4н. H2SO4 и нагре-вание 10 мин при120 °С

H2O2 + FeCl 3 :a) об-работка 3%-ным ра-створом Н2О2, нагре-вание 5 мин при90 °С, опрыскивание2%-ным растворомFeCl3

пурпур-ная

оранже-во-желтая

светло-пурпур-

ная

пурпур-ная

темно-пурпур-

ная

желтая

светло-пурпур-

ная

розовая

желтая

ярко-красная

пурпур-ная

светло-желтая

пурпур-ная

пурпур-ная

желтая

пурпур-ная

светло-желтая,

желто-ко-ричневая

синяя

желтая

желтая

розовая розовая розовая

желтая желтая желтая

желто-коричне-

вая

б) нагревание 5 мин? при 90 °С, обработка

2%-ным растворомFeCl3, затем 3%-нымраствором Н2О2

Бромфеноловый синий:обработка смесьюрастворов 120 мгбромфенолового си-него в 100 мл водыи 60 мг метиловогокрасного в 100 мл96%-ного этанолас добавлением 100 млфосфатного буфера(рН 7,17) с последу-ющей обра боткойдиа-зотированной сульф-аниловой кислотой

2,6-Дихлор-я-бензохи-нон-4-хлоримин,1%-ный раствор

и-Нитроанилин диазо-тированный

Сульфат церия:к 4 мл 2,5%-ногораствора CeSO4 До-бавляют 1 г трихлор-уксусной кислоты,нагревают и освет-ляют 1,рибавлением

H2SO4

пур-пурная

желтая

коричне-во-серая

темно-коричне-

вая

светло-желтая

—

—

желтая

коричне-вая

фиоле-товая

пурпур-ная

корич-невая

коричне-во-крас-

наяфиолето-

вая

корич-невая

желтая

серая

—

зеленая

желтая

желтая

светло-желтая

серая

светло-желтая

светло-желтая

серая

— желтая

светло-желтая

светло-желтая

серая

желтая

светло-желтая

светло-желтая

В связи с этим в настоящее время поставлены во-просы о возможной физиологической роли и значениидобавляемых в продукты пищевых красителей, о воз-можности накопления их в организме, токсичности, кан-церогенности и т. д.

Для правильной постановки и решения всех этихвопросов весьма важна разработка методов определенияи анализа пищевых красителей, присутствующих обычнов продуктах в микроколичествах.

Методы определения пищевых красителей из про-дуктов сводятся, как правило, к их экстракции с после-дующим определением при помощи различных анали-тических методов. В последнее время для этой целивсе шире начинает применяться метод хроматографиив тонких слоях.

Так, [133] тонкослойная хроматография была ис-пользована для разделения и анализа 20 водораствори-мых красителей, употребляемых в пищевой промышлен-ности. В качестве адсорбента применяли полиамидмарки Wako. Растворителями служили системы, содер-жащие метанол (А), 28%-ный водный раствор аммиакаи воду (А : 1 : 16).

В этом случае может быть достигнуто вполне удов-летворительное разделение пищевых красителей, причемзначение Rf существенно изменяется в зависимости отколичества метанола в растворителе. С увеличением со-держания метанола в смеси Rf, как правило, повышает-ся [133].

Для тонкослойной хроматографии пищевых красите-лей в качестве адсорбента был использован также сили-кагель [134]. Ниже приведены значения Rf некоторыхкрасителей на этом адсорбенте в различных системахрастворителей (I — диметилсульфоксид — изопропа-нол (70:30)+25 г CuSCU; II — диметилсульфоксид —изопропанол — уксусная кислота (30:69:1) :

*/Краситель ] j j

Амарант 0,1 0,2Аурамин 0,8 0,8Кислотный бордо 0,1 0,1Бриллиант черный BN 0,3 0,2Эритрозин 0,9 0,9Эозин 0,9 0,9Индигокармин 0,2 0,3

98

Красный 2G 0,2 0,3Красный 6В 0,2 0,2Красный 10В 0,2 0,3Красный FB 0,2 0,2Кислотный желтый 0,3 0,3Кислотный красный 0,3 0,4Нафтоловый желтый 0,2 0,3Кислотный оранжевый 0,2 0,3Оранжевый 1 0,8 0,8Оранжевый GGN 0,3 0,3Кислотный алый 0,1 0,2Родамин В 0,7 0,7Хинолин желтый 0,3 0,3Хризоидин 0,9 0,9Хризоин S 0,8 0,5Черный 7984 0,1 0,1

Многие из приведенных красителей имеют довольноблизкие или даже идентичные значения Rf и, следова-тельно, с трудом поддаются разделению в данных ус-ловиях.

Антиоксиданты. В настоящее время антиоксидантышироко применяют для защиты различных материаловот окислительного действия кислорода воздуха и озона.В частности, антиоксиданты используют для защитыкаучуков и резин, различных смазочных материалов,промышленных жиров и т. д. [135].

Как метод анализа антиоксидантов в последнеевремя начинают использовать и метод хроматографии втонких слоях. Описан [136] метод количественноготонкослойного определения таких антиоксидантов, какнеозон Д (фенил-р-нафтиламин), диафен ФП (N-изо-пропил-Ы'-фенил-я-фенилендиамин) и я-оксинеозон(я-оксифенил-р-нафтиламин).

Методы химического и спектрофотометрическогоопределения этих соединений без их предварительногоразделения трудно осуществимы. Поэтому было прове-дено разделение антиоксидантов в тонком слое силика-геля с последующим препаративным выделением пятени количественным определением содержащихся в нихантиоксидантов. В качестве растворителей использованасмесь — бензол — ацетон — концентрированный рас-твор аммиака (100:5:0,1); адсорбент — силикагельмарки КС К.

Значения Rf этих веществ, а также характер окраскипятен в ультрафиолете приведены ниже:4* 99

Неозон Д 0,84 Ярко-фиолетовая

Диафен ФП 0,73 Коричневая

я-Оксинеозон 0,55 Бледно-лиловая(0,42)

Неозон Д и «-оксинеозон определяют по реакции сдиазотированным и-нитроанилином, диафен ФП — припомощи смеси, приготовленной из 0,5 г ацетата меди,4,66 г КС1, 10 мл 0,5 н. НС1 и 250 мл дистиллированнойводы с последующим доведением до объема 1 л эта-нолом.

В настоящее время антиоксиданты широко исполь-зуются во многих отраслях промышленности [137].

Глава 8

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЫ*

Тонкослойная хроматография находит широкое при-менение в химии органических соединений серы, особен-но при их синтезе, исследовании реакций и установле-нии строения. Это обусловлено тем, что при образова-нии и превращениях соединений, содержащих серу,происходит, как правило, существенное изменение ихадсорбционной способности. Оно весьма значительно, вчастности, при реакциях, протекающих с участием са-мого атома серы или групп, связанных с этим атомомвзаимным влиянием.

С помощью тонкослойной хроматографии изучалиадсорбционные свойства различных органических со-единений серы: S, S'-диоксидов, дисульфидов, дитиокар-баматов, изотиомочевин, изотиоцианатов, ксантогенатов,сложных эфиров тиокислот, сульфидов, сульфоксидов,сульфонов, сульфиновых и S-сульфоновых кислот, суль-фенамидов, сульфинамидов, тиазолов, тиоамидов, тио-карбаматов, тиокетонов, тиолактонов, тиоловых кислот,тиолов, тиомочевин, тиосульфинатов, тиосульфонатов,тиофенов, тиоцианатов, тиурамов, тиофосфорных соеди-нений.

Адсорбенты. При тонкослойной хроматографии орга-нических соединений серы применяют различные моди-фикации двух адсорбентов — силикагеля и окиси алю-миния (как в виде незакрепленного, так и в виде за-крепленного слоев).

Незакрепленный слой силикагеля марки АСК с раз-мером частиц 0,063—0,16 мм2 использовали [6] дляразделения сульфидов, дисульфидов, сульфоксидов итиофосфорных соединений. На силикагеле марки КСК,

* Глава написана Е. Н. Карауловой.

101

содержащем 6% воды, хроматографировали тиофос-форные соединения [138].

На закрепленном слое силикагеля разделяли [139]сульфиды, сульфоксиды и сульфоны, на слое силика-гель — гипс разделяли сульфиды, тиолактоны, тиоловыекислоты и полярные производные тиазола [140], а так-же дисульфиды, тиолы [141] и тиофосфорные соедине-ния [142—143].

Для тонкослойной хроматографии [144] различныхклассов сернистых соединений можно использоватьсиликагель, закрепленный крахмалом и содержащийполикомпонентную флуоресцентную добавку, а такжеокись алюминия различных степеней активности (неза-крепленный слой). На незакрепленном слое окиси алю-миния разделяли смеси сульфидов, сульфоксидов исульфонов. На незакрепленном слое окиси алюминиятретьей степени активности хроматографировали суль-фиды и тиокетоны, а на окиси алюминия четвертой сте-пени активности — сульфоксиды [148].

Реагенты для проявления хроматограмм органиче-ских соединений серы. Наиболее универсальным про-явителем для органических соединений серы являютсяпары иода. Для этого пластинку помещают в сосуд(обычно в большой эксикатор), на дне которого нахо-

дятся кристаллы иода и несколько миллилитров воды.После проявления избытку иода дают испариться · навоздухе. Время проявления различно, оно зависит, впервую очередь, от степени окисления атома серы(и, разумеется, от количества детектируемого вещест-ва). Так, например, тиолы и сульфиды проявляютсячерез несколько минут, сульфоксиды — через 10—15 мин,сульфоны — значительно медленнее. Предел [148] чув-ствительности для сульфоксидов 2,5—10 мкг.

Проявление парами иода удобно тем, что его можноприменять при работе с незакрепленным слоем сорбен-та. Однако оно непригодно для препаративных целей,так как очень трудно четко отграничить зону действияпроявителя, что при этом варианте ТСХ необходимо.

Для различных классов сернистых соединений опи-сано свыше двух десятков проявителей, применяемыхпутем опрыскивания хроматограммы, т. с. пригодныхдля работы на закрепленном слое сорбента (см.табл. 21).

102

Т а б л и ц а 21. Реагенты для проявления органическихсоединений серы при ТСХ

I — S.S'-диоксиды, II — дисульфиды, III — дитиокарбаматы, IV — изотио-мочевины, V — изотиоцианаты, VI — ксантогенаты, VII —сложные эфиры тио-кислот, VIII — сульфиды, IX — сульфоксиды, X — сульфоны, XI — сульфино-вые кислоты, XII — S сульфоновые кислоты, XIII — сульфенамиды, XIV —сульфинамиды, XV — тиазолы, XVI — тиоамиды, XVII — тиокарбаматы,XVIII — тиокетоны, XIX — тиолактоны XX — тиоловые кислоты, XXI — тиолы,XXII — тиомочевины, XXIII — тиосульфинаты, XXIV — тиосульфонаты, XXV —тиофены, XXVI — тиоцианаты, XXVII — тиурамы, XXVIII—тиофосфорные

соединениг

ПроявительОбнаруживаемые

соединения Литература

Анилин—Вг2

10^"—бензидин*

Иодоплатинат

1,3,6,8-Тетрамеркуртетрааце-тат флуоресцеина (ТМФ) . .

Платинохлористоводор однаякислота

N-Бромсукцинимид—флуоресцеин

L· —NaN 3

PdCl2 — Calcein (флуоресцент-ная добавка)***

K I + H C 1Ацетальдегид — нитропруссид;

НС1

НС1О4 + Н5Юв

КМпО4 + конц. H2SO4 . . . .

H2Se5,5'-Дитиобис(2 нитробензой-

ная) кислота2% ный раствор нитропруссида

натрия в 75%-ном спирте . .

Бромтимоловый синий

0,1 н. КМпО4 в Н3РО4 . . . .

0,4%-ный раствор изатина вконц. H2SO4 с последующимоблучением УФ-светом . . .

II, III, VIII, XIII,XIV, XXI—XXIV

II, V, VI, VIII, XVI,XVIII, XXI, XXII

I, II, VIII—XI, XXI

VII, XVI, XVIII, XXI,XXII, XXVII

XXV

149, 150

151

152, 153

154

II, VIII—X, XXI, XXIIIII, VI, XIII, XV,

XXVIIИ, VIII, XXI, XXII,

XXVIII**

νΐΐΐ, χ ν ΐ , χ χ - χ χ πXI—XI, XXIV

VIII—XXXI, XXII, XXVIII

VIII—XII, XV

XIX, XXI

XIX****, XXIVIII, XXI

XVIII

155, 156157

142, 143152, 153

158159

160

161

162

163

164

140

165

147

166

* Бензидин ядовит'** Нижний предел чувствительности 1—5 мкг.

*** Предел чувствительности 10—100 нг**** Предел чувствительности для тиобутиролакюна 0,1 мкмоль

103

Для тонкослойной хроматографии сернистых соеди-нений можно использовать силикагель, содержащийсмесь трех флуоресцентных добавок, поглощающихУФ-излучение в различных областях спектра; проявля-ют хроматограмму, освещая ее подходящим источникомУФ-света [144].

Сернистые соединения, дающие положительную про-бу при методе «смешанных флуоресцентных добавок»,должны содержать группы C = S (тиомочевины, изотио-мочевины, тиурамы, тиолактоны, сложные эфиры тио-кислот, ксантогенаты, дитиокарбаматы) или связь S—S(дисульфиды, S-сульфоновые кислоты).

Положительную пробу дают также тиофосфорныесоединения (со связью P = S). Этим методом не прояв-ляются тиолы, сульфиды, сульфоновые и сульфиновыекислоты и их эфиры, моноэфиры серной кислоты. Всеже диапазон обнаруживаемых соединений весьма ши-рок.

При работе методом «смешанных флуоресцентныхдобавок» используют пластинки, где слой адсорбентатолщиной 250 мкм состоит [167] из 89% силикагеля,1% крахмала и 7,9% смеси флуоресцентных добавок[ёггРгО? с примесью солей олова (λΜ8κο = 260 нм, голу-бая флуоресценция), Zn 2Si0 4 с примесью солей марган-ца (λΜ8κο=280 нм, зеленая флуоресценция) и YVO4 спримесью солей европия (Ямакс = 330 нм, красная флуо-ресценция)], взятых в соотношении 2 0 : 5 : 1 . [Такиепластинки под названием «Wakogel FM» выпускаетфирма Wako (Осака, Япония).]

Чувствительность этого метода проявления высока10~8—10~и моль. Цвет пятна зависит от длины волныпоглощаемого УФ-света, так, например, пятна дисуль-фидов, изотиомочевины, изотиоцианатов, S-сульфоновыхкислот, тиолактонов, тиоцианатов окрашены в красныйцвет, пятна дитиокарбаматов и тиофосфорных соедине-ний — в красно-фиолетовый, ксантогенатов — в сине-зеленый.

Системы элюентов. При тонкослойной хроматогра-фии органических соединений серы применяют различ-ные системы элюентов [оптимальный выбор их дик-туется поставленной задачей (см. табл. 22, 23)].

Качественный анализ органических соединений, со-держащих серу. Метод тонкослойной хроматографии

104

Т а б л и ц а 22. Системы элюентов при ТСХ органическихсоединений серы на силикагеле

Соединения

Дисульфиды

ароматическиеполярные

разделение гомологов

разделение с тиоло-выми кислотами

Ксантогенаты

Сложные эфиры тиокис-лот

Сульфиды

разделение с суль-фоксидами и суль-фэнами

КетосульфидыСульфоксиды

разделение с сульфи-дами и сульфонами

Сульфоны

разделение с сульфи-дами и сульфокси-дами

S-Сульфоновые кислоты

Тиоамиды

Элюенты

Диизопропиловый эфир* — изо-октан (1,96:98,04)

Фенол — вода (4:1); бутанол —пиридин — вода (1:1:1)

БензолБутанол — уксусная кислота —

вода (5:2:3)Жидкий парафин (5%)** — ме-

танолБутанол — уксусная кислота —

вода (12:3:5)Пропанол — 25%-ный аммиакБензол — диоксан — 28%-ный

аммиак —• насыщенный рас-твор тетрабората натрия;жидкий парафин (5%)** —5%-ный аммиак; жидкий па-рафин (5%)** — 10%-ныйраствор ацетата натрия

Бутанол — уксусная кислота —вода (5:2:3)

Диизопропиловый эфир* — изо-октан (1,16:98,84)

Ацетон — бензол (2,5:97,5); то-луол—этилацетат (1:1)

Диизопропиловый эфир* — изо-октан (1:4; 3:2)

ИзооктанГексан — ацетон (2:1)Хлороформ

Диизопропиловый эфир*Ацетон — бензол (2,5:97,5)ХлороформТолуол — этилацетат (1:1)ХлороформАцетон—бензол (2,5:97,5)Толуол — этилацетат (1:1)

Бутанол — уксусная кислота —вода (5:2:3); пропанол —28%-ный аммиак (7:3)

Гексан-ацетон (2:1)

Литера-тура

6

141

167167

167

141

144167

167

6

139

140

168158169

158139169139169139139

167

158

105

Продолжение табл. 22

Соединения

Тиолактоны

Тиоловые кислоты

ТиолыТиомочевины

Тиофеныполярные .

Тиурамы

Тиофосфорные соедине-ния

Элюенты

Диизопропиловый эфир* ·— изо-октан

Бутанол — уксусная кислота —вода (5:2:3) *

Диизопропиловый эфир* — изо-октан

Гексан — ацетон (2:1)Фенол — вода; бутанол — ук-

сусная кислота— вода (12:3::5); бутанол — пиридин — во-да (1:1:1)

Гексан — ацетон (2:1)Жидкие парафины (5%)** —

хлороформ; жидкие парафины(5%)** —вода

Бензол — хлороформ (9:1)Диизопропиловый эфир* — изо-

октан (1,16:98,84%)Бензол; этилацетат — гексан

(1:6)Диизопропиловый эфир* — изо-

октан (1,18:98:82)Гексан — ацетон (4:1)Метанол — хлористый метилен—

10%-ный аммиак (20:80:3;7:12:1)

Литера-тура

140

167

140

158141

158167

1666

167

6

142143

* Диизопропиловый эфир чрезвычайно легко окисляется при хранениис образованием взрывчатых перекисей (через 2—3 недели содержание перекисейможет достичь 30%).

** Неподвижная фаза.

был использован для контроля скорости и глубины пре-вращений при таких реакциях, как окисление сульфидов,перегруппировка арилалкенилсульфидов, реакция Пум-мерера, дегидратация тиацикланолов, присоединение ккратной связи ненасыщенных сульфидов и др. [6]; осу-ществлено разделение стереоизомероз тиабицикланов итиабициклансульфоксидов [6].

Необходимо отметить, что при наиболее часто при-меняющейся восходящей адсорбционной хроматографиина незакрепленном слое сорбента абсолютные значенияRf не обладают высокой воспроизводимостью, однакопри разделении смесей сохраняется постоянная раз-ность Rf, что при работе с подходящим свидетелем по-

106

' Т а б л и ц а 23. Система элюентов при ТСХ органическихсоединений серы на окиси алюминия

Соединения

Сульфиды

разделение гомологов

разделение с сульфо-нами

Кетосульфиды

ОксисульфидыСульфоксиды

Сульфоныразделение с сул!-фи-

дамиТиокетоныТиолы

алифатические

ароматические

Тиофены, неподярныеТиофосфорные соединения

Элюенты

Диизопропиловый эфир* (с по-степенным увеличением ег одоли в смеси)— изооктан

ИзооктанЦетан** — хлороформ — мета-

нол (1:3)Гексан — эфир

Диизопропиловый эфир* — изо-октан (9:1)

Изоокган·—эфир (3:2)Хлороформ; ацетон — четырех-

хлористый углеродГексан — эфирПетролейный эфир — эфир (от

1:1 до 1.4)ЭфирИзооктанЦетан** —96% -ная уксусная

кислота — ацетонитрил (1.3)Цетан** •— метанол — хлоро-

форм—вода (5:5:1)Петролейный эфирГетан — ацетон (10:1)

Литера-тура

6, 168

6

165

145

6

6148

145170

1456

165

165

166161

* Диизопропиловый эфир чрезвычайно легко окисляется при хранениис образованием взрывчатых перекисей (через 2—3 недели содержание перекисейможет достичь 30%)

** Неподвижная фаза

зволяет получать вполне удовлетворительные резуль-таты.

К о н т р о л ь о к и с л е н и я с у л ь ф и д о в в с у л ь ф -о к с и д ы . Значения Rf убывают в ряду:

Сульфиды > Сульфоны > СульфоксидыПри хроматографировании смеси сульфоксида и со-

ответствующего сульфида на окиси алюминия II степе-ни активности в системе растворителей ацетон — четы-реххлористый углерод или хлороформ сульфид четкоотделяется от сульфоксида и движется с линией фрон-та; при использовании в качестве растворителя изоок-тана сульфоксид остается на старте. Метод был исполь-зован, например, для контроля полноты окисления

107

Чыс,^ис-2-метил-1-тиадекалина перекисью водорода βуксусной кислоте [171].

Р а з д е л е н и е п р е д е л ь н ы х и н е п р е д е л ь -ных с у л ь ф и д о в . Полнота превращения сульфокси-дов в ненасыщенные сульфиды нагреванием с уксуснымангидридом (реакция Пуммерера) также контролируетсяметодом ТСХ, в качестве элюента используют ацетон —четыреххлористый углерод или хлороформ.

При этой реакции наряду с образованием непре-дельного сульфида происходит частичное восстановле-ние сульфоксида в соответствующий насыщенныйсульфид. Так, например, диизопентилсульфоксид превра-щается [6] в смесь цис- и гранс-2,8-диметил-5-тианоне-нов-3 и диизопентилсульфида, которую не удалось раз-делить методом газо-жидкостной хроматографии. Мето-дом тонкослойной хроматографии диизопентилсульфид(Rf = 0,3) отделен [6] от смеси 2,8-диметил-5-тианоне-нов-3 (#, = 0,5).

Количественный анализ органических соединенийсеры. Разработан метод количественного определениядисульфидов, ксантогенатов, тиомочевин и тиурамов насиликагеле, содержащем смешанные флуоресцентныедобавки [144]. Были использованы следующие систе-мы элюентов: для дисульфидов —• бензол, для ксанто-генатов — неподвижная фаза — жидкие парафины(5%), подвижная фаза — 5%-ный раствор аммиакаили 10%-ный раствор ацетата натрия; для тиомочевиннеподвижная фаза та же, что для ксантогенатов, по-движная — хлороформ, для тиурамов — бензол илисмесь этилацетат — гексан (1 : 6).

После проявления в УФ-свете пятна копируют натолстую бумагу, вырезают и взвешивают. Площадьпятна рассчитывают, сравнивая эту массу с массойбумаги площадью 100 мм2.

Количественное определение изученных классов со-единений возможно в пределах следующих концентра-ций (в моль):

Диалкилдисульфиды . . . . (3,3—10) -10 8

Ароматические дисульфиды (2—7,5) -10 г °Ксантогенаты (1,65—5) · 10~9

Тиомочевины (2—10)·10~9

Тиурамы (4—20)-10~9

108

Препаративная тонкослойная хроматография орга-нических соединений серы. Методика препаративнойтонкослойной хроматографии (ПТСХ) применительно корганическим соединениям серы разработана авторамиработы [171]. Были разделены и очищены от примесейнасыщенные и ненасыщенные сульфиды, тиабициклано-лы, кетосульфиды и сульфоксиды [6]. Удалось осущест-вить полное или частичное разделение смесей стерео-изомерных тиабицикланов, тиабицикланолов и тиаби-циклансульфоксидов [6]. Сочетая методы ТСХ, ПТСХи газо-жидкостной хроматографии, можно количествен-но оценить состав смеси стереоизомерных тиабицикла-нов, образующихся при нестереоспецифическом синте-зе [6].

Для проявления сернистых соединений при ПТСХудобен универсальный проявитель — раствор 0,5 г пер-манганата калия в 25 мл концентрированной сернойкислоты. Проявление ведут, смачивая оба края вдольдлинных сторон пластины проявителем (его наносят спомощью пипетки с тонко оттянутым кончиком), приэтом у краев зон адсорбированных сернистых соедине-ний окраска адсорбента становится светло-желтой илибурой. После проявления краев отграничивают зоны раз-деления веществ поперек пластины и собирают их, вса-сывая адсорбент с помощью фильтра с пористой пла-стинкой № 2; поглощенные вещества десорбируют обыч-ным образом.

Контроль полноты десорбции и хода разделения ча-ще всего осуществляют с помощью аналитической ТСХ.Если при однократной ПТСХ получают промежуточныефракции, то их хроматографируют многократно до техпор, пока не будет достигнуто четкое разделение.

Р а з д е л е н и е с т е р е о и з о м е ρ о в 2 - м е т и л - 1 -т и а д е к а л и н а . Смесь четырех стереоизомеров 2-ме-тил-1-тиадекалина (цис-транс-, транс-транс-; цис-цис- итранс-цис-) хроматографировали [6] на нейтральнойокиси алюминия II степени активности, растворитель —изооктан. Получены две фракции — цис-цис-2-метил-1-тиадекалин (56%) и смесь остальных трех изомеров(44%). Данные ПТСХ положены в основу колоночнойхроматографии этой смеси стереоизомеров [169].

Разделение стереоизомеров 2-метил-1-тиадекалин-1-сксида, различающихся пространственным расположе-

109

нием сульфоксидной группы. При окислении Цис-транс-2-метил-1-тиадекалина образуется смесь двух стерео-изомерных сульфоксидов. Эта смесь была разделена нанейтральной окиси алюминия III степени активности,растворитель ацетон ·— четыреххлористый углерод(1:4) . Выделены транс-цис-транс-изоыер («|>0 =1,4721,,£/ = 0,39; 70,8%) и цис-цис-транс-изомер [Rf = 0,57; т. пл74,5—76 °С (из изооктана); 29,8%].

Глава 9

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯАЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ

В качестве сорбентов для тонкослойной хроматогра-фии азотсодержащих соединений (амины, аминокисло-ты и их производные, .белки) используют производныецеллюлозы, обладающие ионообменными свойствами,сефадексы, гидроксилапатит, силикагель, порошки цел-люлозы.

К а н и о н и т а м на о с н о в е ц е л л ю л о з ы отно-сятся диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза),триэтиламиноэтилцеллюлоза (ТЭАЭ-целлюлоза); эктео-ла-целлюлоза, аминоэтилцеллюлоза (АЭ-целлюлоза).К к а т и о н и т а м на о с н о в е ц е л л ю л о з ы относят-ся карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза), сульфо-этилцеллюлоза (СЭ-целлюлоза), фосфорилированнаяцеллюлоза. Характеристика некоторых используемых втонкослойной хроматографии типов ионитов на основецеллюлозы приведена ниже:

Ионит

Диэтиламиноэтил-целлюлоза . . .

Аминоэтилцеллю -лоза

Полная обмен-ная емкость

мг-экв/г

0,4—1,0

0,1—0,7

Ионит

Эктеола -целлюлозаКарбоксиметилцел-

люлоза . . . .Сульфоэтилцел лю -

лоза

Полная обменная емкость

мг-экв/г0,3—0,5

0,3—0,7

0,5

Для хроматографии в тонких слоях используютс е ф а д е к с ы различных марок. С их помощью осуще-ствляют фракционирование веществ по молекулярноймассе:

Диапазон фракционированияСефадекс (сверхтонкий) пептидов по молекулярной

массеG-25 1 000—5 000G-50 1500—30 000G-75 3 000—70 000G-100 4 000—150 000G-150 5 000—400 000G-200 5 000—800 000

111

При нанесении слоя сефадекса необходимо иметьопределенную консистенцию геля сефадекса, которуюполучают после набухания сефадекса в буферном рас-творе. Объемы буферного раствора, прибавляемого к10 г сухого сефадекса, приведены ниже:

Объем ОбъемСефадекс буферного Сефадекс буферного

(сверхтонкий) раствора, (сверхтонкий) раствора,мм мм

G-25 50 G-100 190G-50 110 G-150 225G-75 150 G-200 250

При работе с сефадексами применяют как нисходя-щую, так и восходящую хроматографию. Для обнару-жения результатов хроматографии разделяемые веще-ства переносят на лист хроматографической бумагипутем контакта бумаги с поверхностью геля в течениеобычно 1 мин. Затем бумагу сушат 30 мин при 80 °С иобрабатывают соответствующими реагентами, напримерв случае белковых соединений 0,1%-ным растворомбромфенолового синего в смеси метанола и уксуснойкислоты (9:1) . Затем бумагу промывают водой, под-кисленной уксусной кислотой.

Г и д р о к с и л а п а т и т — неорганический адсорбент,состава ЗСаз(РО4)2-Са(ОН)2. Он обладает хорошейстабильностью в щелочной среде, широко применяетсядля хроматографии белков. Оптимальное отношениеСа/Р в гидроксилапатите составляет 1,67. Это отноше-ние колеблется от 1,30 до 2,00 в зависимости от спосо-ба получения.

Гидроксилапатит обычно получают взаимодействиемрастворов СаС12 и Na2HPO4 или К2НРО4 [172—175] икипячением образовавшегося СаНРО4 с NaOH. Предло-жен также метод получения гранулированного гидро-ксилапатита [176].

Амины. Для разделения смеси аминов (триптамина,тирамина, серотонина, гистамина) и аминокислот(триптофана, тирозина, гистидина) использовали [177]целлюлозу марки FND; элюирующий раствор — изо-пропиловый спирт — 25%-ный раствор аммиака — вода(80:10:10).

Смесь аминов разделяли на пластинках марки Silu-vol [178] в системе растворителей пиридин — трет-бу-

112

тиловый спирт — 26—27%-ный раствор аммиака( 1 : 1 : 1 ) :

Амин Hf Амин

Эти лен диамин 0,191,5-Диамино-З-азапентан

Ri

(диэтилентриамин)1,8-Диамино-3,6-диазаок-тан (триэтилентетраамин)Пропилендиамин . . . .

0,12

0,070,33

1,6-Диамино-З-азагексан(этиленпропилентри-амин) 0,27

1,11-Диамино-4,8-Диаза-ундекан (трипропилен-тетраамин) 0,10

Триэтаноламин 0,74Диэтаноламин 0,60Моноэтаноламин . . . . 0,46

Для хроматографии ряда аминов [179] в тонкихслоях был использован также силикагель, импрегниро-ванный оксалатом кальция (2 ч. силикагеля, 1 ч. окса-лата кальция и 2 ч. дистиллированной воды). Пластин-ки с сорбентом перед хроматографией активировалинагреванием до 60 °С в течение 24 ч. Значения Rf ами-нов в двух системах растворителей приведены ниже:

Значение R

Амин

Анилин . . . .МонометиланилинДиметиланилин .о-Толуидин . . .ж-Толуидин . . ,я-Толуидин . . . ,о-Анизидин . . . ,ж-Анизидин . . .я-Анизидин . . .о-Фенетидин . . .я-Фенетидин . . .о-Оксианилин . . .ж-Оксианилин . .я-Оксианилин . .о-Нитроанилин . .Λί-Нитроанилин . .я-Нитроанилин . .о-Фенилендиаминж-Фенилендиаминя-Фенилендиамин .

Бензол—этил-ацетат (9 0:10)

0,450,720,880,510,420,360,540,400,200,640,230,140,090,050,560,440,320,П0,080,02

tЧетыреххло-

ристыйуглерод-

этил ацетат(90:10)

0,430,780,920,520,460,380,560,330,180,640,220,120,080,020,490,260,150,050,030,00

Для разделения нитрозаминов в качестве сорбентаиспользовали силикагель [180]. Значения Rf нитроз-аминов приведены ниже:

113

Соединение

Диметилнитрозамин

ЭтилметилнитрозаминДиэтилнитрозаминN-Нитрозопиперидин

ДиизопропилнитрозамииДифенилнитрозамин

Растворитель

к-Гексан — эфир — дихлорметан(4:3:2)

То же»

н-Гексан — эфир — дихлор — ме-тан (5:7:10)

То же (4:3:2)То же (10:3:2)

*/

0,25

0,40 •0,500,60

0,650,80

Аминокислоты и их производные. Для разделенияаминокислот в качестве сорбента использовали цел-люлозу MN-300 с толщиной слоя 0,5 мм [181]. Хрома-тография восходящая, двумерная, в одном направлениииспользовали изопропиловый спирт — метилэтилке-тон — 0,1 н. НС1 (60:15:25), в перпендикулярномнаправлении — метиловый спирт — вода — пиридин(20:5:1) . Для обнаружения пятен аминокислот на

тонкослойных хроматограммах применяли флуоресци-рующие реагенты (флуорескамин), что позволяет увели-чить чувствительность метода [182, 183]. Хроматограм-му опрыскивали 10%-ным раствором триэтиламина вСНгСЬ и после сушки на воздухе в течение несколькихсекунд—0,05%-ным раствором флуорескамина в аце-тоне с повторной обработкой хроматограммы 10%-нымраствором триэтиламина.

Эффективное разделение аминокислот в тонкихслоях может быть достигнуто путем сочетания хрома-тографии и электрофореза [184]. Сорбент — целлюло-за MN-300 с толщиной слоя 0,25 мм, размер пластинок20X40 см. В одном направлении по короткой сторонепластинки проводили нисходящую хроматографию в си-стеме растворителей пиридин — этанол — вода ( 2 : 2 : 1 )в течение 7,5 ч (за ходом хроматографии следили попередвижению пятна красителя — бриллиантового чер-ного). После удаления растворителя слой сорбентапропитывали 0,025 Μ раствором буры и проводилиэлектрофорез в перпендикулярном направлении приградиенте напряжения 10 В/см в течение 3 ч.

Пятна аминокислот обнаруживали при помощи

114

0,1%-ного раствора 2,4,6-тринитробензолсульфокислотыв смеси ацетон — этанол — вода ( 2 : 2 : 1).

Широкое применение хроматография в тонком слоеполучила для разделения производных аминокислот —фенилтиогидантоиновых и дансильных (5-диметилами-нонафтилсульфонильных) производных, широко ис-пользуемых для анализа аминокислот в химии пепти-дов и белков.

Разделение фенилтиогидантоинов [185] проводилисначала в одном направлении в системе растворителейтолуол — пентан — ацетон (60:30:16), затем послесушки на воздухе — в другом направлении в 25%-номводном ацетоне.

Фенилтиогидантоины аминокислот наблюдали в ви-де темных пятен на люминесцирующем фоне. Продол-жительность разделения 30 мин, чувствительность опре-деления 0,05—0,20 нг. Для идентификации применялистандартные растворы фенилтиогидантоинов амино-кислот.

Для тонкослойной хроматографии фенилтиогиданто-иновых производных аминокислот в качестве сорбентаиспользовали также силикагель, а в качестве раствори-телей системы: ксилол — метанол (80: 10) и гептан —дихлорэтан — пропионовая кислота (45:25:30) [186].Проявление велось при помощи 1,7%-ного растворанингидрина в смеси метанол — коллидин — уксуснаякислота (15:2 :5) . Этим методом можно разделятьфенилтиогидантоины, имеющие близкие значения Rf.

Фенилтиогидантоиновые производные аминокислотмогут быть разделены на тонких слоях силикагеля всистемах растворителей: сначала —н-гептан — пропио-новая кислота — дихлорэтан (58:17:25), затем —н-гептан — н-бутанол — 75%-ная муравьиная кислота(50:30:9).

При введении в силикагель флуоресцирующего ин-дикатора фенилтиогидантоины обнаруживаются в видеголубоватых пятен на флуоресцирующем фоне. Посленагревания при 100°С в течение 15 мин пятна приоб-ретают специфическую окраску. Чувствительность мето-да достигает 0,005 ммоль.

Для микротонкослойной хроматографии фенилтио-гидантоиновых производных аминокислот использовали[187] кизельгель 6OF254 [188]. Пластинки размером

115

6,3X6,3 см предварительно погружали в 1%-ный рас-твор крахмала и сушили при 80 °С в течение 30 мин.Хроматография восходящая; растворители хлороформ —метанол (9:1) и после сушки повторное элюированиев хлороформе на высоту 5 см. Пятна фенилтиогиданто-иновых производных обнаруживали при помощи крах-мал-йодного индикатора.

Используя различные системы растворителей, наслоях полиамида марки 6UV254 удается добиться разде-ления одномерной хроматографией почти всех фенилтио-гидантоиновых производных [189] (табл. 24).

Т а б л и ц а 24. Значение Rf фенилтиогидантоиновыхпроизводных аминокислот

I — дихлорэтан — уксусная кислота (4 5:8); II — хлороформ — 95%-ныйэтанол — уксусная кислота (20:10:3); III — толуол—к-гептан — уксусная

кислота (12:6:5); IV — уксусная кислота — вода (7:13); V — уксуснаякислота — вода (1:3)

Фенилтиогидантоиныаминокислот

III IV

АланииАргининАспарагинВалинГистидинГликоколГлутаминовая кислотаИзолейцинЛейцинЛизинМетионинСерииТирозинТреонинТриптофанФенилаланин . . . .Цистеин

,57,20,63,77,18,37,12,75,86,49,65,45,81,40,34,83,76

0,760,800,490,880,750,650,680,850,900,880,840,870,600,760,670,840,50

0,310,050,010,560,040,160,050,490,650,090,320,270,010,250,080,510,39

0,720,900,700,630,930,750,640,560,560,830,610,580,450,570,270,450,57

0,640,870,590,510,920,680,530,410,390,750,470,550,280,440,160,290,36

При анализе концевых аминокислот часто применя-ют дансилпроизводные аминокислот. Их получаютобработкой растворов аминокислот дансилхлоридом вацетоне при рН = 9,5 в 0,05 Μ боратном буфере.

Хорошее разделение дансилпроизводных аминокис-лот осуществлено [190] на пластинках с силикагелем.Хроматография одномерная с последовательным исполь-116

Зобанием трех систем растворителей: толуол — пири-дин — уксусная кислота (70:30:8); хлороформ —трег-бутанол — уксусная кислота (60:40:15); толу-ол — 2-хлорэтанол — 25%-ный аммиак — вода(30 :50 :2 :2) .

Тонкослойная хроматография фенилтиогидантоино-вых производных использована для анализа пепти-дов [191].

Необходимо отметить, что анализ производных ами-нокислот в тонком слое приблизительно в 10 раз чув-ствительнее, чем хроматография их на бумаге. Исполь-зуя оптимальное зернение силикагеля в пределах 2—5 мк и ограничивая пробег растворителя до 4—5 см,можно резко (в 5—10 раз) улучшить чувствительностьопределения фенилтиогидантоиновых производных ами-нокислот [192].

Белковые соединения. Сравнительно с тонкослойнойхроматографией аминокислот хроматография белковыхсоединений в тонком слое развита пока недостаточно.

Наиболее часто тонкослойную хроматографию ис-пользуют для определения молекулярной массы белкови белковых соединений. Показано [193, 194], что припомощи тонкослойной гель-фильтрации можно прово-дить приблизительную оценку молекулярной массыбелков, используя сефадексы G-75 и G-200. Объем элю-ирующего буферного раствора находится в линейнойзависимости от логарифма молекулярной массы бел-ка [195].

Для получения достоверных результатов рекомен-дуется проводить гель-хроматографию на сефадексахG-75 и G-100 в присутствии денатурирующих агентов,например, в 6 н. растворе гидрохлорида гуанидина[196, 197].

На сефадексах проводилось также разделение раз-личных белковых смесей. Для белков с относительнонебольшими молекулярными массами использовалисефадексы G-50 и G-75; для белков с молекулярнымимассами 100 000 и выше применяют слабосшитые сефа-дексы G-100 и G-200. На пластинках с сефадексомG-75 удалось добиться хорошего разделения смеси аль-буминов, а также β- и α-лактоглобулинов с молекуляр-ными массами 60 000, 35 000 и 15 000 соответствен-но [198].

117

Интересно применение тонкослойной гель-хромато-графии белков в сочетании с техникой изоэлектрофоку-сирования [199].

Сравнительно немного работ по разделению белко-вых соединений на тонких слоях целлюлозы. Так, про-ведено [200] разделение смеси альбумина и γ-глобули-на сыворотки крови человека на пластинках с целлю-лозой.

Предложен [201] метод оценки качества пищевыхпродуктов путем анализа пептидных карт, полученныхна тонких слоях целлюлозы. Пептидные карты получаютхроматографией проб на пластинке в одном направле-нии в системе «нбутанол — уксусная кислота — пири-дин — вода и электрофореза в пиридин-ацетатном бу-фере при рН = 6,5 в перпендикулярном направлении.

Для разделения и анализа белковых смесей и оценкиоднородности индивидуальных белков использовали так-же гидроксилапатит [202—205]. Хроматография восхо-дящая, слой сорбента, как правило, незакрепленный,размеры пластинок 7,5X15 см, толщина слоя 0,5 мм.Элюирующие растворы — фосфатные буферы различ-ных концентраций (0,07; 0,10; 0,15 и 0,40 Λί), ρΗ = 6,8.Для обнаружения пятен пластинки опрыскивали1%-ным раствором нингидрина с последующим нагре-ванием до 80 °С [203].

Значения Rf некоторых белков при тонкослойнойхроматографии на гидроксилапатите в фосфатном бу-фере (рН = 6,8) приведены ниже:

СоединениеКонцентрация

фосфатногобуфера,

моль

Химотрипсин . .Химотрипсиногенγ-Глобулин . . ,Трипсин . . .Рибонуклеаза . ,Альдолаза . .Альбумин . .

0,850,640,600,430,390,350,33

0,100,150,100,100,150,150,10

Литература

I. Измайлов Η. Α., Шрайбер Μ. С. «Фармация», 1938, № 3, с. 1.2. Хроматография в тонких слоях. Пер. с нем. Под ред. Э. Шта-

ля. М., «Мир», 1965. 508 с.3. Kirchner I. G. Chem. Technol., 1974, Bd. 4, S. 79—83.4. Кибардин С. Α., Лазуркина В. Б. «Успехи химии», 1969, № 12,

т. 38, с. 2279—2292.5. Новицкая Г. В. Методическое руководство по тонкослойной

хроматографии фосфолипидов. М., «Наука», 1972. 63 с.6. Караулова Ε. Η. В сб.: Методы анализа органических соедине-

ний нефти, их смесей и производных. Под ред. Г. Ф. Гальпер-на. М., «Наука», 1969. с. 76—94.

7. Miller J. Μ., Kirchner J. G. Analyt. Chem., 1951, v. 23, p. 428—432.

8. Kirchner J. G., J. Chromat., 1971, v. 63, p. 3—6.9. Liteanu C, Goran S. Gradient Liquid Chromatography. Chiches-

ter, Ellis Horwood, 1974. 338 p.10. Loeffel H. "Textilveredlung", 1973, Bd. 8, S. 349—354.II. Bobbit I. McCue. Thin. Layer Chromatography. London, Chap-

man a. Hall, 1963, 208 p.12. Truter E. V. Thinfilm Chromatography. London, 1963, 205 p.13. Ахрем Α. Α., Кузнецова А. И. Тонкослойная хроматографич.

М., «Наука», 1964, 175 с.14. Randerath К. Dunnschicht Chromatographie. 2Ed. Weinheim/

/Bergstr. Vcrl. Chemie. N. Y. — London, Acad. Press , 1966, 243 S.15. Stahl E. Thin Layer Chromatography. N. Y. — London, Acad.

Press., 1969. 553 p.16. Kirchner J. G. Thin Layer Chromatography. N. Y. Interscience

Publ., 1967. 788 p.17. Janchen D. Thin Layer Chromatography. Muttzen, Camag, 1967.

380 p.18. Progress in Thin Layer Chromatography. Eds. A. Niederwieser,

G. Pataki. V. 1. London, Ann. Arbor., 1970. 224 p.19. Количественная хроматография на бумаге и в тонком слое.

Под ред. Э. Д. Шелларда. Пер. с англ. Под ред. А. Н. Ерма-кова. М., «Мир», 1971. 192 с.

20. Touchstone J. Quantitative Thin Layer Chromatography. N. Y.,Willey, 1973. 330 p.

21. Волынец М. П. Тонкослойная хроматография в неорганическоманализе. М., «Наука», 1974. 150 с,

119

22. Беленький Б. Г., Нестеров В. В., Ганкина Э. С. ЖФХ, 1968,т. 42. с. 2876—2881.

23. Беленький Б. Г., Нестеров В. В., Смирнов Μ. Μ. ЖФХ, 1968,т. 42, с. 1484—1489.

24. Беленький Б. Г. и др. В сб.: «Теория ионного обмена и хрома-тографии». М., «Наука», 1968, с. 140.

'25. Waksmundzki Α., Rozylo J. К. "Chemia Analityczka", 1972, ν. 17,p. 1079—1084.

26. Waksmundzki Α., Rozylo J. K. J. Chromat., 1973, v. 78, p. 55—59.

27. Hurtubise R. J., Lott P. J., Dias J. R. J. Chromat. Sci., 1973,v. 11, p. 476—491.

28. Вдовенко В. М. и др. «Изотопы в СССР». 1973, № 30, с. 20—25.

29. Виноградова Р. Г. и др. «Заводская лаборатория», 1975, т. 41,№ 5, с. 556—559.

30. Лурье А. А. Сорбенты и хроматографичеокие носители. М.,«Химия», 1972.1320 с.

31. Range F., Zimmerman W. J. pract. Chem., 1955, Bd. 1, S. 5—6.32. Неймарк И. Е., Чуйко А. А. «Высокомолекулярные соедине-

ния», 1961, № 5, с. 711—715.33. Тюкавкина Η. Α., Литвиненко В. И., Шостаковский Μ. Φ. Хро-

матография иа полиамидных сорбентах в органической химии.Новосибирск, «Наука», 1973. 176 с.

34. Wang K.-T., Huang J. M.-K-, Wang J. S. Y. J. Chromat., 1966,ν. 22, p. 362—368.

85. Eijnden D., von Den H. Anal. Biochem., 1974, v. 57, p. 321—322.36. De Deyne V. J. R., Vetters A. F. J. Chromat., 1967, v. 31, p. 261—

264.37. Stickland R. G. Anal. Biochem., 1965, v. 10, p. 108—119.38. Niederwieser Α., Honegger С G. Helv. Chim. Acta, 1965, v. 48,

p. 893—898.39. Warren B. J. Chromat., 1965, v. 20, p. 603—605.40. Rozumek К. Е. J. Chromat., 1969. v. 40, p. 97—102.41. Stahl E., Dumont E. "Talanta", 1969, v. 16, p. 657—667.42. Sandroni S., Schlitt H. J. Chromat., 1970, v. 52, p. 169—171.43. De Zeenw R. Α., Wijsbeek J. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 90—94.44. De Zeenw R. A. Anal. Chem., 1968, v. 40, p. 2134—2139.45. Niederwieser Α., Brenner M. "Experientia", 1965, v. 21, p. 50—55.46. De Zeenw R. A. Anal. Chem., 1968, v. 40, p. 915—918.47. Blume P. Anal. Biochem., 1966, v. 16, p. 372—375.48. Horobin R. W. J. Chromat., 1968, v. 37, p. 354—356.49. Jordan D. M. J. Chromat., 1971, v. 57, p. 427—432.50. Jordan D. M. J. Chromat., 1971, v. 63, p. 442—445.51. James С N.. Ma T. S. J. Chromat., 1966, v. 21, p. 151—154.52. Smith J. e. a. J. Chromat., 1973, v. 82, p. 159—163.53. Geiss F., Schlitt H. J. Chromat., 1968, v. 33, p. 208—216.54. Janchen D. J. Chromat., 1968, v. 33, p.195—198.55. Dallas M. S. J. J. Chromat., 1968, v. 33, p. 193—194.56. Нестеров В. В., Беленький Б. Г., Эрастов Д. П. «Биохимия»,

1968, т. 33, с. 537—542.57. Samuels S., Fisher С. J. Chromat., 1972, ν. 71, p. 297—306.

58. Goodall R. R. J. Chromat., 1972, v. 73, p. 161—172.

120

59. Touchstone I. С, Levin S. S., Murawee T. Anal. Chem., 1971,v. 43, p. 858—862.

60. York H. J. Chromat., 1970, v. 48, p. 372—374.61. Schlitt H., Geiss F. J. Chromat., 1972, v. 67, p. 261—276.62. Janak J., Klimes J., Hana K. J. Chromat., 1965, v. 18, p. 270—

277.63. Janak J. J. Chromat., 1964, v. 15, p. 15—28.64. Janak J. J. Gas Chromat., 1965, v. 18, p. 270—274.65. Pretorius V., Hopkins B. Y., Schicke J. D. J. Chromat., 1974,

v. 99, p. 23—30.66. Mukherjee K. D. J. Chromat., 1974, v. 96, p. 242—244.67. Jimeno de Osse F. J. Chromat., 1974, v. 96, p. 239—241.68. Copius-Peereboom Υ. Ψ. "Nature", 1964, v. 204, p. 748—750.69. Thompson A. C, Hedin P. A. J. Chromat., 1966, v. 21, p. 13—17.70. Seligman J. M., Doy F. A. Anal. Biochem., 1972, v. 46, p. 62—

66.71. Lynes A. J. Chromat., 1964, v. 15, p. 108—110.72. Knappe E., Yekunde K. G. Z. Anal. Chem., 1964, Bd. 203, S. 87—

92.73. Андреев В. Л., Финкельштейн 3. И., Беляев С. С. Прикл. био-

хим. и .микробиол, 1974, т. 10, с 308—'312.74. Gossettn L, De Graeve Y. J. Chromat., 1975, ν. 110, p. 117—124.75. Petrowitz Η. Υ., Pastuska G. J. Chromat., 1962, v. 7, p. 128—130.76. Knappe E., Peteri D. Z. Anal. Chem., 1962, Bd. 188, S. 184—189.77. Higgins H., Brand T. Anal. Biochem., 1966, v. 15, p. 122—126.78. Myers W. F., Huang Κ. Υ. Anal. Biochem, 1966, v. 17, p. 210—

213.79. Beaudoin А. В., Moorjan S., Lemonde A. Can. J. Biochem, 1973,

v. 51, p. 318—320.80. Андреев В. Л., Сапожникова Г. П., Родионова М. А. Прикл.

'биохим. и микробиол, 1974, т. 10, с. 921—927.81. Hoffman Ν. Ε., Killinger Jh. A. Anal. Chem., 1969, ν. 41,

ρ, 162—163.82. Pastuska G., Petrowitz H.-Y. J. Chromat, 1963, v. 10, p. 517—

520.83. Frankenfeld J. W. J. Chromat., 1965, v. 18, p. 179—180.84. Андреев Л. В. и др. Прикл. биохим. и микробиол, 1972, т. 8,

с. 75—81.85. Bailey R. W. Anal. Chem, 1964, ν. 36, p. 2021—2025.86. Kelly S. Η., Finkll В. J. J. Chromat., 1971, v. 63, p. 438—441.87. Petrowitz H.-J. Angew. Chem, 1960, Bd. 72, S. 921—922.88. Henein R. G., David A. J. Chromat, 1968, v. 36, p. 543—545.89. Lawrence В. М. J. Chromat, 1968, v. 38, p. 535—537.90. Petrowitz H. J. J. Chromat, 1971, v. 63, p. 9—14.91. Hranisavljevic-Jakovljevic M., Pejkovic-Tadic Y-, Stojljkovic A.

J. Chromat, 1963, v. 12, p. 70—74.92. Pastuska G., Petrovitz H.-J. Chem. Zeit, 1964, Bd. 88, S. 311—

316.93. Berei K-, Vasazos L. J. Chromat, 1967, v. 26, p. 301—304.94. Cooper P. D. J. Chromat., 1972, v. 67, p. 184—185.95. Palamareva M. e. a. J. Chromat, 1971, v. 64, p. 383—387.96. Petrowitz H.-J. Chem. Zeit., 1966, Bd. 90, S. 627—630.97. Petrowitz H.-J. "Chimia", 1964, v. 18, p. 137—141.

121

98. Petrowitz H.-L, Pastuska G., Vagner S. Chem. Zeit, 1965, Bd. 89.S. 7—10.

99. Mayer R., Rosmus P., Fabian J. J. Chromat., 1964, v. 15, p. 153—167.

100. Мельников Η. Η. Химия и технология пестицидов. М., «Химия»,1974. 766 с.

101. Письменная М. В., Клисенко М. А. «Проблемы аналитическойхимии», 1972, т. 2, с. 111—115.

102. Ackermann Η. J. Chromat., 1969, ν. 44, p. 414—416.103. Ramasamy Μ. "Analyst", 1969, ν. 94, p. 1075—1080.104. Askew J., Ruzicka J. H., Wheats В. В. "Analyst", 1969, v. 94,

p. 275—283.105. Косматый Ε. С, Тверская Б. Μ., Полонская Φ. И. «Проблемы

аналитической химии», 1972, т. 2, с. 70—72.106. Вилегжанина Г. Ф., Калмыкова Р. Г. «Проблемы аналитиче-

ской химии», 1972, т. 2, с. 32—38.107. Новикова К. Ф-, Мельцер Ф. Р. «Проблемы аналитической хи-

мии», 1972, т. 2, с. 95—98.108. Самосват Л. С. «Проблемы аналитической химии», 1972, т. 2,

с. 127—130.109. Векштейн М. Ш., Клисенко М. А. «Проблемы аналитической

химии», 1972, т. 2, с. 21—27.ПО. Nagasawa К-, Yoshidome Η., Kamata F. J. Chromat., 1970, v. 52,

p. 453—459.111. Nagasawa K-, Yoshidome П., Anryu K- J. Chromat., 1970, v. 52,

p. 173—176.112. Abbott D. C, Tatton J. O'G., Wood N. F. J. Chromat., 1909,

v. 42, p. 83—85.113. Sadroni S., Schlitt H. J. Chromat., 1971, v. 55, p. 385—389.114. Fehringer N. N.. Westfall J. E. J. Chromat., 1971, v. 57, p. 397—

405.115. Bishera R. H., Bom G. S., Christian Y. S. J. Chromat., 1971,

v. 57, p. 444—447.116. Седых А. С. и др. «Проблемы аналитической химии», 1972, т. 2,

с. 130—135.117. ВопеШ Е. I. Anal. Chem., 1972, ν. 44, p. 603—605118. Frei К- W., Beltiveau P. E. "Chromatographia", 1972, v, 5,

p. 296—299.119. Glike F. J. Chromat, 1971, v. 61, p. 279—283.120. Clike F. J. Chromat., 1970, v. 5, p. 447—452.121. Mendosa С Ε. J. Chromat, 1973, v. 78, p. 29—40.122. Geldmacher-Mallinckrodt M., Ong G. L. Arch. Kriminol, 1970,

Bd. 146, S. 154—159.123. Bogusy M., Borkowski Τ. Ζ. Rechtsmed, 1971, Bd. 68, S. 267—

270.124. Seifert I., Davidek J. J. Chromat, 1971, v. 59, p. 446—449.125. Mendosa С Ε. e. a. "Analyst", 1969, v. 94, p. 805—810.126. Mendosa С Ε., Sjields J. B. J. Chromat, 1970, v. 50, p. 92—102.127. Sherma I., Zweig G. Thin Layer Chromatography and Analysis

Pesticides of International Importance. N. Y, Acad. Press, 1973.225 p.

128. Gossele Y. A. W., Srebznik-Friszman S. J. Chromat, 1966, v. 23,p, 305—308.

122

129. Copius-Peereboom J W, Beekes Η W J Chromat, 1964, ν U,ρ 417—423

130 Chiamg Η -С J Chromat, 1969, ν 44, ρ 201—207131. Gossele Υ A W J Chromat 1971, ν 63, ρ 433—437132 Nagasowas К, Yoshidome Η, Takeshita R J Chromat, 19o9,

v. 43, ρ 473—479133 Takeshita R, Yamashita T, Itoh N J Chromat, 1972, ν 73,

p. 173—182134 De Clerco H, Massart D L J Chromat, 1974, ν 93, ρ 243—

247.135 Старение и стабилизация полимеров Под ред А С Кузьмин-

ского Μ , «Химия», 1966 210 с136 Солодова Г М, Малышев А И, Ростовцева Ε Ε «Проблемы

аналитической химии», 1970 τ 1, с 91—96137 Гедрайтите Г Б, Багданайте В А, Юшкевичюте С С ЖАХ,

1975 τ 30, с 1618—1619138 Мастрюкова Τ А Сахарова Τ Б, Кабачник Μ И Изв АН

СССР ОХН, 1963 № 12, с 2211—2219139 Fischbein L Faukers J J Chromat, 1966, ν 22, ρ 323—328140 Korte F, Vogel J J Chromat, 1962, ν 9, ρ 381—385141 Bonker G J, Tonge В L J Chromat, 1963, v. 12, ρ 52—56142 Baumler J, Rippstein S Helv chim acta, 1961, ν 44, ρ 1163-

1168143 Fischer R, KUngelholler W Arch Toxikol, 1961, ν 19, ρ 119 -

124144 Nakamura Η, Tamura Ζ J Chromat, 1974, ν 96, ρ 195—210145 Прилежаева Ε Η, Снегоцкий В И, Сюндюкова В Χ X науч

ная сессия по химии сероорганических соединений нефтей инефтепродуктов Тезисы докчадов Уфа, 1966, с 61

146 Дронов В П, Снегоцкая В А, Коленченко Л И, Ворончусина Д Л Там же, с 61

147 Parkanyi С, Zahradnik R Coll Czech Chem Comm, 1902,ν 27, ρ 1355—1358

148 Караулова Ε Η, Бобруйская Τ С, Гальперн Г Д ЖАХ, 1966,τ 21 с 893—896

149 Bayfield R F, Clarke V Cole Ε R J Chromat, 1965, ν Iе·,ρ 370—374

150 Bayfield R F, Cole Ε R J Chromat, 1969, ν 40, ρ 470—472151 Stephan Ρ Erdman J G "Nature" (London), 1964, ν 203,

ρ 749—755152 Chargaff Ε, Letine С, Green С J Biol Chem, 1948, ν 175,

ρ 67—70153 Winegrad Η Μ Toenmes G "Science", 1948, ν 108, ρ 506 -

509154 Havir J Vrestal J, Chromy V Chem hsty, 1965 ν 59, ρ 431 —

435155 Toenmes G Kolb J J Anal Chem 1951, ν 23, ρ 823—826156 Wong F F J Chromat, 1971, ν 59, ρ 448—451157 Popov A Gadeva V J Chromat 1964, ν 16 ρ 256—260158 Fiei R W Maddlan В L Maduil Г D Anal Chem Acta,

1973 ν 66 ρ 139—142159 de Marco С 'Nature" (London) 1963 ν 198 ρ 683—686160 Carson J F, Wong F F J. Chromat, 1963, ν 12, ρ 408—411

123

161. Petschik Η., Steger Ε. J. Chromat., 1962, ν. 7, p. 135—136.162. Ertel H., Homer L. J. Chromat., 1962, v. 7, p. 268—269.163. Wrounski M. J. Chromat., 1966, v. 24, p. 480—482.164. Glaser С. В., Maeda Η., Meienhofer J. J. Chromat., 1970, v. 50,

p. 151—154.165. Prinzler H. W., Pape D., Teppke M. J. Chromat., 1965, v. 19,

p. 375—381.166. Curtis R. D., Phillips G. T. J. Chromat., 1962, v. 9, p. 366—368.167. Nakamura H., Tamura Z. J. Chromat., 1974, v. 96, p. 211—222.168. Караулова Ε. Η. и др. «Проблемы аналитической химии», 1970,

т. 1, с. 76—79.169. Караулова Ε. Η: и др. ХГС, 1973, № 7, с. 913—917.170. Грачева Е. П. и др. ЖОХ, 1963, т. 33, с. 2493—2496.171. Караулова Ε. Η. и др. «Нефтехимия», 1967, т. 7, с. 812—815.172. Tisellus Α., Hjerten S., Levin О. Arch. Biochem. Biophys., 1956,

v. 65, p. 132—155.173. Anacker V. Т., Stoy V. Biochem. Z., 1958, Bd. 330, S. 141—152.174. Main R. K-, Wilkins M. J., Cole L. J. J. Am. Chem. Soc, 1959,

v. 81, p. 6490—6498.175. Atkinson Α., Bradford P. A. Selmes J. P. J. Appl. Chem., 1973,

v. 23, p. 517—529.176. Мазин А. Л., Сулимова Г. Е. «Биохимия», 1975, т. 40, № 1,

с. 115—122.177. Fucker К., Meyer R. Α., Pictsch Η. Ρ. "Nahrung", 1976, Bd. 20,

S. 81—82.178. Wiesner J., Wiesnerova L. J. Chromat., 1975, v. 114, p. 411—417.179. Srivastava S. P., Dua V. Κ. Ζ. Anal. Chem., 1975, Bd. 276,

S. 382—383.180. Gunatilaka Α. Α., Leslie P. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 229—

233.181. Krivis A. F., Ong С. С. Microchem. J., 1971, v. 16, p. 391—394.182. Felix A. M., Jimener M. H. J. Chromat., 1974, v. 89, p. 361—364.183. Sherma J., Touchstone J. С Anal. Letter., 1974, v. 7, p. 279—287.184. Munier R. L., Peigner Α., Thommegay Ch. "Chromatographia",

1970, N 5, p. 205—210.185. Kulbe K. D. Anal. Biochem., 1974, v. 59, p. 564—573.186. Walz D. Α., Routerby J. J. Chromat., 1975, v. 104, p. 180—183.187. Sjoquist J. Jeppsson J. O. Anal. Biochem., 1967, v. 18, p. 264—

269.188. Solal M. C, Bernard J. L. J. Chromat., 1973, v. 80, p. 140—143.189. Rangarajan M., Darbre A. Biochem. J., 1975, v. 147, p. 435—438.190. Stehelin D., Duranton H. J. Chromat., 1969, v. 43, p. 93—102.191. Pataki G. J. Chromat., 1964, v. 47, p. 1763—1765.192 Беленький Б. Г. и др. «Молекулярная биология», 1967, т. 1.

№ 1, 184—190.193. Andrews P. Biochem. J., 1964, ν. 91, p. 222—230.194. Determann Η. "Experientia", 1962, ν. 18, p. 389—395.195. Детерман Г. Гель-хроматография. Пер. с нем. Под ред.

А. С. Хохлова. М., «Мир», 1970. 252 с.196. Heinz F., Prosch W. Anal. Biochem., 1971, ν. 40, p. 327—330.197. Klaus G. G. В., Nitecki D. E., Goodman J. W. Anal. Biochem.,

1972, v. 45, p. 286—297.198. Johansson B. G., Rymo L. Acta Chem. Scand., 1962, v. 16,

p. 2067—2070.

124

199. Dravert F., Muller W. "Chromatographia", 1971, v. 4, p. 23—26.200. Simonianova E., Rybak M. Biochim. Biophys. Acta, 1964, v. 93,

p. 194—198.201. Gunther Η. Ζ. Anal. Chem., 1968, Bd. 243, S. 609—616.202. Hofmann A. F. Biochim. Biophys. Acta, 1962, v. 60, p. 458—462.203. Кибардин С. Α., Лазуркина В. Б. «Биохимия», 1965, т. 30,

с. 559—562.204. Лазуркина В. В., Кибардин С. А. «Биохимия», 1968, т. 33,

с. 922—927.205. Лазуркина В. Б. Кандидатская диссертация. Л., ЛГУ, 1972,

СЕРГЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ КИБАРДИЫКОНСТАНТИН АЛЕКСЕЕВИЧ МАКАРОВ

ТОНКОСЛОЙНАЯХРОМАТОГРАФИЯВ ОРГАНИЧЕСКОЙ

ХИМИИ

Редактор П а с т у ш е н к о Μ Η.Технический редактор В о з н е с е н с к а я Р . М.

Художник С у м н и т е л ь н ы й Ε АХудожественный редактор Н о с о в Η В

Корректоры Л о б а н о в а В А , И в л и е в а Μ А

И Б № 239

Сдано в наб 13 0178 Подп в печ 20 04 78 Τ 07678Формат бумаги 84Х108'/з2 Бумага тип № 2 Гарн литПечать высокая Уел печ л 6 72 Уч изд л 6 7)Тираж 7500 экз Зак № 80 Цена 55 к Изд № 1133

Издательство «Химия», 107076, Москва, Стромынка, 13

Московская типография № 32 Союзполиграфпромапри Государственном комитете Совета Министров СССРПО делам издательств, полиграфии и книжной торговли

Москва, К 51, Цветной бульвар, 26