spettroscopia di

assorbimento e fluorescenza

laura d’alfonso @ Unimib

assorbimento e colori

assorbimento molecolareuna molecola può assorbire una radiazione (λ) solo se nella molecolaesiste una transizione di corrispondente energia

λ=ν=

hchE

c = 3x108 m/sech = 6.63x10-34 Jsec

la radiazione elettromagnetica

pigmenti naturali

la legge di Beer - Lambert

• variazioni dei coefficienti di assorbimento ad alte concentrazioni (>10mM)a causa delle interazioni elettrostatiche tra molecole vicine;

• scattering di luce (torbidità, particelle in sospensione, ~ 1/λ4);• contributi di fluorescenza o fosforescenza;• variazioni di indice di rifrazione ad alta concentrazione;• spostamento degli equilibri chimici in funzione della concentrazione;• contributi non monocromaticità (più affidabile il massimo della banda);• luce di fondo.

I0 I

cammino ottico l

sostanzaconcentrazione c

0II T arasmittanzt =

cl IIlog logT- A 0

ε=

−==

deviazioni:

250 300 350 400 450 5000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4as

sorb

anza

lunghezza d'onda

strumentazione

Assorbanza (A) A = log10 (I0/I)

A=3 I0 = 1000 IA=2 I0 = 100 IA=1 I0 = 10 I

% Transmission (%T) %T = I/IoA = log10 (1/T)

I0 Iz II-dI

dzz l

significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3

r = raggio molecole

P = probabilità assorbimento luce incidente

σ = Pπr2 = sezione d’urto

A

dz N IdI z σ−= dz N IdI

σ−=

∫∫ σ−=l

0

I

Idz N

IdI

0l N IlnIln 0 σ−=−

l c /1000)(N l N IIln AV0

σ=σ=

−

=

−

00 II2.303log-

IIln

l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0

σ=

l c A IIlog- 0

ε==

03/1000)/2.3(N AVσ=ε

I0 Iz II-dI

dxz l

significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3

σ = sezione d’urtoA

dx N IdI σ−=

l N IlnIln 0 σ−=−

l c /1000)(N l N IIln AV0

σ=σ=

−

=

−

00 II2.303log-

IIln

l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0

σ=

l c A

IIlog- 0

ε==

03/1000)/2.3(N AVσ=ε

3x10910-29scattering Raman

3x1010-19infrarosso

3x10410-16molecole

3x10810-12assorbimento atomi

ε(M-1cm-1)

σ(cm2)

1 GM = 10-50 cm4sec

assorbimento multi-fotoni

10-84 cm6sec2

www.drbio.cornell.edu/MPE

σ2 ÷ σ1 ∆x ∆t

∆x ≈ σ1 ≈ 10-17–10-16 cm2

∆t ≈ 10-16 sec

σn ÷ σ1n ∆tn-1

alcune sezioni d’urto a 2 fotoni

sonde convenzionali

indicatori del calcio

proteine fluorescenti

sezione d’urto a due fotoni

il picco di assorbimento si trova spesso ad una λ doppia rispetto al

picco a singolo fotone..

es.: cumarina

.. e spesso no!

es.: rodamina

assorbimentosingolo fotone(asse x per 2)

probabilitàassorbimento

2 fotoni

responsabili assorbimento nelle proteine..

Wavelength (nm)

E x

10-

4

1. alfa elica (pH 11, 25°C)

2. random (pH 6, 25°C)

3. beta sheet (pH 11, 52°C)

Wavelength (Å)

.. e negli acidi nucleici

D. Hamdane et al, J. BIOL. CHEM Vol. 278, No. 51, pp. 51713–51721, 2003

TNB anione ε412 =13.6 mM-1 cm-1

analisi della reattivita’ dei gruppi SH via DTNB5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)

neuroglobina umanacitoglobina umanacitoglobina zebrafish

mioglobina

TNBS-STNB+SCys STNB+TNBS-SCys

TNB carbossilato ε420 = 190 mM-1 cm-1

la luce puo’ indurre transizionitra gli stati elettronici di una molecola

molecola nellostato fondamentale

molecola nellostato eccitato

fotone

fotone

fluorescenza di biomolecole

diagramma di Jablonskiassorbimento 10-15 sfluorescenza 10-12-10-7 sfosforescenza 10-2-101 s

NRR

R

qciicR

R

kkk

)Q(kkkkk

+=

+++=φ

Stokes shiftl’emissione avviene sempre dal più basso

stato vibrazionale di S1 (conversione interna)

regola dello specchio

lo spettro di emissioneè un’immagine specularedello spettro di assorbimento

i livelli S0 e S1 presentanostrutture vibrazionali simili

regola di Kasha

lo spettro di fluorescenza è indipendente dallalunghezza d’onda di eccitazione

1kk

kRNRR

R <ττ

=+

=φ

kR

…

emabs PP)(F ⋅÷λ

d)(f ⋅λ⋅φ

II0 −

Cl)(303.20

sabeII λε−=

[ ]Cl)(303.21II sab0 λε−=

se εCl < 0.05

0sab0 ClI)(303.2II λε=−

KIC)(f)()(F 0abs ⋅⋅⋅λ⋅φ⋅λε=λ

linearenellaconcentrazione

non è una misura assoluta

strumentazione

parametri sperimentali

lampada appropriata per l’intervallo di lunghezze d’ondadi interesse

correzione per lo spettrodella lampada

parametri sperimentali

ampiezza fenditure monocromatore

risoluzione spettrale

scelta accurata dei filtri di eccitazione ed emissione

• spettri (effetti circondario)

• tempi di vita della fluorescenza

• polarizzazione (orientazione e dinamica)

• trasferimento eccitazione (distanze -> dinamiche)

• localizzazione della fluorescenza

proprietà misurabili con la fluorescenza

fluorofori: intrinseci o sintetici?

fluorofori intrinsecifenilalanina

tirosinatriptofano

studio del folding1. apoazurin2. ribonuclease T13. staphylococcal nuclease4. glucagon

Eftink MR, Methods Biochem Anal, 1990.

lactate dehydrogenase

mutazioni tyr-trp

Smith CJ et al., Biochemistry, 1991.

human antithrombin

PGW Gettings, Univ Illinois

trpacidic residueshydrophobic res

Mehager JL et al., J Biol Chem, 1998.

fluorofori estrinseci

eccitazione 1 vs 2 fotoni

Xu C et al., PNAS USA, 1996.

eccitazione simultaneaXu C et al., PNAS USA, 1996.

fluorofori sinteticila famiglia “Alexa”..

..fluorofori per tutti i gusti!

la famiglia “Cy..”

titolazione raziometrica del calcio

fluorofori sensibili al pHsonda eccitazione emissione

Alexa 488 - actin (Ar ion 488 line)Texas Red-X - lectin ( green helium-neon 543 line)Hoechst 33342 - nucleus. (violet diode 405 line)

riconoscere i componenti cellulari..

Rat Diaphragm Smooth Muscle Tissue

Rat Brain Hippocampus Sagittal Thin (8-Micrometer) Section

Alexa 568 - vimentin intermediate filamentAlexa 488 - glial fibrillary acidic proteinDRAQ5 - nucleus

Adherent Rat Thoracic Aorta Smooth Muscle Cell

Alexa 568 - tubulinSYTOX Green - nucleusAlexa 350 - actin

Adherent Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cell

Cy2 - cytokeratinMitoTracker Red CMXRos - mitochondrial network DAPI - nucleus

Adherent Normal Tahr Ovary (HJ1.Ov) Epithelial Cell

Alexa Fluor 488 - actinMitoTracker Red CMXRos - mitochondriaHoechst 33342 - nucleus

proteine fluorescenti

Opossum Kidney Cortex Epithelial Cells (OK Line)

Human Cervical Adenocarcinoma Cells (HeLa Line)