SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA … · presença em minha vida. Ao meu amados filhos,...

SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA

FACULDADE EVANGÉLICA DO PARANÁ

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO DE CURITIBA

INSTITUTO DE PESQUISAS MÉDICAS

OCTAVIO ANTONIO AZEVEDO DA COSTA FILHO

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DA METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9

(MMP-9), FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF- β) E

ALFA ACTINA DO MÚSCULO LISO (α-AML) NA CICATRIZAÇÃO DA

APONEUROSE DA PAREDE ABDOMINAL DE RATOS COM BISTURI DE

LÂMINA FRIA E COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO

Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia do Instituto de Pesquisas Médicas daFaculdade Evangélica do Paraná. Orientador: Prof. Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho Co -orientador: Prof. Dr. Mario Augusto Cray da Costa Coordenador: Prof. Dr. Osvaldo Malafaia

CURITIBA

2015

Costa-Filho, Octavio Antonio Azevedo da c837e Expressão imuno-histoquímica da metaloproteinase da matriz 9

(mmp-9), fator de transformação beta (tgf- β) e alfa actina do músculo liso

(α-aml) na cicatrização da aponeurose da parede abdominal de ratos com

bisturi de lâmina fria e com bisturi harmônico ultrassônico / Octavio Antonio

Azevedo da Costa Filho – Curitiba, 2015.

96f. Orientador(a): Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho Coordenador : Dr. Osvaldo Malafaia

Tese (Doutorado) Faculdade Evangélica do Paraná. Ciências da Saúde, Programa de Pós Graduação em Princípios da Cirurgia.

1. Cicatrização. 2. Ultra-Som - Cirurgia. 3. Processo inflamatório. 4. Ratos Wistar 5 metaloproteinase da matriz 9 (mmp-9) 6. fator de transformação beta (tgf- β) 7 alfa actina do músculo liso (α-aml) . I. Ribas Filho, Jurandir Marcondes. II. Título.

CDD 617.14 CDU 617-073

À minha querida esposa, Silvana, pelo seu amor,

companheirismo, constante incentivo e indescritível

presença em minha vida.

Ao meu amados filhos, Thiago, Ana Carolina e Maria

Vitória presentes do Criador, símbolo da alegria e da

esperança, que com ternura souberam entender o

distanciamento do pai para elaboração deste trabalho.

Aos meus pais, Octavio e Vera, pelo amor e dedicação

que sempre me transmitiram, pelos olhares carinhosos

que continuam me acompanhando e me encorajando até

os dias de hoje.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao Prof. Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho, meu orientador,

pelos ensinamentos, paciência, incentivo e atenção dedicados a esta tese. Muito

Obrigado.

Ao Prof. Dr. Mario Augusto Cray da Costa, meu co-orientador, pelo

inestimável auxílio, no momento crucial deste trabalho. Muito Obrigado

Ao Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, coordenador do Programa, pelo

acompanhamento e amizade.

À Prof. Dra. Carmen Austrália Paredes Marcondes Ribas, pela sua

cooperação.

Agradeço a Sras. Geovana Nunes de Lara e Roseni Coprolato Castanho

da Ethicon Endo-Surgery, que me cederam o Bisturi Harmônico Ultrassônico para

realização do trabalho.

Ao Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM), especialmente ao Sr. João

Brito de Freitas, pela oportunidade de realização da etapa experimental desta

tese, por sua amizade e dedicação.

Agradeço aos funcionários do IPEM, Érika Gomes da Rosa e Bruno Luiz

Ariede, pela colaboração durante as diversas etapas deste trabalho.

Aos professores que lecionaram neste período, sem exclusões. Muito

Obrigado.

A Minha Amiga Vilma Malaquias por todos estes anos de incentivo nos

projetos da minha vida.

E principalmente, ao senhor Deus todo poderoso, criador do céu e da

terra. Por essa e todas as outras oportunidades que me propiciou ao longo da

minha vida. Muito obrigado.

E a todos que direta ou indiretamente participaram desta tese.

Por vezes sentimos que aquilo

que fazemos não é senão uma gota de água no mar

, mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota

Madre Teresa de Calcutá

RESUMO

Introdução: Com o avanço tecnológico, procedimentos de incisão e hemostasia são realizados com os mais diversos tipos de aparelhos, em um vasto número de operações, com o objetivo de proporcionar hemostasia eficiente bem como um reduzido tempo cirúrgico, sem prejuízo à cicatrização tecidual. Objetivo: Avaliar a evolução macro e microscópica do processo de cicatrização de feridas com o bisturi harmônico ultrassônico (BHU) na aponeurose média dos músculos reto abdominal de ratos e compará-la às feitas com bisturi de lâmina fria (BLF). Material e Método: Foram utilizados 80 ratos da linhagem Wistar, divididos em dois grupos, que sofreram incisões medianas em aponeurose na junção dos retos abdominais com BLF e BHU, respectivamente em cada grupo. As avaliações macro e microscópicas foram realizadas em subgrupos de 10 animais, nos 3º,7º,14º e 21º dias. Após a retirada da parede abdominal anterior de cada rato.Para análise macroscópica se utilizou a inspeção da ferida operatória antes e após a morte dos animais e a análise microscópica, utilizou-se o método imuno-histoquímico, metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9), fator de transformação do crescimento beta (TGF- β) e alfa actina do músculo liso (α-AML) em ambas as incisões e sua evolução, nas amostras do 3º, 7º, 14º e 21º dias .E com a técnica de Sirius Red , a formação de colágeno Tipo I e III. Os dados foram submetidos a análise estatística com teste t de Student, para análise imuno-histoquímica, para o estudo de hematomas,infecções,deiscências e aderências foi realizado o teste Qui-quadrado. Para a análise da variância do tipo de colágeno e sua concentração foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney.Resultados: Á macroscopia, as complicações estudadas não apresentaram diferença estatística. A análise imuno-histoquímica pela MMP-9 , foi mais intensa no grupo BHU, aos 3º e 7º dias, sem diferença ao 14º dia, e menor ao 21º dia (p< 0,05). Em Relação a TGF β, teve sua expressão menor no grupo BHU aos 14º e 21º dias , sem diferença estatística aos 3º e 7º dias (p< 0,05). A expressão de α-AML se apresentou mais elevada, no grupo BHU ao 14º dia e se manteve semelhante ao 3º,7º e 21º dias (p< 0,05).Em relação à deposição de colágeno, não foi encontrada alteração quanto à deposição de colágeno tipo I, e uma deposição maior de colágeno tipo III nos animais submetidos ao corte com BHU, sendo esta maior ao 3°, 21° dias e no geral, ao 7º dia a deposição foi maior no grupo com BLF, ao 14° dia foi semelhante em ambos os grupos (p<0,001). Conclusões: A utilização do BHU comparado ao BLF apresenta uma maior área de lesão no momento da incisão; assim como levou ao atraso do processo de regeneração e maturação das cicatrizes.

Palavras-chave : 1. Cicatrização. 2. Ultra-Som - Cirurgia. 3. Processo inflamatório. 4. Ratos Wistar 5 metaloproteinase da matriz 9 (mmp-9) 6. fator de transformação beta (tgf- β) 7 alfa actina do músculo liso (α-aml) .

ABSTRACT

Introduction: With technological advancement, incision procedures and hemostasis are performed with various types of machinery, in a wide range of operations, in order to provide effective hemostasis and a reduced surgical time, without prejudice healing tissue. Objective: To assess macro and microscopic evolution of the wound healing process with ultrasonic harmonic scalpel (UHS) in the middle aponeurosis of the rectus abdominis muscle of rats and compare it to those made with cold scalpel blade (CSB). Material and Methods: 80 Wistar rats were divided into two groups, who suffered medial incisions in the aponeurosis at the junction of the rectus abdominis with the CBS and UHS, respectively in each group. The macro and microscopic ratings were performed in subgroups of 10 animals in the 3rd, 7th, 14th and 21st days. After removal of the anterior abdominal wall of each rat . For macroscopic analysis was used to inspect the wound before and after the death of animals and microscopic analysis, we used the immunohistochemical method, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), the beta transforming growth factor (TGF-β) and alpha smooth muscle actin (α-AML) in both incisions and its evolution in the samples 3, 7, 14 and 21 days and the Sirius Red technique, formation of collagen type I and III. Data were statistically analyzed with the Student t test for immunohistochemical analysis for the study of bruising, infection, dehiscence, and adhesions was performed chi-square test. For the analysis of variance on the type of collagen and its concentration was used the nonparametric Mann-Whitney. Results: Macroscopic, complications studied showed no statistical difference. Immunohistochemical analysis for MMP-9 was more intense in UHS group at 3 and 7 days, with no difference after 14 days, and less after 21 days (p <0.05). Toward the TGF β, had his lower expression in UHS group at 14 and 21 days, with no statistical difference at 3 and 7 days (p <0.05). The α-AML expression appeared higher in UHS group after 14 days and remained similar to 3, 7 and 21 days (p <0.05) .In relation to collagen deposition, there was no change as the deposition type I collagen, and increased deposition of type III collagen in the animals submitted to the court with UHS, which is higher by 3 °, 21 days and overall, the 7th day the deposition was higher in the group with the CSB, the 14 ° day was similar in both groups (p <0.001). Conclusions: The use of UHS compared to the CSB has a higher lesion area at the time of the incision; as well as it led to the delay of regeneration and scar maturation process Keywords: 1. Healing. 2. Ultrasound - Surgery. 3. inflammatory process. 4. Wistar 5. Matrix metallopeptidase 9 (MMP-9). 6. Transforming growth factor beta (TGF-β). 7. Alpha smooth muscle actin (α-AML).

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ....................................... 31

FIGURA 2- SISTEMA BISTURI HARMÔNICO ULTRA CISION ......................... 31

FIGURA 3- INCISÂO COM BISTURI LÂMINA FRIA EM PELE EXPONDO A

APONEUROSE ................................................................................ 33

FIGURA 4- INCISÂO COM BISTURI LÂMINA FRIA NA APONEUROSE .......... 34

FIGURA 5- INCISÂO COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO À

APONEUROSE ................................................................................ 34

FIGURA 6 - SÍNTESE DA APONEUROSE .......................................................... 35

FIGURA 7- SÍNTESE DE PELE .......................................................................... 35

FIGURA 8- PEÇA DISSECADA .......................................................................... 37

FIGURA 9 - PINÇA BIÓPSIA DE PELE – PUNCH .............................................. 39

FIGURA 10 - BIÓPSIA COM PUNCH .................................................................... 39

FIGURA 11 - MATERIAL EM BLOCO DE PARAFINA .......................................... 40

FIGURA 12- BLOCO RECEPTOR ........................................................................ 40

FIGURA 13- BLOCO SUBGRUPO BHU14 .......................................................... 41

FIGURA 14- LEITURA IMUNO-HISTOQUÍMICA ................................................. .44

FIGURA 15- HEMATOMA DE PAREDE ............................................................... 49

FIGURA 16- DEISCÊNCIA DE SUTURA DE PAREDE ........................................ 49

FIGURA 17- ADERÊNCIA GRAU 1 ...................................................................... 50

FIGURA 18 - FOTOMICROGRAFIA DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS

IMUNOCORADAS COM MMP-9 ...................................................... 53


IMUNOCORADAS COM TGF-β ....................................................... 55


IMUNOCORADAS COM α-AML ....................................................... 57

FIGURA 21 - FOTOMIOGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS ............. 58

FIGURA 22- FOTOMIOGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS .............. 58

FIGURA 23- FOTOMIOGRAFIA DE FIBRAS COLÁGENAS ................................ 59

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 - MÉDIA DE IMUNOEXPRESSÃO TECIDUAL (EM MICRÔMETROS

QUADRADOS POR CGA) DOMMP-9 EM RELAÇÃO AOS GRUPOS

DE BLF E BHU, NO 3º,7º.14º E 21º DIAS ......................................... 52


QUADRADOS POR CGA) DO TGF-β EM RELAÇÃOAOS GRUPOS



QUADRADOS POR CGA) DO α-AML EM RELAÇÃOAOS GRUPOS


GRÁFICO 4- REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA QUANTIFICAÇÂO DE

COLÁGENOMADURO (TIPO I) E IMATURO (TIPO III) E ANÁLISE

ESTATÍSTICA NOS DOIS GRUPOS ................................................. 60

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA ......................... 38

QUADRO 2 - CLASSIFICAÇÂO DAS ADERÊNCIAS ABDOMINAIS ...................... 38

QUADRO 3 - ANTICORPOS PRIMÁRIOS UTILIZADOS ........................................ 43

QUADRO 4 - RESULTADO DA CLASSIFICAÇÃO DE ADERÊNCIAS ................... 50

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - RESULTADO DE ÁREA IMUNOPOSITIVA PELAS 4 IMAGENS DE

CADA AMOSTRA................................................................................. 45

TABELA 2 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BLF .............. 51

TABELA 3 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BHU ............. 51

TABELA 4 - MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR

CGA, E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E

HARMÔNICO ULTRASSÔNICO MMP-9 ............................................. 52

TABELA 5 - MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR


HARMÔNICO ULTRASSÔNICO TGF- BETA .................................... 54

TABELA 6 - MÉDIA,DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR


HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ALFA-AML ..................................... 56

TABELA 7 - QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE

COLÁGENO MADURO (TIPO I) NOS DOIS GRUPOS ....................... 59

TABELA 8 - QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE

COLÁGENO IMATURO (TIPO III) NOS DOIS GRUPOS ..................... 60

TABELA 9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO TIPO I

(MADURO) E TIPO III (IMATURO) ...................................................... 61

LISTA DE ABREVIATURAS

BLF - bisturi com lâmina fria

BHU - bisturi harmônico ultrassônico

CSB - cold scalple blade

UHS - ultrassonic harmonic scalple

SBCAL - Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório

MMPs - metaloproteinases

MMP-9 - metaloproteinase da matriz 9

TGF-β - fator de transformação do crescimento beta

α-AML - alfa actina do músculo liso

CGA - campo de grande aumento

Min - minutos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................. 19

2.1 BISTUTI COM LÂMINA FRIA E BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ... 19

2.2 METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9 (MMP-9) ............................................ 23

2.3 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β) ........... 24

2.4 MIOFIBROBLASTO E ALFA ACTINA DE MÚSCULO LISO (α-AML) ............. 25

3 MATERIAL E MÉTODO ..................................................................................... 29

3.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................... 29

3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................... 29

3.3 APARELHOS UTILIZADOS ............................................................................ 30

3.3.1 Bistuti com lâmina fria .................................................................................. 30

3.3.2 Bisturi harmônico ultrassônico ...................................................................... 30

3.4 PRÉ-OPERATÓRIO ........................................................................................ 32

3.5 ANESTESIA .................................................................................................... 32

3.6 ATO OPERATÓRIO ........................................................................................ 33

3.7 CIRURGIA ....................................................................................................... 33

3.8 PÓS-OPERATÓRIO ........................................................................................ 36

3.9 MORTE DOS ANIMAIS ................................................................................... 36

3.10 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ..................................................................... 37

3.11 AVALIAÇÕES MACROSCÓPICAS DA CICATRIZAÇÃO ............................. 37

3.12 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA ..................................................................... 39

3.12.1 Preparo das Amostras Teciduais ............................................................... 39

3.12.2 Método imuno-histoquímico ....................................................................... 42

3.12.3 Leitura das lâminas de imuno-histoquímica ............................................... 44

3.12.4 Método picrosirius ...................................................................................... 45

3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................... 46

4 RESULTADOS ................................................................................................... 49

4.1 AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA ...................................................................... 49

4.2 ANÁLISES MICROSCÓPICAS ....................................................................... 51

4.2.1 Metaloproteinase da matriz 9 (mmp-9) ......................................................... 51

4.2.2 Fator de transformação do crescimento beta (tgf-β) .................................... 53

4.2.3 Alfa actina de músculo liso (α-aml) ............................................................... 55

4.2.4 Coloração picrosirius .................................................................................... 57

5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 63

5.1 MODELO EXPERIMENTAL ............................................................................ 63

5.2 TÉCNICA ANESTÉSICA ................................................................................. 63

5.3 TÉCNICA OPERATÓRIA ................................................................................ 64

5.4 ANÁLISE MACROSCÓPICA ........................................................................... 68

5.5 ANÁLISE MICROSCÓPICA ............................................................................ 69

5.5.1 TÉCNICA DE MICROARRANJO TECIDUAL (TISSUE MICROARRAY- TMA)

.............................................................................................................................. 69

5.5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA ........................................................................ 70

5.6 NOVAS PERSPECTIVAS ............................................................................. 74

6 CONCLUSÃO .................................................................................................... 76

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 78

ANEXO ................................................................................................................. 96

1 INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

15

No estudo de acessos a cavidade abdominal, para uma determinada

incisão cirúrgica, a mediana é na maioria das vezes a escolhida, seja pela

facilidade de acesso, pela ampla exposição de suas estruturas, bem como a

rapidez, fundamental, sobretudo em urgências.

Com o aumento no número de laparotomias, aumentam as

complicações como as hérnias incisionais, que possuem tanto fatores locais

quanto sistêmicos, em sua etiologia (VIEIRA et al., 2000).

Sabendo que o traumatismo indevido, bem como hematomas e

infecções são complicações locais muitas vezes dependentes da maneira como

a incisão ocorreu, ou seja, do tipo de trauma sofrido pelos tecidos a fim de ser

realizado o acesso cirúrgico, e que quanto maior a agressão e destruição

celular, mais deficiente se torna a cicatrização dos tecidos, com uma fase

inflamatória mais longa e retardo na deposição de colágeno, que é a estrutura

tecidual que possui a função de manter a mesma resistência que o tecido

possuía antes,daí a importância de se comparar os diversos tipos de energia

que produzem trauma danos e reparos teciduais.

Procedimentos de incisão e hemostasia são realizados com os mais

diversos tipos de equipamentos, com o objetivo de proporcionar hemostasia

eficiente bem como um reduzido tempo cirúrgico, sem prejuízo a cicatrização

tecidual.

O bisturi com lâmina fria (BLF) foi o instrumento mais largamente

utilizado para diérese nas operações, devido ao seu fácil uso e dano previsível

nos tecidos. Nas incisões feitas com BLF ocorrem sangramentos, o que dificulta

a visibilidade do campo operatório e exige hemostasia. Desde a introdução do

eletrocautério por Bovie, em 1929 (VORE et al., 2002), vários modelos desse

instrumento foram desenvolvidos, tanto para uso médico como odontológico.

O bisturi harmônico ultrassônico (BHU) foi inicialmente usado na

videocirurgia, em 1995. Apresentou características como: não produzir fumaça,

possuir bom corte, coagular como um bisturi monopolar, sem fulguração, sendo

usado para dissecção com lesão tecidual mínima e menos resíduos .Tem ainda

a vantagem de não carbonizar o tecido que será enviado para anatomia

patológica, não transmitir corrente elétrica através do corpo do paciente, e poder

ser utilizado tanto em cirurgias abertas quanto laparoscópicas (AMARAL, 1993 ;

INTRODUÇÃO

16

PAREDES, BORGES & COULSON, 1996; GERSTH et al., 2000; VIEIRA et al.,

2000; METTERNICH et al., 2002; METTERNICH et al. 2002; GAO et al., 2003).

O BHU efetua hemostasia pela combinação de dissecção com

coagulação sanguínea e consequente obstrução do vaso. O ultrassom atua

como fonte de energia, pois a ponta do instrumento (lâmina) provoca vibrações

unidirecionais, as quais levam à dissecção do tecido e, ao mesmo tempo, à

coagulação sanguínea. Quando a lâmina vibra em 55.500 Hz de freqüência, o

som é transformado em energia mecânica vibratória, e atua promovendo corte e

coagulação (RAMOS et al., 2004). Proporciona melhor coagulação em função de

sua lâmina apresentar ponta romba e, consequentemente, gerar um corte lento.

A quantidade de energia fornecida aos tecidos e os efeitos sobre eles dependem

de diferentes fatores, como: nível de potência, característica da lâmina, tensão

do tecido, tipo de tecido, doença e técnica cirúrgica (METTERNICH et al., 2003).

Utiliza tecnologia que permite cortar com hemostasia e coagular vasos dos

tecidos moles usando baixas temperaturas, diferente das temperaturas usadas

pelo laser ou eletrocautério. A energia ultrassônica permite ambos, cortar e

coagular no ponto preciso de impacto com mínimo dano térmico tecidual

adjacente (KOCH et al., 2003). Oferece também grande precisão em pequenos

espaços e boa visibilidade no campo cirúrgico devido a mínima produção de

fumaça. O BHU controla sangramento em temperaturas entre 80°C e 100° C. Os

vasos são coaptados e selados devido à desnaturação das proteínas que ocorre

quando a temperatura ultrapassa 63°C e logo sofre resfriamento do tecido. O

laser e o eletrocautério coagulam vasos devido às altas temperaturas geradas,

300°C e 800°C respectivamente, ocasionando a formação de crostas, as quais

podem se desprender do tecido e causar sangramento (METTERNICH et al.,

2002).

O aquecimento do tecido provocado pelo BHU apresenta grau mínimo

na profundidade em comparação ao laser,à radiofrequência e ao eletrocautério,

reduzindo o dano tecidual. A profundidade de aquecimento do tecido varia de

meio a um e meio milímetros, sendo recomendada uma margem de segurança

de três milímetros (METTERNICH et al., 2003).

Portanto este trabalho se objetiva no estudo comparativo de incisões

abdominais, realizadas por bisturi de lâmina fria e bisturi harmônico

INTRODUÇÃO

17

ultrassônico, com o objetivo principal de avaliar a evolução do processo de

cicatrização de feridas com o bisturi ultrassônico na aponeurose média dos

músculos reto abdominal de ratos e compará-la às com bisturi de lâmina fria,

através dos seguintes objetivos secundários:

1) Comparação de complicações macroscópicas: formação de

hematomas, infecção, deiscências de sutura e aderências.

2) Comparação da expressão imuno-histoquímica da metaloproteinase

da matriz 9 (MMP-9).

3) Comparação da expressão imuno-histoquímica do fator de

transformação do crescimento beta (TGF- β).

4) Comparação da expressão imuno-histoquímica alfa actina do músculo

liso (α-AML) .

5) Avaliar a resposta do colágeno maduro, Tipo I pós-agressão cirúrgica

e compará-lo nos dois grupos.

6) Avaliar a resposta do colágeno imaturo, Tipo III pós-agressão

cirúrgica e compará-lo nos dois grupos

2 REVISÃO DA LITERATURA

REVISÃO DE LITERATURA

19

2.1 BISTURI LÂMINA FRIA E BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO.

Hambley et al., (1988), avaliaram a lesão e a cicatrização dos tecidos em

pele de porcos, após incisões com BLF, BHU, CO2 Laser e eletrocautério, e

comparam os aspectos clínicos, histopatológicos e diferenças na força tensil das

feridas. De acordo com os resultados concluíram que o BLF produziu menos

lesão nos tecidos e cicatrização mais rápida, mas o BHU apresentou menor

lesão nos tecidos e cicatrização mais rápida que eletrocautérios e que laser.

Gertch et al., (2000) em estudo mostrando resultados de hepatectomia

usando o BHU, em 16 cirurgias consecutivas mostrou que o bisturi harmônico

promove dissecção eficiente do parênquima hepático, de estruturas intra-

hepáticas e boa hemostasia, diminuindo o tempo cirúrgico e a utilização de

outros tipos de ligadura.

Ziv et al., (2001) realizaram laparotomia mediana em 60 ratos,

randomicamente distribuídos em dois grupos (bisturi de lâmina fria e

eletrocautério). A incisão da fáscia e pele foram fechadas separadamente

usando sutura com nylon. Analisando as propriedades mecânicas dos

segmentos de fáscia seis dias após a cirurgia, não encontraram nenhuma

diferença significativa entre os dois grupos.

Metternich et al., (2001) constataram que na tonsilectomia há

hemostasia eficiente intra e pós-operatória de significado expressivo, com

combinação de dissecção e coagulação sanguínea do vaso promovido pelo

BHU, levando a uma mínima perda de sangue. Isso foi favorável para crianças e

pacientes anêmicos, abreviando a duração do tratamento, mas o tempo da

cicatrização não se alterou. em comparação com as tonsilectomias feitas pelo

método convencional.

Kearns et al., (2001) compararam os resultados da incisão, em

laparotomia mediana, realizada com eletrocautério ou bisturi a frio em 100

pacientes. Eles mostraram que pacientes que receberam incisão eletrocautério

tiveram uma cicatrização mais rápida, menos sangramento importante, e um

mínimo de dor no pós-operatório.

Sood et al., (2001) avaliaram a efetividade do BHU em 59 pacientes

submetidos à tonsilectomias. Foram acompanhados por duas semanas e no


20

pós-operatório, avaliados quanto à dor e sangramento, após dez dias, em média,

retornaram as suas funções normais. Concluíram que o BHU foi um aparelho de

fácil uso, as operações foram mais curtas e o sangramento foi mínimo. Segundo

eles, os achados foram positivos, e por isso o BHU deveria ser incluído como

uma alternativa nas tonsilectomias.

Metternich et al., (2002), em mostraram os benefícios da utilização do

bisturi harmônico em cirurgias para tratamento de carcinoma de língua e de

palato mole. Foram avaliadas a necessidade de eletrocoagulação adjuvante e a

possibilidade do estudo das margens da peça cirúrgica enviada para

anatomopatológico, 82% dos pacientes com tumor de palato não necessitaram

eletrocoagulação ou ligadura de vasos, o mesmo ocorreu em 68% das cirurgias

de língua. A peça cirúrgica mostrou-se adequada para a avaliação pelo

anatomopatologista, principalmente no que se refere às margens cirúrgicas, que

não mostraram lesão tecidual por calor.

Haegner, Handrock & Schade (2002) confrontaram as vantagens e as

desvantagens da tonsilectomia com BHU em relação aos métodos tradicionais e

constataram cirurgias mais rápidas, com menor perda de sangue, menor número

de complicações intra-operatórias e menos dor no pós-operatório. A

desvantagem foi o retardo da cicatrização em relação à tonsilectomia tradicional.

Gao et al., (2003) mostraram a eficácia da secção de vasos em tumores

benignos de tireóide, abordados com o bisturi harmônico por via endoscópica.

Foram avaliados 170 pacientes submetidos a esse procedimento. Nenhum dos

pacientes apresentou sangramento ou hematoma importante no pós-operatório.

Ramos dos principais vasos podem ser satisfatoriamente seccionados com o

bisturi harmônico sem uso de ligadura ou hemo-clipe. O sangramento intra-

operatório foi satisfatoriamente controlado com a coagulação promovida pelo

bisturi harmônico. Os autores concluem que a utilização do bisturi harmônico

simplifica grandemente o manejo intraoperatório da tireóide.

Emann e Cushieri, (2003), em estudo realizado em porcos, avaliaram o

alto poder de dissecção do bisturi harmônico ultrassônico em cirurgias

laparoscópicas e em cirurgias convencionais. Realizaram o mapeamento dos

tecidos durante a dissecção utilizando câmera térmica infravermelha associada a

software. Fizeram estudo histológico e provaram que os níveis de potência


21

influenciavam no dano térmico. No nível três de graduação do BHU o dano

térmico era menor, uma vez que nos níveis quatro e cinco a energia ultrassônica

causou dano tecidual quando permaneceu no mesmo espaço por mais de cinco

segundos.

Metternich et al., (2003) em estudo com 20 pacientes mostrou o

benefício do emprego do bisturi harmônico em pacientes submetidos à

parotidectomia. A hemostasia foi eficiente em 85% dos pacientes para os quais

não foi necessário o uso de ligaduras ou eletrocoagulação. Não houve dano a

tecidos vizinhos ou ao nervo facial.

Ishibashi & Takamatsu (2003) Relatou casos de pacientes com

telangectasia hemorrágica hereditária tratados com o uso de bisturi harmônico.

O uso desse equipamento evitou a carbonização e incrustação na mucosa nasal

que é comum com o uso do eletrocautério ou da cauterização a laser.

Sinha e Gallagher (2003) estudaram os efeitos do BLF, BHU, laser de

CO2 e eletrocautério monopolar e bipolar em cicatrização de feridas em mucosa

oral de Guinea pig. Foram feitas incisões na mucosa oral, avaliada a dor pela

medida de peso do animal, feitas análises histológicas e tensão nos dias 0, 7,

14, 21 e 28. Com a análise dos dados concluíram que o uso do BLF produziu

cicatrizes mais resistentes em todos os tempos estudados e no final da primeira

semana a epitelização era completa nas feridas feitas com BHU e BLF e

incompleta no laser e eletrocautério. A evolução do processo inflamatório foi

mais breve no BHU e BLF.

Ramos et al.(2004), afirmaram que o BHU é um excelente recurso para

a realização de operações mais longas e com maior risco de sangramento.

Relataram desvantagens como a perda da sensibilidade, alteração da

temperatura dos tecidos e ausência de direção de corte. Como vantagens

descreveram a simultaneidade do corte e coagulação, otimizando o tempo

cirúrgico, a não utilização de corrente elétrica, a mínima carbonização tecidual e

a fácil instalação e manipulação do aparelho.

Callejas et al. (2004), em relato de série de casos em que foi realizada

simpatectomia torácica em 100 pacientes utilizando o bisturi harmônico para

tratamento de rubor facial revelou que os pacientes estudados não

apresentaram complicações per ou pós-operatórias, não foi observada lesão de


22

parênquima pulmonar por dispersão de calor como nos casos em que se utiliza

bisturi bipolar.

Blankenship et al. (2004), em estudo retrospectivo de 42 pacientes

submetidos à parotidectomia superficial por doença benigna de parótida, sendo

que 19 foram submetidos à cirurgia utilizando o bisturi harmônico (grupo A) e 21

submetidos à cirurgia com bisturi convencional (grupo controle). O uso do bisturi

harmônico mostrou diminuição significativa do tempo cirúrgico (grupo A- 167,5 ±

42,6min. vs 195,5 ± 37,4 min. para controle, p=0,03), e da perda sanguínea per

operatória (37,5 ±25,8 vs 60 ± 37,1 ml, p=0,03). Não houve diferença

significativa no pós-operatório quanto à função do nervo facial.

Westervelt et al. (2004), em relato de série de casos, com 100 pacientes

submetidos à colecistectomia laparoscópica utilizando o bisturi harmônico para

dissecção de ducto e artéria cística e dissecção do leito da vesícula, sem

utilização de clipe. Apenas dois pacientes com cístico maior que 5 mm

receberam ligadura adicional. Nenhum paciente apresentou sangramento no

pós-operatório ou extravasamento de bile.

Perko et al. (2006), em estudo usando BHU em parede lateral de

abdome de ratos, onde foram realizadas cauterizações por 5,10 segundos

ininterruptos e por duas sequências de aplicações de 5 segundos,demonstrando

que a lesão é maior quanto mais longo e mais sustentado o período de aplicação

Garcia et al. (2007), comparou a cicatrização da aponeurose da parede

abdominal de ratos após incisão com bisturi de lâmina fria e eletrocautério,

sendo sacrificados ao 10° dia , e concluíram que a cicatrização da parede

abdominal após a diérese com bisturi de lâmina fria e eletrocautério se

equivalem e não diferem.

Massi et al. (2009), comparando evolução macro e microscópica do

processo de cicatrização de feridas realizadas com o bisturi harmônico

ultrassônico na mucosa jugal de ratas e comparando às feitas com bisturi de

lâmina fria concluiu que a utilização do BHU proporciona hemostasia eficiente;

leva a uma maior área de lesão no momento da incisão; atrasa o processo de

regeneração; promove maior processo inflamatório; prolonga a fase inflamatória;

desenvolve maior atividade angiogênica; atrasa a fibroplasia e a maturação das

cicatrizes.


23

Broek, Wibers & Goor (2011), em trabalho onde comparou a isquemia

tecidual do orifício de passagem de catéter de hemodiálise em ratos , quando

feita com eletrocautério e BHU, encontrou isquemia superior nos orifícios

realizados com eletrocautério.

2.2 METALOPROTEINASES E METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9 (MMP-9).

O primeiro relato sobre as metaloproteinases foi publicado em 1962,

Gross e Lapiére encontraram uma enzima ativa em cultura de pele que

degradava colágeno tipo I.

As metaloproteinases (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco

dependente, que promovem a degradação da matriz extracelular, podendo

também ser chamadas de matrixinas. Todos os membros dessa família são

secretados como proenzimas. Essas proenzimas são liberadas por neutrófilos,

monócitos, macrófagos, fibroblastos e, além disso, também podem ser

secretadas pelas células tumorais em resposta a uma variedade de estímulos

(WOESSNER et al .,1991).

A família das MMPs inclui cerca de 25 proteínas,as quais podem ser

divididas em: colagenases (MMP-1,8 e 13), gelatinases (MMP-2 e 9),

estromelisinas (MMP-3, 7 e 10), matrilisinas (MMP-7 e 26), MMPs tipo

membrana (MMP-14, 15, 16, 17 e 24) e outras MMPs ,que são classificadas pela

especificidade ao substrato e, principalmente, de acordo a sua estrutura, (VISSE

etal ., 2003).

Gelatinase B (MMP-9) e gelatinase A (MMP-2) são dois membros

intimamente relacionados da família MMP que degradam colágeno desnaturado

ou gelatinas, (VISSE et al ,.2003).

A participação das MMPs em diversos eventos biológicos deve-se ao fato

de que elas podem influenciar potencialmente o comportamento celular através

de algumas ações, como clivagem de proteínas que fazem a adesão célula–

célula, liberação de moléculas bioativas na superfície celular ou por clivagem de

moléculas presentes na superfície celular, as quais transmitem sinais no

ambiente extracelular. Sua importância no processo de cicatrização , deve-se a

sua degradação ao colágeno desnaturado, sendo maior sua concentração,


24

quanto maior o estímulo para sua produção pelos neutrófagos, monócitos e

macrófagos. As colagenases na cicatrização possuem a função de degradar o

tecido lesado , para que a regeneração tecidual possa ocorrer. Sua aferição e

feita pela imuno-histoquimica.

Diversos processos biológicos ocorrem com a participação das

metaloproteinases, (YONG et al .,2007) como determinação da arquitetura da

matriz extracelular, (LEE et al .,2004),desenvolvimento embrionário (CHEN et

al.,2004), implantação do blastocisto, morfogênese dos órgãos, desenvolvimento

do sistema nervoso, ovulação, dilatação cervical, regressão uterina pós-parto

(NAGASE et al.,1999),desenvolvimento e remodelação do tecido oral,

cicatrização, angiogênese , (CHEN et al.,2004) e apoptose, (SOUZA et al.,

2002).

2.3 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-).

A superfamília dos TGF-inclui vários fatores de crescimento responsáveis

pela diferenciação e morfogênese celular em diferentes células e tecidos, tanto

em condições fisiológicas como patológicas, através de receptores de superfície

celular.

São representadas pelas seguintes subfamílias: TGF-(-1, -2, -3, -4 e -

5); activinas e proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), (KINGSLEY.,1994 ;

REDDI.,1994).

O TGF-1 é um regulador multifuncional do crescimento e diferenciação

celular durante desenvolvimento e reparação, influenciando a síntese de

componentes da matriz extracelular, como colágenos, fibronectina, laminina e

glicosaminoglicanas, (IGNOTZ et al., 1987; BORDER e NOBLE, 1994). Além

disso, é um importante modulador da síntese de receptores de membrana, as

integrinas, aumentando assim a interação célula-célula e célula-matriz,

(ROBERTS et al., 1988; HEINO et al.,1989).

Sendo assim faz a quimiotaxia tecidual no processo de cicatrização,

induzindo a célula mesenquimal a se diferenciar em fibroblasto, e atuando na


25

síntese da matriz celular, sua quantificação medida pela imuno-histoquímica, é

quanto maior a necessidade de composição tecidual , maior sua concentração.

O TGF-1 é provavelmente o fator de crescimento mais importante na

indução da α-AML (DESMOULIÉRE et al.,1993; DESMOULIÈRE.,1995

;GREGOIRE e LIEUBEAU.,1995 ; CHAPONNIER e GABBIANI.,2004).

Desmouliére et al. (1993) demonstraram que o TGF-apresenta um

importante papel na diferenciação miofibroblástica durante os fenômenos

fibrocontrativos e cicatriciais, por regular a expressão de α-AML nestas células.

Sabe-se que o TGF-1 induz a produção de colágeno tipo I, por regular

a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas. (NAKASHIMA, 1992;

TOYONO et al., 1997; HU et al., 1998; SHIBA et al., 1998; TZIAFAS et al., 1998;

SLOAN e SMITH, 1999; MELIN et al., 2000; ABOUT e MITSIADIS, 2001;

TZIAFAS, 2004).

2.4 MIOFIBROBLASTO E ALFA ACTINA DE MÚSCULO LISO (α-AML)

Durante muitos anos, propôs-se que o termo “miofibroblasto” se

empregava para nominar células fibroblásticas localizadas nos tecidos de

granulação que exibiam um importante aparato microfilamentoso citoplasmático

(GABBIANI et al., 1971; 1976).

Os miofibroblastos são componentes importantes durante a reparação do

tecido lesionado e aparecem após o término dos fenômenos inflamatórios

iniciais. Na maioria dos órgãos, a lesão tecidual ativa fibrócitos locais que na

presença dos fatores de crescimento derivados dos macrófagos se diferenciam

em miofibroblastos contráteis, que são caracterizados pela expressão da α-

actina de músculo liso. Portanto a sua produção é mediada pelo estimulo

tecidual pós agressão, no caso reação inflamatória, que ativa fibrócitos e estes

se diferenciam em miofibroblastos, sua quantificação pode ser feita pelo método

imuno-histoquímico.

Atualmente, sabe-se que estas células também se encontram em tecidos

normais especializados, onde possuem uma importante função constitutiva e

mecânica, bem como, estão presentes durante uma variedade de condições

patológicas (ROCHE, 1990; TOMASEK et al., 2002; EYDEN, 2004).


26

Esta célula tem um papel fundamental no fenômeno de retração da ferida,

síntese e secreção de proteínas da matriz extracelular (EYDEN, 2001).

Os principais microfilamentos que compõem o citoplasma da célula

miofibroblástica contém actina e/ou desmina, e proteínas associadas a células

de músculo liso, sendo principalmente caracterizada pela presença da isoforma

α-actina de músculo liso, tipicamente localizada nas células musculares lisas da

parede de vasos sanguíneos (DARBY et al., 1990).

As actinas são proteínas presentes somente nas células eucarióticas

envolvidas em diversas funções celulares incluindo contração muscular,

motilidade ,adesão e divisão celulares, bem como, manutenção da morfologia da

célula,(CHAPONNIER e GABBIANI, 2004) Em vertebrados, constitui uma família

de seis proteínas, expressa em padrões específicos no desenvolvimento de

cada tecido (MCHUGH et al., 1991).

Existem quatro isoformas restritas a tipos teciduais, como, α-actina

esqueletal, α-actina cardíaca, α-actina de músculo liso e γ-actina de músculo

liso,expressas respectivamente em músculos esquelético, estriado cardíaco,

musculatura lisa vascular e entérica, (CHAPONNIER e GABBIANI, 2004).

A α-actina de músculo liso é um microfilamento (5-8 nm de diâmetro) que

compõe o citoesqueleto de todas as células musculares lisas de mamíferos,

células mioepiteliais, e particularmente abundante em células musculares lisas

de paredes de vasos, (DARBY et al., 1990; MCHUGH et al., 1991), tendo uma

importante função contrátil nestas células (CASELITZ et al., 1981), sendo

considerada um marcador do fenótipo miofibroblástico, (VAUGHAN et al., 2000;

HINZ et al., 2007) . Está também presente em células conjuntivas como

fibroblastos (DESMOULIÈRE et al., 1993; ARORA e McCULLOCH, 1999;

PREMDAS et al., 2001; KINNER et al., 2002) e miofibroblastos (DARBY et al.,

1990; HINZ et al., 2003, 2007).

Ultra-estruturalmente, estas células apresentam retículo endoplasmático

rugoso e complexo de Golgi bastante desenvolvidos, vesículas de pinocitose,

junções do tipo “gap”, e uma disposição organizada de feixes de miofilamentos

de actina localizados focalmente ao longo eixo da célula (fibras de “stress”) ou

se ligando a domínios de fibronectina extracelular através de proteínas

especializadas de membrana (integrinas), caracterizando especializações da


27

membrana chamadas de fibronexos (SCHÜRCH et al., 1998; EYDEN, 2001,

2004) Funcionalmente, este sistema mecano-transdutor é capaz de transmitir as

forças geradas na matriz extracelular (DUGINA et al., 2001), sendo importante

no processo de reparação tecidual.

Ainda que controversa, a hipótese mais amplamente aceita na literatura

sobre a origem dos miofibroblastos é a partir de fibroblastos quiescentes, que

uma vez ativados, sintetizam abundante quantidade de cisternas de retículo

endoplasmático rugoso para produção de matriz, e transdução de genes que

codificam a transcrição de miofilamentos de actina de músculo liso, importantes

na contratilidade celular (WELCH et al., 1990).

Alliot-Licht et al. (2001) demonstraram a presença de células positivas para

-AML em cultura mineralizada de polpas dentárias humanas. Estas células

apresentavam, ultra-estruturalmente, numerosas fibras e fibronexos bem

desenvolvidos, bem como núcleo edentado e conexões intercelulares do tipo

“gap”,caracterizando-as de miofibroblastos. Sugeriram que alguns fatores de

crescimento presentes no meio de cultivo celular, combinados ou não a

proteínas da matriz extracelular, seriam responsáveis pela diferenciação de

células pulpares em miofibroblastos.

Para que ocorra a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos é

essencial a ação de citocinas e fatores de crescimento, representados pela

família dos TGF (fatores de transformação de crescimento), particularmente do

TGF-, (DESMOULIÈRE et al., 1993; DESMOULIÈRE, 1995; CHAPONNIER e

GABBIANI, 2004).

3 MATERIAL E MÉTODOS

MATERIAL E MÉTODO

29

Este estudo foi realizado no Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM) do

Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade

Evangélica do Paraná – Níveis Mestrado e Doutorado.

Neste trabalho, aplicaram-se as Normas para Apresentação de

Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná (2007), baseados

na Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT); utilizou-se a Nomina

Anatômica Veterinária (1997) e os princípios éticos em experimentação animal

preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório

(SBCAL).

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Sociedade

Evangélica Beneficente de Curitiba (anexo 1).

3.1 CARACTERIZAÇÂO DA AMOSTRA

Foram utilizados 80 ratos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia

mammalia), da linhagem Wistar, machos, adultos jovens, com três meses de

idade com peso variando de 250 a 300 gramas, procedentes do biotério do

Instituto de Tecnologia do Paraná (TECPAR).

3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Os animais foram distribuídos em dois grupos de 40 ratos. O primeiro

submetido à incisão cutânea inicial com bisturi de lâmina fria e abertura da

aponeurose da linha média com a mesma. O segundo grupo foi submetido à

mesma incisão cutânea, porém a aponeurose foi aberta com bisturi harmônico

ultrassônico.

Cada grupo animal foi subdividido em 4 subgrupos de 10 ratos. Os

submetidos a incisões aponeuróticas com bisturi de lâmina fria (BLF) e morte no

3º, 7º, 14° e 21º dias, foram denominados BLF 3, BLF 7, BLF 14 e BLF 21. Já os

MATERIAL E MÉTODO

30

submetidos à incisão aponeurótica com bisturi harmônico ultrassônico; e morte

nos 3º, 7º, 14º e 21º dias, foram denominados BHU 3 BHU 7, BHU 14 e BHU

21, respectivamente. Os animais de cada subgrupo foram identificados pelos

números 1 a 10 com caneta marcadora em cauda.

3.3 APARELHOS UTILIZADOS

3.3.1 Bisturi com Lâmina Fria

Utilizou-se um bisturi de lâmina móvel, cabo número três e lâmina número

quinze.

3.3.2 Bisturi Harmônico Ultrassônico

Foi utilizado bisturi harmônico ultrassônico produzido pela Ethicon Endo

Surgery®, Inc (Figura 1), modelo Gerador 300 GEN04, ano de fabricação 2001.

O aparelho consiste de um móvel com um gerador, com altura de 13 cm,

largura de 37 cm, profundidade 39 cm e peso de 7,48 Kg, sistema de lâmina e

de pedal. O gerador é um microprocessador controlado, com um interruptor de

alta frequência que abastece a potência a qual dirige o sistema acústico. A

potência possui cinco níveis.

MATERIAL E MÉTODO

31

FIGURA 1- BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO FONTE: O autor .

Como instrumento de mão foi utilizado o Bisturi Harmônico (UltraCision®

-ETHICON) (Figura 2) , que consiste em uma Lâmina Tipo Tesoura Curva

(modelo CS-14C), que é utilizada tanto para corte quanto para dissecção dos

tecidos.

FIGURA 2 - BISTURI HARMÔNICO ULTRA CISION

NOTA: Bisturi Harmônico UltraCision ® – ETHICON

FONTE: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/obesidade/obesidade-morbida-9.php

MATERIAL E MÉTODO

32

3.4 PRÉ-OPERATÓRIO

Os animais permaneceram albergados no biotério do IPEM e mantidos

sob condições constantes de luz e temperatura, com doze horas de claridade e

doze horas de escuridão, em sala isenta de ruídos e iluminada com lâmpadas

fluorescentes.

Foram acondicionados em gaiolas-padrão, forradas com serragem,

sendo alimentados com ração comercial (Nuvilab CR-1 ® -Nuvital Nutrientes

S/A), com acesso para água tratada.

Os ratos foram submetidos a um jejum pré-operatório de doze horas,

com oferta de água.

3.5 ANESTESIA

Num frasco estéril foi adicionado 3,75 ml de cloridrato de ketamina 10%

(Ketalar® Aché) - 100mg/ml + 0,5 ml de cloridrato de xilazina 2% (Vibaxyl 2% ®

Virbac) -100mg/ml + 5,75 ml de água destilada estéril.

A anestesia foi realizada com aplicação de sulfato de atropina 0,25

mg/ml (Atropion® Ariston) (0,05 mg/kg de peso) intraperitoneal, e após 10

minutos, a aplicação da mistura de Vibaxyl 2%® (10mg/kg de peso corporal) e

de Ketalar® (25mg/kg de peso corporal), ou seja, foi administrado 0,2 ml/100g

de peso da solução, via intraperitoneal. Quando necessário, repetida metade da

dose após 20 a 30 minutos. (MEZADRI, TOMÁZ & AMARAL, 2004).

MATERIAL E MÉTODO

33

3.6 ATO OPERATÓRIO

As cirurgias foram realizadas no laboratório do IPEM pelo autor e dois

auxiliares.

Após a anestesia os animais foram posicionados em decúbito dorsal

sendo fixados pelas extremidades na mesa cirúrgica. A tricotomia abdominal na

parede ventral foi realizada com a utilização de aparelho de barbear, lâmina de

aço (Gillette® Gillette do Brasil Ltda.) com auxílio de sabão líquido.

Foi realizada antissepsia com iodopolipovidona a 10% (Pvpi ® Geyer)

seguida da colocação de campo estéril delimitando a área cirúrgica.

3.7 CIRURGIA

Realizou-se, incisão cirúrgica abdominal mediana, em pele, com bisturi

lâmina nº 15 (Solidor), com 7 cm de comprimento, longitudinal e retilínea, sendo

a hemostasia realizada por compressão digital, assim expondo a linha média da

aponeurose da parede abdominal (Figura 3).

FIGURA 3 - INCISÃO COM BISTURI DE LÂMINA FRIA EM PELE EXPONDO A APONEUROSE FONTE: O autor.

MATERIAL E MÉTODO

34

Feito isso, no primeiro grupo foi realizada secção da aponeurose, até

atingir o peritônio com bisturi lâmina fria, no comprimento de 6 cm, e no segundo

grupo o mesmo acesso utilizando o bisturi harmônico ultrassônico, gerador 300,

no nível 3 de uso (Figuras 4 e 5).

FIGURA 4 – INCISÃO COM BISTURI DE LÂMINA FRIA NA APONEUROSE FONTE: O autor.

FIGURA 5 - INCISÃO COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO À APONEUROSE FONTE: O autor.

A síntese da aponeurose foi realizada com fio de polipropileno (Prolene®

5-0 Ethicon) em pontos contínuos nos dois grupos sem nenhuma diferenciação

(Figura 6).

MATERIAL E MÉTODO

35

FIGURA 6 - SÍNTESE DA APONEUROSE FONTE: O autor.

Após a correção da parede abdominal, revisou-se a hemostasia e

realizou-se síntese da pele com fio mononylon 5-0, com pontos em sutura

contínua (Figura 7).

FIGURA 7 - SÍNTESE DA PELE FONTE: O autor.

MATERIAL E MÉTODO

36

3.8 PÓS-OPERATÓRIO

Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, aquecidos com luz

artificial até a completa recuperação da anestesia, quando puderam deambular e

se alimentar.

Após a recuperação os animais foram transferidos para gaiolas

identificadas conforme o grupo e subgrupo, onde estavam anotadas a data do

procedimento e o bisturi utilizado na cirurgia (BLF ou BHU), sendo colocados no

máximo quatro ratos por gaiola.

Os animais foram identificados, com numeração na cauda, realizada

com caneta retroprojetor.

Foram submetidos à analgesia pós-operatória com paracetamol

200mg/ml (Tylenol® Janssen-Cilag) via oral na dose de 40 gotas para cada 50

ml de água ofertada, nos primeiros dois dias.

A avaliação macroscópica de cada animal no pós-operatório foi diária,

com observação da ferida operatória, presença ou não de infecção, hematoma,

deiscência ou hérnia incisional.

3.9 MORTE DOS ANIMAIS

Conforme o cronograma estabelecido os ratos foram mortos por injeção

de anestésico intraperitoneal, Ketalar® associado à Vibaxyl 2% ® em dose

anestésica letal, o dobro da dose convencional, sendo, mistura de Vibaxyl 2% ®

(20 mg/kg de peso corporal) e de Ketalar® (50mg/kg de peso corporal), nos dois

grupos de 40 animais, nos subgrupos de 10 ratos de ambos os grupos, aos 3°,

7°, 14°e 21° dias de pós-operatório.

MATERIAL E MÉTODO

37

3.10 OBTENÇÂO DAS AMOSTRAS

Após a morte de cada animal foi analisada a parede abdominal,

observando na cicatriz, a presença ou não de hematoma, infecção, deiscência

de sutura, hérnia incisional.

Realizou-se a incisão na pele e tecido celular subcutâneo, no sentido

craniocaudal, e feita a secção da totalidade da parede ventral (Figura 8).

FIGURA 8 – PEÇA DISSECADA – CORTE DA PAREDE ABDOMINAL NOTA: Segmento de 8 cm de comprimento com 6 cm de largura englobando toda incisão. FONTE: O autor.

Com a remoção da parede abdominal, a cavidade peritoneal foi

analisada quanto à presença ou não de hematoma, abscessos, fístulas,

deiscências e aderências.

3.11 AVALIAÇÕES MACROSCÓPICAS DA CICATRIZAÇÃO

Realizou-se avaliação macroscópica das feridas, observando os

seguintes critérios (Quadro 1):

MATERIAL E MÉTODO

38

Hematoma

Ausente

Presente

Infecção

Ausente

Presente

Deiscência de sutura

Ausente

Presente

Fístula

Ausente

Presente

Aderências

Ausente

Presente

QUADRO 1 – CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA FONTE: O autor.

Em relação às aderências, utilizou-se os parâmetros de Gonçalves et al.,

2000, que classifica estas em relação a sua intensidade, (Quadro 2).

Intensidade Parâmetros

0 Ausência completa de aderências

1 Aderência do omento maior à ferida cirúrgica

2 Aderências do omento maior e do intestino delgado à ferida

cirúrgica

3 Aderências múltiplas intracavitárias

QUADRO 2 – CLASSIFICAÇÃO DAS ADERÊNCIAS ABDOMINAIS FONTE: Gonçalves et al., 2000

MATERIAL E MÉTODO

39

3.12 AVALIAÇÂO MICROSCÓPICA

3.12.1 Preparo das amostras teciduais

A técnica de micro arranjo tecidual (tissue microarray-TMA) foi utilizada,

inicialmente nos blocos de parafina arquivados (bloco doador), selecionou-se a

área de interesse,no caso o centro da cicatriz na linha média das aponeuroses

do músculo reto abdominal. Com uma pinça para biópsia de pele - Punch (

Figura 9 e 10 ), pressionado sobre a marcação feita, retirada a amostra em toda

a sua profundidade (figura 11), um cilindro de tecido de 4 mm de comprimento

foi retirado das amostras.

FIGURA 9 – PINÇA DE BIÓPSIA DE PELE. FONTE: o autor

FIGURA 10 – BIÓPSIA COM PUNCH. NOTA: Retirada de tecido cilíndrico, pós secção com Punch. FONTE: `` Withrow e MacEwen´s Smal Animal Oncology´´, 4th Ed.,Esevier, 2007.

MATERIAL E MÉTODO

40

FIGURA 11 - MATERIAL EM BLOCO DE PARAFINA ANTES E APÓS PUNÇÃO FONTE : o autor

Este cilindro foi então introduzido em um novo bloco (bloco receptor)

,previamente preparado com orifícios cilíndricos vazios (Figura 12). Os cilindros

dos vários casos são sucessivamente adicionados ao bloco receptor, e a

posição de cada amostra foi identificada em uma planilha com referências de

coluna e linha (eixos X e Y). Ao fim, um bloco receptor com 10 amostras

diferentes foi conseguido. Deste bloco foram obtidos cortes histológicos

seqüenciais numerados em lâminas tratadas com adesivo que permitiram a

realização de múltiplas reações (TROTER, DEMETRICK & CIEZAR.,2002).

FIGURA 12 – BLOCO RECEPTOR.

NOTA : Montado conforme o mapa com as identificações FONTE: Protocolo de TMA da UFPR PR.

MATERIAL E MÉTODO

41

Neste trabalho, cada bloco correspondeu a um subgrupo com 10

amostras cada, uma de cada rato, sendo identificados como: BLF 3, BLF 7, BLF

14 e BLF 21, que foram submetidos a incisões aponeuróticas com bisturi de

lâmina fria (BLF), e numeradas com 3, 7,14 e 21, que correspondem ao dia da

morte dos animais , com a mesma metodologia ,BHU 3 BHU 7, BHU 14 e BHU

21, submetidos à incisão com bisturi harmônico ultrassônico (Figura 13).

FIGURA 13 – BLOCO DO SUBGRUPO BHU 14 FONTE: O autor .

As amostras ficaram dispostas por número do animal do subgrupo, na

primeira linha os animais números 1,2,3 e 4 na segunda linha os 5, 6,7 e 8, na

terceira os números 9 e 10, e na última linha a amostra sinalizadora. Exemplo:

subgrupo BHU 14, primeira linha BHU 14 1, BHU 14 2, BHU 14 3 e BHU 14 4 na

segunda linha BHU 14 5, BHU 14 6, BHU 14 7 e BHU 14 8 , na terceira linha as

amostras BHU 14 9 e BHU 14 10 (Figura 13).

A coloração realizou-se pelo método imuno-histoquímico de

metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9), fator de transformação beta (TGF- β) e

alfa actina do músculo liso (α-AML) . O patologista não teve conhecimento do

grupo animal em estudo. Na análise dos resultados o patologista selecionou as

lâminas para documentação fotomicrográfica.

MATERIAL E MÉTODO

42

3.12.2 Método Imuno-histoquímico

Para realização da técnica de imuno-histoquímica, os blocos de

parafina foram cortados em micrótomo com espessura de três micrometros (μm)

e distendidos em lâminas histológicas previamente preparadas com

Organosilano (Sigma-Aldrich A3648) com o intuito de promover maior aderência

dos cortes às lâminas, evitando a perda do material durante o procedimento

imuno-histoquímico. As lâminas foram estocadas em estufa com temperatura

entre 55 e 58ºC por 24 horas, e transferidas para cubas de vidro vertical para

iniciar a técnica de imuno-histoquímica.

A desparafinização foi realizada com dois banhos em xilol de 30

minutos cada em temperatura ambiente. O processo de desidratação foi

realizado com passagens em álcool 95º, em álcool absoluto (três vezes de três

minutos), álcool 95º e álcool 85º.

O bloqueio da peroxidase endógena (bloqueio dos radicais livres

provenientes do fixador) foi realizado com solução de peróxido de hidrogênio e

metanol 5% (para diluir o peróxido em metanol) e lavado com água destilada.

A recuperação antigênica pelo calor é a etapa que tem como objetivo a

liberação dos epítopos antigênicos do tecido. As lâminas foram mergulhadas no

recuperador Imuno Retriver (Dako®) à cuba de banho-maria à 99º C por 40 min.

, deixado esfriar à temperatura ambiente.

Realizada lavagem em água destilada, marcou-se lâmina por lâmina

com caneta hidrofóbica Dako pen (Dako®), delimitando a área do corte ,antes de

pingar as alíquotas de anticorpos, foi deixado em tampão TBS tris pH 7.3,

evitando que o corte secasse .

Na seqüência, pingou-se as alíquotas de anticorpos primários

monoclonais MMP-9, TGF- β e α-AML (Quadro 3) e levou-se para câmara

úmida por 18 hs à 4ºC (''overnight'').

MATERIAL E MÉTODO

43

QUADRO 3 - ANTICORPOS PRIMÁRIOS UTILIZADOS FONTE: O autor.

Foram lavadas as lâminas em tampão TBS tris pH 7.3 e deixado por 15

min. Novamente lavado em tampão, quando seco e pingou-se Advance link

(Dako®) e aguardou-se por 30 min. Nova lavagem em tampão e pingou-se

Advance enzyme (Dako®), ligante secundário (marcador) e deixado por 30

minutos.

O Advance link e o Advanced Enzyme fazem parte de uma solução que

se chama polímero secundário ou de revelação e eles são responsáveis pela

ligação entre o anticorpo primário e o cromógeno. O cromógeno é a solução

responsável por dar cor à reação.

Lavado em tampão, após secar foi adicionado o cromógeno DAB (1:1) ,

marcador, até a visualização da cor castanha e lavou-se rápido em água

destilada.

Contracorado com Hematoxilina de Harris por 5 min, para fundo de

imagem. Lavou-se em água de torneira e aguardados 5 min. Desidratado com

álcool etílico absoluto (3 x 1 min.), diafanizou-se com xilol (3 x 5 min). Realizou-

se a montagem.

Anticorpo

primário

Tipo

de marcação

Clone Marca Diluição

Padronizada

MMP-9

Citoplasma

15W2

Novocastra

Laboratories

Ltd.™

1: 50

TGF- β1

Citoplasma

2C5

Santacruz

Biotechnology ®

1: 50

α-AML

Citoplasma

1A4

Dako ®

1:400

MATERIAL E MÉTODO

44

312.3 Leitura das lâminas de Imuno-histoquímica

As lâminas imunomarcadas foram submetidas à leitura, através de

microscópio óptico Olympus® BX50 (Tóquio, Japão), acoplado a câmera de

vídeo Dinoeye e a computador com software de análise de imagem Image Pro

Plus™ (Maryland, USA). Foram capturadas quatro imagens em campo de

grande aumento (CGA = 400 vezes), cuja área total de 115226,1µm2 com

resolução de 1024x 768 pixels para cada caso do estudo.

O controle positivo da reação foi digitalizado e uma imagem em CGA

foi escolhida como máscara, contendo a positividade adequada para o

biomarcador escolhido (Figura 14 A).

A máscara foi então sobreposta às imagens digitais dos casos.

Baseado na imunopositividade ideal da máscara, o software de análise Image

Pro Plus (TM) encontra as áreas imunopositivas nas amostras do estudo e

transforma este dado em área imunopositiva por micrômetro quadrado (µm2)

(Figura 14 B).

FIGURA 14 - LEITURA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA

LEGENDA: imuno-histoquímica pelo tgf- β subgrupo BLF 3 .

NOTA: A- lâmina submetida a método imuno-histoquímico B - área imunopositiva marcada em

vermelho pós análise pelo software.

FONTE: O autor.

3.1.1.1.1.1.1

3.1.1.1.1.1.2

MATERIAL E MÉTODO

45

A área em µm2 gerada por este método foi então dividida pela constante

115.226,1 µm2 que é a área total do campo avaliado, gerando uma

porcentagem de área imunopositiva por CGA. Uma porcentagem média de área

em 4 CGA foi calculada para cada caso , como no exemplo abaixo (Tabela 1).

TABELA 1 - RESULTADO DE ÁREA IMUNOPOSITIVA PELAS 4 IMAGENS DE CADA

AMOSTA

LEGENDA : animal do subgrupo BLF 3

NOTA: média de área de cada animal e média de área total .

FONTE: O autor.

MMP 9

TMA FOTO1 FOTO2 FOTO3 FOTO4 media do

animal % área positiva

BLF 3

1A 2398,8635 1634,8127 5156,5708 3829,6743 3254,980325 3,32%

1B 7868,6494 6753,7031 4863,9614 4415,334 5975,411975 5,18%

1C 8057,3438 7038,5112 2989,8218 5314,2085 5849,971325 5,07%

1D 4967,1401 1939,3439 1648,2068 897,99158 2363,170595 2,05%

2A 2074,0205 1570,3446 4280,2153 1444,4991 2342,269875 2,01%

2B 6438,1328 8201,7354 4433,7324 7151,4043 6556,251225 5,68%

2C 5418,123 6656,7065 5387,8022 6749,729 6053,090175 5,25%

2D 9160,8096 3207,6594 7015,8442 6408,4014 6448,17865 5,59%

3A 3446,9866 4144,0669 4818,0391 2552,969 3740,51540 3,24%

3B 4081,9539 2637,6018 6509,9604 6032,9258 4815,610475 4,17%

media geral 4739,945002 4,11%

3.12.4 Método picrosirius

Fez-se a análise do colágeno corando-se os cortes histológicos pela

técnica do Sirius Red e examinando-os sob luz polarizada. As fibras colágenas

tipo III, mais finas e dispersas, sob luz polarizada são fracamente birrefringentes

e adquirem tonalidades que variam do amarelo ao verde, enquanto as do tipo I,

mais espessas e fortemente birrefringentes, tonalidades que variam do laranja

ao vermelho.

Examinaram-se as lâminas sem o conhecimento da identificação

estabelecida, em microscópio óptico da marca Olympus®, modelo BX40, com

MATERIAL E MÉTODO

46

objetiva de 20x, acoplado a uma câmera DinoEye ® e a um computador.

Utilizou- se o software Image Pró-Plus ® for Windows.

Inicialmente capturava-se a imagem da lâmina para o computador e,

com o auxílio do programa Image Pro-Plus foi selecionada uma fotomicrografia

que seriou como máscara para as medidas das áreas de interesse.

Com a ferramenta conta-gotas, na fotomicrografia identificada como

máscara, selecionavam-se as cores de interesse (tonalidades que variam do

amarelo ao verde para colágeno tipo III e tonalidades que variam do laranja ao

vermelho para colágeno tipo I) e o programa automaticamente identificava os

colágenos I e III pela sua coloração á luz polarizada, destacando-os da

fotomicrografia. Esta máscara contendo a seleção de cores era sobreposta em

todas as outras fotomicrografias do estudo, identificando automaticamente as

áreas de colágeno I e III. Uma vez que a área total de exame era constante, o

programa fornecia a área e o percentual da área ocupada pelo objeto de

estudo, ou seja, o colágeno tipo I e o tipo III. Mediram-se três fotomicrografias

(objetiva de 20x) por corte histológico em cada lâmina, obtendo-se, então, uma

média da leitura daquele corte (JUNQUEIRA, CORSSEMELLI & BRENTANI,

1979).

3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As variáveis quantitativas foram descritas através das estatísticas de

média e desvio padrão. Para comparação dos tipos de bisturi, em cada um dos

momentos de avaliação, foi considerado o teste t de Student para amostras

independentes. Em cada tipo de bisturi, para comparação dos momentos dois a

dois, foi considerado o teste t de Student para amostras independentes,

considerando-se o modelo de análise de variância com uma fonte de variação

para estimação da variância dentro dos momentos de avaliação. Para

manutenção do nível de significância global foi considerado o procedimento de

Bonferroni. Para avaliação da condição de normalidade das variáveis, dentro de

cada tipo de bisturi e em cada momento de avaliação foi considerado o teste de

Jarque-Bera. No caso de rejeição da hipótese de normalidade foi investigada

uma transformação nos dados que permitisse atender a referida condição. Para

MATERIAL E MÉTODO

47

a comparação dos momentos de avaliação, dentro de cada grupo, em relação à

classificação de hematoma, deiscência e aderência, foi considerado o teste de

Qui-quadrado. Para a comparação dos grupos em cada momento de avaliação,

em relação à classificação de aderência, foi usado o teste exato de Fisher. Para

a análise da variância do tipo de colágeno e sua concentração foi utilizado o

teste não paramétrico de Mann-Whitney. Valores de p menores do que 0,05

indicaram significância estatística. Os dados foram analisados com o programa

computacional IBM SPSS Statistics v.20.

4 RESULTADOS

RESULTADOS

49

4.1 AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA

Não foram registrados óbitos; um animal do subgrupo BLF 3, número 5:

apresentou hematoma (Figura 15), sem significância estatística , p = 1 .

FIGURA 15 - HEMATOMA DE PAREDE FONTE: O autor. LEGENDA: animal do subgrupo BLF 3, nº 5.

Dois animais do subgrupo BHU 3 números 1 e 7: apresentaram infecção e

deiscência parcial de sutura da parede, observadas após a morte dos dois animais

(Figura 16), sem significância estatística, p = 1 .

FIGURA 16 - DEISCÊNCIA DE SUTURA DE PAREDE FONTE: O autor . LEGENDA: animal do subgrupo BHU 3, nº 1.

RESULTADOS

50

Em relação às aderências foram observadas, somente as de intensidade

1 (Figura 17): em um animal dos subgrupos BLF 3 (nº2), BHU 3 (nº 5), BLF 7

(nº4), BLF14 (nº2) e BHU 21 (nº9), em dois animais do subgrupo BHU14 (nº 3 e

6) e em três animais do subgrupo BHU 7 (nº 2, 7,10). (Quadro 4).

FIGURA 17 – ADERÊNCIA GRAU 1 LEGENDA: animal do subgrupo BLF 14 n°2. NOTA: Seta indica aderência. FONTE: O autor .

Aderência BLF3 BHU3 BLF7 BHU7 BLF14 BHU14 BLF21 BHU21

Grau 0 9 9 9 7 9 8 10 9

Grau 1 1 1 1 3 1 2 0 1

Grau 2 0 0 0 0 0 0 0 0

Grau 3 0 0 0 0 0 0 0 0

Total 10 10 10 10 10 10 10 10

QUADRO 4 - RESULTADOS DA CLASSIFICAÇÃO DE ADERÊNCIAS. NOTA: classificação em tipo e momento. FONTE: O autor.

A análise estatística, das aderências, nos grupos BLF e BHU, como resultados,

respectivamente p = 1 e p = 0, 595 e, portanto sem significância estatística (Tabelas

2 e 3).

RESULTADOS

51

TABELA 2- ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BLF

Grupo: BLF

Aderência BLF3 BLF7 BLF14 BLF21

Grau 0 9 (90%) 9 (90%) 9 (90%) 10(100%)

Grau 1 1 (10%) 1 (10%) 1 (10%) 0 (0%)

Total 10 10 10 10

Valor de p = 1

FONTE: O autor.

TABELA 3 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BHU

Grupo: BHU

Aderência BHU3 BHU7 BHU14 BHU21

Grau 0 9 (90%) 7 (70%) 8 (80%) 9(90%)

Grau 1 1 (10%) 3 (30%) 2 (20%) 1(10%)

Total 10 10 10 10

Valor de p = 0,592

FONTE: O autor.

Não foram observadas fístulas no presente trabalho.

4.2 ANÁLISES MICROSCÓPICAS

4.2.1 metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9)

A expressão da MMP-9, no acompanhamento evolutivo dos casos onde foi

realizada incisão com lâmina fria, ocorreu aumento progressivo de sua

concentração, mais evidente do 7º ao 14º dia, com menor progressão até o 21º dia.

Na série onde foi utilizado o BHU, ao 3º dia, já apresentava níveis elevados, com

aumento até o 7º dia e diminuição ao 14º dia e o nível se manteve até o 21º dia.

A análise estatística da expressão da MMP-9 encontrada na comparação dos

dois tipos de bisturi, apresentou significância estatística aos 3º, 7º e 21º dia (Tabela

4 e Gráfico 1).

RESULTADOS

52

TABELA 4 : MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA, E ANÁLISE

ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO MMP-9.

Bisturi Subgrupos

3 dias 7 dias 14 dias 21 dias

Lâmina Fria

4.739,95+1.676,9 6.633,82+1.867,31 10.560,1+1.653,4 11.533,89+1.161,7

Harmônico Ultrassônico

9.185,9+1.502,61 12.036,44+1.216,7 9.104,05+2.201,6 9.171,86+1.785,63

Valor de p* < 0,001 < 0,001 0,099 0,001

(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05

FONTE: O autor.

No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo:

GRÁFICO 1 : Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do

MMP-9 ,em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.

FONTE : O autor .

A expressão de MMP-9 foi observada em todos os casos das amostras (Figura

18) variando a sua imunoexpressão tecidual entre 2,65% e 11,50% .

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000


BLF

BHU

MMP-9

p < 0,001

P < 0,001

P= 0,001

p = 0,099

RESULTADOS

53

FIGURA 18- FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM MMP-9 . LEGENDA : Imuno-histoquímica MMP-9 200x. NOTA : A - Demonstra caso com 2,65 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3 .B - Demonstra caso com 4,20 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU14. C - Demonstra caso com 8,84 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU21. D - Demonstra um caso com 11,50 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU7. FONTE : O autor

4.2.2 - fator de transformação crescimento beta (TGF- β).

Em relação ao TGF- β, sua expressão nos casos onde se realizou incisão com

lâmina fria, encontrou-se um nível alto ao 3º dia , que cai ao 7º dia , voltando a subir

ao 14º, com pequena queda ao 21º dia. Já na série onde foi realizada a incisão com

BHU, o nível encontrado foi maior ao 3º dia, com queda progressiva, nos 7º,14º e

21º dias. A concentração ao 3º dia foi mais elevada nos casos onde se usou a

lâmina fria, que na série comparada, sendo a maior concentração encontrada no

presente estudo.

A análise estatística da expressão da TGF- β encontrada na comparação dos

dois tipos de bisturi, apresentou significância estatística aos 14º e 21º dias ( Tabela 5

e Gráfico 2 ) .

RESULTADOS

54

TABELA 5: MÉDIA E DESVIO PADRÃO, EM EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA NOS

BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO TGF- β.

(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05.

FONTE: O autor.

No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo.

GRÁFICO 2 : Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do TGF- β

em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.

FONTE : O autor .

A expressão de TGF- β foi observada em todos os casos das amostras

variando a sua imunoexpressão tecidual entre 0,03% e 2,92% (Figura 19) .

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000


BLF

BHU

TGF-β

p =0,081

p = 0,826

p = 0,010

p < 0,001

Bisturi Subgrupos


Lâmina Fria

1.878,74+1.496,4 636,02 + 879,69 1.172,74 +633,35 1.078,6 + 556,78

Harmônico Ultrassônico 946,69 + 638,38 744,66 + 1.099,5 547,56 +1.006,31 195,11 + 157,31

Valor de p* 0,081 0,826 0,010 < 0,001

RESULTADOS

55

FIGURA 19 - FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM . TGF β. LEGENDA: Imunohistoquímica TGF- β 200x. NOTA - Demonstra caso com 0,08 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF14 B - Demonstra caso com 0,64 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU7. C - Demonstra caso com 1,85 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3 D - Demonstra um caso com 2,92 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3. FONTE: O autor.

4.2.3 - Alfa Actina do músculo liso (α-AML) .

Como resultado a expressão de α-AML apresentou níveis pouco variáveis na

série onde foi realizada incisão com lâmina fria, com discreto aumento do 3º para o

7º dia, discreto decréscimo do 7º ao 14º dia e ligeiro aumento até o 21º dia, porém

se mantendo constante. A séria onde utilizamos o bisturi harmônico ultrassônico,

ocorreu elevação dos níveis do 3º ao 7º dias, padrão que se repetiu do 7º ao 14º dia,

ocorrendo ligeiro decréscimo ao 21º dia.

A análise estatística da expressão da α-AML encontrada na

comparação dos dois tipos de bisturi, considerando p < 0,05, apresentou

significância estatística ao 14º dia. (Tabela 6 e Gráfico 3).

RESULTADOS

56

TABELA 6 : MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA E

ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO α-AML

Bisturi Subgrupo


Lâmina Fria

1.836,81 +724,47 2.011,21 + 516,91 1.879,22 +721,32 2.022,17+1.007,34

Harmônico Ultrassônico

1.975,41 +653,38 2.450,35 + 773,47 2.832,99 +893,45 2.741,54 + 699,27

Valor de p* 0,665 0,140 0,011 0,091

(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05

FONTE : O autor

No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo.

GRÁFICO 3 : Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do α-AML

em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.

FONTE: O autor .

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


BLF

BHU

α-AML

p = 0,665

p =0,140

p = 0,011 p = 0,091

RESULTADOS

57

A expressão de α-AML foi observada em todos os casos das amostras (Figura

20) variando a sua imunoexpressão tecidual entre 0,88 % e 3,23 % .

FIGURA 20 - FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM α -AML. LEGENDA : Imunohistoquímica α -AML 200x. NOTA - Demonstra caso com 1,39% % de área de imunoexpressão tecidual média BLF21 B - caso com 1,45 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF7. C - Demonstra caso com 2,04 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF14. D- Demonstra um caso com 3,23 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU3. FONTE : O autor .

4.2.4 Coloração picrosirius

No método picrosirius (Figura 21 e 22) , a análise de dosagem de colágeno

demonstrou que o colágeno maduro Tipo I, não apresentou significância estatística

nas amostras estudadas (Tabela 7).

RESULTADOS

58

FIGURA 21 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS. LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20x, rato nº 1 subgrupo BLF 7. NOTA: Predomínio misto de Fibras Tipo I (VERMELHO) e III (VERDE), setas indicando fibras. FONTE: O autor .

FIGURA 22 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20x, rato nº 8 subgrupo BLF 21. NOTA: Predomínio misto de Fibras Tipo I (VERMELHO) e III (VERDE), setas indicando fibras. FONTE: O autor .

RESULTADOS

59

TABELA 7 : QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO

MADURO (TIPO I) NOS DOIS GRUPOS.

Bisturi Subgrupo

3 dias 7 dias 14 dias 21 dias Geral

Lâmina Fria 0,38 0,38 0,43 0,39 0,40

Harmônico Ultrassônico 0,43 0,38 0,41 0,38 0,40

Valor de p* 0,153 0,622 0,761 0,603 0,906

(*) Teste Mann-Whitney para amostras independentes; p<0,001

FONTE : O autor

Quanto ao colágeno imaturo Tipo III ( Figura 23 ), no 3º dia ocorreu uma

deposição maior no grupo BHU; ao 7º dia a formação foi maior no grupo BLF, ao 14º

foi equivalente nos dois grupos e ao 21º dia o depósito foi maior no grupo BHU.

Como escore geral, ocorreu deposição maior de colágeno Tipo III no grupo

submetido à cirurgia com BHU, do que no grupo operado com BLF apresentando

resultados de p < 0,001 ou 0,01 %, com significância estatística (Tabela 8).

FIGURA 23 – FOTOMICROGRAFIA DE FIBRAS COLÁGENAS. LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20 x, rato nº 2 subgrupo BHU 21. NOTA: Predomínio de fibras tipo III (VERDE) no pós-operatório tardio, setas indicando fibras. FONTE: O autor.

RESULTADOS

60

TABELA 8 : QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO

MADURO (TIPO III) NOS DOIS GRUPOS.

Bisturi Subgrupo

3 dias 7 dias 14 dias 21 dias Geral

Lâmina Fria 0,88 0,93 0,94 0,93 0,92

Harmônico Ultrassônico 0,90 0,91 0,94 0,94 0,93

Valor de p* < 0,001 < 0,001 0,832 < 0,001 < 0,001

(*) Teste Mann-Whitney para amostras independentes; p<0,001

FONTE: O autor

No gráfico e tabela abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no

estudo (Grafico 4 e Tabela 9).

GRÁFICO 4 – Representação gráfica da quantificação de colágeno maduro (tipo I) e imaturo (tipo III) e análise estatística nos dois grupos. FONTE: O autor.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

3 7 14 21

Observação (em dias)

Colágeno Maduro - BLF

Colágeno Maduro - BHU

Colágeno Imaturo - BLF

Colágeno Imaturo - BHU

p < 0,001

p < 0,001 p < 0,001p =0,832

p=0,622 p=0,603

p=0,153

p =0, 761

RESULTADOS

61

TABELA 9 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO TIPO I (MADURO) E III (IMATURO) FONTE: O autor.

Observação (em dias) Colágeno Maduro Colágeno Imaturo

Lâmina Fria x Ultrassom Lâmina Fria x Ultrassom

_________________________________________________________________________________

3 US = LF (p=0,153) US > LF (p<0,001)

7 US = LF (p=0,622) LF > US (p<0,001)

14 US = LF (p=0,761) US =LF (p=0,832)

21 US = LF (p=0,603) US > LF (p<0,001)

Geral US = LF (p=0,906) US > LF (p< 0,001)

_________________________________________________________________________________

5 DISCUSSÃO

DISCUSSÂO

63

5.1 MODELO EXPERIMENTAL

O Rato Wistar foi o animal escolhido para a pesquisa por ser um animal

resistente e amplamente utilizado nas pesquisas da parede abdominal, de fácil

manuseio e fácil aquisição conforme referido por Souza e Merrusse,(1996).

Além disso, resistem bem às infecções, têm anatomia conhecida e

podem ficar albergados em biotério. Por ser a espécie convencional de

laboratório, têm técnica anestésica específica e segura. A obtenção fácil destes

animais permite a formação de grupos padronizados e com número adequado

para o estudo. Suas dimensões não interferem nas análises das características

macroscópicas e microscópicas. De acordo com Rocha (1986), a utilização de

pequenos roedores permite a avaliação comparativa de grupos com grande

número de animais, padronizados e da mesma espécie, o que facilita a análise

estatística.

Além de ratos, outros animais podem ser utilizados, como no estudo

comparativo da cicatrização de tecidos com BLF e BHU realizado por, Hambley

et al. (1988); o qual utilizou porcos, na análise de cicatrização de pele com BLF,

BHU, CO2 Laser e eletrocautério. Emann e Cushieri, (2003), também utilizaram

porcos em trabalho onde foi avaliado o poder de dissecção do BHU em cirurgias

laparoscópicas.

5.2 TÉCNICA ANESTÉSICA

A escolha do Cloridrato de Ketamina considerou o conhecimento

registrado na literatura de alguns de seus efeitos. A capacidade dissociativa que

possui bem descrita por Cunningham e Mckinney (1983), trouxe a vantagem da

dissociação entre o animal e o meio, com sedação, imobilização e marcada

analgesia. Sua importância em evitar o choque foi descrita por Atalay (2003).

Tudo isso fez do Cloridrato de Ketamina, com ou sem adjuvante, o anestésico de

primeira escolha nesta pesquisa. Esta técnica anestésica mostrou-se eficiente

DISCUSSÂO

64

em todos os ratos. Não houve necessidade de doses complementares, conforme

preconizado por Geise (1998), Bacelar-Jr. (1999) e Atalay (2003).

A Ketamina usada sozinha em pequenos mamíferos produz imobilização de

curto prazo com pouco relaxamento muscular. Normalmente são necessárias

grandes doses para produzir imobilidade prolongada e anestesia cirúrgica, conforme

Quesenberry & Carpenter (2003).

A Ketamina é um anestésico dissociativo, termo usado para descrever a

dissociação funcional entre o córtex e o sistema nervoso periférico. Quando

combinada com a Xilazina normalmente produz uma anestesia cirúrgica mais eficaz

que misturada com outros agentes. A Xilazina tem propriedades analgésicas e

sedativas e têm a vantagem adicional de poderem ser revertidas por administração

de antagonistas específicos. A combinação Ketamina /Xilazina produz planos

médios de anestesia cirúrgica na maioria dos animais conforme relato de Flecknel, et

al.,(1996)

A Atropina é usada para reduzir as secreções respiratórias e salivação,

evitando assim obstrução respiratória. Contudo tem sido discutido que podem

fomentar esta ao fazer com que as secreções fiquem mais espessas. Também pode

melhorar ou prevenir bradiarritmias de origem vagal como descrito por Quesenberry

& Carpenter (2003).

5.3 TÉCNICA OPERATÓRIA

Diérese e síntese são procedimentos cirúrgicos de rotina e a

compreensão correta do processo de cura é de grande importância, uma vez

que distúrbios na evolução normal da cicatrização podem representar um

problema clínico severo com morbidade e mortalidade conforme referido por

Phillips et al., (2003). O foco principal do presente estudo foi comparar o

processo de cicatrização após o uso, quer diatermia ou bisturi convencional para

abrir a aponeurose abdominal.

DISCUSSÂO

65

O presente trabalho realizou a incisão mediana de abdome, utilizando o

BLF, bem como o BHU. Foi usado o bisturi harmônico, pois é um instrumento

onde uma menor quantidade de energia é transferida ao tecido em comparação

a métodos de frequência de alta corrente (eletrocautério) ou laser, propiciando

assim menor possibilidade de dano térmico ou lesão tissular profunda pois este

bisturi trabalha em baixas temperaturas, com corte gerado em apenas 50-100 ºC

(SIETSES et al., 2001). O uso do bisturi harmônico tem o adicional de não

passar toda a energia elétrica através do corpo, com o benefício de redução do

dano térmico, com menor estresse cirúrgico associado ao bisturi harmônico . O

nível de coagulação no BHU utilizado foi o nível três, pois é o nível normalmente

utilizado em seres humanos, conforme Broek et al., (2011). A potência do BHU

varia do nível de um a cinco no marcador do aparelho. Na menor potência, ou

seja, nível um, a coagulação é maior; enquanto no nível cinco, é o corte que é

maior. Nas cirurgias da cavidade abdominal utiliza-se o nível três, porque corta e

coagula de forma homogênea; outra vantagem do BHU é que não há passagem

de corrente elétrica pelo paciente como no eletrocautério, não se fazendo

necessária a utilização de placas de fio-terra conforme estudado por Mettemich

et al., (2003) e Masi et al., (2009).

O objetivo de aumentar a segurança e a qualidade de um procedimento

cirúrgico, visando possibilitar a diminuição do tempo e complicações trans e pós-

operatórias, tem levado a estudos constantes no sentido de se buscar novas

ferramentas que venham a substituir e/ou complementar, com vantagens, o

bisturi convencional. Como exemplos o bisturi elétrico, radiação laser de alta

potência com diferentes comprimentos de onda, criocirurgia e, atualmente, o

bisturi harmônico. Todos eles apresentam vantagens e desvantagens, que

devem ser levadas em consideração quando do planejamento cirúrgico.

Quanto ao BHU, tem sido utilizado há pouco mais de 15 anos em

diversas especialidades da medicina, tais como: cirurgia geral, ginecologia,

gastroenterologia e otorrinolaringologia conforme relatado por (MATTHEWS., et

al, 2008; ALI et al., 2011 e DEAN et al, 2014), demonstrando algumas

vantagens, quando corretamente indicado.

O BLF é o instrumento mais utilizado em incisões cirúrgicas apesar das

desvantagens, tais como: episódios hemorrágicos, necessidade de sutura entre

DISCUSSÂO

66

outras, mesmo assim, é ainda o que promove o mínimo trauma aos tecidos

adjacentes e tempo de reparo menor, conforme relatado por Arashiro et al,

(1996) e Morosolli et al, (2010). Esta afirmação também foi confirmada por esse

estudo. Outros autores discutem que o bisturi convencional não provoca o dano

térmico aos tecidos adjacentes, mas, no momento em que a ferida é realizada,

há um extravasamento de sangue e linfa que provocam maior edema e

formação de cicatrizes, como relatam Fisher et al, (1983) e Wilder-smith et al,

(1995).

Alexiou (2011) não encontrou diferenças em relação a hemorragia trans

e pós-operatória e dor, quando comparou com o uso de bisturi harmônico,

eletocautério e lâmina fria, em tonsilectomias, resultado divergente ao de Walker

(2001), que constatou que pacientes submetidos à tonsilectomias com o bisturi

harmônico retornaram à dieta e atividades habituais mais rapidamente, além de

apresentarem menor taxa de hemorragia tardia.

Outro benefício a ser atribuído ao BHU é a diminuição das doses de

analgésicos administrados no período pós operatório conforme descrito por

Danic et al,(2012) e Ali et al, (2001), quando compararam o bisturi harmônico e o

bisturi elétrico em tonsilectomias, notaram que os pacientes operados com

bisturi harmônico tinham dor menos intensa nas primeiras 72 horas. Os mesmos

autores não encontraram diferença significativa no tempo de cirurgia, mas

atribuíram tal fator à falta de prática com o instrumento.

Estudos permitem enumerar outras vantagens do bisturi harmônico, tais

como: a não transmissão de eletricidade, diminuindo os riscos ao paciente e a

equipe cirúrgica; a adesão insignificante de tecido na ponta ativa do instrumento,

que poderia interferir na diminuição da potência (SHERMAN & DAVIS., 2000;

BARRETT & GARBER., 2003 ; DEAN et al, 2014). Além disso, uma vez que o

bisturi harmônico serve tanto para a dissecção como para a coagulação, há

menos substituições de instrumentos, conforme estudos de Ali et al, (2001);

Matthews et al, (2008) e Mantke et al, (2011), ainda acrescentam que o bisturi

harmônico pode ser utilizado em pacientes portadores de marcapasso, condição

esta que não permite o uso do bisturi elétrico.

Mantke et al (2011) explicam que a seleção do instrumento deve ser feita

conforme a necessidade e o planejamento do cirurgião, pois não há um

DISCUSSÂO

67

equipamento ideal para as diversas situações cirúrgicas. Há situações em que

os danos térmicos e elétricos são mais relevantes que o selamento de vasos,

como, por exemplo, na proximidade de um nervo ou tecido cartilaginoso.

A respeito das margens cirúrgicas, estudos não indicam o bisturi elétrico e

bisturi harmônico quando é necessário avaliar com precisão as margens de uma

lesão, pois provocam fragmentações, artefatos e contração do tecido biopsiado,

como constatado por Kakarala et al, (2011) e George et al, (2013). O dispositivo

utilizado numa biópsia deve ser de conhecimento do patologista que realiza a

análise das margens de um tumor, somente dessa forma é possível diminuir os

resultados falso positivos ou falso-negativos e assim permitir, com cautela, o uso

do laser de CO2 ou do bisturi harmônico para exérese de tumores.

Exemplificando com casos de câncer em laringe, um resultado falso-positivo

pode levar a uma cirurgia revisional ou uma radioterapia pós-operatória, sendo

assim, autores defendem o uso do bisturi de lâmina fria nestes casos Manelli et

al.,(2014).

Uma das maiores desvantagens atribuídas ao BHU é o alto custo do

equipamento, porém vários autores refutam este argumento como Tirelli et al,

(2014), os quais demonstraram que há uma redução no custo das cirurgias de

exérese de câncer bucal e orofaríngeo, quando utiliza-se o bisturi harmônico,

correlacionando o custo do equipamento com o tempo em centro cirúrgico. Irfan

et al., (2011) acreditam que todas as vantagens citadas a respeito do bisturi

harmônico justificam os custos, desde o investimento inicial aos gastos com

manutenções. Ainda assim, para as cirurgias bucais menores realizadas em

ambulatório, o custo do equipamento utilizado pode representar uma

desvantagem considerável em relação ao bisturi de lâmina fria, fato que outros

autores estão de acordo com Michelsen et al, (2011). O confronto dessas

opiniões divergentes chama atenção para um aspecto importante na relação

custo/benefício: o grau de habilidade do cirurgião para manipular o equipamento,

pois quanto mais evoluída a habilidade menor é o tempo da cirurgia, o que

diminuiria os custos hospitalares.

Para a síntese foi escolhido o fio de polipropileno monofilamentar, que é

considerado bastante inerte, causa pouca reação tecidual e, portanto, tem

influência mínima no processo de avaliação da cicatrização. Em relação ao tipo

DISCUSSÂO

68

de sutura, foi escolhida a sutura contínua por ser eficaz, assegurando que a

força seja distribuída uniformemente ao longo de todo comprimento da incisão e

não se concentrando em pontos específicos da sutura; oferecendo maior

repouso à ferida, facilitando reparação e cicatrização conforme analisado por

Perko et al., (2006).

5.4 ANÁLISE MACROSCÓPICA

Na avaliação macroscópica, foram analisadas, a presença ou ausência

de hematomas, infecção (abscessos), deiscência, aderências e fístula;

comprovando que o BHU é um instrumento de corte e hemostasia simultânea

eficiente, sendo utilizado largamente em vídeo-cirurgia e em cirurgias abertas;

que suas propriedades são defendidas por vários autores, como Sherman e

Davis (2000) e Emam e Cuschieri (2003); no presente estudo, apenas 1 caso,

apresentou hematoma, confirmando a propriedade hemostática do BHU, embora

Emam e Cuschieri (2003) tenham chamado a atenção para a produção de

fumaça com partículas em suspensão as quais podem comprometer a

visibilidade, dificultando o ato operatório, porém as facilidades no uso do BHU

são consideráveis.

O presente trabalho apresentou 2 casos com infecção e deiscência

parcial de aponeurose, ambos no grupo operado com BHU no 3º dia,

confirmando a maior resposta inflamatória, necrose tecidual e presença de

colônias bacterianas, o que posteriormente se confirmou na avaliação

microscópica.

Em relação às aderências, o presente estudo a constatou em 10 ratos

dos 80 operados, com distribuição uniforme ao 3º dia (1 de cada subgrupo BFL e

BHU), ao 7º e 14º dias um número maior nos subgrupos operados com BHU

(1BLF/3BHU no 7º dia e 1BLF/2BHU no 14º dia) e um caso isolado no 21º dia do

subgrupo com BHU. Pelo fato, que a incisão com BHU causou maior reação

inflamatória, com maior necrose tecidual e entendendo que as aderências são

maiores onde o trauma é mais intenso, foi encontrado um maior número de

aderências nas cirurgias com BHU (3 casos BLF para 7 casos com BHU). Em

DISCUSSÂO

69

relação ao tipo de aderência, somente foi encontrada a do tipo 1, fato que pode

ser entendido pela não manipulação visceral, durante a cirurgia. À semelhança

de Viana et al. (2008), que fazendo estudo comparativo de sutura ou não do

peritônio parietal nas laparotomias medianas em ratos encontrou após

laparotomia uma taxa de 17 casos de aderências em 40 ratos estudados, com

incisão similar a deste estudo com BLF; ao contrário de Gonçalves et al., (2000),

que em seu trabalho, analisando 20 ratos submetidos à laparotomia no grupo 1

que se assemelha aos grupos com BLF, não encontrou aderências na amostra

estudada.

O presente estudo não encontrou fístulas nos grupos estudados, fato

explicado pela não intervenção na cavidade abdominal.

5.5 ANÁLISE MICROSCÓPICA

5.5.1 TÉCNICA DE MICROARRANJO TECIDUAL (TISSUE MICROARRAY-TMA)

Como o método tradicional de análise de amostras uma a uma é

relativamente dispendioso, a técnica de microarranjo tecidual (Tissue microarray-

TMA) tem sido utilizada para reduzir custos, principalmente em pesquisas.

Esta é baseada na construção de um bloco de parafina com fragmentos

cilíndricos de amostras teciduais obtidas de dezenas ou centenas de blocos de

parafina originais.

Dessa forma, o uso da imuno-histoquímica para conhecer a expressão de

um determinado marcador pode ocorrer em uma lâmina de TMA com centenas de

amostras ao custo de uma única reação, corroborando com Andrade et al, (2007).

O TMA em relação aos cortes convencionais apresenta: áreas satisfatórias

de análise em distintos níveis de corte, possibilidade de repetição dos experimentos

,estudo de grande número de amostras simultaneamente, grande economia de

tempo , custos menores e uniformização das reações Andrade et al, (2007) .

A maior preocupação dos críticos na utilização do TMA é a representação da

lesão, considerando a pequena amostra estudada. A fidelidade dos resultados em

DISCUSSÂO

70

relação ao uso dos cortes convencionais foi objeto de estudo por ocasião da

validação do método e está demonstrada em vários trabalhos da literatura (CAMP et

al .,2000; ENGELLAU et al., 2001; HOOS et al., 2001; HENDRIKS et al.,2003;

ROCHA et al., 2006; SAPINO et al., 2006).

5.5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA

Costa Filho (2012) em procedimento idêntico revelou que, análise

microscópica pela Hematoxilina – Eosina e Tricômio de Gomori revelou que o

corte com BHU atrasa o processo de regeneração; com um processo

inflamatório mais prolongado, maior necrose tecidual e atraso do início do

processo de fibrogênese, com significância estatística. Nesta avaliação

microscópica revelou-se uma fase inflamatória mais intensa nas incisões

realizadas com BHU, quando comparadas com BLF; essa diferença ficou mais

evidente nos grupos do 3º e 7º dias, sendo que ao 14º dia os parâmetros ficaram

semelhantes e ao 21º , já apresentando fase de cicatrização avançada,a

semelhança de Hambley et al. (1988), que realizando incisão na pele de porcos

encontrou resultados semelhantes, onde ocorre uma fase inflamatória menos

prolongada em incisões com BLF que BHU.

Masi et al. (2009) fizeram experimento semelhante em mucosa oral de

ratas, com cicatrização mais prolongada na série feita com BHU, apresentando

uma fase inflamatória mais intensa e demorada, corroborando com SINHA et al

(2003) que demonstrou em mucosa oral de Guinea pig, que o BHU promovia um

processo inflamatório mais prolongado e intenso.

Garcia et al. (2007) e Ziv et al. (2001), realizando experimento

semelhante, porém usando eletrocautério, não encontrou alterações

significativas nas amostras, tendo mesma cicatrização em ambos os grupos.

A expressão da MMP-9, no acompanhamento evolutivo dos casos onde

foi realizada incisão com BLF, apresentou aumento progressivo de sua

concentração, mais evidente do 7º ao 14º dia, com menor progressão até o 21º

dia. No grupo onde foi utilizado o BHU, ao 3º dia, apresentava níveis elevados

DISCUSSÂO

71

de MMP-9, com aumento até o 7º dia e diminuição ao 14º dia, que se manteve

até o 21º dia, conforme esperado. Porém a análise estatística se mostrou

positiva na comparação dos dois grupos aos 3º, 7º e 21 dias. A presença da

MMP-9 em todo o período estudado e níveis mais elevados no grupo BHU, pela

elevada destruição celular apresentada na fase inflamatória, levou a um

processo de remodelação dos tecidos mais intenso e prolongado de acordo com

a análise de Costa Filho, (2012).

Navarro et.al. (2006), relatam que a MMP-9, participa de um grande

número de processos fisiológicos, como os processos de mineralização, erupção

dental e remodelação do colágeno, entre outros, que no metabolismo humano,

participa também de processos patológicos como a destruição tecidual , lesões

de cárie radicular, desordens da articulação temporomandibular e metástases

em tumores, corroborando com achados neste trabalho , de elevação de níveis

teciduais em ambos os grupos.

Perches et.al.(2012), relata em revisão literária que as MMPs podem ser

observadas em qualquer tecido inflamado e culturas celulares e que os tipos e

quantidades expressadas dessas enzimas variam de acordo com as doenças,

neoplasias, inflamações e tipos celulares, já que todo tecido possui matriz

extracelular, que necessita das MMPs frente a um processo fisiológico ou

patológico de remodelação tecidual, e que são sintetizadas até que seja

necessário, e que uma série de citocinas e fatores de crescimento podem induzir

ou inibir, como fator betatransformador do crescimento (TGF β), o que fica de

acordo com o encontrado no presente estudo, nível elevado de TGF- β , na série

BLF 3 , com nível baixo de MMP-9 no mesmo período, e com a diminuição dos

níveis de TGF β nos períodos posteriores a elevação da MMP-9 .

A expressão do TGF- β nos casos onde se realizou incisão com lâmina

fria, foi elevada ao 3º dia, diminuindo ao 7º dia, voltando a subir ao 14º, com

pequena queda ao 21º dia. Já na série onde foi realizada incisão com BHU, o

nível encontrado foi maior ao 3º dia, com queda progressiva, nos 7º, 14º e 21º

dias. A significância estatística ocorreu aos 14º e 21º dias. Como eram

esperadas, ondas de remodelação no 3º e 14º dias, com conseqüente aumento

da TGF- β, ocorreu no grupo onde a incisão foi feita com o BLF, já no grupo

onde a incisão, foi feita com o BHU, apresentou nível inicial mais baixo ao

DISCUSSÂO

72

terceiro dia, se comparado com o grupo BLF; e decréscimo progressivo até o 21º

dia, pela fase inflamatória mais prolongada, com a possibilidade de um 2º pico

ocorrer após o 21º dia, conseqüência de um processo cicatricial mais lento.

Oliveira (2009), em estudo em fibrose hepática, demonstrou a importância

da TGF- β,no processo de fibrogênese na cicatrização hepática, em associação

de seus níveis com a formação de colágeno tipo I.

Martinez (2008) , em estudo em células de polpa dentária e gengiva humana

obteve resultados demonstrando que o TGF-1 induz a expressão de -AML,

sugerindo a indução do fenótipo miofibroblástico, o que não se confirmou no

presente estudo.

A expressão de α-AML apresentou níveis pouco variáveis na série onde

foi realizada incisão com lâmina fria , com discreto aumento do 3º para o 7º dia,

discreto decréscimo do 7º ao 14º dia e ligeiro aumento até o 21º dia, porém se

tendendo constante. Na série onde utilizamos o bisturi harmônico ultrassônico,

ocorreu elevação dos níveis do 3º ao 7º dias, padrão que se repetiu do 7º ao 14º

dia, ocorrendo ligeiro decréscimo ao 21º dia, porém a comparação dos dois só

apresentou significância estatística ao 14º dia, concluindo assim que a

remodelação da ferida é mais intensa, neste grupo .

O método mais simples de manusear, e de fácil interpretação para a

quantificação de colágeno, é a utilização do corante Picrosirius Red F3BA

(CONSTANTINE E MOWRY, 1968). Ele deriva do ácido pícrico, princípio que

fundamentou a realização do exame para este estudo.

A coloração de picrosirius foi descrita em 1979 por Junqueira, Bignolas e

Brentani, que realizaram análise da presença de colágeno, quanto ao

aparecimento das formas jovens (tipo III) e madura (tipo I), através desta

coloração. O estudo das lâminas foi do tipo fechado, duplo cego e sua leitura foi

realizada por microscopia de luz polarizada. As imagens foram analisadas pelo

Software Image Pro-Plus para quantificação de colágeno jovem e maduro.

Considerando a hipótese nula de que a quantidade de colágeno jovem e de

colágeno maduro é igual nos grupos estudados, versus a hipótese alternativa de

resultados diferentes. Utilizaram o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, cujo

nível mínimo de significância era 0,05. e desde então vem sendo usada para a

quantificação de colágeno tipo I e III.

DISCUSSÂO

73

O colágeno dos tipos I, II, III revela diversas cores e intensidades de

birrefringência no mesmo corte histológico Junqueira, Bignolas e Brentani,

(1979). Isto se deve ao fato de que os diferentes colágenos intersticiais

demonstram padrões diferentes de agregação física (MINOR, 1980; MONTES,

1996). O colágeno do tipo I constitui fibras colágenas grossas, compostas por

fibrilas grossas densamente agrupadas e, portanto, expõem ativa birrefringência

com coloração amarela ou avermelhada. O colágeno do tipo III compõe fibras

reticulares finas, compostas por fibrilas finas, frouxamente dispostas que

apresenta fraca birrefringência de coloração esverdeada Karasick e Schweitzer,

(1993). As fibras com coloração verde, compatíveis com colágeno tipo III,

predominam no período inicial com declínio nos períodos mais tardios. Já as

fibras espessas e avermelhadas, compatíveis com colágeno tipo I apresentam

comportamento inverso.

Nesta tese houve predomínio de fibras colágenas tipo III, nos 3º e 21º

dias, nos cortes por BHU quando comparadas com BLF, ao 7º dia a deposição

foi maior no grupo BLF e ao 14º dia ocorreu igualdade nos grupos; o colágeno

tipo I se manteve constante em todos os períodos estudados. Este estudo

corrobora com o de Masi et al. (2009) que fazendo estudo na mucosa oral de

ratas, utilizou esta coloração para comparar a deposição de colágeno nas

cicatrizes da mucosa oral, em estudo comparativo com BLF e BHU tendo

encontrado maior densidade de colágeno Tipo III, no 14° dia de operação,

configurando atraso na maturação das cicatrizes e da fibroplasia, demonstrada

pela menor densidade de colágeno do tipo I e III no 7º dia de evolução.

A coloração pelo método do picrosírius red, estimula grande quantidade

de moléculas do Sirius Red, alongadas e de natureza ácida, que se colocam

paralelamente às moléculas do colágeno. Isto provoca aumento da

birrefringência das fibras que conservam colágeno ao serem observadas à luz

polarizada. O método da coloração com picrosírius, unido com a microscopia de

polarização, constitui um método histoquímico específico para a percepção de

estruturas compostas de moléculas de colágeno orientadas (MONTES E

JUNQUEIRA, 1991; MONTES, 1996), sendo utilizada a mesma técnica neste

estudo.

DISCUSSÂO

74

5.6 NOVAS PERSPECTIVAS

Embora as incisões realizadas com o BHU produzam um atraso no

processo cicatricial em relação às produzidas com BLF comparações estas

confirmadas neste estudo pelas avaliações macroscópicas e microscópicas, o

BHU é um instrumento de corte e coagulação simultânea de baixa produção de

energia térmica nos tecidos, proporcionando uma cirurgia limpa, com ausência

de sangramento e mais rápida.

O BHU é amplamente usado em cirurgias videolaparoscópicas por não

produzir fumaça, promover hemostasia eficiente, e trabalhar a temperatura mais

baixa que os eletrocautérios, e mais recentemente sendo utilizado em

procedimentos abertos, como o que motivou este estudo.

Estudos ulteriores devem ser feitos, comparando resultados das incisões

com BLF e BHU com os de laser e eletrocautérios, bem como novas análises

utilizando marcadores imunohistoquímicos a fim de esclarecer, detalhes do

processo de inflamação e cicatrização.

6 CONCLUSÃO

CONCLUSÕES

76

A análise dos resultados do presente estudo permite concluir que:

A comparação entre os grupos estudados a resposta inflamatória foi

aumentada no grupo BHU em relação ao BLF, e que:

1) Na comparação das complicações macroscópicas : formação de

hematomas, infecção, deiscências de sutura e aderências, não houve diferença

estatística entre os dois grupos.

2) A expressão da MMP-9, foi mais intensa no grupo BHU, aos 3º e 7º dias,

sem diferença ao 14º dia, e menor ao 21º dia, pela fase inflamatória, mais

prolongada;

3) O TGF- β, teve sua expressão menor no grupo BHU aos 14º e 21º dias , sem

diferença estatística aos 3º e 7º dias. O aumento da TGF- β ao 14º e 21º dias,no

grupo BLF, conseqüência de um processo cicatricial mais acelerado neste grupo

que no BHU;

4) A expressão de α-AML foi mais elevada, no grupo BHU ao 14º dia e se

manteve semelhante ao 3º,7º e 21º dias. Levando a uma miocontração maior em

decorrência de uma maior agressão sofrida por este grupo;

5) A aferição do colágeno demonstrou que o maturo (tipo I), não apresentou

alteração estatística nos grupos estudados;

6) O colágeno imaturo (tipo III), com significância estatística, se elevou ao 3°e

21° dias e no cômputo geral, no grupo com BHU, sem diferença ao 14°dia e

elevado ao 7º dia, no grupo BLF; demonstrando uma fase proliferativa mais

longa.

7. REFERÊNCIAS

REFERÊNCIAS

78

REFERÊNCIAS

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ANEXO

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COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA … · presença em minha vida. Ao meu amados filhos,...

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