UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE · PDF file 2017. 3....

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  • UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

    FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

    DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA

    PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

    O MicroRNA miR-696 regula a expressão da proteína

    PGC-1α e induz à disfunção mitocondrial em células

    musculares de camundongos através do sistema

    SNARK/miR-696/PGC-1α

    André Lima Queiroz

    RIBEIRÃO PRETO

    2016

  • André Lima Queiroz

    O MicroRNA miR-696 regula a expressão da proteína PGC-1α e

    induz à disfunção mitocondrial em células musculares de

    camundongos através do sistema SNARK/miR-696/PGC-1α

    Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Bioquímica Orientador: Prof. Dr. Leonardo Dos Reis Silveira

    RIBEIRÃO PRETO

    2016

  • AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

    QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,

    DESDE QUE CITADA A FONTE.

    FICHA CATALOGRÁFICA

    Queiroz, André Lima

    O MicroRNA miR-696 regula a expressão da proteína PGC-1α

    e induz à disfunção mitocondrial em células musculares de

    camundongos através do sistema SNARK/miR-696/PGC-1α

    143f.:il.; 30cm.

    Tese de doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina

    de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Bioquímica

    Orientador: Silveira, Leonardo R.

    1. miR-696. 2. Função Mitocondrial. 3. Músculo Esquelético. 4.

    SNARK. 5. PGC-1α.

  • FOLHA DE APROVAÇÃO

    André Lima Queiroz O MicroRNA miR-696 regula a expressão da proteína PGC-1α e induz à disfunção mitocondrial em células musculares de camundongos através do sistema SNARK/miR-696/PGC-1α Aprovado em: ____/ ____/ ____

    Banca Examinadora

    Prof. (a) Dr.(a): __________________________________________________

    Instituição:________________Assinatura: ___________________________

    Prof. (a) Dr.(a): __________________________________________________

    Instituição:________________Assinatura: ___________________________

    Prof. (a) Dr.(a): __________________________________________________

    Instituição:________________Assinatura: ___________________________

    Prof. (a) Dr.(a): __________________________________________________

    Instituição:________________Assinatura: ___________________________

    Prof. (a) Dr.(a): __________________________________________________

    Instituição:________________Assinatura: ___________________________

    Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Leonardo Dos Reis Silveira

  • “A persistência é o menor caminho do êxito”.

    (Charles Chaplin)

  • “Toda despedida é dor. Tão amarga todavia, que eu preferiria

    nunca ter-te conhecido!”

    Adaptado de William Shakespeare.

  • Agradecimentos Especiais

    Agradeço a Deus por seu amor incondicional, por nunca ter me abandonado e representar toda a forma e busca de conhecimento. Agradeço à família Lima Queiroz por todo o apoio, mesmo à distância, e por poder desfrutar dessa amizade tão preciosa. Aos meus pais, meu irmão Filipe e minha irmã Débora. Agradeço a minha amada Amanda! Por todo o Amor que vivemos juntos...por ser a mulher mais doce que conheci na vida...pelos sonhos inspiradores que realizamos ou ainda vamos realizar...pela companhia mais prazerosa que já experimentei...por ser a realização de um sonho! Te amo!

    Ao meu querido amigo e pai científico, Malson, por ter me confiado sua amizade e feito de mim um conhecedor da bioquímica.

    Aos meu estimado amigo Renato pelos inúmeros momentos de alegria e bebedeira.

    Ao casal Rafael e Mariana pelo bate papo filosófico, pelas jogatinas, pelos filmes e seriados, por todos os momentos que compartilhamos e pela amizade.

    Aos amigos de Laboratório: Igor Sampaio, Lucas, Bruno Gonzaga, Michel, Tanes, Simone, Madla, Reginaldo, Hygor, Eveline, Carlos e Luh.

    Aos amigos Bruno Rodrigues, Leka, Elise, Leo, Taylon. Àqueles que de alguma forma contribuíram para execução desse

    trabalho.

  • Agradecimentos

    Ao Professor Leonardo dos Reis Silveira por ter acreditado no meu potencial e me orientado, mesmo no caminhos mais obscuros, e ter me dado a oportunidade de abrir os olhos para o valor da ciência. Seu exemplo é de grande valia para a minha jornada como um futuro educador.

    A Professora Ísis do Carmo Kettelhut por ser tão meiga em suas palavras independemente da situação, por seu exemplo de pesquisador e por ter me aceitado em seu laboratório para execução da grande maioria dos meus experimentos. Também aos técnicos e alunos do laboratório: Antonieta, Pila, Lílian, Víctor, Dawit, Wiliam, Rafa, Danilo, Juliano, Samyra, Sílvia, Leandro, Fran e Grazi.

    Ao Professores Fernando de Lucca pelo incentivo no projeto com

    microRNAs. E a Professora Thais Amaral e Sousa pelo pontapé inicial em todos os meus experimentos e pela paciência para ensinar.

    A Professora Enilza Maria Espreáfico pelas ensinamentos e pelo espaço

    cedido para realização dos experimentos de clonagem. Também as técnicas e alunos do laboratório Silmara, Joana, Lucas, Marcela, Jackeline, Fernanda, Johnny, Rui, Talita e Cibele.

    Agradeço a Professora Luciane Carla Alberici pelo espaço cedido para a

    realização dos experimentos de consumo de oxigênio, bem como pelos conselhos científicos.

    Agradeço aos professores do programa de bioquímica da FMRP, pois foram fundamentais para minha formação como bioquímico e pesquisa de doutorado.

    Agradeço a Professora Laurie Goodyear pela oportunidade ímpar de trabalhar ao lado dela em um dos grupos de maior prestígio na área do diabetes. Aos amigos que fiz em Boston: Kawai, Tiago, Vicência, Minakshi, Joram, Becca, Taka, Jia, May, Mike, Sarah, Noah, Pasquale, Kristin e Alison. Também a todos os colegas que fiz no Joslin Diabetes Institute.

    A Ivone pela paciência, eficiência e carinho.

    Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP).

    Agradeço aos membros da banca pela disposição do tempo e orientação.

    A Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES)

    pela bolsa de doutorado concedida durante este período e pela bolsa de doutorado sanduíche.

  • RESUMO

    QUEIROZ, A. L. O MicroRNA miR-696 regula a expressão da proteína PGC-1α e induz à disfunção mitocondrial em células musculares de camundongos através do sistema SNARK/miR-696/PGC-1α, 2016. XXXf. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2016. A disfunção mitocondrial pode ser um mecanismo chave associado à ocorrência de doenças metabólicas como o diabetes. Neste contexto, é importante obeservar os mecanismos envolvidos nesse processo. MicroRNAs (miRs) são conhecidos por regular a expressão de genes em vários processos fisiológicos, incluindo o metabolismo de glicose e ácidos graxos, biogênese mitocondrial, proliferação, diferenciação e morte celular no músculo esquelético. Usando análise "in silico" (Sfold2.2) identificamos 219 microRNAs que, potencialmente, se ligam à região 3 'UTR do PGC-1α, um gene envolvido na biogênese mitocondrial e no metabolismo de glicose. Dos 219 candidatos, encontramos um alto valor de energia livre de hibridização entre o microRNA miR-696 e PGC-1α (-29,8 kcal / mol), sugerindo que o miR-696 poderia estar envolvido na regulação negativa do PGC-1α resultando em disfunção mitocondrial. Consistente com esta hipótese, observamos que a expressão do miR-696 apresentou-se aumentada nos músculos esqueléticos de dois modelos de camundongos com diabetes: camundongos diabéticos induzidos por STZ e camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Para compreender se o miR-696 regula a disfunção mitocondrial utilizamos células musculares C2C12 expostas a uma alta dose de ácido palmítico (700 µM) durante 24 horas, o que causou uma redução na expressão de genes mitocondriais, bem como no consumo de oxigênio. Vale destacar que a inibição do miR-696 através da transfecção de oligonucleotídeos antisenso (ASO) preveniu, parcialmente, a perda da função mitocondrial de células C2C12 tratadas com ácido palmítico. Curiosamente, não houve nenhuma alteração nos níveis de miR-696 em modelos envolvidos com a proteína AMPK, tal como em células C2C12 incubadas com uma droga ativadora de AMPK (AICAR) e no músculo esquelético de camundongos transgênicos superexpressando AMPKα2 com o domínio quinase inativo ou AMPKγ3 com mutação de ativação crônica (R70Q). Em contraste, a expressão alterada de uma quinase relacionadas com a AMPK, SNF1-AMPK-related kinase (SNARK), recentemente demonstrada por ter sua expressão aumentada em virtude do envelhecimento, exerceu efeit