I

RESUMO

A intolerância à lactose é a mais comum a um hidrato de carbono

e pode afectar pessoas de todos os grupos etários, apesar de ocorrer

com mais frequência em idades avançadas. A intolerância à lactose é

causada pela deficiência em lactase (β-galactosidase), a enzima que

digere o açúcar do leite, a lactose. Neste trabalho pretendeu-se estudar

a enzima β-galactosidase, proveniente de Kluyveromyces lactis, sob

diferentes formas e em diferentes condições experimentais, através da

variação da concentração de enzima, concentração de substrato

padrão, o-nitrofenol-β-ᴅ-galactoside, e da variação temperatura. Foram

depois realizados ensaios na matriz alimentar, o leite, uma vez que o pH

óptimo desta enzima, 6,8, é semelhante ao pH do leite. Para tal, foi

utilizada a enzima Lactozym 2600L, disponibilizada comercialmente pela

Sigma-Aldrich® sob a forma de suspensão líquida e a enzima imibond

galactosidase SPRIN®, disponibilizada comercialmente de forma

imobilizada numa resina amino-acrílica pela SPRIN Tecnhologies®. Foi

também realizada a imobilização da enzima Lactozym 2600L em suporte

de alginato de cálcio. De todas as formas enzimáticas testadas, a

imibond galactosidase SPRIN® foi a que apresentou melhores

resultados, nomeadamente a nível da estabilidade operacional nos

ensaios de reutilização. No final foram utilizados os valores optimizados

na matriz alimentar, o leite, de modo a testar a actividade hidrolítica da

enzima sobre a lactose, não se conseguindo obter um grande

rendimento de conversão nesta reacção, sugerindo a necessidade da

realização de mais estudos e ensaios nesta promissora área da

biotecnologia.

II

ABSTRACT

Lactose intolerance is the most common one carbohydrate and

can affect people of all age groups, although occur more frequently in

elderly persons. Lactose intolerance is caused by a deficiency of lactase

(β-galactosidase), the enzyme that digests the milk sugar lactose. This

work aimed the study of the enzyme β-galactosidase, obtained from

Kluyveromyces lactis in different forms and in different experimental

conditions, by varying the enzyme concentration, standard substrate

concentration, o-nitrophenol-β-ᴅ-galactoside, and temperature

variation. Assays were then performed in the food matrix, milk, since

the pH optimum of this enzyme, 6.8, is similar to pH of milk. To do this,

the enzyme used was Lactozym 2600L, commercially available from

Sigma-Aldrich ® in the form of liquid suspension and enzyme imibond

galactosidase SPRIN®, available commercially immobilized on an amino-

acrylic resin by SPRIN® Tecnhologies. It was also performed

immobilization of de the enzyme Lactozym 2600L in a calcium alginate

support. Of all the enzyme forms tested, the imibond galactosidase

SPRIN® showed the best results, particularly in terms of operational

stability in the reuse assays. At the end, values optimized were used in

the food matrix, milk, in order to test the hydrolytic activity of the

enzyme on the lactose, but was not possible to obtain a high conversion

yield, suggesting a need for further studies and tests on this promising

area of biotechnology.

III

AGRADECIMENTOS

À Professora Doutora Maria Henriques Ribeiro, a minha

Orientadora, pela supervisão, orientação, compreensão, simpatia,

disponibilidade e apoio prestado ao longo destes meses.

À Professora Doutora Matilde Castro, Coordenadora do

Mestrado em Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, da

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, a quem agradeço a

organização de mais uma edição deste mestrado.

A todos os docentes desta edição do Mestrado em Controlo da

Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, pelos conhecimentos

transmitidos durante a parte curricular do mesmo.

Ao Mário Nunes e à Isabel Ribeiro, pelas opiniões e conselhos

práticos, pela simpatia e disponibilidade expressas durante este

trabalho.

À D. Maria do Carmo, pela atenção dispensada e prontidão

demonstrada em relação ao material de laboratório.

À minha família (mãe, avó, pai Mário, Bruno, Renata, Rafaela,

Marcela, Sérgio, Nuno, Alice, Maria, Anita, Miguel, Zeca, Margarida,

Francisca, Carlota, Afonso, Nino e Leonardo) por toda a compreensão e

encorajamento e em especial ao meu namorado, José Jorge, pelo apoio

incondicional, pelo incentivo e disponibilidade e por toda a paciência e

carinho demonstrados ao longo destes meses.

A todos os meus amigos, Marina, Clarisse, Charlotte, Sérgio, pela

troca de ideias e opiniões e pelo animo transmitido ao longo deste

mestrado, e em especial à Ana por tudo isto e pela sua inestimável

companhia durante as longas horas passadas no laboratório.

IV

Índice

Resumo ............................................................................................... I

Abstract ............................................................................................. II

Agradecimentos ................................................................................ III

Índice ................................................................................................ IV

Índice de Figuras ............................................................................. VIII

Índice de Tabelas .............................................................................. IX

Indice de Gráficos ............................................................................. XI

1. INTRODUÇÃO E OBJECTIVOS ................................................... 1

1.1. Lactose ............................................................................... 1

1.2. Intolerância à lactose .......................................................... 4

1.3. β-galactosidase ................................................................... 7

1.3.1. Fontes microbianas da enzima ......................................... 8

1.3.1.1. Enzimas Bacterianas .................................................. 8

1.3.1.2. Enzimas de Fungos ..................................................... 9

1.3.1.3. Enzimas de Leveduras ................................................ 9

1.3.2. Aplicação Industrial .......................................................... 13

1.4. Métodos de Imobilização Enzimática ................................ 13

1.4.1. Adsorção física ............................................................... 14

1.4.2. A Encapsulação ............................................................... 15

1.4.3. Ligação Covalente .......................................................... 16

1.5. Cinética Enzimática ............................................................ 17

1.5.1. Inibição Enzimática............................................................. 21

1.6. Objectivos ......................................................................... 22

2. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................... 23

2.1. Reagentes .......................................................................... 23

2.2. Enzimas ............................................................................. 23

V

2.3. Equipamentos .................................................................... 24

2.4. Preparação de soluções ..................................................... 25

2.5. Métodos analíticos ............................................................ 29

2.5.1. Ensaio para a quantificação de açucares

redutores: Método DNS ................................................. 29

2.5.1.1. Técnica ..................................................................... 29

2.5.2. Método de Bradford para determinação da proteína ... 30

2.5.2.1. Técnica ..................................................................... 31

2.5.3. Doseamento da hidrólise enzimática de o-npg: método

colorimétrico .................................................................. 32

2.5.3.1. Curva de calibração de o-np ..................................... 34

2.5.4. Kit Glucose-Oxidase Sigma-Aldrich® para

determinação da glucose ............................................... 35

2.5.4.1. Técnica ..................................................................... 36

2.6. Métodos experimentais ................................................... 37

2.6.1 Imobilização ................................................................... 37

2.6.1.1. Técnica ..................................................................... 38

2.6.2. Avaliação da Influência da Concentração de Enzima .... 39

2.6.2.1. Técnica ..................................................................... 39

2.6.3. Avaliação da Influência da Concentração de Substrato 40

2.6.3.1. Técnica ..................................................................... 40

2.6.4. Estudo do Efeito da Temperatura ................................ 42

2.6.4.1. Técnica ..................................................................... 42

2.6.5. Ensaios de Reutilização .................................................. 43

2.6.5.1. Técnica ..................................................................... 43

2.6.6. Ensaios de Bioconversão da lactose em leite ................. 44

2.6.6.1. Técnica .................................................................... 44

2.6.6.2. Delineamento Experimental para modelação da

Bioconversão da Lactose ......................................... 45

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 48

3.1. Ensaios com a Enzima Sóluvel Lactozym® 2600L ............... 48

3.1.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração

de Enzima ....................................................................... 48

3.1.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de

Substrato ........................................................................ 51

3.1.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura ............. 53

VI

3.2. Ensaios com a enzima imibond galactosidase SPRIN® ........ 57

3.2.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração

de Enzima ....................................................................... 57

3.2.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de

Substrato ........................................................................ 59

3.2.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura .............. 62

3.2.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo

em contínuo ................................................................... 64

3.3. Ensaios com a enzima imobilizada em esferas de Alginato

de Cálcio ........................................................................... 67

3.3.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de

Enzima ............................................................................ 68

3.3.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de

Substrato ........................................................................ 69

3.3.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura .............. 72

3.3.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo

em continuo ................................................................... 73

3.4. Comparação da β-galactosidase livre, imibond

galactosidase SPRIN®e enzima imobilizada em alginato de

cálcio ................................................................................ 77

3.5. Ensaios de Bioconversão na Matriz Alimentar: Leite ......... 78

3.5.1. Optimização da bioconversão em leite pela

Metodologia das Superfícies de Resposta ..................... 81

4. CONCLUSÃO ............................................................................... 88

5. BIBLIOGRAFIA ............................................................................. 90

ANEXOS

Anexo I. Cálculos para a Preparação de Solução Tampão de Fosfato

de Potássio 0,1 M, p.H. 6,8

Anexo II. Cálculos para Preparação de Solução Tampão de Tris-HCl

0,1 M, p.H. 7,0

Anexo III. Cálculos para Preparação das soluções padrão de o-np

VII

Anexo IV. Cálculos para Preparação das soluções padrão de

Lactozym 2600 L para o ensaio de Bradford

Anexo V. Cálculo para a Preparação das diluições de Lactozym

2600 L utilizadas paras os ensaios com enzima livre

Anexo VI. Cálculos para a Preparação de Solução de Ácido

Sulfúrico 12N

Anexo VII. Cálculo para a Preparação das soluções padrão de

glucose

VIII

Índice de Figuras

Figura 1. Molécula de lactose ............................................................ 2

Figura 2. Hidrólise da lactose em glucose e galactose ...................... 7

Figura 3. β-galactosidase ................................................................... 8

Figura 4. Esquema dos vários métodos de imobilização ................ 16

Figura 5. Redução do reagente 3,5-dinitrosalicilato ....................... 29

Figura 6. Reacção de hidrólise do o-npg pela β-galactosidase ....... 34

Figura 7. Esquema da reacção de determinação da glucose pelo

teste da glucose/oxidase ................................................................. 35

Figura 8. Esferas de alginato de cálcio (2%) .................................... 39

IX

Índice de Tabelas

Tabela 1. Percentagem de lactose em leite e derivados .................. 2

Tabela 2. Valores nutricionais de lacticínios por 100 g de parte

edível ................................................................................................. 6

Tabela 3. Fontes microbianas de β-galactosidase .......................... 10

Tabela 4. Quantidades de leite e de preparações enzimáticas

utilizadas nos ensaios ..................................................................... 36

Tabela 5. Valores experimentais das duas variáveis testadas em

simultâneo e respectivos níveis codificados por aplicação do

CCRD ................................................................................................ 47

Tabela 6. Constantes cinéticas ........................................................ 77

Tabela 7. Teores de Hidratos de Carbono e Lactose no leite

(tabela) e valores de glucose doseados em ensaio ......................... 79

Tabela 8. Valores de actividade enzimática das diferentes

enzimas a 20 e a 37°C ; e valores de glucose das amostras de leite

aos 180 minutos de ensaio a 20 e a 37 °C ....................................... 80

Tabela 9. Efeito da concentração de imibond galactosidase

SPRIN®, da temperatura e do tempo na bioconversão da lactose

em glucose no leite .......................................................................... 82

Tabela 10. Equações dos modelos das superfícies de resposta,

ajustados aos resultados experimentais obtidos em leite na

bioconversão da lactose em glucose (mg/mL) por acção da

imibond galactosidase SPRIN® [Gal] em função da concentração

de enzima (mg/mL), da temperatura (T) (°C) e do tempo (t) (min)

e respectivos R2 e R2ajustado ............................................................... 87

X

Tabela A-I. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários

para a realização das soluções padrão de o-np

Tabela A-II. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários

para a realização das soluções padrão de proteína

Tabela A-III. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários

para a realização das diluições de Lactozym 2600 L

Tabela A-IV. Resumo dos valores obtidos nos cálculos

necessários para a realização das soluções padrão de glucose.

XI

Índice de Gráficos

Gráfico 1. Curva de Calibração da glucose (Método DNS) ............. 30

Gráfico 2. Curva de Calibração de proteína (Método Bradford) .... 32

Gráfico 3. Curva de Calibração de o-np .......................................... 34

Gráfico 4. Efeito da variação da concentração de enzima livre ao

longo do tempo ............................................................................... 49

Gráfico 5. Efeito da variação da concentração de enzima livre na

actividade enzimática ...................................................................... 50

Gráfico 6. Efeito da variação da concentração de substrato

na enzima livre................................................................................. 51

Gráfico 7. Actividade enzimática da enzima livre às

diferentes concentrações de substrato .......................................... 52

Gráfico 8. Efeito da variação da temperatura na enzima livre ....... 54

Gráfico 9. Actividade enzimática da enzima livre a

diferentes temperaturas ................................................................. 56

Gráfico 10. Efeito da variação da concentração de enzima

SPRIN® ............................................................................................... 58

Gráfico 11. Actividade enzimática da enzima SPRIN® às

diferentes concentrações de enzima .............................................. 59

Gráfico 12. Efeito da Variação da Concentração de Substrato

na enzima SPRIN® ............................................................................ 60

Gráfico 13. Actividade enzimática da enzima SPRIN® às diferentes

concentrações de substrato ............................................................ 60

Gráfico 14. Efeito da variação da temperatura na enzima

SPRIN® ............................................................................................. 62

Gráfico 15. Actividade enzimática da enzima SPRIN® a diferentes

temperaturas ................................................................................... 63

Gráfico 16. Reutilizações da enzima SPRIN® ................................... 64

XII

Gráfico 17.Actividade enzimática da enzima SPRIN® em cada

reutilização ...................................................................................... 65

Gráfico 18. Actividade Residual da enzima SPRIN® ao longo do

tempo ............................................................................................... 65

Gráfico 19. Efeito da variação da concentração de enzima

imobilizada em alginato de cálcio .................................................... 68

Gráfico 20. Actividade enzimática da enzima imobilizada em

alginato de cálcio a várias concentrações ....................................... 69

Gráfico 21. Efeito da Variação da Concentração de Substrato

na enzima imobilizada em alginato de cálcio ................................... 70

Gráfico 22. Actividade enzimática da enzima imobilizada em

alginato de cálcio às diferentes concentrações de substrato ......... 70

Gráfico 23. Efeito da variação da temperatura na enzima

imobilizada em alginato de cálcio .................................................... 72

Gráfico 24. Actividade enzimática da enzima imobilizada em

alginato de cálcio a diferentes temperaturas ................................. 73

Gráfico 25. Reutilizações da enzima imobilizada em alginato de

cálcio (2%) ......................................................................................... 74

Gráfico 26. Actividade enzimática da enzima imobilizada em

alginato de cálcio (2%) em cada reutilização .................................. 75

Gráfico 27. Actividade residual da enzima imobilizada em

alginato de cálcio (2%) em cada reutilização .................................. 76

Gráfico 28. Superfície de resposta ajustada à formação de

glucose como função da temperatura e do tempo em leite,

com uma concentração de imibond galactosidase SPRIN® de

8 mg/mL ........................................................................................... 83

Gráfico 29. Superfície de resposta ajustada à formação de

glucose como função do tempo e da concentração em leite à

temperatura de 30 °C ...................................................................... 84

XIII

Gráfico 30. Superfície de resposta ajustada à formação de

glucose como função da temperatura e da concentração de

imibond galactosidase SPRIN® em leite ao fim de 30 min ............... 86