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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de ADN en sangre periférica

La técnica de extracción por GeneClean empleada en este trabajo dio un buen

rendimiento, ya que la cantidad de ADN y el nivel de purificación del mismo fueron

muy buenos y las concentraciones obtenidas estuvieron entre 19.23 hasta 30.33 pg/μL,

el cual se encontró como de buen rendimiento de la cantidad de DNA total obtenido por

la técnica de GeneClean empleada en este trabajo.

En la extracción del ADN proveniente de las células mononucleares no fue buena

en comparación con el ADN extraído en sangre total ya que se observaron en el DNA

proveniente de la capa de blancos, una calidad de banda con poca intensidad, se realizó

una cuantificación del ADN extraído para ver la concentración, en donde se obtuvieron

19.33 pg/μL; lo cual nos llevó a considerar que pudo ser debido a la presencia de algún

componente que se encuentra en sangre que está interfiriendo, y considerar el hecho que

la concentración del bacilo a nivel sanguíneo, el número de células mononucleares

infectadas es bajo, como se ha reportado por otras investigaciones que se han realizado.

Mientras, que en el caso del ADN proveniente de sangre total siguiendo el mismo

protocolo de extracción dio un mejor resultado, la intensidad de la banda esperada fue

mayor, por lo que se optó por la extracción en sangre total (ver figura 3). Sin embargo

debido a este hecho y a la necesidad de tener un control positivo franco, se probó la

extracción en esputo, el cual provino de uno de los pacientes positivos, y se obtuvo una

excelente intensidad de banda, lo cual permitió corroborar el protocolo de extracción, y

poder tener un control positivo confiable, así también permitió asegurar las condiciones

de amplificación y la cepa control positivo H37Rv dio una buena intensidad de banda

ver figura 4.

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2000pb

1200pb

800pb

400pb

200pb 245pb

100pb

Figura 3.- Electroforesis productos amplificación de extracción en sangre total y

capa de blancos “células mononucleares”.

Carril 4: marcador Low Ladder (100pb), Carril 5: ADN TB positivo muestra sangre

total, Carril 6: ADN TB positivo muestra sangre periférica separación de células

mononucleares.

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2000pb

1200pb

800pb

400pb

200pb 245 pb

100pb

Figura 4.- Electroforesis de los productos de PCR expectoración TB positiva y

Cepa control positivo H37Rv.

Carril 1: Marcador peso molecular Low –ladder, Carril 2: ADN expectoración TB

positivo, Carril 3: ADN cepa control cepa H37Rv y Carril 4: Negativo agua.

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Condiciones de Amplificación

Los ADN obtenidos se sometieron a los protocolos tomados de referencia donde

los productos de amplificación se analizaron y el programa de amplificación con el que

se obtuvieron mejores resultados fue el proporcionado por Laboratorios Clínicos de

Puebla y fueron bajo estas condiciones que se partió la estandarización de la PCR.

Se realizó un gradiente de temperatura para encontrar la mejor condición de

alineación. De las amplificaciones por gradiente se tomaron las temperaturas

recomendadas como la guía, tomando como temperatura mínima de alineación de 60 °C,

62°C, 63°C, 64°C hasta 69°C para establecer la temperatura de alineación la cual fue de

67°C, ver figura 5, así mismo se probaron los tiempos de cada etapa en la amplificación

y estos no variaron con respecto a la referencia. En cuanto a los números de ciclos de

cada etapa de la PCR se movieron ya una vez elegido las temperaturas, y estos ciclos se

modificaron de 33, 35 y 40 ciclos; pero no se obtuvieron buenos resultados, ya que al

momento de correr la electroforesis para observar el patrón de bandeo, se presentaba la

banda esperada de 245 pb la cual identifica la presencia del bacilo, pero se observaron

bandas inespecíficas en estas reacciones, mientras que con los iniciadores del control

interno no se tuvo presencia de bandas inespecíficas, con ello se realizaron distintas

pruebas para descartar contaminación durante el proceso de extracción, al momento de

preparar las reacciones de PCR, por contaminación del agua, ya que es común este

problema, así también se descartó la posibilidad de algún problema con los iniciadores

por contaminación o que estuviesen mal sintetizados.

Una vez descartadas las posibles causas; se realizaron modificaciones; una fue

realizar una PCR con una etapa de hot start previo, es decir, antes de colocar las

muestras de ADN al termociclador se pre-calentó por 5 minutos a 93°C, ya que se ha

visto que se minimiza la producción de productos inespecíficos y decrementa

sensiblemente la reacción, así como se puso cuidado al momento de agregar el ADN a la

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Figura 5.- Electroforesis productos amplificación TB positivos a gradientes

en temperatura de alineación.

ADN TB positivo con iniciador LCP11.- Carril 1: Muestra 60°C ,Carril 2: Muestra

63°C, Carril 3: Muestra 65°C, Carril 4: Muestra 66.7°C, Carril 5: Control negativo agua

60°C . ADN TB positivo con iniciador LCP13.- Carril 7: Muestra 60°C, Carril 8:

Muestra 63°C, Carril 9: Muestra 65°C, Carril 10: Muestra 66.7°C, Carril 11: Control

negativo agua 60°C.

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mezcla reacción de PCR, se colocaron los tubos de reacción inmediatamente a hielo para

evitar cualquier reacción inespecífica como se ha visto en otros estudios.

Por otro lado, se probaron distintas concentraciones de ADN purificado, se

realizó PCR con distintas cantidades de iniciadores; con ello se logró eliminar las

bandas inespecíficas y aparte ajustar la cantidad de muestra ADN y de iniciadores en la

reacción de PCR.

Las condiciones óptimas de amplificación encontradas para el diagnóstico del

complejo M. tuberculosis en sangre periférica se encuentra especificada en la tabla II.

Análisis de ADN amplificado

Los productos de amplificación analizados provenientes de los dos pacientes con

diagnóstico a TB positivo con cultivo fueron analizado por PCR, ambos DNAs fueron

positivos, por el método estandarizado observándose la banda esperada de 245pb; en el

caso del ADN proveniente de tres pacientes presuntamente sanos, dos de los productos

amplificados dieron negativo, mientras que la tercera de las muestras extraídas dio

positivo. Por lo que se realizó nuevamente la amplificación, se tomó el ADN extraído y

se amplificó por duplicado dando positivo una ves más, para asegurar y corroborar que

el ADN si es positivo, se mandó parte del ADN extraído por nuestra técnica y muestra

de sangre de la persona al laboratorio estatal de referencia, que ya cuenta con una

técnica de PCR para tuberculosis validada, obteniéndose la prueba de PCR positiva tanto

en el ADN como en la muestra directa de sangre (ver figura 6). Por lo que se identificó

como positivo a tuberculosis pero no se puede asegurar o hacer un diagnóstico definitivo

como tuberculoso ya que para ello se tiene que dar un seguimiento médico y hacer un

estudio clínico detallado, pasar por la batería de pruebas aprobadas para diagnóstico y

realizar el estándar de oro, es decir el cultivo y así poder decir que es una persona con

tuberculosis ya que es la única prueba de diagnóstico definitivo validada y aprobada.

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Tabla II. Condiciones de amplificación por PCR.

Proceso Temperatura (°C) Tiempo (minuto:segundo) Ciclos

1 Desnaturalización 95°C 10:00 minutos 1

2 Desnaturalización 94°C 0:15 segundos

Hibridación o

Alineación 67°C 0:20 segundos 40

Extensión 72°C 0:030 segundos

3 Extensión final 72°C 2:00 minutos 1

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268 pb

245pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 6.- Electroforesis de los productos de PCR en sangre periférica,

expectoración TB positiva y negativa en gel de agarosa.

Carril 1:Muestra sangre negativa (TB positiva),Carril 2:Muestra sangre positiva, Carril

3: Muestra expectoración positiva, Carril 4: Muestra negativa, Carril 5: marcador peso

molecular (100pb Low DNA Ladder) y Carriles 6,7,8: Control interno de sangre muestra

negativa (TB positiva), sangre positiva, expectoración respectivamente y Carril 9:

control negativo agua.

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Análisis de Restricción de los productos de amplificación TB positivos

El fragmento amplificado de 245 pb (muestras control positivo y sangre

periférica positivo) del fragmento de inserción IS6110 se digirieron incubando con la

enzima de restricción Sac II, la cual reconoce el sitio de restricción de 55pb de la

secuencia. Cuando la muestra sanguínea contiene al bacilo M. tuberculosis, en la

digestión del producto de 245 pb con SacII, se obtiene un fragmento de 190 pb, y si el

bacilo no se encuentra presente o el ADN extraído no es de TB no hay digestión. La

figura 7 muestra que en el control positivo de expectoración TB positivo si presenta una

diferencia en el patrón de bandeo en donde se observó una banda de 190 pb en el

producto digerido y en la no digerida se observó solamente la banda de 245 pb, en el

caso de la muestra proveniente de sangre periférica se observó el mismo patrón. Esto

indica que la enzima reconoció el sitio de restricción que existe solo en la secuencia del

segmento de inserción IS6110 específico del complejo M tuberculosis y por tanto, se

confirma que el producto purificado y amplificado en sangre periférica y en

expectoración como control son efectivamente del complejo M tuberculosis.

La enzima de restricción se eligió en base al análisis en un banco de genes, se

realizó el mapa de restricción con diversas enzimas específicas que reconocen algún

sitio específico de la secuencia utilizada y se eligió la enzima que se tubo disponible.

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1 2 3 4 5

245 pb

190 pb

Figura 7.- Electroforesis de productos de digestión con SacII.

Carril 1: DNA sangre periférica sin digerir, Carril 2: DNA sangre digerido, Carril 3:

marcador de peso molecular Low Ladder Mass, Carril 4: DNA expectoración sin digerir

y Carril 5: DNA expectoración digerido.

2000pb 1200pb 800pb 400pb 200pb 100pb