Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e...

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  • Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

    Bioquímicos

    PRODUÇÃO DE β-GLUCOSIDASE EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

    RECOMBINANTE E AVALIAÇÃO DE SEU EMPREGO NO PROCESSO DE

    HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SIMULTÂNEA À FERMENTAÇÃO PARA A

    PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

    Verônica Ferreira

    Tese apresentada ao Curso de Pós-

    Graduação em Tecnologia de

    Processos Químicos e Bioquímicos

    para Obtenção do Título de Doutor

    em Ciências (DSc)

    Orientador: Prof. Nei Pereira Jr, PhD

    Escola de Química

    2010

  • ii

    Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise

    enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

    segunda geração

    Verônica Ferreira

    Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de

    Processos Químicos e Bioquímicos para Obtenção do Título de Doutor

    em Ciências (DSc)

    Escola de Química

    Universidade Federal do Rio de Janeiro

    2010

  • iii

    Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise

    enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

    segunda geração

    Verônica Ferreira

    Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de

    Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade

    Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção

    do grau de Doutora em Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.

    Aprovada por:

    ________________________________ Prof. Nei Pereira Junior, PhD

    (Orientador-Presidente da Banca)

    ________________________________ Prof. Eliana Mossé Alhadeff, DSc - UFRJ

    ________________________________ Prof. Fernando Araripe Gonçalves Torres, PhD - UNB

    ________________________________

    Maria Antonieta Ferrara, DSc - FioCruz

    ________________________________ Prof. Maria Antonieta P. G. Couto, DSc - UFRJ

    ________________________________ Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc – PETROBRÁS

    EQ/UFRJ 2010

  • iv

    FICHA CATALOGRÁFICA

    Ferreira, Verônica. Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de segunda geração / Verônica Ferreira – Rio de Janeiro, 2010.

    xx, 132 f, 29,7 cm. Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de

    Janeiro - UFRJ, Escola de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, 2010.

    Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.

    1. β-glucosidase 2. Expressão heteróloga 3. Saccharomyces cerevisiae 4. SSF 5. Bioetanol

    I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Química. Pós- Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.

    í

  • v

    Agradecimento Especial...

    Ao querido e estimado Prof. Nei, pela orientação,

    constante estímulo, crédito, amparo e confiança.

  • vi

    “Mas é preciso ter manha

    É preciso ter graça

    É preciso ter sonho sempre

    Quem traz na pele essa marca

    Possui a estranha mania

    De ter fé na vida...”

    Milton Nascimento

  • vii

    AGRADECIMENTOS

    A Deus por me dar a vida e me permitir todas os momentos e conquistas;

    Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr., pela excelência e

    singularidade no desempenho de suas competências que, somadas, elevam

    a estrutura e qualidade de seu grupo e de nossa Universidade;

    Ao Walber, meu amado marido, por todo companheirismo, paciência e

    compreensão;

    Ao Antônio, meu filho querido, melhor presente de Deus, responsável por

    meu mais novo e mais completo conceito de felicidade;

    A minha família, por toda certeza, amparo, constante confiança e presença,

    e principalmente, pelo amor incondicional;

    Ao Luizão, amigo de todas as horas, pelo fundamental apoio estrutural e

    pela indispensável atuação administrativa. Além do apoio, amizade e

    confiança constante;

    Ao amigo Gabriel Betancur, meu anjo da guarda, que mais uma vez

    exercitou sua paciência e capacidade de ajudar;

    As queridíssimas alunas de iniciação científica, Mariana de Oliveira Faber,

    Sabrina da Silva Mesquita e Ludmylla pelo companheirismo e amizade

    sincera solidificada durante os longos e maravilhosos momentos

    experimentais;

    Ao querido amigo Roberto Maeda, carinhosamente chamado de Maedão,

    por toda paciência, ajuda e constante presença;

    Aos colegas e amigos do laboratório 121 pelo companheirismo e por

    tornarem o laboratório 121 um local extremamente agradável e alegre;

    Ao amigo Maurílio Mesquita por todo auxílio, amizade e confiança;

    Ao professor Fernando Araripe Gonçalves Torres, a professora Lidia Maria

    Pepe de Moraes e aos seus orientandos que me acolheram em seus

    laboratórios com toda dedicação, carinho e paciência para compartilhar

    seus conhecimentos de biologia molecular;

  • viii

    As professoras Andréa Salgado, Maria Antonieta, Eliana Alhadeff e Eliana

    Flávia pela amizade e por todos os ensinamentos e momentos didáticos

    compartilhados;

    A todos os professores do Departamento de Engenharia Bioquímica que

    contribuíram para o meu crescimento acadêmico e profissional;

    Ao amigo Absai por todo auxilio analítico;

    Ao CENPES/Petrobras pela oportunidade e apoio financeiro e estrutural;

    Aos funcionários da secretária de Pós-graduação da Escola de Química que

    estiveram presentes durante a realização deste trabalho;

    Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

    Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ pela oportunidade;

    À CAPES, pela bolsa e auxílio financeiro.

  • ix

    R E S U M O Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

    segunda geração

    Verônica Ferreira

    Orientador: Prof. Nei Pereira Jr., PhD.

    Atualmente, o grande desafio das grandes potenciais mundiais é a redução dos custos envolvidos nos processos de produção do etanol de segunda geração. Uma forma que pode levar a redução de parte desses custos é a utilização de uma linhagem capaz de suplementar o preparado enzimático empregado na produção de etanol de segunda geração em sistemas de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF). O presente trabalho objetivou a produção em biorreator de β-glucosidase 4 de Humicola grisea var. thermoidea em Saccharomyces cerevisiae recombinante e sua utilização na obtenção de bioetanol a partir de celulignina pré-tratada de bagaço de cana- de-açúcar. Inicialmente, selecionou-se o melhor clone produtor de β- glucosidase, a maioria dos clones apresentou crescimento e produção enzimática em meio contendo apenas glicose e também em meio contendo glicose e celobiose. A quantidade máxima de atividade β-glucosidásica apresentada foi 6 U L-1 e 43 U L-1 em meio de glicose e celobiose e em meio de glicose, respectivamente. Adicionalmente, avaliou-se a melhor fonte de nitrogênio e a melhor relação C/N a ser empregada na produção da enzima em biorreator. O meio suplementado com extrato de levedura como fonte de nitrogênio, e glicose como fonte de carbono, com a relação C/N de 13 forneceu os maiores valores de atividade β-glucosidásica (800 U L-1). Posteriormente, foi avaliada a produção de β-glucosidase em biorreator conduzido em batelada simples e batelada alimentada através de alimentação de glicose ou glicose e extrato de levedura por pulsos e contínua. A linhagem utilizada apresentou produção enzimática associada ao crescimento celular e apresentou atividade enzimática extracelular na presença de glicose residual. Em cultivos conduzidos em regime de batelada alimentada por pulsos de glicose e extrato de levedura obteve-se 3000 U L-1, correspondendo a uma produtividade volumétrica de atividade enzimática total de 63 U L-1 g-1 em 48 horas de processo. Finalmente, foi avaliada a utilização da levedura recombinante na produção de etanol de diferentes fontes celulósicas, CMC, AVICEL e celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. Celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado forneceu a maior concentração de etanol 52,69 g L-1, representando uma eficiência de fermentação de 69% e produtividade volumétrica de 1,18 g L-1 h-1. Concluindo, a levedura utilizada no presente trabalho é uma linhagem recombinante capaz de produzir elevadas concentrações de enzima β-glucosidase intracelular e extracelular e apresenta grande robustez para ser utilizada como agente catalítico em processo de sacarificação e ferme