Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos

PRODUÇÃO DE β-GLUCOSIDASE EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

RECOMBINANTE E AVALIAÇÃO DE SEU EMPREGO NO PROCESSO DE

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SIMULTÂNEA À FERMENTAÇÃO PARA A

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

Verônica Ferreira

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos

para Obtenção do Título de Doutor

em Ciências (DSc)

Orientador: Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Escola de Química

2010

ii

Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise

enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

segunda geração

Verônica Ferreira

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos para Obtenção do Título de Doutor

em Ciências (DSc)

Escola de Química

Universidade Federal do Rio de Janeiro

2010

iii

Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise

enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

segunda geração

Verônica Ferreira

Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do grau de Doutora em Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.

Aprovada por:

________________________________ Prof. Nei Pereira Junior, PhD

(Orientador-Presidente da Banca)

________________________________ Prof. Eliana Mossé Alhadeff, DSc - UFRJ

________________________________ Prof. Fernando Araripe Gonçalves Torres, PhD - UNB

________________________________

Maria Antonieta Ferrara, DSc - FioCruz

________________________________ Prof. Maria Antonieta P. G. Couto, DSc - UFRJ

________________________________ Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc – PETROBRÁS

EQ/UFRJ 2010

iv

FICHA CATALOGRÁFICA

Ferreira, Verônica. Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de segunda geração / Verônica Ferreira – Rio de Janeiro, 2010.

xx, 132 f, 29,7 cm. Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de

Janeiro - UFRJ, Escola de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, 2010.

Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.

1. β-glucosidase 2. Expressão heteróloga 3. Saccharomyces cerevisiae 4. SSF 5. Bioetanol

I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Química. Pós- Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.

í

v

Agradecimento Especial...

Ao querido e estimado Prof. Nei, pela orientação,

constante estímulo, crédito, amparo e confiança.

vi

“Mas é preciso ter manha

É preciso ter graça

É preciso ter sonho sempre

Quem traz na pele essa marca

Possui a estranha mania

De ter fé na vida...”

Milton Nascimento

vii

AGRADECIMENTOS

A Deus por me dar a vida e me permitir todas os momentos e conquistas;

Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr., pela excelência e

singularidade no desempenho de suas competências que, somadas, elevam

a estrutura e qualidade de seu grupo e de nossa Universidade;

Ao Walber, meu amado marido, por todo companheirismo, paciência e

compreensão;

Ao Antônio, meu filho querido, melhor presente de Deus, responsável por

meu mais novo e mais completo conceito de felicidade;

A minha família, por toda certeza, amparo, constante confiança e presença,

e principalmente, pelo amor incondicional;

Ao Luizão, amigo de todas as horas, pelo fundamental apoio estrutural e

pela indispensável atuação administrativa. Além do apoio, amizade e

confiança constante;

Ao amigo Gabriel Betancur, meu anjo da guarda, que mais uma vez

exercitou sua paciência e capacidade de ajudar;

As queridíssimas alunas de iniciação científica, Mariana de Oliveira Faber,

Sabrina da Silva Mesquita e Ludmylla pelo companheirismo e amizade

sincera solidificada durante os longos e maravilhosos momentos

experimentais;

Ao querido amigo Roberto Maeda, carinhosamente chamado de Maedão,

por toda paciência, ajuda e constante presença;

Aos colegas e amigos do laboratório 121 pelo companheirismo e por

tornarem o laboratório 121 um local extremamente agradável e alegre;

Ao amigo Maurílio Mesquita por todo auxílio, amizade e confiança;

Ao professor Fernando Araripe Gonçalves Torres, a professora Lidia Maria

Pepe de Moraes e aos seus orientandos que me acolheram em seus

laboratórios com toda dedicação, carinho e paciência para compartilhar

seus conhecimentos de biologia molecular;

viii

As professoras Andréa Salgado, Maria Antonieta, Eliana Alhadeff e Eliana

Flávia pela amizade e por todos os ensinamentos e momentos didáticos

compartilhados;

A todos os professores do Departamento de Engenharia Bioquímica que

contribuíram para o meu crescimento acadêmico e profissional;

Ao amigo Absai por todo auxilio analítico;

Ao CENPES/Petrobras pela oportunidade e apoio financeiro e estrutural;

Aos funcionários da secretária de Pós-graduação da Escola de Química que

estiveram presentes durante a realização deste trabalho;

Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ pela oportunidade;

À CAPES, pela bolsa e auxílio financeiro.

ix

R E S U M O Produção de β-glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

recombinante e avaliação de seu emprego no processo de hidrólise enzimática simultânea à fermentação para a produção de etanol de

segunda geração

Verônica Ferreira

Orientador: Prof. Nei Pereira Jr., PhD.

Atualmente, o grande desafio das grandes potenciais mundiais é a redução dos custos envolvidos nos processos de produção do etanol de segunda geração. Uma forma que pode levar a redução de parte desses custos é a utilização de uma linhagem capaz de suplementar o preparado enzimático empregado na produção de etanol de segunda geração em sistemas de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF). O presente trabalho objetivou a produção em biorreator de β-glucosidase 4 de Humicola grisea var. thermoidea em Saccharomyces cerevisiae recombinante e sua utilização na obtenção de bioetanol a partir de celulignina pré-tratada de bagaço de cana- de-açúcar. Inicialmente, selecionou-se o melhor clone produtor de β- glucosidase, a maioria dos clones apresentou crescimento e produção enzimática em meio contendo apenas glicose e também em meio contendo glicose e celobiose. A quantidade máxima de atividade β-glucosidásica apresentada foi 6 U L-1 e 43 U L-1 em meio de glicose e celobiose e em meio de glicose, respectivamente. Adicionalmente, avaliou-se a melhor fonte de nitrogênio e a melhor relação C/N a ser empregada na produção da enzima em biorreator. O meio suplementado com extrato de levedura como fonte de nitrogênio, e glicose como fonte de carbono, com a relação C/N de 13 forneceu os maiores valores de atividade β-glucosidásica (800 U L-1). Posteriormente, foi avaliada a produção de β-glucosidase em biorreator conduzido em batelada simples e batelada alimentada através de alimentação de glicose ou glicose e extrato de levedura por pulsos e contínua. A linhagem utilizada apresentou produção enzimática associada ao crescimento celular e apresentou atividade enzimática extracelular na presença de glicose residual. Em cultivos conduzidos em regime de batelada alimentada por pulsos de glicose e extrato de levedura obteve-se 3000 U L-1, correspondendo a uma produtividade volumétrica de atividade enzimática total de 63 U L-1 g-1 em 48 horas de processo. Finalmente, foi avaliada a utilização da levedura recombinante na produção de etanol de diferentes fontes celulósicas, CMC, AVICEL e celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. Celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado forneceu a maior concentração de etanol 52,69 g L-1, representando uma eficiência de fermentação de 69% e produtividade volumétrica de 1,18 g L-1 h-1. Concluindo, a levedura utilizada no presente trabalho é uma linhagem recombinante capaz de produzir elevadas concentrações de enzima β-glucosidase intracelular e extracelular e apresenta grande robustez para ser utilizada como agente catalítico em processo de sacarificação e ferme