KAJIAN INHIBITOR α GLUKOSIDASE AKTINOMISET ENDOFIT … · -glucosidase inhibitor, endophytic...

Click here to load reader

  • date post

    21-Mar-2019
  • Category

    Documents

  • view

    237
  • download

    7

Embed Size (px)

Transcript of KAJIAN INHIBITOR α GLUKOSIDASE AKTINOMISET ENDOFIT … · -glucosidase inhibitor, endophytic...

KAJIAN INHIBITOR -GLUKOSIDASE AKTINOMISET ENDOFIT ASAL BROTOWALI

(Tinospora crispa)

SRI PUJIYANTO

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI

DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Kajian Inhibitor -

Glukosidase Aktinomiset Endofit Asal Brotowali (Tinospora crispa) adalah

karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan

dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun

tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Agustus 2012

Sri Pujiyanto

NRP: G361070031

ABSTRACT

SRI PUJIYANTO. The Study of -Glucosidase Inhibitor of Endophytic Actinomycetes Isolated from Brotowali (Tinospora crispa). Under direction of YULIN LESTARI, ANTONIUS SUWANTO, SRI BUDIARTI and LATIFAH K. DARUSMAN.

An -glucosidase inhibitor is one of the compounds for the treatment of diabetes. This inhibitor can retard the liberation of glucose from dietary complex carbohydrates and delay glucose absorption, resulting in reduced postprandial plasma glucose levels and suppress postprandial hyperglycaemia. Diabetic medicinal plants are potencial sources of -glucosidase inhibitor-producing endophytic microorganisms. Actinomycetes has been known as a source of various bioactive compounds that have been used in human health. The purpose of this study were to isolate and to select -glucosidase inhibitor-producing endophytic actinomycetes from Tinospora crispa and to characterize the selected

isolated and their -glucosidase inhibitor. Endophytic actinomycetes were isolated from the roots, leaves and stems of T. crispa. Sterilized plant samples were inoculated on the HV Agar medium containing 50 ppm cycloheximide and 30 ppm nalidixic acid and were incubated for 2-3 weeks at room temperature. All actinomycetes isolates were tested for their ability to inhibit the -glucosidase. Identification for the selected isolates was based on 16S rDNA sequences. The inhibitor activity to -glucosidase was determined spectrophotometrically at 400 nm using p-nitrophenyl--D-glucopyranoside as a substrate, and acarbose as a positive control. Characterization and identification of inhibitor component was based on thin layer chromatography, column chromatography, phytochemicals, UV-Vis spectrophotometer and FTIR analyses.The results showed that endophytic actinomycetes isolated from T. crispa produced various inhibition activities. The highest inhibition activity to -glucosidase was shown by BWA65 found from T. crispa. Production of -glucosidase inhibitor compounds in this

plant largely related with the contribution of its actinomycetes endophytes. The identification based on 16S rDNA sequence revealed that the isolate has 98% similarity to Streptomyces diastaticus. Separation of bioactive components by

column chromatography obtained active fraction (F6), which has a low IC50 and high inhibitory activity. Based on phytochemicals, UV-Vis spectrophotometer and FTIR analyses, the active compound F6 is an auron group of flavonoid.

Key words: -glucosidase inhibitor, endophytic actinomycetes, diabetes mellitus, Tinospora crispa.

RINGKASAN

SRI PUJIYANTO. Kajian Inhibitor -Glukosidase Aktinomiset Endofit Asal Brotowali (Tinospora crispa). Dibimbing oleh YULIN LESTARI, ANTONIUS

SUWANTO, SRI BUDIARTI dan LATIFAH K. DARUSMAN

Pengobatan diabetes secara tradisional pada umumnya adalah dengan memanfaatkan berbagai jenis tanaman yang memiliki kandungan bahan aktif yang dapat menurunkan kadar gula dalam darah, diantaranya adalah senyawa yang dapat menghambat enzim -glukosidase. Eksplorasi mikrob endofit diharapkan dapat menghasilkan metabolit sekunder penting yang memiliki khasiat sama dengan metabolit yang dihasilkan tanaman inangnya. Tanaman obat diabetes merupakan sumber mikrob potensial penghasil inhibitor -glukosidase. Isolat potensial dari tanaman obat tersebut diharapkan dapat digunakan untuk memproduksi senyawa inhibitor -glukosidase secara mikrobiologis.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat aktinomiset endofit dari tanaman obat diabetes, khususnya Tinospora crispa (brotowali) yang berpotensi sebagai penghasil senyawa inhibitor -glukosidase, mengkarakterisasi dan mengidentifikasi isolat aktinomiset endofit penghasil inhibitor -glukosidase terpilih, serta mengkarakterisasi dan mengidentifikasi senyawa inhibitor -glukosidase yang dihasilkan oleh isolat aktinomiset endofit terpilih.

Berdasar kerangka pemikiran bahwa: a) inhibitor -glukosidase dapat dihasilkan oleh berbagai organisme, yaitu tanaman tingkat tinggi, alga, cendawan, bakteri (non aktinomiset) dan aktinomiset, b) terdapat beberapa temuan penelitian yang menyatakan bahwa beberapa mikrob endofit dapat menghasilkan senyawa yang serupa dengan tanaman inangnya, dan c) tanaman T. crispa secara empiris diketahui memiliki aktivitas antidiabetes serta menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase, maka dapat dirumuskan suatu hipotesis: aktinomiset endofit penghasil senyawa inhibitor -glukosidase dapat diisolasi dari tanaman T. crispa. Isolat aktinomiset yang diperoleh mampu menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase secara in vitro.

Isolasi aktinomiset endofit dilakukan dari T. crispa menggunakan media Humic Acid Vitamin B (HV) agar dengan penambahan 50 ppm cycloheximide dan 30 ppm nalidixic acid. Sebelum dilakukan isolasi, sampel tanaman disterilisasi

permukaan menggunakan natrium biklorit dan alkhohol 70% secara bertahap. Aktivitas inhibitor -glukosidase diuji berdasarkan pada penghambatan pemecahan substrat p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside oleh enzim -

glukosidase selama periode tertentu. Senyawa acarbose (Sigma) digunakan sebagai pembanding.

Untuk mengetahui peran aktinomiset endofit dalam menghasilkan inhibitor -glukosidase, dilakukan pengujian aktivitas inhibitor -glukosidase terhadap tanaman T. crispa bebas endofit yang diperoleh dari kultur jaringan tanaman,

tanaman asli yang diperoleh dari alam dan isolat aktinomiset endofit terpilih, kemudian hasilnya dibandingkan.

Identifikasi isolat terpilih dilakukan berdasarkan sekuen 16S rDNA. Pengamatan morfologi isolat dilakukan menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 100 dan 400x dan SEM pada perbesaran 10.000x.

Deteksi keberadaan gen yang terlibat dalam biosintesis inhibitor -glukosidase dilakukan dengan amplifikasi gen penyandi sedoheptulosa-7-fosfat siklase menggunakan primer VOG-F 5'GGSGGSGGSGTSCTSATGGACGT-

SGCSGG-3', dan primer VOG-R 5'GCCATGTCSACGCASACSGCSGCCTCS-CCGAG-3'. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR selanjutnya disekuen dan dibandingkan dengan sekuen yang ada di database GenBank.

Produksi senyawa inhibitor menggunakan media produksi cair berisi 0.1% soluble starch, 0.5% pepton, dan 0.1% yeast extract . Ekstraksi senyawa inhibitor

dilakukan dengan menggunakan pelarut etil asetat. Fraksinasi senyawa aktif dilakukan dengan kromatografi kolom silika gel dengan eluen heksan:etil asetat 1:4. Analisis fraksi dilakukan dengan bantuan KLT analitik. Fraksi yang diperoleh diuji aktivitas inhibitor -glukosidasenya. Fraksi terbaik dikarakterisasi lebih lanjut meliputi: nilai IC50, pengaruh konsentrasi substrat, pemeriksaan fitokimia, scanning serapan maksimum dengan spektrofotometer UV-Vis dan pemeriksaan

dengan spektrofotometer FTIR. Tiga puluh dua isolat aktinomiset endofit telah berhasil diisolasi dari

tanaman T. crispa. Isolat BWA65 dari tanaman T. crispa merupakan isolat paling berpotensi untuk dikaji lebih lanjut. Penemuan isolat aktinomiset endofit dari T. crispa yang menghasilkan inhibitor -glukosidase dalam penelitian ini,

memperkuat pendapat bahwa tanaman dapat mengandung mikrob endofit yang dapat menghasilkan beberapa senyawa biologis atau metabolit sekunder yang diduga sebagai hasil transfer genetik (rekombinasi genetik) dari tanaman inang ke mikrob endofit.

Tanaman T. crispa bebas endofit yang diperoleh dari kultur jaringan

tanaman hanya memiliki kemampuan yang sangat rendah untuk menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase. Tanaman T. crispa yang diperoleh dari alam

mampu memproduksi senyawa inhibitor jauh lebih besar dibandingkan tanaman bebas endofit yang diperoleh dari kultur jaringan. Namun demikian, kemampuan inhibitor -glukosidase yang dihasilkan oleh aktinomiset endofit BWA65 lebih dari dua kali daripada aktivitas inhibitor -glukosidase tanaman inang. Hasil ini mengindikasikan bahwa aktinomiset endofit dalam tanaman T. crispa tersebut

memberikan kontribusi besar terhadap produksi senyawa inhibitor -glukosidase. Hasil identifikasi berdasarkan sekuen 16S rDNA sepanjang 1343 pasang

basa menunjukkan bahwa isolat BWA65 memiliki kesamaan 98% dengan Streptomyces diastaticus. Kajian tentang inhibitor -glukosidase yang dihasilkan oleh S. diastaticus hingga saat ini belum pernah dilaporkan. Berdasarkan hal

tersebut, kemungkinan besar isolat BWA65 merupakan jenis baru penghasil inhibitor -glukosidase.

Analisis menggunakan program BLASTX terhadap sekuen basa hasil amplifikasi gen sedoheptulosa-7-fosfat siklase dari isolat BWA65 menunjukkan kemiripan paling tinggi 92% dengan GAF sensor hybrid histidine kinase pada Streptomyces violaceusniger Tu4113 (no akses YP-004812094.1). Amplifikasi

ulang gen sedoheptulosa-7-fosfat siklase pada isolat aktinomiset BWA65 ini dengan primer Forward: 5-CCTACGAGGTGCGCTTCCGGGACGACGT-3 dan Reverse: 5-GGCGGCCTGCAGCTCGGCGGCCGTCACGT-3, berhasil meng-

amplifikasi gen tersebut secara spesifik sepanjang 300 bp. Analisis hasil sekuensing menggunakan program BLASTX menunjukkan kemiripan 100% dengan gen sedoheptulosa-7-fosfat siklase dari Actinoplanes sp. SE50/110 (no akses Y18523.4) (Velina 2012, unpublished).

Fraksinasi senyawa aktif dari ekstrak etil asetat kultur BWA65 diperoleh fraksi aktif (Fraksi F6) sebagai fraksi paling potensial. Fraksi ini memiliki aktivitas penghambatan sebesar 80.9% pada konsentrasi 200 ppm atau setara dengan 96.2% dari aktivitas acarbose (aktivitas penghambatan 84.1%). Pada pengujian nilai IC50, Fraksi F6 memiliki nilai IC50 10.9 ppm, lebih kecil dibanding nilai IC50 acarbose sebesar 36.65 ppm. Keunggulan senyawa pada fraksi F6 ini pada konsentrasi yang rendah (dibawah 100 ppm) aktivitasnya lebih tinggi dibanding

dengan acarbose. Pada konsentrasi 12.5; 25 dan 50 ppm fraksi F6 memiliki aktivitas penghambatan sebesar 143.1%; 152.4% dan 150.1% dibanding acarbose pada konsentrasi yang sama. Hasil pengujian aktivitas inhibitor dengan berbagai konsentrasi substrat p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside menunjukkan

bahwa senyawa inhibitor -glukosidase yang dihasilkan isolat BWA65 diduga memiliki tipe penghambatan kompetitif.

Berdasarkan hasil pemeriksaan dengan spektrofotometer FTIR dan penelusuran literatur mengindikasikan senyawa Fraksi F6 ini memiliki gugus fungsi: karbonil C=O, ikatan O-H, ikatan C-O, ikatan rangkap dan C=C cincin aromatik, serta memiliki serapan panjang gelombang maksimum 423 nm saat diuji dengan spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan hasil pemeriksaan menggunakan uji fitokimia, spektrofotometer UV-Vis maupun FTIR mengindikasikan bahwa senyawa aktif inhibitor -glukosidase yang dihasilkan oleh isolat BWA65 merupakan senyawa flavonoid kelompok auron.

Kata kunci: aktinomiset endofit, inhibitor -glukosidase, diabetes melitus,

tanaman obat

Hak cipta milik IPB, tahun 2012

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis

dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

KAJIAN INHIBITOR -GLUKOSIDASE AKTINOMISET

ENDOFIT ASAL BROTOWALI (Tinospora crispa)

SRI PUJIYANTO

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor pada Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

Penguji Luar pada Ujian Tertutup : 1. Prof. drh. Dondin Sajuthi, PhD

2. Dr. Yanti, MSi

Penguji Luar pada Ujian Terbuka : 1. Dr. Raymond R. Tjandrawinata

2. Dr. Aris Tri Wahyudi

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Disertasi : Kajian Inhibitor -Glukosidase Aktinomiset Endofit Asal

Brotowali (Tinospora crispa)

Nama : Sri Pujiyanto

NRP : G361070031

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Yulin Lestari Ketua

Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc. Anggota

Dr. dr. Sri Budiarti Anggota

Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana,

Dr. Ir. Gayuh Rahayu Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr.

Tanggal Ujian:. Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahmat dan

karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan disertasi dengan

judul Kajian Inhibitor -Glukosidase Aktinomiset Endofit Asal Brotowali

(Tinospora crispa). Disertasi ini merupakan karya ilmiah penulis selama

mengikuti Program Doktor pada Program Studi Mikrobiologi, Sekolah

Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa karya disertasi ini tidak mungkin tercipta tanpa

bimbingan dari komisi pembimbing, untuk itu penulis menyampaikan

penghargaan yang setinggi-tingginya serta ucapan terimakasih kepada: Dr. Ir.

Yulin Lestari selaku ketua komisi pembimbing serta Prof. Dr. Ir. Antonius

Suwanto, MSc, Dr. dr. Sri Budiarti dan Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS

selaku anggota komisi pembimbing atas segala bimbingan, arahan, perhatian,

nasehat, motivasi serta keteladanan yang telah diberikan kepada penulis mulai

dari awal pemilihan tema penelitian, selama pelaksanaan penelitian hingga

penulisan disertasi.

Penelitian ini didanai oleh Hibah Penelitian Pascasarjana a.n. Dr. Ir. Yulin

Lestari, serta sebagian dari Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS), untuk

itu penulis menyampaikan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya.

Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Prof. drh. Dondin Sajuthi,

PhD dari PS Satwa Primata, IPB dan Dr. Yanti, MSi dari Fakultas Teknobiologi

Universitas Atmajaya (selaku penguji luar pada sidang tertutup), Prof. Dr. Okky

Setyawati Dharmaputra (selaku wakil PS Mikrobiologi), drh. Sulistiyani, MSc,

PhD (selaku wakil Dekan FMIPA) serta Dr. Ir. Aris Tri Wahyudi, MSi dari PS

Mikrobiologi, IPB dan Dr. Raymond R. Tjandrawinata dari PT. DEXA MEDICA

(selaku penguji luar pada sidang terbuka), Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena

(selaku wakil PS Mikrobiologi/Dept. Biologi) dan Dr. Ir. Sri Nurdiati (Dekan FMIPA

IPB) atas saran-saran yang diberikan untuk kesempurnaan penulisan disertasi ini.

Penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada Dr. Ir. Gayuh Rahayu

selaku ketua PS Mikrobiologi serta seluruh staf pengajar PS Mikrobiologi atas

curahan ilmu selama menempuh studi di PS Mikrobiologi SPs IPB. Penulis juga

mengucapkan terimakasih kepada Kepala Bagian Mikrobiologi Departemen

Biologi dan Kepala Bagian Kimia Analitik Departemen Kimia, Fakultas MIPA IPB

yang telah memberi ijin penulis untuk melaksanakan penelitian ini. Kepada

seluruh tehnisi Lab. Mikrobiologi, Dept. Biologi dan Lab. Kimia Analitik, Dept.

Kimia dan PS Biofarmaka, penulis menyampaikan terimakasih atas segala

bantuannya dalam penyelesaian penelitian ini. Kepada seluruh mahasiswa S3,

S2 dan S1 sesama peneliti di Lab Mikrobiologi, penulis sampaikan terimakasih

atas kerjasama yang baik dan saling pengertiannya.

Kepada teman seperjuangan Dr. Ratih Dewi Hastuti dan Dr. Desniar serta

teman-teman dari Undip Semarang, Dr. Sunarno, Dr. Jumari, Dr. Sri Widodo

Agung Suedy dan Dr. Fuad Muhammad, penulis sampaikan terimakasih atas

diskusi-diskusi, kebersamaan dan bantuannya dalam penyelesaian studi ini.

Semoga kebersamaan ini tetap terjaga selamanya.

Kepada kedua orang tua penulis, Bapak Dwijosumarto dan Ibu Suresmi,

juga adik Sri Ristini dan keluarga, terimakasih atas doa yang tulus tiada henti

yang selalu mengiringi setiap langkah untuk penyelesaian studi S3 ini. Kepada

almarhum Bapak/Ibu mertua, penulis sampaikan terimakasih atas doa dan

curahan waktu untuk merawat anak-anak sebelum meninggalkan kami

selamanya. Kepada keluarga tercinta, istriku Nining Indrawati, SKom, MAB dan

anak-anakku Annisa Ismatul Jannah, Nadia Rizka Izzati dan Royan Rasyid

Habibie terima kasih atas kesabaran, pengorbanan, pengertian, dorongan dan

doa yang senantiasa menemani perjalanan S3 ini. Karya ini saya persembahkan

kepada keluarga tercinta.

Penulis menyadari bahwa tiada karya yang sempurna, untuk itu segala

masukan dan saran perbaikan senantiasa penulis harapkan. Semoga karya

ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2012

Sri Pujiyanto

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 13 Januari 1973, sebagai anak

pertama dari Bapak Dwijo Sumarto dan Ibu Suresmi. Pendidikan Sarjana Biologi

dalam bidang Mikrobiologi diselesaikan di Universitas Diponegoro pada tahun

1998. Pendidikan Magister Sains dalam bidang Mikrobiologi diselesaikan di

Institut Pertanian Bogor pada tahun 2001. Selanjutnya, penulis mendapatkan

kesempatan melanjutkan sekolah S3 di Program Studi Mikrobiologi, Sekolah

Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007 melalui program

Beasiswa Pendidikan Pasca Sarjana (BPPS) Direktorat Jenderal Pendidikan

Tinggi. Penulis adalah staf pengajar di Jurusan Biologi, FMIPA Universitas

Diponegoro, Semarang. Hingga kini, penulis tercatat sebagai anggota himpunan

profesi Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (PERMI). Selama menjadi

mahasiswa S3, penulis telah mempresentasikan sebagian dari penelitian

disertasi pada International Seminar of Indonesian Society for Microbiology,

tahun 2010 di Bogor, dengan judul The Activity of -Glucosidase Inhibitor of

Endophytic Actinomycetes Isolated from Indonesian Diabetic Medicinal Plants.

Pada tahun 2012, sebagian hasil penelitian ini telah dipublikasikan di

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Vol 4, tahun

2012, dengan judul lpha Glucosidase Inhibitor Activity and Characterization of

Endophytic Actinomycetes Isolated from some Indonesian Diabetic Medicinal

Plants.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL. xiii

DAFTAR GAMBAR. xv

DAFTAR LAMPIRAN.. xvi

PENDAHULUAN

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah.. 6

Tujuan Penelitian 6

Manfaat Penelitian. 6

Novelty. 7

Hipotesis.. 7

TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Diabetes Melitus 9

Inhibitor -Glukosidase dalam Pengobatan Diabetes. 9

Tanaman Obat Diabetes... 13

Tanaman Brotowali ... 16

Mikrob Endofit. 18

Aktinomiset Endofit dan Potensinya 19

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian.. 23

Isolasi Aktinomiset Endofit 23

Seleksi dan Uji Penghambatan Enzim -Glukosidase. 24

Peran Aktinomiset Endofit dalam Menghasilkan inhibitor -Glukosidase

24

Penentuan Waktu Produksi Optimum. 25

Identifikasi Isolat Terpilih.. 25

Karakterisasi Morfologi Isolat... 26

Deteksi Gen Sedoheptulosa-7-Fosfat Siklase.. 26

Isolasi dan Identifikasi Senyawa Inhibitor -Glukosidase....... 27

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Aktinomiset Endofit 33

Penapisan Aktinomiset Endofit Penghasil Inhibitor -Glukosidase....... 35

Karakterisasi Morfologi Isolat BWA65 40

Identifikasi Isolat Aktinomiset... 41

Deteksi Gen Sedoheptulosa-7-Fosfat Siklase.. 43

Ekstraksi Senyawa Inhibitor 45

Uji Aktivitas Inhibitor -Glukosidase Ekstrak.. 46

Anaisis Fitokimia Ekstrak Etil Asetat 48

Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom. 49

Pencarian Eluen Terbaik 50

Uji Inhibisi -Glukosidase Fraksi.. 52

Karakterisasi dan Identifikasi Senyawa Inhibitor -Glukosidase .. 55

Pemeriksaan dengan KLT Analitik 55

Pengaruh Konsentrasi Substrat 57

Identifikasi dengan Uji Fitokimia... 59

Analisis dengan Spektrofotometer UV-Vis.. 60

Identifikasi Gugus Fungsi dengan FTIR 64

Temuan Penting dan Implikasinya 66

KESIMPULAN DAN SARAN. 69

DAFTAR PUSTAKA... 71

LAMPIRAN...... 79

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Beberapa organisme penghasil senyawa inhibitor -glukosidase... 13

2 Kajian tanaman obat diabetes di berbagai negara..

14

3 Kajian aktinomiset endofit pada beberapa tanaman dan potensinya...

21

4 Komposisi reaksi PCR:amplifikasi gen 16S rRNA...

25

5 Komposisi reaksi PCR amplifikasi gen Sedoheptulosa-7-fosfat siklase.

27

6 Isolat aktinomiset endofit dari berbagai tanaman obat diabetes dan aktivitas inhibitor -glukosidase yang dihasilkannya..

35

7 Karakteristik kultur isolat BWA65 pada berbagai media.

40

8 Hasil analisis sekuen DNA hasil amplifikasi gen penyandi sedoheptulosa-7-fosfat siklase isolat BWA65 menggunakan program BLASTX..

45

9 Hasil ekstraksi senyawa inhibitor dengan berbagai pelarut

46

10 Aktivitas inhibitor -glukosidase berbagai ekstrak kultur aktinomiset BWA65 ..

47

11 Kandungan fitokimia ekstrak etil asetat kultur BWA65

49

12 Hasil percobaan KLT untuk menentukan pelarut terbaik....

50

13 Hasil fraksinasi senyawa menggunakan kromatografi kolom gel silika

52

14 Aktivitas inhibitor -glukosidase hasil fraksinasi kolom...

52

15 Aktivitas inhibitor -glukosidase beberapa senyawa dibanding acarbose

54

16 Hasil KLT analitik Fraksi F6 dengan beberapa eluen..

57

17 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kemampuan inhibitor -glukosidase hasil fraksinasi..

57

18 Rentangan serapan spektrum UV-Vis flavonoid .....

62

19 Ciri spektrum golongan flavonoid utama ..

62

20 Identifikasi gugus fungsi fraksi F6 dengan FTIR. 65

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Diagram alur kerangka pemikiran penelitian ......

5

2 Struktur senyawa acarbose

10

3 Jumlah isolat aktinomiset endofit isolat dari tanaman obat...........

33

4 Jumlah isolat aktinomiset endofit berdasarkan asal bagian tanaman.....

34

5 Aktivitas inhibitor -glukosidase oleh aktinomiset endofit tanaman T. crispa.

38

6 Aktivitas inhibitor -glukosidase yang dihasilkan oleh tanaman hasil kultur jaringan tanaman, tanaman dari alam dan isolat aktinomiset endofit ...

39

7 Morfologi isolat aktinomiset endofit BWA65 yang diamati pada media Oatmeal Agar, mikroskop cahaya dan SEM

41

8 Pohon filogenetik isolat BWA65 berdasarkan sekuen 16S rDNA............

42

9 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer VOG-F dan VOG-R .......

44

10 Nilai IC50 berbagai ekstrak kultur BWA65. 48

11 Kromatografi lapis tipis dengan variasi campuran pelarut pengembang heksan: etil asetat 1:4..

51

12 Nilai IC50 dari fraksi aktif hasil kromatografi kolom gel silika..

53

13 Aktivitas inhibitor -glukosidase fraksi terpilih (Fraksi F3 dan Fraksi F6) dibandingkan acarbose.

55

14 Hasil kromatografi lapis tipis Fraksi F6 menggunakan berbagai jenis eluen ..

56

15 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kemampuan inhibitor -glukosidase hasil fraksinasi.

58

16 Kurva Lineweaver-Burke aktifitas -glukosidase

58

17 Spektrum spektrofotometer UV-Vis Fraksi F6....................

61

18 Spektrum spektrofotometer UV-Vis Fraksi F3 .

61

19 Spektrum FTIR Fraksi F6

54

20 Struktur dasar senyawa auron 65 21

Tanaman brotowali...

87

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Uji aktivitas inhibitor dan penentuan nilai IC50 ekstrak ...

79

2 Hasil uji aktivitas hasil kromatografi kolom dan penentuan nilai IC50..........

81

3 Hasil sekuensing gen 16S rRNA isolat BWA65...

83

4 Hasil analisis BLAST sekuen gen 16S rRNA isolat BWA65.. 85

5 Tanaman brotowali... 87

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Diabetes melitus (DM) merupakan salah satu masalah utama kesehatan

dunia. Menurut perkiraan, penderita diabetes di seluruh dunia pada tahun 2025

mendatang akan mencapai 300 juta orang. Sebagian besar (lebih dari 95%)

penderita diabetes merupakan penderita diabetes tipe 2 atau sering disebut non-

insulin dependent diabetes (Bailey & Day 2003). DM atau kencing manis

merupakan penyebab kematian tertinggi di antara penyakit non infeksi lainnya.

Sekitar 1.08 juta kematian akibat penyakit kardiovaskular (pembuluh darah) yang

terjadi di seluruh dunia setiap tahunnya, sebanyak 851 ribu di antaranya

merupakan pasien DM.

Gejala penyakit diabetes adalah adanya keadaan hiperglikemia

(peningkatan kadar gula darah) yang terus-menerus dan bervariasi, terutama

setelah makan. Penyakit diabetes mellitus dapat menyebabkan adanya

komplikasi pada tingkat lanjut. Hiperglikemia dapat menyebabkan dehidrasi dan

ketoasidosis. Komplikasi jangka lama termasuk penyakit kardiovaskular,

kegagalan kronis ginjal, kerusakan retina yang dapat menyebabkan kebutaan,

serta kerusakan saraf yang dapat menyebabkan impotensi dan gangren dengan

risiko amputasi.

Penyakit DM merupakan penyakit yang tidak dapat disembuhkan, tetapi

dapat dikontrol. Pengobatan penyakit diabetes pada prinsipnya adalah suatu

usaha untuk menjaga agar kadar glukosa darah dapat dipertahankan pada

kondisi normal (80-120 mg/dl). Berbagai pilihan obat diabetes baik modern

maupun tradisional telah dikenal di masyarakat. Saat ini terdapat berbagai

pilihan obat diabetes oral yang tersedia untuk penderita diabetes tipe 2 (Bailey &

Day 2003).

Penggunaan inhibitor enzim dalam pengobatan penyakit telah lazim

digunakan dan mengalami perkembangan yang pesat. Nilai ekonomi obat yang

tergolong inhibitor enzim diperkirakan mencapai 95.57 milyar dolar pada tahun

2006 (Copeland 2005). Demikian juga dalam pengobatan diabetes, salah satu

target obat diabetes adalah menghambat enzim -glukosidase. Enzim -

glukosidase (EC 3.2.1.20) ini berperan dalam pencernaan karbohidrat komplek

(amilum) menjadi glukosa di dalam usus halus. Enzim ini menghidrolisis ikatan -

1,4-D-glukosa dengan membebaskan molekul glukosa. Dengan dihambatnya

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Hiperglisemia&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Gula_darahhttp://id.wikipedia.org/wiki/Dehidrasihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Ketoasidosis&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Penyakit_kardiovaskular&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kegagalan_kronis_ginjal&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Retinahttp://id.wikipedia.org/wiki/Kebutaanhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sarafhttp://id.wikipedia.org/wiki/Impotensihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gangren&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Amputasi

2

aktivitas enzim ini, maka asupan glukosa dari usus ke dalam darah dapat

dikurangi. Senyawa aktif yang memiliki aktivitas seperti ini adalah inhibitor -

glukosidase. Beberapa senyawa kimia yang telah diketahui merupakan inhibitor

-glukosidase antara lain: pradimicin (Yosuke et al. 1992), deoxynojirimycin

(Fischer et al. 1995), acarbose (Hemker et al. 2001), curcumin (Du et al. 2006)

dan ceptezole, suatu antibiotik beta laktam (Lee et al. 2007). Beberapa ekstrak

tanaman seperti: Pinus densiflora (Kim et al. 2003), Phalleria macrocarpa

(Sugiwati et al. 2006) dan Terminalia sp. (Anam et al. 2009) juga diketahui

memiliki aktivitas inhibitor -glukosidase. Selain tanaman, organisme lain seperti

cendawan Ganoderma lucidum (Kim & Nho 2004) dan alga (Cannell et al. 1988)

serta aktinomiset juga diketahui memiliki aktivitas inhibitor -glukosidase.

Beberapa aktinomiset yang diketahui menghasilkan inhibitor -glukosidase

adalah: Actinomadura verrucosospora (Yosuke et al. 1992), Actinoplanes sp.

(Gown 2006), Streptomyces clavuligerus (Lee et al. 2007) dan Micromonospora

sp. (Suthindhiran et al. 2009).

Senyawa inhibitor -glukosidase yang telah sukses dikomersialkan

adalah acarbose, suatu pseudooligosakarida yang memiliki struktur mirip glukosa.

Senyawa ini dihasilkan oleh Actinoplanes sp., suatu aktinomiset yang diisolasi

dari suatu daerah di Kenya dan dikomersialkan oleh perusahaan Bayer, Jerman

dengan nilai jual 379 juta US dolar pada tahun 2004 (Gown 2006).

Pengobatan diabetes secara tradisional pada umumnya dengan

memanfaatkan berbagai jenis tanaman yang memiliki kandungan bahan aktif

yang dapat menurunkan kadar gula dalam darah. Berbagai tanaman obat yang

secara empiris diketahui memiliki khasiat sebagai agen hipoglikemia antara lain

adalah: brotowali (Tinospora crispa), pinus (Pinus densiflora), lidah buaya (Alloe

vera), bawang putih (Allium sativum), bawang merah (Allium cepa), stevia

(Stevia rebaudiana), ubi jalar (Ipomoea batatas), sambiloto (Andrographis

paniculata), mengkudu (Morinda citrifolia), delima (Punica granatum), kelapa

(Cocos nucifera), jambelang (Eugenia jambolana), mahkota dewa (Phaleria

macrocarpha), ginseng (Panax sp), buah merah (Pandanus conoideus) dan pare

(Momordica charantia) (Subroto 2006; Klein et al. 2007; Bnouham et al. 2006).

Brotowali (Tinospora crispa) telah lama di kenal oleh masyarakat

tradisional Indonesia sebagai bahan pembuatan jamu yang di campur dengan

tanaman-tanaman herbal lainnya. Brotowali merupakan tanaman herba (perdu)

yang hampir semua bagian dari tubuhnya di manfaatkan sebagai obat serba

3

guna yang dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit seperti: kencing

manis, hipertensi, dan demam. Kajian ilmiah terhadap tanaman brotowali sebagai

obat diabetes telah dilakukan para peneliti. Noor dan Ashcroft (1998) melaporkan

bahwa ekstrak T. crispa mampu menstimulasi peningkatan sekresi insulin,

sehingga dapat berperan sebagai antihiperglikemia. Noipa dan Ninlaaesong

(2011) melaporkan bahwa ekstrak T. crispa dapat meningkatkan laju transpor

glukosa ke dalam sel. Uji klinis oleh Sriyapai et al. (2009) menunjukkan bahwa

konsumsi serbuk T. crispa dapat menurunkan kadar gula darah setelah makan.

Chougale et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak tanaman T.cordifolia memiliki

aktivitas inhibitor -glukosidase. Patela dan Mishrab (2012) menemukan tiga

senyawa dari tanaman Tinospora cordifolia yang memiliki kemampuan inhibitor

-glukosidase, yaitu jatrorrhizine, palmatine dan magnoflorine. Senyawa-

senyawa tersebut memiliki nilai IC50 berturut-turut sebesar 22.05, 38.42 and 7.6

g/mL untuk jatrorrhizine, palmatine dan magnoflorine. Hasil uji in vivo juga

menunjukkan adanya penekanan yang signifikan terhadap kenaikan kadar

glukosa plasma darah oleh ketiga senyawa tersebut pada konsentrasi 20 mg/kg

berat badan. Senyawa magnoflorine merupakan senyawa paling potensial

sebagai inhibitor -glukosidase di antara ketiga senyawa yang ditemukan

tersebut.

Selama ribuan tahun, senyawa bioaktif yang berasal dari alam telah

memegang peran penting dalam pengobatan dan upaya mempertahankan

kesehatan manusia. Senyawa-senyawa tersebut dapat dihasilkan dari berbagai

sumber seperti tanaman, hewan maupun mikroorganisme (Chin et al. 2006).

Bahan bioaktif alami selain dapat digunakan sebagai obat secara langsung, juga

berperan sebagai bahan baku dalam pembuatan senyawa sintetik (Topliss et al.

2002). Tanaman, merupakan salah satu sumber yang sangat penting dalam

upaya pengobatan dan upaya mempertahankan kesehatan masyarakat. Sampai

saat ini menurut perkiraan badan kesehatan dunia (WHO), 80% penduduk dunia

masih menggantungkan dirinya pada pengobatan tradisional termasuk

penggunaan obat yang berasal dari tanaman. Sampai saat ini seperempat dari

obat-obat modern yang beredar di dunia berasal dari bahan aktif yang diisolasi

dan dikembangkan dari tanaman (Radji 2005).

Indonesia yang memiliki keanekaragaman hayati terbesar kedua di dunia

berpotensi besar untuk mengembangkan obat herbal yang berbasis pada

tanaman obat. Lebih dari 1000 spesies tumbuhan dapat dimanfaatkan sebagai

4

bahan baku obat. Tumbuhan tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan

struktur molekul dan aktivitas biologis yang beraneka ragam serta memiliki

potensi yang sangat baik untuk dikembangkan menjadi obat berbagai penyakit

(Radji 2005).

Permasalahan yang muncul dari pemakaian obat herbal adalah

bagaimana menjaga tingkat produksi obat herbal tersebut dengan bahan baku

yang terbatas karena sebagian besar bahan baku obat herbal diambil dari

tanaman induknya. Terdapat kekhawatiran bahwa sumberdaya hayati ini akan

musnah karena adanya kendala dalam budidayanya. Bahkan disinyalir bahwa

bahan obat herbal yang diproduksi dan diedarkan di Indonesia saat ini sebagian

besar bahan bakunya sudah mulai diimpor dari beberapa negara lain (Radji

2005).

Mikrob endofit merupakan mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman

pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan tanaman

tanpa membahayakan inangnya. Mikrob endofit ini dapat berupa cendawan dan

bakteri termasuk aktinomiset. Menurut Tan dan Zou (2001) setiap tanaman

tingkat tinggi dapat mengandung sejumlah mikrob endofit yang mampu

menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder serupa dengan inangnya

yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic

recombination). Beberapa penelitian telah menunjukkan hasil yang mendukung

pendapat tersebut. Strobell dan Daisy (2003) melaporkan bahwa Taxomyces

andreanae endofit pada tanaman Taxus menghasilkaan paclitaxel. Paclitaxel

adalah senyawa antikanker yang dihasilkan juga oleh tanaman Taxus brevivolia.

Taechowisan et al. (2007) melaporkan Streptomyces aureofaciens, endofit pada

tanaman jahe menghasilkan senyawa arylcoumarin yang memiliki aktivitas

antitumor, dimana tanaman jahe juga memiliki senyawa anti tumor seperti

dilaporkan oleh Katiyar et al. (1996). Penelitian Castillo et al. (2002)

menunjukkan bahwa Streptomyces NRRL 30562 endofit pada tanaman Kennedia

nigriscans mampu menghasilkan antibiotik spektrum luas. Tanaman ini secara

tradisional digunakan suku aborigin untuk mencegah infeksi mikrob pada luka.

Aktinomiset telah lama diketahui sebagai sumber berbagai senyawa

bioaktif yang telah dimanfaatkan dalam berbagai bidang seperti kesehatan,

pertanian, maupun industri. Sekitar 70% senyawa bioaktif baru dihasilkan oleh

kelompok aktinomiset (Takahashi 2004). Berdasarkan fenomena tersebut, mikrob

endofit khususnya aktinomiset pada tanaman obat diharapkan dapat menjawab

5

Diabetes mellitus (DM) merupakan masalah utama kesehatan

(WHO 1999)

permasalahan keterbatasan pemakaian tanaman obat sebagai sumber senyawa

bioaktif. Eksplorasi mikrob endofit diharapkan dapat menghasilkan metabolit

sekunder penting yang memiliki khasiat sama dengan metabolit yang dihasilkan

tanaman inangnya. Beberapa tanaman obat khas Indonesia seperti: brotowali,

sambiloto, mahkota dewa, ciplukan, dan lain-lain telah diketahui secara empiris

memiliki khasiat sebagai obat diabetes. Tanaman obat diabetes merupakan

sumber potensial penghasil inhibitor -glukosidase (Benalla et al 2010).

Berdasarkan pendapat Tan dan Zou (2001) yang menyatakan bahwa endofit

dapat menghasilkan senyawa yang sama dengan senyawa yang dihasilkan

tanaman inangnya maka tanaman obat diabetes merupakan sumber potensial

isolat penghasil inhibitor -glukosidase. Isolat potensial dari tanaman obat

tersebut, diharapkan dapat digunakan untuk memproduksi senyawa inhibitor -

glukosidase secara mikrobiologis, dengan jumlah yang lebih banyak dan

kualitas yang lebih baik. Dengan demikian, penelitian tentang potensi mikrob

endofit terutama aktinomiset dari tanaman obat diabetes khususnya brotowali

untuk menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase yang berguna dalam

pengobatan penyakit diabetes perlu dilakukan. Kerangka pemikiran dari

penelitian ini secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Diagram alur kerangka pemikiran penelitian.

Aktinomiset sumber bioaktif terbesar (70%)

(Takahashi 2004)

Endofit mampu menghasilkan bioaktif sama dengan inangnya (Tan & Zou 2001; Strobel & Daisy 2003; Castillo et al. 2002)

Potensi aktinomiset endofit tanaman T. crispa sebagai penghasil

senyawa inhibitor -glukosidase

Pengobatan diabetes: menjaga glukosa darah tetap normal. Inhibitor alfa glukosidase menunda digesti karbohidrat (Bailey & Day 2003)

Brotowali secara empiris sebagai antidiabet, inhibitor -glukosidase (Subroto 2006; Chougale et al.

2009; Patela & Mishrab 2012)

Beberapa Aktinomiset menghasilkan inhibitor - glukosidase (Gown 2006; Lee et al. 2007; Suthindhiran et al. 2009)

6

Perumusan Masalah

Inhibitor -glukosidase dapat dihasilkan oleh berbagai organisme, yaitu

tanaman tingkat tinggi, alga, cendawan, bakteri non aktinomiset dan aktinomiset.

Tanaman dapat mengandung mikrob endofit yang mampu menghasilkan

senyawa biologi atau metabolit sekunder serupa dengan tanaman inangnya.

Beberapa tanaman obat, khususnya T. crispa secara empiris diketahui memiliki

aktivitas antidiabetes dan menghasilkan -glukosidase inhibitor. Dengan

demikian, dari tanaman obat yang telah diketahui memiliki aktivitas sebagai

antidiabetes serta diketahui menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase akan

dapat diperoleh isolat endofit khususnya aktinomiset yang dapat menghasilkan

senyawa inhibitor -glukosidase pula. Berdasarkan hal tersebut, dapat

dirumuskan masalah sebagai berikut:

1. Apakah dari tanaman T. crispa yang telah diketahui memiliki khasiat

sebagai obat diabetes dapat diperoleh isolat aktinomiset endofit yang

dapat menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase?

2. Bagaimanakah karakteristik dan identitas isolat aktinomiset endofit

penghasil inhibitor -glukosidase yang diperoleh dari tanaman T. crispa

tersebut?

3. Bagaimana karakteristik senyawa inhibitor -glukosidase yang dihasilkan

oleh isolat aktinomiset endofit tersebut?

Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mendapatkan isolat aktinomiset endofit dari tanaman T. crispa yang telah

dikenal memiliki khasiat sebagai antidiabetes, yang berpotensi sebagai

penghasil senyawa inhibitor -glukosidase.

2. Mengkarakterisasi dan mengidentifikasi isolat aktinomiset endofit

penghasil senyawa inhibitor -glukosidase terpilih.

3. Mengkarakterisasi dan mengidentifikasi senyawa inhibitor -glukosidase

yang dihasilkan oleh isolat aktinomiset endofit terpilih.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi landasan ilmiah untuk

memproduksi senyawa inhibitor -glukosidase secara mikrobiologis yang dapat

digunakan sebagai agen antihiperglikemia. Inhibitor -glukosidase memiliki nilai

7

komersial tinggi karena kebutuhan obat diabetes semakin meningkat seiring

dengan meningkatnya jumlah penderita diabetes.

Produksi senyawa inhibitor -glukosidase secara mikrobiologis ini

diharapkan lebih murah dan lebih efisien dibandingkan dengan cara mengekstrak

dari tanaman obat secara langsung karena dibutuhkan tanaman obat dalam

jumlah yang besar serta sulitnya penyeragaman kualitas bahan baku tanaman

obat. Dengan demikian, hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi terobosan

teknologi dalam penyediaan bahan obat diabetes khususnya di Indonesia.

Novelty

Berdasarkan penelusuran literatur yang telah dilakukan, hingga saat ini

belum ada laporan kajian tentang inhibitor -glukosidase dari aktinomiset endofit,

apalagi yang diisolasi dari tanaman T. crispa yang merupakan salah satu

tanaman obat tradisional di Indonesia. Beberapa informasi yang menyebutkan

adanya aktinomiset penghasil inhibitor -glukosidase di atas semuanya adalah

bukan aktinomiset endofit.

Dengan demikian penelitian ini memiliki unsur kebaharuan yang akan

menambah khasanah ilmu pengetahuan tentang potensi aktinomiset sebagai

penghasil senyawa bioaktif, khususnya senyawa inhibitor -glukosidase dari

aktinomiset endofit tanaman T. crispa.

Hipotesis Penelitian

Berdasar kerangka pemikiran dari uraian pada latar belakang bahwa:

a) inhibitor -glukosidase dapat dihasilkan oleh berbagai organisme, yaitu

tanaman tingkat tinggi, alga, cendawan, bakteri non aktinomiset dan

beberapa aktinomiset,

b) terdapat beberapa temuan penelitian yang menyatakan bahwa beberapa

mikrob endofit dapat menghasilkan senyawa yang serupa dengan

tanaman inangnya, dan

c) tanaman T. crispa diketahui memiliki aktivitas inhibitor -glukosidase,

maka dapat dirumuskan suatu hipotesis: aktinomiset endofit penghasil senyawa

inhibitor -glukosidase dapat diisolasi dari tanaman brotowali. Isolat aktinomiset

yang diperoleh mampu menghasilkan inhibitor -glukosidase secara in vitro.

8

9

TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Diabetes Melitus

Diabetes melitus (DM) atau dikenal sebagai kencing manis adalah

penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia (peningkatan kadar gula darah)

yang terus-menerus dan bervariasi, terutama setelah makan. Sumber lain

menyebutkan bahwa yang dimaksud dengan diabetes melitus adalah keadaan

hiperglikemia kronik disertai berbagai kelainan metabolik akibat gangguan

hormonal, yang menimbulkan berbagai komplikasi kronik pada mata, ginjal, dan

pembuluh darah, disertai lesi pada membran basalis (Bailey & Day 2003).

Semua jenis diabetes melitus memiliki gejala yang mirip dan komplikasi

pada tingkat lanjut. Hiperglikemia sendiri dapat menyebabkan dehidrasi dan

ketoasidosis. Komplikasi jangka lama termasuk penyakit kardiovaskular,

kegagalan kronis ginjal (penyebab utama dialisis), kerusakan retina yang dapat

menyebabkan kebutaan, serta kerusakan saraf yang dapat menyebabkan

impotensi dan gangren dengan risiko amputasi. Komplikasi yang lebih serius

lebih umum terjadi bila kadar gula darah tidak dikendalikan dengan baik (WHO

1999).

Penyebab diabetes yang utama adalah karena kurangnya produksi insulin

(DM tipe 1, yang pertama dikenal), atau kurang sensitifnya jaringan tubuh

terhadap insulin (diabetes melitus tipe 2, bentuk yang lebih umum). Selain itu,

terdapat jenis diabetes melitus yang juga disebabkan oleh resistensi insulin yang

terjadi pada wanita hamil. Tipe 1 membutuhkan penyuntikan insulin, sedangkan

tipe 2 diatasi dengan pengobatan oral dan hanya membutuhkan insulin bila

obatnya tidak efektif. Diabetes melitus pada kehamilan umumnya sembuh

dengan sendirinya setelah persalinan (WHO 1999).

Inhibitor -Glukosidase dalam Pengobatan Diabetes

Inhibitor - glukosidase merupakan obat diabetes yang digunakan per

oral untuk pengobatan diabetes melitus tipe 2 yang bekerja dengan cara

mencegah digesti karbohidrat terutama amilum menjadi glukosa. Karbohidrat

secara normal akan dikonversi menjadi gula sederhana atau monosakarida yang

dapat diabsorbsi melalui instestinum. Dengan demikian inhibitor - glukosidase

berperan dalam mengurangi pengaruh karbohidrat terhadap kandungan gula

darah.

http://id.wikipedia.org/wiki/Penyakithttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Hiperglisemia&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Gula_darahhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Hiperglikemia&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Matahttp://id.wikipedia.org/wiki/Ginjalhttp://id.wikipedia.org/wiki/Pembuluh_darahhttp://id.wikipedia.org/wiki/Lesihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Membran_basalis&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gejala&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Dehidrasihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Ketoasidosis&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Penyakit_kardiovaskular&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kegagalan_kronis_ginjal&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Dialisis_ginjal&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Retinahttp://id.wikipedia.org/wiki/Kebutaanhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sarafhttp://id.wikipedia.org/wiki/Impotensihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gangren&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Amputasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Insulinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Hamilhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Persalinan&action=edit&redlink=1

10

Inhibitor - glukosidase digunakan untuk mempertahankan kadar gula

agar tidak terjadi hiperglikemia di dalam diabetes melitus type 2. Obat ini dapat

digunakan sebagai monoterapi atau digunakan bersama obat diabetes lainnya.

Inhibitor - glukosidase dapat berupa senyawa sakarida yang berperan sebagai

inhibitor kompetitif dari enzim yang diperlukan untuk mendigesti karbohidrat,

khususnya enzim - glukosidase yang terdapat di dalam fili-fili usus kecil. Enzim

-glukosidase yang terdapat pada membran sel-sel usus kecil menghidrolisis

oligosakarida, trisakarida dan disakarida menjadi glukosa dan monosakarida

lainnya yang terdapat di dalam usus kecil.

Salah satu contoh inhibitor -glukosidase adalah acarbose. Acarbose

merupakan inhibitor -glukosidase yang telah diterima di Amerika untuk

pengobatan diabetes tipe 2. Efek langsung dari antidiabetes ini adalah menunda

digesti karbohidrat komplek dan disakarida menjadi monosakarida yang mudah

diabsorbsi yaitu glukosa. Hal ini dapat tercapai oleh adanya penghambatan

reversibel terhadap enzim -glukosidase (termasuk sukrase dan maltase) yang

terdapat di dalam duodenum. Pada pasien diabetes tipe 2, enzim ini

menghambat penundaan absorbsi glukosa sebagai kelanjutan proses

pencernaan karbohidrat kompleks. Acarbose tidak menimbulkan pengaruh

secara langsung terhadap resistensi insulin atau pengambilan glukosa yang

distimulasi insulin pada manusia (Clark 1998).

Acarbose merupakan pseudooligosakarida yang dihasilkan oleh genus

Actinoplanes dan telah digunakan untuk pengobatan pasien diabetes. Senyawa

ini sangat efektif untuk menghambat kerja enzim -amilase, -glukosidase, dan

sukrase. Struktur senyawa acarbose dapat dilihat pada Gambar 2 berikut.

Gambar 2 Struktur senyawa acarbose (Zhang et al. 2002).

http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-glucosidase

11

Inhibitor enzim memiliki nilai potensi digunakan dalam pengendalian dan

pengobatan berbagai jenis penyakit. Pengendalian kinetika pencernaan

karbohidrat dan absorbsi glukosa dapat digunakan sebagai sarana mencegah

dan terapi terhadap penyakit diabetes, obesitas, hiperlipoproteinemia dan

hiperlipidemia. Kaitannya dengan hal ini, inhibitor -glukosidase merupakan

enzim hidrolase amilolitik yang membebaskan glukosa dari ujung non reduksi

dari molekul polisakarida dan oligosakarida (Kim & Nho 2004).

Senyawa inhibitor -glukosidase SKG-3 telah berhasil diisolasi dari

Ganoderma lucidum dengan fraksinasi menggunakan berbagai teknik

kromatografi. Senyawa yang telah dipurifikasi dikonfirmasi menggunakan

kromatografi lapis tipis (KLT) dan High Pressure Liquid Chromatography (HPLC).

Senyawa SKG-3 murni menunjukkan spot tunggal pada pelat TLC dan

menunjukkan satu puncak pada HPLC dengan waktu retensi 13 menit. Pengaruh

konsentrasi SKG-3 terhadap daya hambat terhadap berbagai glikosidase diuji

dan hasilnya secara jelas menunjukkan bahwa SKG-3 potensial dalam

menghambat -glukosidase yang ditunjukkan nilai IC50 sebesar 4,6 g/ml. SKG-3

tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap beta glukosidase, beta

galaktosidase atau -mannosidase yang diujikan pada konsentrasi 100 g/ml

(Kim & Nho 2004).

Daya hambat SKG-3 terhadap -glukosidase akan meningkat dengan

melakukan preinkubasi senyawa SKG-3 dengan enzim mengindikasikan bahwa

senyawa ini bereaksi lambat dengan enzim -glukosidase. Senyawa SKG-3

dapat dipisahkan dari -glukosidase dengan dialisis. Ketika -glukosidase

dicampur dengan sejumlah SKG-3 yang menghasilkan penghambatan 90%,

campuran reaksi ditempatkan pada kantong dialisis, hampir semua enzim dapat

diperoleh kembali dan memiliki aktivitas yang tinggi. Hasil ini menunjukkan

bahwa penghambatan SKG-3 terhadap - glukosidase bersifat reversibel (Kim &

Nho 2004).

Penelitian Xiancui et al. (2005) menunjukkan bahwa beberapa spesies

makro alga juga dapat menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase. Ekstrak

kasar makroalga seperti Rhodomela confervoides, Gracillaria textorii, Plocamium

telfairie, Ulva pertusa dan Enteromorpha intestinalis menunjukkan adanya

penghambatan yang kuat terhadap -glukosidase pada konsentrasi 79,6 g/ml.

Hasil penelitian Cannell et al. (1988) diperoleh senyawa pentagalloyl-glucose,

suatu inhibitor -glukosidase dari alga air tawar Spirogyra varians. Aktivitas

12

inhibitor - glukosidase juga ditunjukkan dari ekstrak air douchi (produk makanan

fermentasi kedelai dari Cina). Kultur murni Aspergillus oryzae yang digunakan

untuk fermentasi douchi di laboratorium ini, mampu menghasilkan inhibitor -

glukosidase lebih tinggi dari pada isolat Actinomucor elegans dan Rhizopus

arrhizus (Chen et al. 2004).

Suatu antibiotik beta laktam ceftezole, dilaporkan memiliki aktivitas

menghambat -glukosidase. Uji in vitro terhadap -glukosidase, senyawa ini

menunjukkan adanya hambatan yang reversibel. Senyawa SKG-3 diketahui juga

merupakan hambatan non kompetitif. Percobaan pada mencit diabet

menunjukkan bahwa pemberian ceptezole (10 mg/kg/hari) dapat menurunkan

kadar glukosa darah sebesar 30% dalam waktu 20 menit setelah pemberian

obat tersebut (Lee at al. 2007).

Senyawa inhibitor -glukosidase juga dapat dihasilkan oleh binatang spon

laut Penares sp. Senyawa yang dihasilkan hewan tersebut adalah penarolide

sulfat A1 dan A2, suatu makrolida yang merupakan kelompok senyawa poliketida.

Senyawa tersebut memiliki nilai IC50 berturut-turut 1.2 dan 1.5 g/ml (Nakao et

al. 2000). Kajian inhibitor -glukosidase pada beberapa organisme diringkaskan

pada Tabel 1.

Berdasarkan informasi pada tabel tersebut dapat dilihat bahwa inhibitor -

glukosidase dapat dihasilkan oleh berbagai kelompok organisme seperti:

tanaman, alga, cendawan, aktinomiset maupun bakteri non aktinomiset. Dari

tabel tersebut terlihat bahwa kelompok aktinomiset telah cukup banyak

dilaporkan mampu menghasilkan senyawa inhibitor -glukosidase. Namun

demikian, dari semua aktinomiset penghasil inhibitor -glukosidase tersebut,

tidak satupun yang dilaporkan sebagai aktinomiset endofit. Berdasarkan fakta

tersebut terbuka peluang yang besar untuk mendapatkan isolat-isolat baru

aktinomiset penghasil inhibitor -glukosidase, khususnya aktinomiset endofit

yang diisolasi dari tanaman obat.

13

Tabel 1 Beberapa organisme penghasil senyawa inhibitor - glukosidase

No Organisme penghasil

Bahan aktif Pustaka

Tumbuhan 1 Pisonia alba ekstrak etanol Sunil et al. 2009 2 Terminalia sp. ekstrak etanol 96% Anam et al. 2009 3 Bergenia ciliata ekstrak kasar Bhandari et al. 2008 4 Piptadenia africana piptadienol Mbouangouere et al.

2008 5 Curcuma longa curcumin Du et al. 2006 6 Pinus densiflora ekstrak etanol 70% Kim et al. 2003

Cendawan 1 Ganoderma lucidum SKG-3, senyawa belum

diidentifikasi Kim et al. 2004

2 Penicillium sp Cyclo (dehydroala-L-Leu) Kwoon et al. 2000

Alga 1 Ecklonia stolonifera phlorotannin Moon et al. 2011 2 Spirogyra varians pentagalloyl glucosa Cannell et al. 1988

Aktinomiset 1 Micromonospora ekstrak etil asetat Suthindhiran et al.

2009

2 Streptomyces clavurigus

ceftezole, suatu antibiotik beta laktam

Lee et al. 2007

3 Actinoplanes sp. acarbose Hemker et al. 2001 4 Actinomadura

verrucospora pradimicin Q, C24H16O10 Yosuke et al. 1992

Bakteri non aktinomiset 1 Bacillus subtilis Ekstrak kasar Zhu et al. 2008

Tanaman Obat Diabetes

Bnouham et al. (2006) melaporkan bahwa setidaknya ada 176 spesies

tanaman yang berasal dari 84 famili yang telah dikaji di berbagai negara dan

menunjukkan potensi yang tinggi di dalam pengobatan penyakit diabetes.

Beberapa tanaman yang sangat potensial tersebut antara lain adalah famili:

Leguminoseae (11 spesies), Lamiaceae (7 spesies), Liliaceae (8 spesies),

Cucurbitaceae (7 spesies), Asteraceae (6 spesies), Moraceae (6 spesies),

Rosaceae (6 spesies), Euphorbiaceae (5 spesies) and Araliaceae (5 spesies).

Spesies yang paling banyak dikaji adalah: Citrullus colocynthis, Opuntia

streptacantha Lem. (Cactaceae), Trigonella foenum greacum L. (Leguminosae),

Momordica charantia L. (Cucurbitaceae), Ficus bengalensis L. (Moraceae),

Polygala senega L. (Polygalaceae) dan Gymnema sylvestre R. (Asclepiadaceae).

14

Tanaman Lagerstroemia speciosa (Lythraceae), yang di kawasan Asia

Tenggara dikenal dengan nama banaba, secara tradisional telah dikonsumsi

masyarakat dalam berbagai bentuk untuk pengobatan diabetes dan penyakit

ginjal. Pada tahun 1990-an popularitas tanaman ini telah menarik perhatian para

ilmuwan di berbagai negara. Sejak saat itu, konsistensi aktivitas anti diabetes

dari tanaman ini diuji secara in vitro maupun in vivo (Klein et al. 2007).

DM merupakan penyakit yang umum terjadi di berbagai negara, sehingga

upaya pengobatan penyakit DM mulai tradisional hingga modern banyak

dilakukan. Sejumlah penelitian tanaman obat yang memiliki khasiat sebagai

antidiabetes juga telah dilakukan oleh ilmuwan di berbagai negara (Tabel 2).

Tabel 2 Kajian tanaman obat diabetes di berbagai negara

No Tanaman Negara Informasi bahan aktif Referensi

1 Ceiba pentandra Afrika Selatan

ekstrak C. pentandra pada dosis rendah 40 mg/kg bb menurunkan glukosa darah 40.0% dan 48.9%, pada tikus normal dan tikus diabet

Djoemeni et al. 2006

2 Helichrysum odoratissimum, Helichrysum nudifolium, Artemisia afra, Vernonia oligocephala

Afrika Selatan

secara tradisional dikonsumsi sebagai sayur atau lalap

Mahop & Mayet 2007

3 Coccinia cordifolia, Catharanthus roseus

Bangla-desh

ekstrak metanol daun tanaman C. cordifolia dan C. roseus memiliki efek antihiperglikemik pada tikus diabet yang diinduksi dengan aloksan

Akhtar et al. 2007

4 Cissus sicyoides

Brazilia senyawa aktif yang terkandung pada tanaman ini juga memiliki aktivitas antimikrob

Beltrame et al. 2002

5 Panax ginseng

Cina senyawa ginsenosida hasil ekstraksi secara signifikan sebagai antihiperglikemik pada mencit yang kegemukan

Attele et al. 2002

6 Andrographis paniculata

Malaysia pemberian secara oral ekstrak etanol Andrographis paniculata berperan dalam meningkatkan sensitivitas insulin dan penundaan perkembangan resistensi insulin

Subramanian et al. 2008

7 Murraya konigii, Ocimum tenuiflorum

India ekstrak kloroform Ocimum tenuiflorum dan Murraya konigii menghambat - glukosidase

Bhat et al. 2008

8 Syzygium cumini

India diperoleh senyawa mycaminose yang memiliki efek antidiabet pada tikus

Kumar et al. 2008

9 Acacia catechu, India berbagai tanaman tersebut Jeyacand

15

Alpinia calcarata, Budea monosperma

secara tradisional digunakan dalam ayurveda sebagai obat antidiabet

ran & Mahes 2007

10 Melia dubia India ekstrak alkhohol M. dubia efektif sebagai agen hipoglikemik

Susheela et al. 2008

11 Phyllanthus fraternus

India ekstrak etanol P. fraternus memiliki efek antidiabet dan antioksidan dibanding obat standar tolbutamide.

Garg et al. 2008

12 Tribullus terrestris India ekstrak T. terrestris dapat menurunkan gula darah mencit hiperglikemia

Lamda et al. 2011

13 Terminalia sp.

Indonesia ektrak metanol daun terminalia mampu menghambat -glukosidase, nilai IC50 5g/ml

Anam et al. 2009

14 Shorea balanocarpoides

Indonesia ekstrak kayu raru dari jenis S. balanocarpoides memiliki inhibisi terhadap - glukosidase berkisar 88-97%.

Pasaribu, 2009

15 Andrographis paniculata

Indonesia ekstrak etanol herba sambiloto mempunyai efek menurunkan glukosa darah pada uji toleransi glukosa

Yulinah et al. 2001

16 Phalleria macrocarpa

Indonesia ekstrak buah mahkota dewa memiliki aktivitas inhibitor - glukosidase yang memiliki efek antihiperglikemia pada tikus putih

Sugiwati et al. 2006

17 Tanaman famili Apocynaceae,Clusiaceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae

Indonesia berbagai ekstrak memiliki aktivitas lebih tinggi dari acarbose

Elya et al. 2012

18 Verbascum cermanensis, Rosa damascene, Rosmarinus officinnalis

Iran ekstrak metanol dan air beberapa tanaman tersebut menghambat di atas 50% terhadap - glukosidase

Gholamhoseinian et al. 2008

19 Viscum album Inggris terdapat senyawa aktif dalam tanaman Viscum album yang berperan meningkatkan sekresi insulin, sebagai senyawa antidiabetes

Gray & Flat 1999

20 Chrysanthemum coronarium, Dioscorea batatas, Morus alba, Citrus unshiu

Korea pemberian ekstrak C. coronarium dan M. alba memiliki efek hipoglikemik pada tikus diabet setara dengan glibenclamide. Pemberian ekstrak C.unshiu menunjukkan efek antihiperlipidemik dibanding antidiabetik.

Kim et al. 2006

21 Guaiacum coulteri, Psacalium peltatum dan Psidium guajava

Mexico P. peltatum dan G. coulteri memiliki efek antihiperglikemik pada kelinci diabet dan kelinci sehat.

Aguilar et al. 2003

22 Azadirachta indica Nigeria ekstrak tanaman tersebut baik Ebong et

16

dan Vernonia amygdalina

secara kombinasi atau secara sendiri dapat mereduksi kadar gula darah yang setara dengan clorpropamid.

al. 2008

23 Lagerstroemia speciosa

Philipina digunakan sebagai obat diabetes di Philipina, mengandung tannic acid dan penta galoil glucose (PGG)

Klein et al. 2007

24 Flemingia sp Taiwan ekstrak air Flemingia sp memiliki IC50 253 g/ml terhadap - glukosidase

Hsieh et al. 2010

Di Indonesia, juga dikenal berbagai tanaman yang dikenal memiliki kasiat

sebagai obat diabetes seperti sambiloto, brotowali, ciplukan, daun dewa, pare,

dan mahkota dewa. Tanaman tersebut secara empiris telah digunakan oleh

masyarakat Indonesia untuk pengobatan diabetes. Beberapa kajian ilmiah juga

telah dilakukan untuk mengetahui kandungan bahan aktif tanaman ataupun

mekanisme kerja bahan aktif tanaman dalam menurunkan kadar gula darah.

Yulinah et al. (2001) melaporkan bahwa ekstrak etanol tanaman sambiloto

mampu menurunkan kadar gula darah tikus putih yang menderita hiperglikemia.

Ekstrak buah mahkota dewa juga dilaporkan memiliki kemampuan sebagai anti

hiperglikemia melalui aktivitas inhibitor -glukosidase (Sugiwati et al. 2006).

Pasaribu (2009) melaporkan bahwa kayu raru (Shorea sp) memiliki aktivitas

inhibitor - glukosidase. Di samping, itu masih banyak jenis-jenis tanaman dii

Indonesia dari famili Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, dan Rubiaceae

yang memiliki aktvitas inhibitor -glukosidase (Elya et al. 2011).

Tanaman brotowali (T. crispa)

Klasifikasi tanaman brotowali adalah sebagai berikut:

Kingdom: Plantae

Subkingdom: Tracheobionta

Super Divisi: Spermatophyta

Divisi: Magnoliophyta

Kelas: Magnoliopsida

Sub Kelas: Magnoliidae

Ordo: Ranunculales

Famili: Menispermaceae

Genus: Tinospora

Spesies: Tinospora crispa

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Menispermaceaehttp://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Tinospora

17

Tanaman brotowali merupakan salah satu tanaman obat yang terkenal

dari Asia Tenggara. Tanaman ini sudah berabad-abad dikenal sebagai salah satu

tanaman obat yang sangat manjur. Penyebaran brotowali di Asia meliputi:

wilayah Cina, Semenanjung Melayu, Filipina, India dan Indonesia. Brotowali

mulai tersebar ke seluruh penjuru benua setelah terjadi hubungan dagang antar

benua. Hal tersebut di karenakan manfaatnya yang sangat besar sebagai bahan

baku obat-obatan. Brotowali merupakan tanaman obat tradisional Indonesia yang

biasa ditanam di pekarangan atau tumbuh liar di hutan. Rebusan batangnya yang

terasa sangat pahit biasa dijadikan obat rematik, menurunkan kadar gula darah

dan menurunkan panas. Di Indonesia, selain dikenal dengan nama bratawali,

tanaman ini juga dikenal dengan nama daerah andawali, antawali, putrawali atau

daun gadel.

Tinospora crispa, termasuk suku Menispermaceae, klas Magnoliopsida

(Dicotyledoneae), divisi Magnoliophyta (Spermatophyta). Ciri-ciri penting dari

tumbuhan ini: liana, membelit dengan batang dan ranting, batang sukulen dan

berbenjol-benjol; daun tunggal, tanpa stipula, tulang daun menjari, fitotaksis

tersebar; bunga uniseksual, trimeros, aksiler atau cauliflorous; buah batu; tipe

daun dorsiventral, stomata anomositik; berkas pembuluh kolateral terbuka; pada

bagian korteks batang terdapat lengkungan sklerenkim; kandungan kimianya

terdiri atas: amilum, pikroretin, pikroretosida, alkaloida, saponin, tanin. (Santa et

al. 1998)

Brotowali atau Tinospora crispa (L.) Miers ex Hoff. memiliki sinonim T.

cordifolia (Thunb.) Miers, T. rumphii Boerl, T. tuberculata, Cocculus crispum,

Menispermum crispum, M. tuberculatum, M. verrucosum. Di setiap daerah dan

negara juga memiliki berbagai macam nama yang berbeda-beda. Walaupun

persebarannya sudah ke seluruh benua tetapi belum di temui keragaman tingkat

subgenus yang mencolok. Hal tersebut disebabkan karena tanaman ini termasuk

tanaman yang mudah bertahan hidup dalam kondisi ekstrim.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa brotowali mengandung berbagai

macam zat kimia yang sangat membantu sekali dalam proses penyembuhan.

Brotowali telah lama di kenal oleh masyarakat tradisional Indonesia sebagai

bahan pembuatan jamu yang di campur dengan tanaman-tanaman herbal

lainnya. Brotowali merupakan tanaman herba (perdu) yang hampir semua

bagian dari tubuhnya di manfaatkan sebagai obat serba guna yang dapat

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Tanaman_obat&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Pekaranganhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pahit&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Indonesia

18

menyembuhkan berbagai macam penyakit seperti: diabetes melitus, hipertensi,

dan demam. Kajian ilmiah terhadap tanaman brotowali sebagai obat diabetes

telah dilakukan para peneliti. Noor dan Ashcroft (1997) melaporkan bahwa

ekstrak T. crispa mampu menstimulasi peningkatan sekresi insulin, sehingga

dapat berperan sebagai antihiperglikemia. Noipa dan Ninlaaesong (2011)

melaporkan bahwa ekstrak T. crispa dapat meningkatkan laju transpor glukosa

ke dalam sel. Chougale et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak tanaman T.

cordifolia memiliki aktivitas inhibitor -glukosidase. Patela dan Mishrab (2012)

menemukan tiga senyawa dari tanaman Tinospora cordifolia yang memiliki

kemampuan inhibitor -glukosidase, yaitu jatrorrhizine, palmatine dan

magnoflorine. Senyawa-senyawa tersebut memiliki nilai IC50 berturut-turut

sebesar 22.05, 38.42 and 7.6 g/mL untuk jatrorrhizine, palmatine dan

magnoflorine. Hasil uji in vivo juga menunjukkan adanya penekanan yang

signifikan terhadap kenaikan kadar glukosa plasma darah oleh ketiga senyawa

tersebut pada konsentrasi 20 mg/kg berat badan. Senyawa magnoflorine

merupakan senyawa paling potensial sebagai inhibitor -glukosidase diantara

ketiga senyawa yang ditemukan tersebut. Uji klinis oleh Sriyapai et al. (2009)

menunjukkan bahwa konsumsi serbuk T. crispa dapat menurunkan kadar gula

darah setelah makan.

Mikrob Endofit

Mikrob endofit adalah mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman pada

periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikrob endofit yang mampu menghasilkan senyawa

biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau

transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrob

endofit (Tan & Zou 2001).

Kemampuan mikrob endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder

sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan

dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrob endofit

yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Sekitar 300000 jenis tanaman

yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau

lebih mikrob endofit yang terdiri dari bakteri dan cendawan (Strobel & Daisy

2003). Apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat

19

menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman inangnya atau bahkan

dalam jumlah yang lebih tinggi, maka tidak perlu mengambil tanaman aslinya

untuk diambil sebagai simplisia.

Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan

telah berhasil dibiakkan dalam media sintetik yang sesuai. Demikian pula

metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrob endofit tersebut telah berhasil

diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya. Berbagai

produk mikrob endofit yang telah dilaporkan adalah sebagai antibiotik, antivirus,

antikanker, antioksidan, antidiabetes, imunosupresif dan lain-lain (Strobel &

Daisy 2003).

Endofit yang telah dilaporkan memiliki aktivitas antidiabet adalah

Pseudomassaria sp. Endofit yang diisolasi dari hutan dekat Kinshasa, Republik

Congo ini mampu menghasilkan senyawa non peptida (L-783,281). Senyawa ini

memiliki aktivitas yang menyerupai insulin, tetapi tidak seperti insulin karena tidak

terdegradasi di dalam sistem pencernaan, sehingga dapat digunakan secara oral.

Pemberian secara oral senyawa L-783,281 terhadap hewan model mencit

diabetes menunjukkan adanya penurunan kadar gula darah secara signifikan.

Hasil ini memberi kemungkinan terapi baru terhadap diabetes (Strobel & Daisy

2003).

.

Aktinomiset Endofit dan Potensinya

Aktinomiset telah lama diketahui sebagai sumber berbagai senyawa

bioaktif yang telah dimanfaatkan dalam berbagai bidang seperti kesehatan,

pertanian, maupun industri. Beberapa hasil penelitian di bawah ini merupakan

contoh potensi aktinomiset endofit yang mampu menghasilkan senyawa bioaktif

yang berguna dalam bidang medis.

Streptomyces sp. strain NRRL 30562 merupakan isolat endofit dari

tanaman obat snakevine (Kennedia nigriscans) yang mampu menghasilkan

antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin. Senyawa ini dapat

menghambat pertumbuhan Bacillus anthracis, dan Mycobacterium tuberculosis

yang multi resisten terhadap berbagai obat anti tuberkulosis, sehingga senyawa

ini berpotensi digunakan untuk pengobatan terhadap penyakit tuberkulosis

(Castillo et al. 2002).

Jenis endofit lainnya yang juga menghasilkan antibiotik berspektrum luas

adalah aktinomiset endofit yang diisolasi dari tanaman Grevillea pteridifolia.

20

Endofit ini menghasilkan metabolit kakadumycin. Aktivitas anti bakterinya sama

seperti munumbicin (Castillo et al. 2003). Streptomyces sp. (MSU-2110) yang

merupakan isolat endofit pada tanaman Monstrea sp. mampu menghasilkan

antibiotik coronamycin yang dapat menghambat cendawan Cryptococcus

neoformans yang bersifat patogen pada manusia (Ezra et al. 2004).

Paclitaxel dan derivatnya merupakan zat yang berkhasiat sebagai anti

kanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikrob endofit.

Paclitaxel merupakan senyawa diterpenoid yang terdapat dalam tanaman Taxus.

Senyawa yang dapat mempengaruhi molekul tubulin dalam proses pembelahan

sel-sel kanker ini, dapat diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora yang

terdapat pada tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana

(Strobel 2001). Beberapa aktinomiset endofit lainnya seperti Kitasatospora dan

Micromonospora telah dapat diisolasi dari tanaman Taxus yang mampu

menghasilkan berbagai senyawa taxane yang memiliki aktivitas sebagai

antitumor (Caruso et al. 2000).

Streptomyces aureofaciens CMUAc130 yang diisolasi dari jaringan akar

tanaman jahe (Zingiber officinale) dapat menghasilkan senyawa 4-arylcoumarin

yang memiliki aktivitas anti tumor. Pemberian senyawa ini secara intra peritonial

dapat menghambat perkembangan sel Lewis Lung Carcinoma (LLC). Senyawa

4-arylcoumarin menunjukkan aktivitas anti tumor dengan nilai T/C 80.8 dan

50,0% pada dosis 1 dan 10 mg/kg berat badan (dalam bentuk 5,7-dimetoxy-4-

pherylcoumarin) dan 81.5 dan 44.9% pada dosis 1 dan 10 mg/kg (dalam bentuk

5,7-dimetoxy-4-phenylcoumarin). Kontrol positif yang berupa senyawa

adriamycin menunjukkan nilai T/C 55.9% pada dosis 2 mg/kg berat badan

(Taechowisan et al. 2007). Senyawa pterocidin yang dihasilkan oleh

Streptomyces hygroscopicus merupakan senyawa sitotoksik terhadap beberapa

human cancer cell lines sehingga berpotensi digunakan untuk pengobatan

kanker (Igarashi et al. 2006).

Munumbicin C dan D yang dihasilkan dari Streptomyces endofit sangat

berpotensi digunakan sebagai obat anti malaria. Hasil pengujian terhadap

Plasmodium falciparum menunjukkan bahwa nilai IC50 dari munumbicin tersebut

masing-masing 6.5 dan 4.5 ng/ml, lebih rendah dari IC50 cloroquin yang

merupakan gold standar obat anti malaria yaitu 7.0 ng/ml (Castillo et al. 2002).

Streptomyces sp. (MSU-2110) yang merupakan isolat endofit pada tanaman

Monstrea sp. mampu menghasilkan antibiotik peptida yang disebut coronamicin.

21

Senyawa ini juga memiliki kemampuan dalam menghambat Plasmodium

falciparum dengan IC50 sebesar 9 ng/ml sehingga berpotensi juga digunakan

sebagai obat antimalaria (Ezra et al. 2004). Ringkasan kajian aktinomiset endofit

pada beberapa tanaman dan potensinya dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Kajian aktinomiset endofit pada beberapa tanaman dan potensinya

No Aktinomiset endofit

Tanaman inang Potensi Pustaka

1 Microbispora Streptomyces Micromonospora

Brassica campestris

biokontrol terhadap Plasmodiospora brassicae

Sun et al. 2008

2 Pseudonocardia oroxyli sp.

Oroxylum indicum

belum dilaporkan Gu et al. 2006

3 Streptomyces Microbispora Micromonospora Nocardiades

Gandum biokontrol patogen tanaman

Coombs & Franco 2003

4 Streptomyces sp Zingiber officinale Alpinia galanga

biokontrol terhadap Candida albicans dan Fusarium oxysporum

Taecowisan & Lumyong 2003

5 Streptomyces sp Aegiceras comiculatum

menghasilkan cyclopentenone

Lin et al. 2005

6 Streptomyces hygroscopicus

- senyawa sitotoksik (pterocidin)

Igarashi et al. 2006

7 Streptomyces sp Monstrea menghasilkan coronamicin (antifungi, antimalaria)

Ezra et al. 2004

8 Streptomyces aureofaciens

Zingiber officinale

menghasilkan coumarin (antitumor)

Taecowisan et al. 2007

9 Kitasatospora Micromonospora Streptomyces

Taxus sp menghasilkan taxane (antikanker)

Caruso et al. 2000

10 Streptomyces sp Kennedia nigriscans

menghasilkan munumbicin (antifungi, antimalaria, anti TBC

Castillo et al. 2002

Studi awal telah dilakukan Irawan (2008) dengan melakukan isolasi

aktinomiset endofit dari tanaman ciplukan, temulawak dan brotowali. Lima belas

isolat aktinomiset yang telah diperoleh, dua diantaranya mampu menghasilkan

inhibitor -glukosidase, yaitu isolat Tc-2.1 (dari brotowali) dan Cx-10.1 (dari temu

lawak). Hasil pengujian awal menunjukkan ekstrak kasar isolat Cx-10.1 memiliki

daya hambat lebih besar dibandingkan dengan Glucobay 0.1% terhadap enzim

-glukosidase.

Tabel 3 di atas menunjukkan bahwa sejumlah aktinomiset endofit dapat

diisolasi dari berbagai jenis tanaman. Isolat-isolat aktinomiset endofit tersebut

22

juga dilaporkan mampu menghasilkan senyawa bioaktif dalam medium sintetik di

laboratorium. Kenyataan ini mengindikasikan adanya peluang yang besar untuk

mendapatkan isolat-isolat baru aktinomiset endofit dalam rangka pencarian

senyawa bioaktif baru, khususnya senyawa inhibitor -glukosidase.

23

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi

dan di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia, FMIPA IPB dari bulan

April 2009 sampai dengan Maret 2012.

Isolasi Aktinomiset Endofit

Sampel tanaman brotowali (Tinospora crispa) diperoleh dari Kebun

Koleksi Tanaman Obat, Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Sampel tanaman berupa bagian akar, batang dan daun tanaman brotowali.

Disamping brotowali, beberapa tanaman obat yang telah diketahui memiliki

kasiat sebagai obat diabetes juga dilakukan isolasi aktinomiset endofitnya, yaitu:

lidah buaya (Alloe vera), mahkota dewa (Phaleria macrocarpa), temu ireng

(Curcuma aeruginosa), pegagan (Centela asiatica), tempuyung (Xoncus

arvensis), sambiloto (Andrographis paniculata), secang (Caesalpinia sappan),

temu lawak (Curcuma xanthorriza), pete (Parcia speciosa) sambung nyawa

(Gynura procumbens), ciplukan (Physalis peruviana) dan rosela (Hibiscus

sabdariffa).

Bagian tanaman yang diisolasi dicuci dengan air lalu dilakukan sterilisasi

permukaan mengikuti metode seperti yang diterangkan Coombs dan Franco

(2003). Sampel tanaman direndam dalam alkhohol 70% selama 1 menit, larutan

hipoklorit 1% selama 5 menit, lalu alkhohol 70% selama satu menit, dan terakhir

dibilas dengan akuades steril. Sampel tanaman yang telah steril selanjutnya

dihaluskan secara aseptik dengan mortar dan ditambahkan 4 ml 12.5 mM buffer

fosfat. Sebanyak 100 l suspensi sampel diinokulasikan pada medium Humic

Acid Vitamin B (HV) agar dengan penambahan 50 ppm cycloheximide dan 30

ppm nalidixic acid. Inkubasi dilakukan selama 14-21 hari pada suhu ruang.

Untuk konfirmasi keberhasilan proses sterilisasi permukaan, bilasan terakhir

akuades juga dilakukan pencawanan pada medium HV agar. Koloni-koloni

aktinomiset yang tumbuh diisolasi dan dimurnikan lebih lanjut menggunakan

medium Yeast Malt Extract Agar (YMA). Koleksi isolat disimpan dalam medium

YMA miring pada suhu 4 0C dan larutan gliserol 15% pada suhu -20 0C.

24

Seleksi dan Uji Aktinomiset Endofit Penghasil Inhibitor -glukosidase

Semua isolat yang diperoleh ditumbuhkan ke dalam medium cair berisi

0.1% soluble starch, 0.5% pepton, dan 0.1% yeast extract (pH 7) selama 14 hari

dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada temperatur ruang. Biomassa sel

dipisahkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 1432 x g selama 20 menit dan

supernatan yang diperoleh diuji aktivitas inhibitor -glukosidasenya. Aktivitas

inhibitor -glukosidase diuji menurut Anam et al. (2009). Uji penghambatan

enzim dilakukan berdasarkan pada pemecahan substrat untuk menghasilkan

produk berwarna, yang diukur absorbansinya selama periode waktu tetentu.

Enzim -glukosidase (Sigma, St. Louis) dilarutkan dalam 0.1 M buffer fosfat pH 7

dengan konsentrasi 0.25 unit/ml. Substrat yang digunakan adalah p-Nitrophenyl

-D-glucopyranoside (Sigma, St. Louis) 20 mM yang dilarutkan dalam 0.1 M

buffer fosfat pH 7. Campuran reaksi terdiri dari 125 l substrat, 240 l 0.1 M

buffer fosfat pH 7 dan 10 l sampel. campuran reaksi diinkubasi pada suhu 370C

selama 5 menit, ditambahkan 125 l larutan enzim dan diinkubasi selama 15

menit pada suhu 37 0C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 500 l larutan

Na2CO3 200 mM, dan p-nitrophenol yang dihasilkan diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 400 nm. Sebagai pembanding digunakan larutan acarbose 1

mg/ml. Penghambatan aktivitas enzim -glukosidase ditentukan dengan rumus:

Penghambatan (%) = (Ak-(As1-As0))/Ak x 100%

(Ak: absorbansi kontrol, AS0: absorbansi sampel tanpa enzim, As1: absorbansi sampel)

Peran Aktinomiset Endofit dalam Menghasilkan Inhibitor -glukosidase

Untuk mengetahui peran isolat aktinomiset endofit dalam menghasilkan

inhibitor -glukosidase, digunakan tanaman T. crispa bebas endofit yang hasil

kultur jaringan tanaman yang diperoleh dari Lab. Konservasi Sumberdaya Hutan,

Fakultas Kehutanan IPB. Sebanyak 0.5 gram sampel tanaman hasil kultur

jaringan digerus secara aseptik dan ditambah 0.5 ml buffer fosfat, kemudian

dipisahkan antara biomassa dan supernatan dengan sentrifugasi pada kecepatan

1432 x g. Supernatan yang diperoleh diuji aktivitas inhibitor -glukosidasenya.

Dengan cara yang sama dilakukan pula uji aktivitas inhibitor -glukosidase

terhadap tanaman T. crispa yang diperoleh dari alam. Kemampuan aktivitas

25

inhibitor -glukosidase kemudian dibandingkan dengan aktivitas inhibitor dari

kultur aktinomiset endofit terpilih.

Penentuan Waktu Produksi Optimum

Kurva produksi digunakan untuk mengetahui waktu optimum yang

digunakan untuk memproduksi inhibitor -glukosidase dalam jumlah besar. Isolat

terpilih ditumbuhkan dalam medium produksi menurut Chen et al. (2004) yang

berisi 0.1% soluble starch, 0.5% pepton dan 0.15 yeast extract (pH 7) steril.

Sebanyak 1% starter diinokulasikan ke dalam media produksi dan diinkubasi

pada suhu ruang dengan kecepatan agitasi 150 putaran per menit dengan rotary

shaker. Setiap 5 hari dilakukan panen kultur dengan cara sentrifugasi pada

kecepatan 1432 x g selama 10 menit pada suhu 40C. Supernatan yang diperoleh

diuji aktivitas penghambatannya terhadap enzim -glukosidase. Pengukuran

berat kering pelet dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan isolat. Percobaan

diakhiri jika produksi inhibitor -glukosidase telah mengalami penurunan.

Identifikasi Isolat Terpilih

Identifikasi isolat terpilih dilakukan berdasarkan sekuen 16S rDNA.

Ekstraksi DNA isolat aktinomiset BWA65 dilakukan menggunakan Genomic DNA

Mini Kit (Geneaid) dilanjutkan dengan amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan

Primer 20F (5'GATTTTGATCCTGGCTCAG3') dan 1500R (5'GTTACCTT-

GTTACGACTT3'). Komposisi reaksi PCR seperti tertera pada Tabel 4.

Tabel 4 Komposisi reaksi PCR untuk amplifikasi gen 16S rRNA

Komponen Volume (l)

dH2O 19.5 Buffer PCR 4 MgCl2 5 dNTP 1.5 Primer 20-F (10 pM) 1 Primer 1500-R (10 pM) 1 DMSO 0.5 DNA template 7 Taq DNA polimerase 0.5

Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan thermal cycler (model

480, Perkin-Elmer, USA), dengan siklus sebagai berikut: 5 menit denaturasi awal

pada 94 0C, 45 detik denaturasi pada 94 oC, dan 45 detik annealing primer pada

26

57 oC, 1 menit ekstensi pada 72 oC dan 7 menit ekstensi final pada 72 oC,

sebanyak 30 siklus. Hasil amplifikasi kemudian dilarikan menggunakan gel

agarosa 1% pada 70 Volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis selanjutnya

diwarnai menggunakan etidium bromida selama 15 menit dan divisualisasi

menggunakan lampu UV transluminator. Pita DNA yang muncul didokumentasi

menggunakan Gel Doc.

Hasil PCR disekuen menggunakan jasa sekuensing MacroGen, Korea.

Analisis sekuen DNA dilakukan menggunakan program BioEdit dan dilakukan

analisis BLAST pada Bank Gen NCBI dataLibrary. Analisis filogenetik

menggunakan program multiple aligment Clustal X dan konstruksi pohon

filogenetik menggunakan program NJ plot.

Karakterisasi Morfologi Isolat

Karakterisasi morfologi isolat dilakukan dengan mengamati pertumbuhan

isolat pada media Yeast Malt Extract Agar (YMA), Yeast Extract Agar (YSA) dan

Oatmeal Agar (OA). Pengamatan makroskopis meliputi pertumbuhan koloni,

warna miselium aerial, warna miselium substrat dan keberadaan pigmen terlarut.

Pengamatan mikroskopis isolat dilakukan menggunakan mikroskop cahaya pada

perbesaran 100 dan 400x, serta Scanning Electron Microscope (SEM)(JSM-

5310LV) pada perbesaran 10000x.

Deteksi Gen Sedoheptulosa-7-Fosfat Siklase

Isolasi DNA Genom. DNA genom aktinomiset diisolasi menggunakan

Genomic DNA Mini Kit (Geneaid). Tahapan kerjanya adalah sebagai berikut.

Kultur sel umur 3 hari sebanyak 1.5 l ditransfer ke dalam tabung mikro, lalu

disentrifus 3354 xg selama 3 menit. Supernantan dibuang dan pelet sel yang

diperoleh diresuspensi dengan 200 l buffer lisozim. Suspensi tersebut

diinkubasi 10 menit pada suhu ruang, tiap 2-3 menit dibolak-balik. Ke dalam

suspensi kemudian ditambahkan 200 l buffer GB dan diinkubasi 70 0C selama

10 menit, dan dibolak-balik tiap 3 menit hingga suspensi terlihat jernih. Tahap

berikutnya adalah penambahan 200 l etanol 96% ke dalam lisat dan diaduk

dengan pipet perlahan-lahan.

Hasil pelisisan sel selanjutnya ditransfer ke dalam kolom GD yang telah

ditempatkan ke dalam tabung koleksi. Tabung disentrifus 8586 xg selama 2

menit, dan tabung koleksi dipisahkan. Kolom GD ditempatkan pada tabung

27

koleksi yang baru lalu ditambahkan 400 l buffer W1, lalu disentrifus 8586 xg

selama 30 detik. Kolom GD diambil dan ditempatkan pada tabung koleksi yang

baru. Ke dalam kolom GD ditambah 600 l wash buffer dan disentrifus 8586 x g

selama 30 detik. Kolom GD ditempatkan kembali pada tabung koleksi dan

disentrifus lagi selama 3 menit untuk mengeringkan matriks pada kolom GD.

Kolom GD selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung mikro dan ditambah 100 l

buffer elusi yang telah dipanaskan 70 0C. Tabung dibiarkan 3-5 menit hingga

buffer elusi meresap ke dalam matriks, lalu disentrifugasi 8586 x g dan larutan

DNA yang diperoleh disimpan di suhu -20 0C.

Amplifikasi Gen Penyandi Sedoheptulosa-7-Fosfat Siklase.

Amplifikasi gen penyandi Sedoheptulosa-7-fosfat siklase menggunakan primer

yang didesain oleh Hyun et al. (2005) sebagai berikut: primer VOG-F

5'GGSGGSGG-SGTSCTSATGGACGTSGCSGG-3' (GGGVLMDVAG), dan

primer VOG-R 5'GCCATGTCSACGCASACSGCSGCCTCSCCGAG-3'

(HGEAVCVDMA). Amplifikasi dengan PCR dilakukan menurut Hyun et al. (2005)

dengan modifikasi. Sebagai kontrol positip dilakukan pula amplifikasi fragmen

DNA dari Actinoplanes sp. SE50/100. Komposisi reaksi campuran PCR yang

digunakan dalam percobaan ini seperti tertera pada Tabel 5.

Tabel 5 Komposisi PCR untuk amplifikasi gen sedoheptulosa-7-fosfat siklase

Komponen Volume (l)

dH2O 12.9 Buffer PCR 5 MgCl2 1 dNTP 0.5 Primer VOG-F (10 pM) 2 Primer VOG-R (10 pM) 2 DMSO 0.5 DNA template 2 Taq DNA polimerase 0.1

Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan thermal cycler (model

480, Perkin-Elmer, USA), dengan siklus sebagai berikut: 5 menit denaturasi awal

pada 95 0C, 20 detik denaturasi pada 98 oC, dan 1 menit annealing primer pada

67 oC, 45 detik ektensi pada 72 oC dan 7 menit ekstensi final pada 72 oC,

sebanyak 30 siklus. Hasil amplifikasi kemudian dilarikan menggunakan gel

agarosa 1% pada 70 V selama 45 menit. Hasil elektroforesis selanjutnya

diwarnai menggunakan etidium bromida selama 15 menit dan divisualisasi

28

menggunakan lampu UV transluminator. Pita DNA yang muncul didokumentasi

menggunakan Gel Doc.

Sekuensing dan Analisis Molekuler. Hasil PCR disekuen menggunakan

jasa sekuensing 1ST BASE Singapura. Hasil sekuensing kemudian dibandingkan

dengan sekuen yang diambil dari database di GenBank, menggunakan program

BLASTX pada situs NCBI.

Isolasi dan Identifikasi Senyawa Inhibitor -Glukosidase

Persiapan Kultur dan Media Fermentasi. Isolat BWA65 ditumbuhkan

pada media YSA selama 7 hari selanjutnya diinokulasikan ke dalam medium cair

berisi 0.1% soluble starch, 0.5% pepton, dan 0.1% yeast extract (pH 7). Kultur

diinkubasi selama 7 hari dengan kecepatan agitasi 120 putaran per menit pada

temperatur ruang. Kultur ini selanjutnya digunakan sebagai starter.

Produksi Senyawa Inhibitor -Glukosidase. Untuk keperluan

karakterisasi senyawa inhibitor -glukosidase diperlukan kultur produksi dalam

jumlah besar (5 liter). Pada penelitian ini produksi skala 5 liter dilakukan dengan

menggunakan galon steril bekas kemasan air minum ukuran 19 liter, dengan

aerasi yang dilewatkan mikro filter 0.2 m. Produksi inhibitor -glukosidase

dilakukan dengan menginokulasikan sebanyak 150 ml (berat kering biomassa sel

0.1 gram) kultur aktinomiset umur 7 hari ke dalam 5 liter media produksi, dan

dilakukan inkubasi selama 15 hari dengan aerasi. Pemanenan kultur dilakukan

dengan menyaring kultur