PERLAKUAN GNOTOBIOTIK KULTUR ARTEMIA DENGAN β-GLUKAN: KAJIAN POTENSI β-GLUKAN UNTUK MEMPERKUAT...

Aquacultura Indonesiana (2013) 14 (XX): XX-XX ISSN 0216-0749

Hak cipta oleh Masyarakat Akuakultur Indonesia 2013

PERLAKUAN GNOTOBIOTIK KULTUR ARTEMIA DENGAN -GLUKAN: KAJIAN POTENSI -GLUKAN UNTUK MEMPERKUAT RESISTENSI

TERHADAP VIBRIOSIS

Romi Novriadi dan Muh Kadari1

1Balai Budidaya Laut Batam, Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya,

Kementerian Kelautan dan Perikanan, Jl. Raya Barelang, PO BOX 60 Sekupang,

Batam 29422, Kepulauan Riau, Indonesia

Telphone: (0778) 7027623 7027624, Faksimile: (0778) 3582557

Abstrak

Romi Novriadi dan Muh Kadari .XXXX. Strategi alternatif untuk mengurangi dan mencegah dampak

mematikan dari serangan penyakit pada kegiatan budidaya perikanan sangat dibutuhkan, terlebih lagi setelah

diketahui bahwa penggunaan antibiotika terbukti tidak efektif dan telah menyebabkan resistensi pada beberapa

strain bakteri. Salah satu strategi alternatif tersebut adalah penggunaan -glukan yang telah diketahui secara umum berperan penting dalam meningkatkan sistem imun baik yang bersifat adaptif maupun bawaan. Pada

kajian ini, dampak perlindungan -glukan yang diproduksi dari strain ragi khusus Saccharomyces cerevisiae (MacroGard), telah diuji pada kultur Artemia dengan menggunakan beberapa konsentrasi yang berbeda pada

kondisi gnotobiotik. Uji tantang dilakukan dengan menggunakan 2 strain bakteri pathogen: Vibrio harveyi

BB120 dan strain baru Vibrio H6, pada konsentrasi 105 sel/mL. Bakteri strain LVS3 yang telah diautoklaf

dengan konsentrasi 107 sel/mL disediakan sebagai pakan untuk Artemia selama masa pengamatan. Hasil analisa

menunjukkan bahwa dari tiga konsentrasi -glukan yang diberikan untuk memperkat sistem imun berdasarkan analisa ukuran partikel, 39 g/L, 100 g/L dan 200 g/L memberikan efek perlindungan pada kultur gnotobiotik

Artemia dari infeksi bakteri pathogen. Hasil ini menegaskan potensi penggunaan -glukan sebagai tindakan alternatif dari penggunaan antibiotika, khususnya dalam upaya pencegahan serangan penyakit.

Kata kunci: -glukan, Artemia, gnotobiotik, Vibrio spp

Pendahuluan

Industri perikanan budidaya ikan dan udang merupakan sektor yang sangat diharapkan dapat berkontribusi dalam peningkatan ekonomi masyarakat di berbagai daerah di Indonesia. Salah satu

kegiatan industri perikanan adalah penyediaan benih ikan dan udang yang berkualitas agar menjamin

keberlanjutan dan peningkatan produksi budidaya. Program penyediaan benih berkualitas sangat bergantung kepada penentuan strategi pemberian pakan yang tepat, sejak masa transisi dari

ketergantungan pada kuning telur hingga konsumsi pakan alami dari lingkungan (Hjort, 1914).

Diantara pakan alami, Artemia banyak digunakan di berbagai panti benih ikan dan udang

dikarenakan kualitas nutrisi yang tinggi untuk mendukung pertumbuhan larva dan sistem penyediaan yang mudah (Sorgeloos et al., 1986). Artemia sebagai pakan alami mengandung asam lemak 20:5 (-3) eicosapentaenoic acid atau EPA (Leger et al., 1986) yang sangat dibutuhkan oleh sistem

pencernaan larva. Namun, ada kekhawatiran bahwa Artemia dapat menjadi vektor dalam perkembangan penyakit, khususnya penyakit yang disebabkan oleh kelompok bakteri patogen Vibrio

penyebab vibriosis yang dapat menyebabkan tingkat mortalitas yang tinggi (Gomezgil et al., 1994;

Muroga et al., 1994; Verdonck et al., 1994). Pada budidaya Artemia, beberapa bakteri patogen yang

termasuk kedalam genus Vibrio spp dilaporkan telah menjadi mimpi buruk dan menjadi salah satu faktor penghambat dalam keberlanjutan produksi, diantaranya adalah: Vibrio hispanicus (Gomez-Gil

et al., 2004); Vibrio alginolyticus (Gunther dan Catena, 1980; Rico-Mora dan Voltolina, 1995); Vibrio

parahaemolyticus (Gunther dan Catena, 1980; Puente et al., 1992; Rico-Mora dan Voltolina, 1995; Orozco-Medina et al., 2002). Fusarium solani (Criado-Fornelio et al., 1989); Vibrio proteolyticus

(Verschuere et al., 1999, 2000b); Vibrio harveyi atau Vibrio campbelli (Roque and Gomez-Gill, 2003;

Soto-Rodriguez et al., 2003a,b); dan Vibrio vulnificus (Soto-Rodriguez et al., 2003a). Disamping bakteri dari kelompok genus Vibrio spp, beberapa kelompok genus, seperti: Bacillus sp., Micrococcus

sp., Staphylococcus sp., dan Erwinia sp juga menyebabkan kematian pada Artemia (Austin dan Allen,

1982).



Upaya mengatasi penyakit yang disebabkan oleh bakteri umumnya masih bertumpu kepada

penggunaan antibiotika. Namun penggunaan yang berlebihan dalam industri akuakultur telah menyebabkan bakteri resisten terhadap beberapa antibiotika. Kajian dari Karunasagar et al. (1994)

menyebutkan bahwa kematian massal udang windu (Penaeus monodon) disebabkan oleh bakteri

Vibrio yang resisten terhadap Cotrimoxazole, Chloramphenicol, Erythromycin dan Streptomycin.

Selain hal tersebut, penggunaan antibiotik juga menimbulkan ancaman terhadap kesehatan manusia berupa alergi dan keracunan melalui akumulasi antibiotik pada produk olahan ikan dan udang

(Alderman dan Hastings, 1998; Cabello, 2006). Saat ini, upaya untuk melindungi organisme akuatik

dari infeksi Vibrio tanpa penggunaan antibiotika sedang terus dikembangkan, salah satunya adalah melalui tindakan pencegahan penyakit melalui penguatan sistem imun. Dalam konteks Artemia,

penguatan sistem imun alamiah pada inang melalui penggunaan -glukan dapat menjadi salah satu upaya pengendalian penyakit yang cukup efektif.

Tujuan dari kajian ini adalah untuk menginvestigasi apakah penggunaan -glukan dapat melindungi dan meningkatkan kelulushidupan (%) Artemia dari infeksi 2 strain bakteri patogen:

Vibrio harveyi BB120 dan strain baru Vibrio H6 yang sebelumnya telah terbukti menyebabkan tingkat

kematian yang tinggi pada Artemia (Vanmaele et al., 2012). Sebagai tambahan, aplikasi beberapa konsentrasi -glukan juga dilakukan untuk memverifikasi konsentrasi optimal yang dapat meningkatkan resistensi Artemia terhadap infeksi patogen Vibrio spp.

Materi dan Metode

Strain bakteri

Dua strain bakteri digunakan sebagai patogen, yakni: Vibrio harveyi BB120 dan sebuah strain

baru Vibrio H6. Kultur murni dari kedua bakteri diperoleh dari Laboratory of Aquaculture dan

Artemia Reference Centre (ARC), Universitas Ghent, Belgia. Strain H6 merupakan jenis bakteri baru yang termasuk ke dalam kelompok/grup Vibrio harveyi dan dipilih karena memiliki aktivitas

haemolytic dan lipolytic yang kuat (Vanmaele et al., 2012). Sementara Vibrio harveyi BB120 telah

dikarakterisasi sebelumnya sebagai bakteri patogen pada kultur Artemia (Soltanian, 2007;

Ruwandeepika et al., 2010). Selama periode kultur dan uji tantang, strain bakteri Aeromonas hydrophila LVS3 digunakan sebagai pakan untuk Artemia. Strain bakteri ini telah diuji sebelumnya

tidak memiliki pengaruh untuk meningkatkan sistem imun pada Artemia dan tidak berinteraksi baik

dengan -glukan maupun dengan patogen yang akan digunakan selama uji tantang (Defoirdt et al., 2005).

Tabel 1. Jenis bakteri yang digunakan dalam penelitian ini.

Strain Bakteri Keterangan Referensi

Vibrio harveyi strain

BB120

Jenis strain dari alam, dimana beberapa

strain, seperti: BB152, BB170, MM30,

BB886, MM77 and JAF548 dihasilkan

Bassler et al. (1997)

Strain baru Vibrio H6 Diisolasi dari udang vanamei (Penaeus

vannamei) yang mengalami wabah

penyakit dan belokasi di Rio Grande do Norte (Natal-Area, Brazil)

Vanmaele et al. (2012)

Aeromonas hydrophila

strain LVS3

Diketahui memiliki sifat positif bila

digunakan sebagai pakan bagi Artemia

Verschuere et al. (1999)

Penetasan Artemia secara axenic

Seluruh percobaan yang dilakukan menggunakan kista Artemia fransiscana, yang berasal dari danau Great Salt, Utah, Amerika Serikat. Artemia yang bersifat axenic dihasilkan melalui proses

hidrasi dan dekapsulasi yang distandarisasi. Seluruh peralatan yang digunakan sebelumnya harus telah

disterilisasi dan diautoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit. Seluruh perlakuan dilakukan di dalam

lemari laminar untuk mempertahankan kondisi axenic. Untuk uji tantang, sekitar 100 mg kista



Artemia dihidrasi dalam tabung gelas yang telah diisi 90 mL air steril selama 1 jam dengan aerasi

kuat. Kemudian 3,3 mL NaOH dan 50 mL larutan klorin dingin dimasukkan dan setelah 1,5 menit 60 mL Na2S2O3.5H2O dimasukkan untuk menetralisir klorin dalam media kultur. Kista yang telah

didekapsulasi kemudian dicuci beberapa kali dengan menggunakan air laut yang sudah disterilisasi.

Tabung yang berisi kista kemudian ditempatkan di dalam rotor dengan siklus putar 4 kali dalam satu

menit dan secara konstan diletakkan dibawah sinar lampu fluoresen pada suhu 280 C selama 18 22

jam. Naupli Artemia yang telah masuk fase Instar II yang siap untuk mengkonsumsi pakan diambil

dan dihitung didalam lemari laminar.

Kultur Gnotobiotik pada Artemia

Setelah penetasan secara axenic, sebanyak 20 naupli yang masuk tahapan Instar II diambil dan ditransfer ke dalam tabung falkon yang telah berisikan 10 mL air laut steril bersama dengan bakteri

patogen yang digunakan untuk uji tantang dan strain bakteri yang digunakan sebagai pakan. Setiap perlakuan memiliki empat pengulangan dan setiap tabung falkon ditempatkan dibawah sinar lampu

fluoresen pada suhu 280 C.

Kultur Bakteri

Isolat murni Vibrio harveyi BB120 dan strain baru H6 yang sebelumnya telah disimpan dalam larutan 30% gliserol pada suhu -80

0 C, diinokulasi secara aseptik didalam 30 mL media marine broth

dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 250-28

0 C dengan pengadukan yang konstan. Sebanyak

150 L selanjutnya ditransfer dan dikembangkan hingga fase stationery dalam 30 mL media marine broth selama 6 jam sebelum digunakan untuk uji tantang. Kepadatan bakteri ditentukan secara

spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Kepadatan bakteri kemudian dihitung dengan

menggunakan perhitungan:

Berdasarkan perhitungan baku McFarland (BioMerieux, Marcy L'Etoile, France), diasumsikan bahwa

OD550=1.000 sebanding dengan 1,2109 sel/mL bakteri.

Verifikasi kondisi axenic kultur Artemia dan media -glukan

Kondisi axenic pada kultur Artemia dan larutan -glukan dianalisa dengan menggunakan metoda cawan petri yang mengandung media Difco Marine Agar 2216. Ketidakhadiran bakteri dianalisa dengan mentransfer 100 L media kultur dan larutan -glukan ke dalam cawan petri dan disimpan di dalam inkubator selama 5 hari pada suhu 25

0 C. Setiap perlakuan memiliki empat ulangan. Media

yang terkontaminasi tidak dapat digunakan untuk analisa berikutnya dan perlakuan harus kembali

diulang.

Penentuan ukuran partikel dan konsentrasi -glukan

Distribusi ukuran partikel -glukan (MacroGard) ditentukan dengan menggunakan Malvern Mastersizer S (Malvern Instruments, Spring Lane South, UK) yang dilengkapi dengan unit pelarutan

skala kecil dan lensa 300 RF. Ketika partikel yang berukuran 50 m di kalkulasi, yang merupakan ukuran maksimal partikel yang dapat dicerna oleh Instar II Artemia (FAO, 1996), jumlah -glukan untuk setiap tabung dapat ditentukan berdasarkan kajian yang dilakukan sebelumnya oleh Marques et

al. (2006) dan Soltanian (2007). Dalam eksperimen ini, selain menggunakan konsentrasi minimum berdasarkan jumlah partikel -glukan (MacroGard) yang memiliki ukuran < 50 m, juga digunakan konsentrasi -glukan yang lebih besar untuk menentukan perlindungan yang lebih baik bagi kultur Artemia.

Penentuan persentase tingkat kelulushidupan

Persentase kelulushidupan (%) Artemia ditentukan berdasarkan kepada perhitungan yang dilakukan oleh Marques et al. (2004). Untuk ini, jumlah Artemia dihitung terlebih dahulu di dalam

Konsentrasi bakteri = [1200*106*OD]



lemari laminar untuk mempertahankan kondisi gnotobiotik dan pada akhir percobaan, jumlah naupli

yang masih hidup dihitung dan persentase kelulushidupan (%) ditentukan.

Analisa statistik

Data untuk persentase tingkat kelulushidupan (%) Artemia disajikan sebagai nilai rata-rata yang diikuti oleh perhitungan penyimpangan baku. Data kelulushidupan (%) di ubah ke dalam bentuk

arcsine untuk memenuhi persyaratan distribusi normal dan keseragaman data. Data kelulushidupan (%) kemudian dianalisa menggunakan one way ANOVA yang diikuti dengan analisa Tukeys multiple comparison range menggunakan piranti lunak SPSS. Seluruh level signifikan ditentukan

pada p



Gambar 2. Gambar rata-rata kelulushidupan (%) Artemia dengan atau tanpa pemberian 3,9

g -glukan/tabung. Uji tantang dilakukan dengan menggunakan strain baru H6 pada kepadatan 10

5 sel/mL. Kontrol berarti tidak ada perlakuan. D-LVS3 merujuk pada pemberian

bakteri strain LVS3 (107 sel/mL) sebagai pakan bagi kultur Artemia. BG3.9 merujuk pada

pemberian -glukan sebanyak 3,9 g/tabung. (p



pemberian bakteri strain LVS3 (107 sel/mL) sebagai pakan bagi kultur Artemia. BG10 dan 20 merujuk

pada pemberian -glukan sebanyak 10 dan 20 g/tabung. (p



Daftar Pustaka

Aldeman, D.J. and Hastings, T.S. 1998. Antibiotic use in aquaculture: development of antibiotic resistance-

potential for consumer health risks. Int. J. Food Sci. Technology (33): 139-155.

Austin, B. and D. Allen. 1982. Microbiology of laboratory-hatched brine shrimp (Artemia). Aquaculture (26):

369-383.

Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., MacRae, T.H and Bossier, P. 2011. Priming the prophenoloxidase

system of Artemia fransiscana by heat shock proteins protect agains Vibrio campbelli challenge. Fish

and Shellfish Immunology 31: 134-141.

Bassler, B.L., Greenberg, E.P. and Stevens, A.M. 1997. Cross-species induction of luminescence in the

quorum-sensing bacterium Vibrio harveyi. J Bacteriol (179): 4043-4045.

Cabello, F.C. 2006. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and

animal health and for the environment. Environ Microbiol (8): 1137-1144.

Cabello, F.C. 2003. Antibiotics and aquaculture. An analysis of their potential impact upon the environment, human and animal health in Chile. Fundacion Terram. Analisis de Politicas Publicas No. 17, pp. 116.

Criado-Fornelio, A., E. Mialhe., E. Constantin. and H. Grizel. 1989. Experimental infection of Artemia sp.

By Fusarium solani. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. (9): 35-37.

De Schryver, P., Sinha, A., Kunwar, P., Baruah, K., Verstraete, W., Boon, N., De Boeck, G., Bossier, P. 2009. Poly--hydroxybutirate (PHB) increases growth performance and intestinal bacterial range-weighted richness in juvenile European sea bass (Dicentrarchus labrax). Applied Microbiology and

Biotechnology (86): 1535-1541.

Defoirdt, T., Bossier, P., Sorgeloos, P. & Verstraete, W. 2005. The impact of mutations in the quorum

sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence

towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Environmental Microbiology 7 (8): 12391247. FAO. 1996. Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries and Technical Paper.

Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome

Gomez-Gil, B., Thompson, FL., Thompson, CC., Garcia-Gasca, A., Roque, A., Swings, J. 2004. Vibrio

hispanicus sp. nov., isolated from Artemia sp. and sea water in Spain. Int J Syst Evol Microbiol. 54(Pt

1): 261-265.

Gomez-Gil, B., F.A.A. Grobois, J.R. Jarero and M.D.H. Vega. 1994. Chemical disinfection of Artemia

nauplii. J. World Aquaculture Society (25): 574-583.

Gunther, D. and Catena, A. 1980. The interaction of Vibrio with Artemia nauplii. In : G. Persoone, P.

Sorgeloos, O. Roels, E. Jaspers (Eds.). The brine shrimp Artemia- Ecology, culturing and use in

aquaculture. Vol. 1, Universa Press, Wetteren, Belgium.

Hjort. J. 1914. Fluctuations in the great fisheries of northern Europe. Rapp Pv Reun Cons int Explor Mer (20):

1-22.

Hultmark, D. 1993. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity. Trends Genet. (9) : 178183.

Kurtz J. 2005. Specific memory within innate immune systems. Trends Immunol. (26): 186-192.

Kurtz, J. and Franz, K. 2003. Evidence for memory in invertebrate immunity. Nature (425): 3738. Lger, P.H., D.A. Bengtson., K.L. Simpson. and P. Sorgeloos. 1986. The use and nutritional value of Artemia

as a food source. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev.(24): 521-623.

Marques, A., Dhont, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P. 2006. Immunostimulatory nature of -glucans and bakers yeast in gnotobiotik Artemia challenge tests. Fish and Shellfish immunology (20): 682-692.

Marques, A., Dhont, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P. 2004b. Evalution of different yeast cell wall mutants

and microalgae strains as feed for gnotobiotically-grown brine shrimp Artemia fransiscana. J. Exp. Mar.

Biol. Ecol. (312): 115-136

Marques, A., Francois, J., Dhont, J., Bossier, P. and Sorgeloos, P. 2004a. Influence of yeast quality on performance of gnotobiotically-grown Artemia. J.Exp. Mar. Biol. Ecol. (310): 247-264.

Meister. M., Hetru, C., Hoffmann, J.A. 2000. The antimicrobial host defence of Drosophila. Curr. Top.

Microbiol. Immunol. (248): 1736. Muroga, K., K. Suzuki, K. Ishimaru. and K. Nogami. 1994. Vibriosis of swimming crab Portunus

trituberculatus in larviculture. J. World Aquaculture Society (25): 50-54.

Orozco-Medina, C., A. Maeda-Martinez. and A. Lopez-Cortes. 2002. Effect of aerobic Gram positive

heterotrophic bacteria associated with Artemia fransiscana cysts on the survival and development of its larvae. Aquaculture (213): 15-29.

Puente, M.E., Vega-Villasante, F., Holguin, G. and Bashan, Y. 1992. Susceptibility of the brine shrimp

Artemia and its pathogen Vibrio parahaemolyticus to chlorine dioxide in contaminated sea water. J.

Appl.. Bacteriol (73) : 465-471



Rico-Mora, R. and D. Voltolina. 1995. Effects of bacterial isolates from Skeletonema costatum cultures on the

survival of Artemia fransiscana nauplii. J. Invertebr. Pathol. (66): 203-204.

Roque, A. and B. Gomez-Gill. 2003. Therapeutic effects of enrofloxacin in an experimental infection with a

luminescent Vibrio harveyi in Artemia fransiscana Kellog 1906. Aquaculture (220): 37-42.

Snieszko, S.F. 1973. Diseases of fish and their control in the US. The Two Lakes Fifth Fishery Management

Training Course Report. Jansen. London. pp. 55-66. Soltanian, S. 2007. Protection of gnotobiotik Artemia against Vibrio campbelli using bakers yeast strains and

extracts. PhD thesis. Ghent University. Belgium.

Soltanian, S., Francois, JM., Dhont, J., Arnouts, S., Sorgeloos, P. and Bossier, P. 2007. Enhanced disease

resistance in Artemia by application of commercial beta-glucans sources and chitin in a gnotobiotic

Artemia challenge test. Fish and Shellfish Immunology 23(6): 1304-1314 .

Sorgeloos, P., Lavens, P., Leger, P., Tackaert, W. and Versichele, D. 1986. Manual for the culture and use of

Brine shrimp Artemia in aquaculture. FAO, Ghent, Belgium.

Soto-Rodriguez, S.A., Simoes, N., Jones, D.A., Roque, A. and Gomez-Gil, B. 2003b. Assessment of

fluorescent-labeled bacteria for evaluation of in vivo uptake of bacteria (Vibrio spp.) by crustacean

larvae. J Microbil Methods (52): 101-114.

Soto-Rodriguez, S.A., Roque, A., Lizarraga-Partida, M.L., Guerra-Flores, A.L. and Gomez-Gil, B. 2003a.

Virulence of luminous vibrios to Artemia franciscana nauplii. Dis Aquat Org (53): 231-240. Vanmaele, S. Defoirdt, T., Bossier, P. 2012. Immunostimulation through the eyes of gnotobiotic Artemia

fransiscana. World Aquaculture Society 2012- Meeting Abstract no : 330.

Verdonck, L., J. Swings, K. Kersters, M. Dehasque, P. Sorgeloss. and P. Leger. 1994. Variability of the

microbial environment of rotifer Brachionus plicatilis and Artemia production systems. J. World

Aquaculture Society (25): 55-59.

Verschuere, L., G. Rombaut., P. Sorgeloos. And W. Verstarete. 2000a. Probiotic bacteria as biological

control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (4): 655-671.

Verschuere, L., Heang, H., Criel, G., Sorgeloos, P. and Verstraete, W. 2000. Selected Bacterial Strains

Protect Artemia spp. from the Pathogenic Effects of Vibrio proteolyticus CW8T2. Applied and

Environmental Microbiology (66): 11391146. Verschuere, L., G. Rombaut., G. Huys., J. Dhont., P. Sorgeloos. and W. Verstraete. 1999. Microbial control

of the culture of Artemia juveniles through preemptive colonization by selected bacterial strains. Appl.

Environ. Microbiol. (65): 655-671.

PERLAKUAN GNOTOBIOTIK KULTUR ARTEMIA DENGAN β-GLUKAN: KAJIAN POTENSI β-GLUKAN UNTUK MEMPERKUAT...

Documents

Transcript of PERLAKUAN GNOTOBIOTIK KULTUR ARTEMIA DENGAN β-GLUKAN: KAJIAN POTENSI β-GLUKAN UNTUK MEMPERKUAT...