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Introducción Bacillus thuringiensis se caracteriza por producir un cuerpo paraesporal conocido como cristal durante su fase de esporulación, el cual es de naturaleza proteínica y tiene propiedades insecticidas. El cristal proteínico está constituido por proteínas denominadas δ-endotoxinas también conocidas como proteínas Cry. Se han encontrado δ-endotoxinas activas contra insectos lepidópteros (mariposas y palomillas), coleópteros (escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también contra otros invertebrados como nemátodos, gusanos planos y protozoarios (Soberón y Bravo, 2007). Debido al gran uso de formulaciones de B. thuringiensis, los insectos han estado expuestos en continuas generaciones a las toxinas y por lo tanto desarrollando una condición ideal para la resistencia. H. zea (Boddie) está registrado como polífago en hábitos alimenticios pero parece mostrar una preferencia definida en Norteamérica por las mazorcas y espigas jóvenes de maíz, y particularmente para cultivares de maíz dulce y palomero y también para el sorgo. Los cultivos más comúnmente registrados como hospederos son maíz, sorgo, algodón, Phaseolus, chícharo, tomate, berenjena, chile, haba y, en menor grado, Trifolium, okra, col, lechuga, fresa, tabaco, girasol y muchas otras leguminosas (Smith et al., 1992). El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de resistencia en insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el manejo de plagas resistentes, por lo tanto este estudio tiene como objetivo aportar información en el comportamiento de la resistencia hacia algunas toxinas de B. thuringiensis en insectos plaga de México. Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis* Jesús Oswaldo Medina López , Saúl Martínez y Medina López y Benito Pereyra Alférez Instituto de Biotecnología,. Facultad De Ciencias Biológicas, UANL Materiales y Métodos Las larvas de Helicoverpa zea se mantuvieron en cría a base de dieta artificial, las larvas neonatas se han expuesto a dos concentraciones de la toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis para inducir progresivamente una resistencia a dicha toxina. Se realizaron bioensayos para determinar la LC 50 . Para determinar la LC50 se realizó un ensayo por triplicado en el que las larvas fueron expuestas a concentraciones de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20 y 50 μg/g de dieta. Luego de 7 días las sobrevivientes fueron contadas y los datos se sometieron a un análisis PROBIT. Un bioensayo preliminar fue hecho para observar las diferencias de peso, tamaño y grado en el desarrollo entre las larvas sometidas a la toxina y las larvas en dieta artificial sin toxina. Para obtener colonias resistentes, las larvas neonatas fueron expuestas a concentraciones de 10 μg/g (Tabashnik et al,. 2009) y 20 μg/g (A base de la sobrevivencia observada en los estudios preliminares). Después de 7 días las sobrevivientes se mantuvieron en cría con dieta sin toxina hasta completar su ciclo. Resultados Después de tres bioensayos realizados durante la cría de Helicoverpa zea sometiendo a las larvas a diferentes concentraciones los resultados fueron ingresados al programa BMDS (Benchmark Dose Software) proporcionado por la EPA dando la cifra promedio de 1.309 μg/gramo de dieta como la LC50 referente para el estudio. En seis generaciones de exposición progresiva a Cry1Ac se han establecido dos colonias de H.zea resistentes a 10 μg/gramo de dieta y 20 μg/gramo de dieta. Dentro del desarrollo de las colonias a través de las generaciones se ha observado una diferencia entre la cantidad de pupas de machos que llegan a adulto con respecto a las pupas hembras en una proporción casi de 2:1 (macho:hembra), esto aun se mantiene en observación en el estudio. Las hojas analizadas con inmunotiras resultaron positivas para Cry1Ac, Cry2Ab, y algunas para la resistencia a pesticidas dependiendo del predio del cual fueron extraídas. Durante la cruza de colonias resistentes con sensibles, las hembras resistentes demostraron una menor cantidad de huevecillos ovopositados en las cámaras además de resultar algunos infértiles al ser observados bajo el estereoscopio, se dará continuidad a las colonias y a las cruzas para analizar estos datos. Materiales y Métodos Toma de muestras de hojas, flores, bellotas y algodón fueron obtenidas en viajes a campo en las hectáreas donde el algodón transgénico es sembrado (Sonora, Mexicali, Torreón, 2012-2013) para verificar la expresión de la toxina Cry1Ac y Cry2Ab y resistencia a Herbicida (Glifosato), dicha prueba fue realizada a base de inmunotiras Agdia® y el protocolo fue seguido de acuerdo a la instrucciones del producto. *Estadios, pupa y adulto de Helicoverpa zea *Bacillus thuringiensis y cristales paraesporales *Campos de algodón, Torreón 2013 *Placa con dieta artificial y toxina junto con larvas de H. zea Larva en dieta con toxina (izquierda) Larva en dieta sin toxina (derecha) Después de una semana *Hojas de algodón e inmunotiras utilizadas. Conclusiones Las medidas de prevención en campo abierto como lo es la expresión de altas dosis de toxina y refugios es un método efectivo para evitar que las poblaciones de plagas puedan generar una resistencia a dichas toxinas. El estudio de resistencia a toxinas Cry aun no es realizado en todas las áreas donde los plantíos transgénicos son implementados por lo cual es de suma importancia seguir con este tipo de estudios para incrementar la información y tener métodos mas eficientes y rápidos para prevenir cualquier tipo de resistencia a futuro. Referencias Bibliográficas Jurat-Fuentes, J. L., and M. J. Adang. 2006. Cry toxin mode of action in susceptible and resistant Heliothis virescens larvae. J. Invertebr. Pathol. 92:166–171. Pigott, C. R, Ellar D. J. 2007. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71:255–281. Soberón, M., Pardo-López, L., López, I. Gómez, I., Tabashnik, B.E., and A. Bravo. 2007. Engineering modified bt toxins to counter insect resistance. Science 318:1640- 1642 Smith, I.M.; D.G. McNamara; P.R. Scott; K.M. Harris. 1992. Helicoverpa zea. Data sheets on quarantine pests. CAB International & EPPO. Tabashnik, B. E.; Van Rensburg, J. B. J.; Carrière, Y. 2009. Field evolved insect resistance to Bt crops: definition, theory, and data. J. Econ. Entomol. 102:2011–2025. * Proyecto apoyado económicamente por CIBIOGEM. Clave 164429
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Introducción Bacillus thuringiensis se caracteriza por producir un cuerpo paraesporal
conocido como cristal durante su fase de esporulación, el cual es de naturaleza
proteínica y tiene propiedades insecticidas.
El cristal proteínico está constituido por proteínas denominadas δ-endotoxinas
también conocidas como proteínas Cry. Se han encontrado δ-endotoxinas
activas contra insectos lepidópteros (mariposas y palomillas), coleópteros
(escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también
contra otros invertebrados como nemátodos, gusanos planos y protozoarios
(Soberón y Bravo, 2007). Debido al gran uso de formulaciones de B.
thuringiensis, los insectos han estado expuestos en continuas generaciones a
las toxinas y por lo tanto desarrollando una condición ideal para la resistencia.
H. zea (Boddie) está registrado como polífago en hábitos alimenticios pero
parece mostrar una preferencia definida en Norteamérica por las mazorcas y
espigas jóvenes de maíz, y particularmente para cultivares de maíz dulce y
palomero y también para el sorgo. Los cultivos más comúnmente registrados
como hospederos son maíz, sorgo, algodón, Phaseolus, chícharo, tomate,
berenjena, chile, haba y, en menor grado, Trifolium, okra, col, lechuga, fresa,
tabaco, girasol y muchas otras leguminosas (Smith et al., 1992).
El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de
resistencia en insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el
manejo de plagas resistentes, por lo tanto este estudio tiene como objetivo
aportar información en el comportamiento de la resistencia hacia algunas toxinas
de B. thuringiensis en insectos plaga de México.
Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina
Cry1Ac de Bacillus thuringiensis*
Jesús Oswaldo Medina López , Saúl Martínez y Medina López
y Benito Pereyra Alférez
Instituto de Biotecnología,. Facultad De Ciencias Biológicas, UANL
Materiales y Métodos
Las larvas de Helicoverpa zea se mantuvieron en cría a base de dieta artificial, las
larvas neonatas se han expuesto a dos concentraciones de la toxina Cry1Ac de
Bacillus thuringiensis para inducir progresivamente una resistencia a dicha toxina.
Se realizaron bioensayos para determinar la LC50. Para determinar la LC50 se
realizó un ensayo por triplicado en el que las larvas fueron expuestas a
concentraciones de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20 y 50 µg/g de dieta. Luego de 7 días las
sobrevivientes fueron contadas y los datos se sometieron a un análisis PROBIT.
Un bioensayo preliminar fue hecho para observar las diferencias de peso, tamaño
y grado en el desarrollo entre las larvas sometidas a la toxina y las larvas en dieta
artificial sin toxina.
Para obtener colonias resistentes, las larvas neonatas fueron expuestas a
concentraciones de 10 µg/g (Tabashnik et al,. 2009) y 20 µg/g (A base de la
sobrevivencia observada en los estudios preliminares). Después de 7 días las
sobrevivientes se mantuvieron en cría con dieta sin toxina hasta completar su
ciclo.
Resultados
Después de tres bioensayos realizados durante la cría de Helicoverpa zea
sometiendo a las larvas a diferentes concentraciones los resultados fueron
ingresados al programa BMDS (Benchmark Dose Software) proporcionado por la
EPA dando la cifra promedio de 1.309 µg/gramo de dieta como la LC50 referente
para el estudio.
En seis generaciones de exposición progresiva a Cry1Ac se han establecido dos
colonias de H.zea resistentes a 10 µg/gramo de dieta y 20 µg/gramo de dieta.
Dentro del desarrollo de las colonias a través de las generaciones se ha
observado una diferencia entre la cantidad de pupas de machos que llegan a
adulto con respecto a las pupas hembras en una proporción casi de 2:1
(macho:hembra), esto aun se mantiene en observación en el estudio.
Las hojas analizadas con inmunotiras resultaron positivas para Cry1Ac, Cry2Ab, y
algunas para la resistencia a pesticidas dependiendo del predio del cual fueron
extraídas.
Durante la cruza de colonias resistentes con sensibles, las hembras resistentes
demostraron una menor cantidad de huevecillos ovopositados en las cámaras
además de resultar algunos infértiles al ser observados bajo el estereoscopio, se dará continuidad a las colonias y a las cruzas para analizar estos datos.
Materiales y Métodos
Toma de muestras de hojas, flores, bellotas y algodón fueron obtenidas en viajes a
campo en las hectáreas donde el algodón transgénico es sembrado (Sonora,
Mexicali, Torreón, 2012-2013) para verificar la expresión de la toxina Cry1Ac y
Cry2Ab y resistencia a Herbicida (Glifosato), dicha prueba fue realizada a base de
inmunotiras Agdia® y el protocolo fue seguido de acuerdo a la instrucciones del
producto.
*Estadios, pupa y adulto de Helicoverpa zea
*Bacillus thuringiensis y cristales paraesporales *Campos de algodón, Torreón 2013
*Placa con dieta artificial y toxina junto con larvas de H. zea
Larva en dieta con
toxina (izquierda)
Larva en dieta
sin toxina (derecha)
Después de una
semana
*Hojas de algodón e inmunotiras utilizadas.
Conclusiones
Las medidas de prevención en campo abierto como lo es la expresión de altas dosis
de toxina y refugios es un método efectivo para evitar que las poblaciones de plagas
puedan generar una resistencia a dichas toxinas.
El estudio de resistencia a toxinas Cry aun no es realizado en todas las áreas donde
los plantíos transgénicos son implementados por lo cual es de suma importancia
seguir con este tipo de estudios para incrementar la información y tener métodos mas eficientes y rápidos para prevenir cualquier tipo de resistencia a futuro.
Referencias Bibliográficas
Jurat-Fuentes, J. L., and M. J. Adang. 2006. Cry toxin mode of action in susceptible
and resistant Heliothis virescens larvae. J. Invertebr. Pathol. 92:166–171.
Pigott, C. R, Ellar D. J. 2007. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin
activity. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71:255–281.
Soberón, M., Pardo-López, L., López, I. Gómez, I., Tabashnik, B.E., and A. Bravo.
2007. Engineering modified bt toxins to counter insect resistance. Science 318:1640-
1642
Smith, I.M.; D.G. McNamara; P.R. Scott; K.M. Harris. 1992. Helicoverpa zea. Data
sheets on quarantine pests. CAB International & EPPO.
Tabashnik, B. E.; Van Rensburg, J. B. J.; Carrière, Y. 2009. Field evolved insect
resistance to Bt crops: definition, theory, and data. J. Econ. Entomol. 102:2011–2025.
* Proyecto apoyado económicamente por CIBIOGEM. Clave 164429
