Mémoire de M1 SIMS (2014)

Implication de la voie du TNF-α dans les effets de

microparticules macrophagiques sur la

contractilité de cellules cardiaques isolées de

souris adultes

Grimaud Joaquim

2013-2014 Master 1 SIMS

Sous la direction du Dr. Noireaud Jacques,

Directeur de Recherche Inserm Membres du jury

Nom/Prénom 1 | Fonction






Soutenu le : 19 juin 2014

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REM

ER

CIEM

EN

TS

Je tiens à remercier en premier lieu le Dr. Jacques Noireaud pour ses nombreux conseils, les connaissances et expériences qu’il m’a transmis, la confiance qu’il m’a accordée, son accessibilité, sa disponibilité, sa bonne humeur et sa gentillesse. Je tiens aussi à remercier le Dr. Ramaroson Andriantsitohaina de m’avoir accueilli au sein de son unité et sans qui l’occasion de découvrir le monde de la recherche ne m’aurait pas été donnée. J’adresse également mes remerciements à Badreddine Lahouel et Edward Milbank pour leurs nombreux conseils et remarques Je tiens enfin à remercier l’ensemble des membres de l’unité Inserm U1063 pour leur aide et leur disponibilité tout au long de ces 2 mois de stage.

Sommaire

INTRODUCTION : ........................................................................................................................ 1

1. Contexte général .................................................................................................................... 1 2. L’athérosclérose ..................................................................................................................... 1 3. Les microparticules ................................................................................................................. 2 4. Le couplage excitation-contraction ........................................................................................ 2 5. Objectif de l’étude .................................................................................................................. 3

MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................ 4

1. Culture des macrophages RAW 264.7 et obtention des microparticules

macrophagiques .................................................................................................................................... 4 1.1. Culture cellulaire de la lignée RAW 264.7 ..................................................................................... 4 1.2. Obtention des microparticules ..................................................................................................... 4 2. Isolement des cardiomyocytes ............................................................................................... 4 2.1. Prélèvement des cœurs de souris C57BL/6 adultes ........................................................................ 4 2.2. Montage Langendorff et digestion enzymatique ............................................................................. 4 3. Analyse fonctionnelle : Mesure de la contraction et du transitoire calcique des

cardiomyocytes isolés ........................................................................................................................... 5 3.1. Marquage des cardiomyocytes par la sonde Fura-2AM ................................................................... 5 3.2. Systèmes d’enregistrement ......................................................................................................... 6 4. Analyse moléculaire ................................................................................................................ 6 4.1. Dosage des protéines ................................................................................................................. 6 4.2. Western-Blot ............................................................................................................................. 6 5. Analyses statistiques .............................................................................................................. 7

RESULTATS .................................................................................................................................. 7

1. Le TNFαest présent dans les MPs macrophagiques ................................................................ 7 2. TNF per se induit un effet inotrope négatif ........................................................................... 7 3. Le TNF-α n’a pas d’effet sur les transitoires calciques ........................................................... 8 4. Les MPS induisent un effet inotrope négatif ........................................................................... 9 5. Le SPD-304 inhibe l’effet des MPs macrophagiques ............................................................... 9

DISCUSSION ............................................................................................................................. 10

CONCLUSION............................................................................................................................. 10

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 11

Liste des abréviations:

Act D : Actinomycine D

Apo B : Apolipoprotéine B

ATP : Adénosine-5’-Triphosphate

BSA : Bovine Serum Albumine (Sérum d’albumine bovine)

Ca2+: Calcium

CICR : Calcium-Induced Calcium Release

DMSO: Diméthyl sulfoxyde

ESM : Erreur standard à la moyenne

HRP : Horseradish peroxydase (Peroxydase de raifort)

I-CAM : Intercellular Adhesion Molecule (Protéine d’adhésion intercellulaire)

ICaL : Canaux calciques potentiel-dépendants de type L (Long Lasting)

IFN-γ: Interféron gamma

IL-1β: Interleukine 1β

IL-8 : Interleukine 8

LDL : Low Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité)

M-CSF : Macrophage colony-stimulating Factor

MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein 1 (Protéine chimioattractante pour les monocytes)

MPs : Microparticules

NCX : Echangeur Sodium/Calcium

OMS: Organisation Mondiale de la Santé

oxLDL : Oxidized Low-Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité oxydée)

RPE : Résonance Paramagnétique Electronique

RS : Réticulum sarcoplasmique

RYR : Récepteur sensible à la ryanodine

SERCA : Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase

SVF: Sérum de veau foetal

TACE: TNF-α-converting enzyme (Enzyme de conversion du TNF-α)

TBS-Tween : Tris-buffered saline and Tween 20

TNF-α : Tumor necrosis factor alpha (Facteur de nécrose de tumeur alpha)

TNF-R1/2 : Récepteurs au TNF-α de type 1 et 2

V-CAM 1 : Vascular Cell Adhesion Protein 1 (Protéine-1 d’adhésion vasculaire)

mots-clés : Athérosclérose, macrophage, microparticule, TNF-α, cardiomyocyte, souris adulte

Keywords : Atherosclerosis, microparticle, TNF-α, cardiomyocyte, adult mouse.

AB

ST

RA

CT

In case of atherosclerosis, inflammation in the coronary arteries involves the activation of monocytes/ macrophages and the release of microparticles (MPs) in the bloodstream. Thus, these MPs can come close to myocardial cardiomyocytes. Moreover, an important expression of tumor necrosis factor (TNF)-α by macrophages of atherosclerotic plaque was highlighted, which makes possible that these MPs carry this cytokine and thus are able to activate the TNF receptors of type 1 and 2 on the cardiomyocytes. A preliminary study in cardiomyocytes isolated from adult mice, demonstrated that MPs from the macrophage RAW 264.7 have the effect of reducing and slowing the shortening of sarcomeres (negative inotropic effect) without affecting calcium transients (i.e. the release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum). The objective of this study was to determine whether TNF-α is actually carried by MPs and if so, if he plays a role in the observed effects of MPs on the contractile performance of adult mouse cardiomyocytes. The experimental approach combines a method of functional analysis, i.e. the simultaneous analysis of sarcomeres contraction and calcium transients, and a method of molecular biology (i.e. Western blot) to detect the presence of TNF-α in the MPs. The results show the presence of TNF-α in the MPs from the macrophages and that TNF-α has a negative inotropic effect on the contraction of cardiomyocytes. Moreover, the negative inotropic effect of MPs from macrophages on cardiomyocyte contractility is removed after a pretreatment with SPD-304 (10 μM), a specific and irreversible inhibitor of TNF-α receptors. Thus, the TNF-α pathway could be involved in the effect of MPs from macrophages on contractility of cardiomyocytes. Now, it would be interesting to confirm the involvement of TNF-α carried by these MPs by studying various signaling pathways of TNF-α, such as NO/ cGMP / PKG, phospholipase A2/arachidonic acid and sphingosines pathway.

RÉS

UM

É Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au niveau des artères coronaires implique l’activation des

monocytes/macrophages et la libération de microparticules (MPs) dans la circulation sanguine, qui peuvent ainsi venir à proximité des cardiomyocytes myocardique. Par ailleurs, une expression importante du facteur de nécrose tumoral (TNF)-α par les macrophages de la plaque d’athérome a été mise en évidence, ce qui rend fortement probable que les MPs issues de ces derniers puissent porter cette cytokine et activer ainsi les récepteurs TNF de type 1 et 2 portés par les cardiomyocytes. Une étude préliminaire réalisée dans des cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de montrer que des MPs macrophagiques issues de la lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de ralentir le raccourcissement des sarcomères (effet inotrope négatif), sans affecter les transitoires calciques (i.e. la libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique). L’objectif de cette étude a donc été de déterminer si le TNF-α est effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un rôle dans les effets observés des MPs sur la performance contractile des cardiomyocytes murins adultes. L’approche expérimentale utilisée combine une méthode d’étude fonctionnelle, i.e. l’analyse concomitante de la contraction des sarcomères et des transitoires calciques, ainsi qu’une méthode de biologie moléculaire (i.e. western-blot) permettant de détecter la présence éventuelle de TNF-α dans les MPs. Les résultats obtenus montrent tout d’abord la présence de TNF-α dans les MPs macrophagiques et que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur la contraction des cardiomyocytes. De plus, l’effet inotrope négatif des MPs macrophagiques sur la

contractilité cardiomyocytaire est supprimé suite à un prétraitement par le SPD-304 (10 M), inhibiteur spécifique et irréversible des récepteurs au TNF-α. La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée dans l’effet des MPs macrophagiques sur la contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté par ces MPs en explorant divers voies de signalisation du TNF-α, comme les voies NO/cGMP/PKG, phospholipase A2/acide arachidonique, sphingosines.

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40 rue de rennes – BP 73532

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Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la

contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes 1

INTRODUCTION :

1. Contexte général

Depuis ces 40 dernières années, de nombreux

progrès ont été réalisés dans la prévention, le

diagnostic et le traitement des maladies

cardiovasculaires (Braunwald et Bristow, 2000).

Toutefois, malgré ces grandes avancées, les

maladies cardiovasculaires continuent de représenter

aujourd’hui une des principales causes de mortalité

dans le monde (World Health Organization, 2007).

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé

que 17 millions de décès en 2008 étaient imputables

aux pathologies cardiovasculaires, soit environ un

tiers de la mortalité mondiale totale (World Health

Organization, 2011). Le diagnostic et la prise en

charge de ces pathologies sont difficiles et ces

dernières ont un impact économique important

(Bloom et al., 2011). Les projections des

épidémiologistes indiquent que les maladies

cardiovasculaires, notamment d’origine ischémique,

devraient rester l’une des principales causes de

mortalité au moins jusqu’à 2030 (Beaglehole et

Bonita, 2008).

2. L’athérosclérose

Il s’agit d’une pathologie cardiovasculaire chronique

très répandue qui s’amplifie avec l’âge. Elle est sous-

jacente à des événements ischémiques coronariens

(infarctus du myocarde) et cérébrovasculaires

(accident vasculaire cérébral). Elle est caractérisée

par le dépôt, dans les artères, d’une plaque

d’athérome essentiellement composée de lipides

riches en cholestérol enveloppée dans une sclérose,

i.e. une gaine fibreuse formée par l’épaississement

de la paroi artérielle (Lusis, 2000). L’OMS l’a définie

comme étant une association variable de

remaniements de l’intima des artères de moyen et de

gros calibre, consistant en une accumulation locale

de lipides, de glucides complexes, de sang et de

produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts

calcaires. Le tout s’accompagne de modifications de

la média. Cette pathologie a longtemps été

considérée uniquement comme un dépôt passif de

lipides, mais aujourd’hui l’athérosclérose est

également définie comme une maladie inflammatoire

chronique entraînée par les lipides, en particulier les

LDLs (« low density lipoproteins ») contenant

l’apolipoprotéine (Apo) B, et les leucocytes (Swirski

et Nahrendorf, 2013). L’athérosclérose peut aussi

toucher des artères de plus petites tailles, comme les

artères coronaires (Libby et al., 2002).

L’accumulation de lipides, et notamment de LDL

oxydés (oxLDL) dans les artères entre l’endothélium

et la lame élastique interne induit une augmentation

de l’expression de certaines molécules d’adhésion

sur la surface endothéliale des vaisseaux, dont la V-

CAM 1 (« Vascular Cell Adhesion Protein 1 »), l’ICAM

(« Intercellular Adhesion Molecule ») et la P-Sélectine

(Poston et Johnson-Tidey, 1996). Ces molécules

permettent l’adhésion de monocytes sanguins

circulants qui d’ordinaire ne se fixent pas

(Blankenberg et al., 2003). Ensuite, sous l’effet de

facteurs chimiotactiques, dont la MCP-1 (« Monocyte

Chemoattractant Protein 1 ») et l’interleukine 8 (IL-8),

les monocytes adhérents pénètrent l’intima à travers

les jonctions inter-endothéliales. Ces facteurs sont

fortement exprimés par les cellules endothéliales de

la plaque d’athérome. Les monocytes se différencient

ensuite en macrophages sous l’action du M-CSF

(« Macrophage colony-stimulating factor ») sécrété

par les cellules endothéliales. Ces derniers expriment



le récepteur Apo B/E et jouent un rôle « d’éboueurs »

(« scavenger ») en phagocytant les oxLDL accumulés

dans l’espace sous-endothélial. Les macrophages se

chargent donc en cholestérol, ce qui conduit à leur

transformation en cellules dites « spumeuses » qui

s’accumulent. Cette accumulation engendre une

réaction inflammatoire chronique et des lymphocytes

T sont à leur tour recrutés dans l’intima. Les

lymphocytes T libèrent de l’interféron (IFN)-γ et du

TNF (« tumor necrosis factor »)-α/β qui stimulent les

cellules spumeuses qui vont à leur tour libérer des

cytokines pro-inflammatoires et/ou pro-apoptotiques

telles que le TNF-α et l’IL-1β. Ces cytokines

renforcent le caractère pro-inflammatoire de la plaque

d’athérome et ont une action autocrine sur les

macrophages transformés en cellules spumeuses.

Elles les activent et induisent la libération de

microparticules (MPs) (Spagnoli et al., 2007).

3. Les microparticules

Les MPs sont dérivées de fragments de membrane

plasmique issue de la cellule qui les sécrète. Leur

taille varie de 0,1 à 1μm de diamètre. Elles peuvent

se retrouver libérées dans le milieu extracellulaire

suite à une activation cellulaire ou à un phénomène

apoptotique (Biro et al., 2007; Sewify et al., 2013).

Au départ décrites comme des « déchets

cellulaires », « platelet dust » (Wolf, 1967), elles sont

aujourd’hui considérées comme de véritables

vecteurs biologiques. En effet, elles portent aussi

bien des marqueurs membranaires que différents

constitutants du cytoplasme ou du noyau (ADN,

ARNm ou miRNA). Les stimuli à l’origine de la

production de microparticules sont multiples et leur

contenu est très varié (Budaj et al., 2012; Cocucci

et al., 2009; Distler et al., 2005). En théorie, toutes

les cellules peuvent en produire, mais les modèles

les plus utilisés pour leur étude sont ceux qui sont le

plus facilement collectables, c'est-à-dire les cellules

sanguines circulantes telles que les plaquettes, les

lymphocytes et les monocytes. La sécrétion de MPs

est souvent liée à une apoptose déclenchée soit par

un stress oxydatif important, de grandes forces de

cisaillement « shear stress » ou des lésions.

Toutefois, la sécrétion de MPs peut aussi être

déclenchée par une activation de la cellule. C’est par

exemple le cas des plaquettes et des cellules

endothéliales (Jenkins et al., 2013). Une fois

libérées, elles pourront soit intéragir avec différents

ligands portés par leurs cellules cibles et ainsi activer

différentes cascades de signalisation, soit transférer

certains de leurs constituants via des phénomènes

d’internalisation ou de fusion membranaire (Hugel et

al., 2005). Les MPs permettent ainsi à leurs cellules

cibles d’acquérir de nouvelles propriétés et fontions

biologiques. Leur implication a été démontrée dans

de nombreux processus physiopathologiques tels que

la thrombose, les diabètes, l’inflammation,

l’angiogenèse, le processus tumoral et

l’athérosclérose (Freyssinet, 2003 ; Piccin, 2007).

4. Le couplage excitation-

contraction

Le couplage excitation-contraction cardiaque est un

processus qui englobe la stimulation électrique des

cardiomyocytes ventriculaires (i.e. du myocarde) et

ainsi la contraction du cœur permettant d’assurer une

distribution sanguine dans tout l’organisme. Les

cardiomyocytes ventriculaires contiennent des

protéines myofibrillaires longitudinales regroupées en

sarcomères, donnant cet aspect strié à la cellule

cardiaque observée en microscopie optique. Le

raccourcissement simultané de ces sarcomères au

niveau cellulaire entraîne le phénomène de



contraction myocardique. Le calcium (Ca2+) est le

messager ubiquitaire essentiel pour cette activité

contractile. La propagation d’un potentiel d’action,

initié au niveau sinusal auriculaire cardiaque, le long

du sarcolemme et du système tubulaire transverse

des cardiomyocytes induit une entrée de Ca2+ dans le

cardiomyocyte via l’ouverture des canaux calciques

potentiel-dépendants de type L (Long Lasting) (ICaL).

Cette entrée d’ions Ca2+ va activer des récepteurs-

canaux sensibles à la ryanodine (RYR) qui vont

permettre une sortie massive de Ca2+ du RS, i.e. le

transitoire calcique. Cette sortie de Ca2+ du RS est

amplifiée par un rétrocontrôle positif autocatalytique,

le mécanisme de CICR (« Calcium-induced Calcium

Release ») (Lee et Keener, 2008). La concentration

calcique passe de 10-8 à 10-6 M. Le Ca2+ induit

l’activation des myofibrilles et ainsi le

raccourcissement sarcomérique, i.e. la contraction.

La concentration de Ca2+ cytosolique doit ensuite

diminuer pour permettre la relaxation de l’appareil

contractile. Le Ca2+ est ainsi principalement (chez la

souris 93%) repompé par la pompe ATPasique

SERCA (« Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-

ATPase ») du RS, et aussi (7%) expulsé par

l’échangeur Sodium/Calcium NCX et la Ca2+ ATPase

du sarcolemme vers le milieu extracellulaire (Bers,

2002).

5. Objectif de l’étude

Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au

niveau des artères coronaires implique l’activation

des monocytes/macrophages et la libération de MPs

dans la circulation sanguine, qui ainsi peuvent venir à

proximité des cardiomyocytes myocardique. Par

ailleurs, une expression importante du TNF-α par les

macrophages de la plaque d’athérome a été mise en

évidence, ce qui rend fortement probable que les

MPs issues de ces derniers puisse porter cette

cytokine (Martinez et al., 2005 ; Tedgui et Mallat,

2006). TNF-α est une protéine impliquée dans

l’inflammation systémique et appartient à un groupe

de cytokines qui stimulent la réaction inflammatoire

aiguë. Il existe deux formes de TNF-α, une forme

transmembranaire et une forme libre (Horiuchi et al.,

2010). Le TNF-α transmembranaire (26 kDa) est un

précurseur de la forme soluble du TNF-α (17 kDa), on

le retrouve exprimé par les macrophages activés et il

peut-être clivé sous l’action d’une « TNF-α-converting

enzyme » (TACE) pour générer la forme soluble du

TNF-α. Cette forme soluble libre est capable de se

lier aux récepteurs TNF de type 1 et 2 (TNF-R1 et

TNF-R2) portés par les cardiomyocytes.

Une étude préliminaire réalisée dans des

cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de

montrer que des MPs macrophagiques issues de la

lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de

ralentir le raccourcissement des sarcomères (effet

inotrope négatif), sans affecter les transitoires

calciques (Milbank et al., 2014). L’objectif de cette

étude a donc été de déterminer si le TNF-α est

effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un

rôle dans les effets observés des MPs sur la

performance contractile des cardiomyocytes murins

adultes. Un inhibiteur spécifique et irréversible des

récepteurs aux TNF-α, le SPD-304 (10μM ;

Calbiochem) a été utilisé afin de vérifier cette

implication du TNF-α.



Matériel et méthodes

1. Culture des macrophages

RAW 264.7 et obtention

des microparticules

macrophagiques

1.1. Culture cellulaire de la lignée RAW 264.7

RAW 264.7 est une lignée de macrophages obtenue

à partir de souris (Mus Musculus) BALB/c (American

Type Culture Collection, Manasses, VA, USA). Ces

cellules ont été par la suite mises en culture dans un

milieu DMEM (Lonza), additionné de 10% de sérum

de veau fœtal (SVF) décomplémenté, de 1% de

Pénicilline/Streptomycine, et de 1% de L-gluthamine.

Les cellules ont été placées dans une atmosphère

humidifiée à 5% de CO2 et à 37°C. Le milieu a été

changé toutes les 48 heures, lorsque les cellules

étaient à 90% de confluence environ. Les

macrophages RAW 264.7 utilisés dans cette étude

pour produire des microparticules l’ont été entre des

repiquages R3 et R10.

1.2. Obtention des microparticules

La lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 a

donc été utilisée pour la production de MPs. Les

cellules ont été réensemencées à une densité de

2.106 cellules/mL puis mises en culture comme décrit

ci-dessus. La production de MPs a été déclenchée

par traitement durant 24 heures avec soit avec de

l’actinomycine D (ActD, 1μg/mL), soit avec de

l’interleukine-1β (IL-1β ; 10ng/mL) seul, soit du TNF-α

(5ng/mL) seul, soit du TNF-α et de l’IL-1β combinés.

Le traitement le plus efficace pour induire la

production de MPs est l’ActD, qui induit l’apoptose

des macrophages. Quatre types de MPs sont ainsi

produites selon le type de stimulation. Un surnageant

a été obtenu par deux centrifugations de 750 g

pendant 15 minutes, et de 1500 g pendant 5 minutes

afin d’éliminer les cellules et les différents débris

cellulaires. Les MPs contenues dans le surnageant

ont été isolées grâce à deux centrifugations

successives pendant 30 minutes à 13 000 g, puis

deux fois 45 min à 13 000 g. Les MPs contenues

dans le surnageant ont été récupérées dans du NaCl

à 0,9 % et conservées à 4°C jusqu’à leur utilisation.

2. Isolement des

cardiomyocytes

2.1. Prélèvement des cœurs de souris C57BL/6 adultes

Les souris utilisées pour l’isolement des

cardiomyocytes ventriculaires sont des mâles de

souche C57BL/6. Elles ont été soumises à un régime

standard et furent utilisées à l’âge de 14 semaines.

Les cardiomyocytes ventriculaires ont été isolés par

dissociation mécanique comme décrit précédemment

(Pinz et al, 2011). Les souris sont soumises à un

prétraitement par de l’héparine (Héparine Choay,

Sanofi Aventis, Paris, 0,05 ml par voie

intrapéritonéale). L’héparine permet d’éviter toute

coagulation sanguine et éventuel infarctus. Après

vingt minutes, les animaux sont sacrifiés dans une

cuve à CO2. Une incision thoracique est ensuite

réalisée, afin d’exposer le cœur.

2.2. Montage Langendorff et digestion enzymatique

Une fois détaché, le cœur est canulé par l’aorte et

placé sur le montage Langendorff. Les artères

coronaires du ventricule gauche sont donc perfusées



de façon rétrograde par une solution tampon HANKS-

HEPES sans Ca2+ ajouté, dite de lavage, à 37°C

(NaCl : 113 mM, KCl : 4,7 mM, KH2PO4: 0,6 mM,

KHCO3 : 10 mM, Na2HPO4 : 0,6 mM, NaHCO3 : 12

mM, HEPES : 10 mM, MgCl2 :1,2 mM, glucose : 5,5

mM, taurine : 29 mM, pH ajusté à 7,4 avec du NaOH

5N) ce qui permet d’enlever toutes traces sanguines

dans les artères coronaires. Du 2,3-Butanedione

monoxime (BDM, 10 mM) est ajouté dans cette

solution de lavage. Il s’agit d’une substance

cardioplégique qui d’inhibe l’ATPase de la myosine et

empêche rapidement et réversiblement la formation

des ponts entre actine et myosine. Cela permet au

cœur de rester en permanence relaxé et prévient les

dommages dus aux contractions terminales, à

l’ischémie et à la reperfusion (Louch et al, 2011).

Toutefois, l’utilisation de ce milieu très réduit en Ca2+

entraîne une fragilisation du sarcolemme qui peut

induire une accumulation de sodium (Na+). Si bien

que lors de la réintroduction du Ca2+ extracellulaire,

l’échange Na+/Ca2+ est dans le sens d’une entrée de

Ca2+, ce qui va induire une surcharge en Ca2+

intracellulaire dramatique pour la survie de la cellule.

C’est pourquoi la solution de lavage contient aussi de

la taurine (3 mM) qui permet de protèger les cellules

contre ce phénomène appelé « paradoxe calcique ».

Il existe en effet un symport taurine/Na+ permettant

de vider la cellule d’une surcharge de sodium.

Ensuite, une solution de lavage contenant de la

Liberase (Solution commerciale contenant différents

types de collagénases ; Roche, 10 ml/mL) est

perfusée jusqu’à ce qu’une augmentation du débit

d’écoulement soit observée (6-9 min), ce qui

témoigne d’une bonne digestion des connections

intercellulaires. Une fois digéré, le cœur est détaché

par coupure au niveau des oreillettes. Puis, les

cellules sont dissociées par séparation mécanique,

filtrées et mises à sédimenter pendant 10 minutes. La

concentration calcique du milieu est alors augmentée

durant une phase de réplétion en 4 étapes

successives de 5 min jusqu’à atteindre 1 mM.

Pour les études par Western-Blot, les cardiomyocytes

sont ensuite déposés dans des boites de Pétri (35

mm de diamètre) prétraitées avec de la laminine (20

mg/mL) en présence d’une solution de Tyrode (NaCl :

113mM, KCl :4,7mM, MgCl2 : 1,2 mM, Na2HPO4 : 0,6

mM, NaHCO3 : 4,4 mM, HEPES : 20 mM, glucose :

10 mM, taurine : 20 mM, Na pyruvate : 3 mM, CaCl2 :

1,25mM, pH : 7,35) pendant 2-3 heures.

Pour les études fonctionnelles, ce n’est pas la boite

de Pétri qui est prétraitée avec de la laminine (20

mg/mL) mais une lamelle de verre (Corning, 25x25

mm) placée à l’intérieur de la boite de Pétri (35 mm)

en présence de la même solution de Tyrode pendant

2-3 heures.

3. Analyse fonctionnelle :

Mesure de la contraction

et du transitoire calcique

des cardiomyocytes

isolés

3.1. Marquage des cardiomyocytes par la sonde Fura-2AM

Les cardiomyocytes sont chargés ou non avec du

Fura-2AM (ester acétoxyméthylé perméant,

Molecular Probes, 1μM dans du DMSO [diméthyl

sulfoxide]) à température ambiante et obscurité

pendant 20 minutes, puis lavés durant 5 minutes

avec la solution de Tyrode afin de permettre la

désestérification du Fura-2 intracellulaire.



3.2. Systèmes d’enregistrement

Les raccourcissements des sarcomères et les

transitoires calciques ont été enregistrés

simultanément en imposant une stimulation électrique

de champ (0,5 Hz, 0,1 ms, 7-15 V) à l’aide du

système IonOptix (Myocyte Calcium and Contractility

Recording System, Dublin, Irlande) couplé à un

microscope à fluorescence inversée (Episcopic

fluorescence attachment ef-inv-II ; Inverted

microscope AE30-31). La contraction des sarcomères

est enregistrée à une fréquence de 500 Hz tandis que

les transitoires calciques sont enregistrés à une

fréquence de 250 Hz. Les réponses sont analysées

avec le logiciel IonWizard 6.3 (IonOptix).

4. Analyse moléculaire

Suite aux différentes stimulations, les cardiomyocytes

sont détachés par grattage, puis les protéines en sont

extraites. Pour cela, les cellules sont récupérées

dans des tubes eppendorf et centrifugés à 500g

pendant 5 minutes à 20°C. Le culot est repris dans du

PBS, puis centrifugé à 1500g pendant 5 minutes. Le

surnageant est ensuite éliminé et le culot plongé dans

l’azote liquide. Dans un premier temps, le dosage des

protéines est réalisé selon la méthode de Lowry. Ce

dosage permet d’orienter la manière dont il est

possible d’exploiter l’échantillon par la suite et

notamment de savoir si la quantité de protéines est

suffisante pour une détection par Western-Blot. Le

reste de l’échantillon est ensuite utilisé pour réaliser

des Western-Blot.

4.1. Dosage des protéines

Le dosage des protéines a été réalisé en suivant le

protocole de Lowry. 5 μL d’échantillons sont déposés

en duplicate sur une plaque 96 puits. 25 μL de réactif

A (BioRad), contenant des ions Cu2+, sont ensuite

ajoutés. Les atomes d’azote contenus dans les

liaisons peptidiques des protéines réduisent ces ions

Cu2+ en ions Cu+. Puis, 200 μL d’un réactif B

(BioRad) sont ajoutés. Ce dernier va former un

complexe de couleur bleu avec les ions Cu+. La

plaque est laissée à incuber 10 minutes à l’abri de la

lumière puis l’absorbance est mesurée à 570 nm

grâce à un lecteur de microplaques (Mithras LB 940,

Berthold technologies). La détermination de la

concentration se fait par comparaison avec

l’absorbance mesurée d’une gamme étalon de BSA

(« Bovine serum albumine ») 5%.

4.2. Western-Blot

Les protéines sont séparées sur un gel de poly-

acrylamide (Novex Protein from Life technologies,

NuPAGE 4-12% Bis-Tri Gel ; 1,0 mm X 12 well ou 1,5

mm X 10 well) pendant 90 minutes à 150 V, puis

transférées sur une membrane de nitrocellulose

pendant 90 minutes à 110 V à 4°C. La membrane est

alors colorée au rouge Ponceau puis saturée avec

une solution de sérum d’albumine bovine (BSA) à 5%

pendant 90 minutes à température ambiante afin

d’éliminer les sites de fixation non spécifiques.

Ensuite, la membrane est mise à incuber avec

l’anticorps primaire pendant 90 minutes à

température ambiante, ou à 4°C durant la nuit. Le

lendemain, 3 lavages de 10 minutes au TBS-Tween

(Tris buffered saline and Tween) (20 mM Tris ;

61,5mM NaCl ; 0,1% Tween) sont effectués afin

d’éliminer l’anticorps en excès. L’anticorps

secondaire couplé à la peroxydase est alors mis à

incuber avec la membrane pendant 90 minutes à

température ambiante, puis une autre série de

lavages, 3 fois 10 minutes, avec du TBS-Tween est

effectuée. Les protéines sont révélées par



chemiluminescence soit avec du luminol (Santa Cruz)

pendant 1 minute, soit grâce au kit de révélation

SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity

Substrate (ThermoScientific, Fischer) pendant 3

minutes. La révélation s’effectue grâce à un système

d’acquisition en chambre noire (ChemiSmart 500,

Vilbert Lourmat) et du logiciel Chemi-Capt 5.0. Les

différents anticorps qui ont été utilisés sont l’anticorps

polyclonal anti-TNF-α (Santa Cruz, 1/500) produit

chez la chèvre, l’anticorps polyclonal anti-α-tubuline

(Santa Cruz, 1/500) produit chez la chèvre et l’anti-

IgG de chèvre conjugué à HRP (Santa Cruz, 1/5000)

produit chez l’âne.

5. Analyses statistiques

Les différentes bandes d’intérêt des Western Blot

sont quantifiées relativement à l’aide du logiciel BIO-

1D. Ces résultats sont exprimés en moyenne ± erreur

standard à la moyenne (ESM) de “n” expériences, i.e.

le nombre de souris étudiées. Les différences entre

les groupes de données ont été comparées à l’aide

d’un Mann-Whitney non paramétrique à l’aide du

logiciel Prism 5.0. Une valeur de P inférieur à 0,05 a

été admise pour que les différences entre les

données soient considérées comme significatives.

Les résultats des analyes fonctionnelles sont

exprimés en moyenne ± ESM de « n » expériences,

i.e. le nombre de cellules étudiées. Les différences

entre les groupes de données ont été comparées sur

le logiciel Prism 5.0 à l’aide du test t (test de Student)

non apparié et par la méthode statistique ANOVA,

suivie d’un test de comparaisons multiples de

Bonferroni, pour les expériences utilisant les MPs.

Une valeur de P inférieure à 0,05 a été admise pour

que les différences entre les données soient

considérées comme significatives.

Résultats

1. Le TNFαest présent dans

les MPs macrophagiques

Le TNF-α a été détecté par Western-blot sur des

extraits protéiques de MPs issues de macrophages

RAW 264.7 traitées avec de l’ActD (figure 1). Sur les

membranes de nitrocellulose, on peut notamment

distinguer les bandes correspondant aux deux formes

de TNF-α, libre (17kDa) et transmembranaire

(26kDa).

Figure 1 : Western-blot montrant la présence de

TNF-α dans les MPs

Expression du TNF-α (n=3)

2. TNF per se induit un

effet inotrope négatif

L’étude de l’effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la

contractilité des cardiomyocytes (figure 2) indique

que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur les

cardiomyocytes dès 15 min et induit un

ralentissement des cinétiques de raccourcissement et

de relaxation sarcomérique.



Figure 2: Effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la

contractilité des cardiomyocytes

A : Amplitude maximale de raccourcissement (% de

variation de la longueur basale de sarcomère)

B : Vitesse maximale de raccourcissement (-dL/dt, en

μm/sec)

C : Vitesse maximale de réallongement (+dL/dt, en

μm/sec)

Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=24-

28 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).

3. Le TNF-α n’a pas d’effet

sur les transitoires

calciques

L’étude de l’effet du TNF-α (800 U/mL) sur les

transitoires calciques des cardiomyocytes (figure 3)

indique qu’il n’y a pas d’effets significatifs du TNF-α

sur les différents paramètres du transitoire calcique.

Figure 3: Effets contrôles du TNF-α (800 U/mL)

sur les transitoires calciques des cardiomyocytes

A : Pourcentage de variation du rapport de

fluorescence F340/F380

B : Vitesse maximale de sortie de Ca2+ à l’extérieur

du RS (depV)

C : Temps au pic depuis t0 (milliseconde) (peak T)

D : Vitesse maximale de repompage du Ca2+ (retV)

E : Constante de tps de repompage calcique (en

milliseconde) (TAU)


28 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).



4. Les MPS induisent un

effet inotrope négatif

L’étude de l’effet des MPs sur la contractilité des

cardiomyocytes (figure 4) indique que les MPs ont un

effet inotrope négatif rapide sur les cardiomyocytes

car ils induisent une diminution des

raccourcissements sarcomériques.

Figure 4 : Effet des MPs à 1 et 10 μg/ml sur la

contractilité des cardiomyocytes

A : Enregistrement typique des raccourcissements

sarcomérique

B : Enregistrement typique des transitoires calciques

C : histogramme présentant l’effet des MPs à 1 et 10

μg/ml sur le pourcentage de raccourcissement

sarcomérique. Les valeurs représentent les

moyennes ± ESM; n=28-50 cellules par groupe,

*P<0,05 vs. contrôle (CTRL).

5. Le SPD-304 inhibe l’effet

des MPs macrophagiques

L’étude de l’effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet

inotrope négatif des MPs (figure 5) indique que Le

SPD-30 empêche l’effet inotrope négatif des MPs.

Figure 5: Effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet

inotrope négatif des MPs

A : Pourcentages des raccourcissements

sarcomériques des cardiomyocytes étudiés par



vidéo-imaging en présence ou non de MPs et de

SPD-304

B : Vitesse maximale de contraction sarcomérique

(depV, μm/sec)

C : Vitesse maximale de relaxation sarcomérique

(retV, μm/sec)


50 cellules par groupe, *P<0,05 vs. contrôle (CTRL).

Discussion

Lors de cette étude, la présence de TNF-α a bien été

confirmée dans les MPs. De plus le TNF-α a un effet

inotrope négatif sur la contraction, i.e. provoque une

diminution de la contractilité des cardiomyocytes.

Cependant, cette diminution de la contractilité ne

s’accompagne pas d’une modification des transitoires

calciques. Nous avons confirmé que les MPs

induisent un effet inotrope négatif. L’inhibition de la

voie du TNF-α par son inhibiteur SPD-304 rétablie la

contractilité normale. L’ensemble de ces résultats

suggère que le TNF-α est impliqué dans l’effet

inotrope négatif des MPs issues de macrophages sur

la contractilité des cardiomyocytes.

Il existe un autre mécanisme d’intéraction potentiel

entre MPs et cardiomyocytes différent de l’intéraction

ligand-récepteur, l’internalisation. Ce processus

d’internalisation des MPs sur des cardiomyocytes a

déjà été étudié (Milbank et al., 2014). Il a ainsi été

montré que les MPs commencent à être internalisées

seulement après 1 heure au contact d’un

cardiomyocyte, tandis que l’effet inotrope négatif des

MPs est observé seulement après 5 minutes.

L’implication de ce mode d’action est donc écartée.

Le temps de traitement avec les MPs est également

trop court pour entraîner des modifications

d’expression de protéines impliquées dans le

couplage excitation-contraction.

Les résultats indiquent que le TNF-α

transmembranaire est porté par les MPs issues des

macrophages RAW 264.7 traités avec de l’Act D. De

plus, il a été montré que le TNF-α transmembranaire

est capable d’intéragir avec le TNF-R1 et le TNF-R2

(Horiuchi et al., 2010). Ces récepteurs TNF-R1 et

TNF-R2 se retrouvent exprimés à la surface des

cardiomyocytes (Higuchi et al., 2004).

Il n’y a pas eu d’effet observé des MPs sur le

transitoire calcique. Il est néanmoins possible qu’il y

ait un effet et que cet effet ne soit pas détectable

avec la technique utilisée ou que la libération de Ca2+

à partir du RS cache la diminution éventuelle de

l’entrée de Ca2+ par ICaL. Cependant, d’autres

travaux indiquent que le TNF-α aurait plutôt un effet

sur la sensibilité des protéines contractiles au Ca2+

(Goldhaber et al., 1996). En présence de TNF-α, la

sensibilité des protéines contractiles, comme l’actine,

la myosine ou la troponine I au Ca2+ serait diminuée.

Conclusion

La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée

dans l’effet des MPs macrophagiques sur la

contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant

intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté

par ces MPs en explorant diverses voies de

signalisation du TNF-α, comme la voie du

NO/cGMP/PKG, la voie phospholipase A2/acide

arachidonique et la voie sphingosines. Différents

inhibiteurs pharmacologiques pourraient être utilisés

comme la L-Nitroarginine (LNA) qui est un inhibiteur

de la « nitric oxide synthase » (NOS), l’ODQ (1H-

[1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one) qui est un



inhibiteur de la guanylate cyclase soluble (GCs), le

KT 5823 qui est un inhibiteur de la protéine kinase G

(PKG), l’AACOCF3 (Arachidonyl trifluoromethyl

ketone) qui est un inhibiteur de la phospholipase-A2

et le SKI-II (Sphingosine kinase inhibitor 2). Un

« cross-talk » entre la voie de la PLA2/AA et la voie

médiée par le TNF-α a par ailleurs été démontré

récemment (Saito et al., 2012).

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Mémoire de M1 SIMS (2014)

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