Izoelektricna tacka (izracunavanje)
2
Zadatak: odrediti smer kretanja peptida Ala-Cys-Ser-Lys-Asp pri elektroforezi na pH=4. Teorijske osnove: Smer kretanja molekula pri elektroforezi zavisi od naelektrisanja čestice – katjoni putuju ka katodi, anjoni ka anodi. Naelektrisanje molekula aminokiselina, peptida i proteina zavisi od naelektrisanja pojedinih funkcionalnih grupa. Grupe koje mogu nositi naelektrisanje su: α-COOH, α-NH 2 , i određene grupe u bočnim nizovima (guanidino-grupa Arg, dodatna COOH grupa Asp i Glu, SH kod Cys, imidazol kod His, ε-NH 2 kod Lys, fenolna OH kod Tyr). Naelektrisanje ovih grupa zavisiće od pH vrednosti. Pri pH<pK a , one će biti protonovane, a pri pH>pKa – deprotonovane: R-COOH ⇔ R-COO – + H + R-PhOH ⇔ R-PhO – + H + (Ph = fenil) R-SH ⇔ R-S – + H + R-NH 3 + ⇔ R-NH 2 + H + R-GuH + ⇔ R-Gu + H + (Gu = guanidino) R-ImH + ⇔ R-Im + H + (Im = imidazol) Rešenje: Da bismo utvrditi nelektrisanje peptida pri datoj pH vrednosti, moramo dakle utvrditi kako se pH svih grupa menja u funkciji pH. U slučaju gore navedenog peptida, grupe koje mogu razmenjivati proton i pri tome menjati naelektrisanje su: Obratiti pažnju: α-COOH grupe Ala, Ser, Cys i Lys, i α-NH 2 grupe Ser, Cys, Lys i Asp uključene su u građenje peptidne veze te ne mogu da razmenjuju protone. U sledećem koraku, izvlačimo iz tablica pKa vrednosti za sve grupe koje mogu doprineti naelektrisanju. Konstruišemo tablicu, tako da u prvoj koloni budu navedene grupe, a u prvom redu – pKa vrednosti, poređane od najniže ka najvišoj. 1,95 3,71 8,14 9,71 10,67 αNH 3 + (Ala) SH (Cys) εNH 3 + (Lys) αCOOH (Asp) βCOOH (Asp) Σ
description
Ukratko izracunavanje izoelektricne tacke kod polipeptida i odredjivanje smera kretanja na elektroforezi
Transcript of Izoelektricna tacka (izracunavanje)
Zadatak: odrediti smer kretanja peptida Ala-Cys-Ser-Lys-Asp pri elektroforezi na pH=4. Teorijske osnove: Smer kretanja molekula pri elektroforezi zavisi od naelektrisanja čestice – katjoni putuju ka katodi, anjoni ka anodi. Naelektrisanje molekula aminokiselina, peptida i proteina zavisi od naelektrisanja pojedinih funkcionalnih grupa. Grupe koje mogu nositi naelektrisanje su: α-COOH, α-NH2, i određene grupe u bočnim nizovima (guanidino-grupa Arg, dodatna COOH grupa Asp i Glu, SH kod Cys, imidazol kod His, ε-NH2 kod Lys, fenolna OH kod Tyr). Naelektrisanje ovih grupa zavisiće od pH vrednosti. Pri pH<pKa, one će biti protonovane, a pri pH>pKa – deprotonovane:
R-COOH ⇔ R-COO– + H+
R-PhOH ⇔ R-PhO– + H+ (Ph = fenil) R-SH ⇔ R-S– + H+ R-NH3
+ ⇔ R-NH2 + H+ R-GuH+ ⇔ R-Gu + H+ (Gu = guanidino) R-ImH+ ⇔ R-Im + H+ (Im = imidazol)
Rešenje: Da bismo utvrditi nelektrisanje peptida pri datoj pH vrednosti, moramo dakle utvrditi kako se pH svih grupa menja u funkciji pH. U slučaju gore navedenog peptida, grupe koje mogu razmenjivati proton i pri tome menjati naelektrisanje su:
Obratiti pažnju: α-COOH grupe Ala, Ser, Cys i Lys, i α-NH2 grupe Ser, Cys, Lys i Asp uključene su u građenje peptidne veze te ne mogu da razmenjuju protone. U sledećem koraku, izvlačimo iz tablica pKa vrednosti za sve grupe koje mogu doprineti naelektrisanju. Konstruišemo tablicu, tako da u prvoj koloni budu navedene grupe, a u prvom redu – pKa vrednosti, poređane od najniže ka najvišoj.
1,95 3,71 8,14 9,71 10,67 αNH3
+ (Ala) SH (Cys) εNH3
+ (Lys) αCOOH (Asp) βCOOH (Asp)
Σ
Sada za svaku grupu upisujemo njeno naelektrisanje pri pH intervalima datim u prvom redu, koristeći gore navedenu činjenicu da je grupa pri pH<pKa protonovana, a pri pH>pKa deprotonovana. Na osnovu naelektrisanja pojedinačnih grupa, računamo naelektrisanje kompletnog molekula u datom pH intervalu.
1,95 3,71 8,14 9,71 10,67 αNH3
+ (Ala) + + + + 0 0 SH (Cys) 0 0 0 – – – εNH3
+ (Lys) + + + + + 0 αCOOH (Asp) 0 – – – – – βCOOH (Asp) 0 0 – – – –
Σ +2 +1 0 –1 –2 –3 Kao što vidimo, izoelektrična tačka (pH pri kome je ukupno naelektrisanje jednako nuli) nalazi se negde u pH intervalu 3,71–8,14. Njenu vrednost računamo kao:
3 71 8 14 5 922
. .IET .+= =
Na kraju, određujemo smer kretanja peptida pri pH=4. Pošto je pH<IET, molekul će biti protonovan, te će nositi pozitivno naelektrisanje (što se vidi i iz tabele). Sledi da će se on kretati prema katodi.
