IL LABORATORIO NELLEURGENZE ED EMERGENZE

Aula Golgi, 2-3 Ottobre 2009, Tor Vergata

β2-microglobulina e KIM-1: punto di vista del Laboratorio

Dr. Rossella Zenobi

Prima che un marcatore possa essere ritenuto clinicamente utile deve :

Essere affidabileDare ulteriori informazioni prognostiche rispetto ai vecchi markerDare informazione sul segmento del nefrone interessatoEssere utile per il monitoraggio della malattiaEssere validato clinicamente

Più utili marker urinari che sierici, solo i primi possono essere di origine esclusivamente renale

La β2−Microglobulina ha un peso molecolare di 11800 dalton e si trova come costituente naturale in tutte le cellule nucleate come componente del sistema HLA.

La sua struttura è formata da 7 foglietti beta intrecciati tipici della superfamiglia delle immunoglobuline, in vitro forma facilmente fibrille amiloidi denaturandosi a pH acido

A pH naturale è in grado di allungare le fibrille ma non di iniziare il deposito.

Si trova costantemente nel sangue a basse concentrazioni e viene liberamente filtrata dal rene dove viene riassorbita e degradata dai tubuli renali.

È stata associata da tempo all’amiloidosi secondaria alla dialisi (DRA) in pazienti nefropatici, inizialmente si pensava limitata ai tessuti osteoarticolari ma è stato recentemente scoperto anche negli organi viscerali.

La β2−microglobulina è il principale costituente del deposito amiloidoso, supportando così l’idea che non ci sia attivazione proteolitica per la formazione delle fibrille amoiloidi.

Studi in vitro mostrano effetti antianabolici sui condrociti cartilaginei e questo potrebbe essere il meccanismo d’azione della degradazione della cartilagine nei pazienti dializzati.È stato evidenziato una correlazione positiva tra la severità dell’amiloidosi gastrointestinale ed il tempo di dialisi dei pazienti.La cinetica di formazione delle fibrille sembra seguire un iniziale processo di polimerizzazione con un lungo tempo di latenza per la formazione del nucleo ed un rapido accrescimento delle fibrille.

AJ Borysik et al.: Glycosaminoglycans in dialysis-related amyloidosis 2007

Studi in vitro hanno dimostrato che alcuni glicosaminoglicani (GAGs) come l’eparina, il 4-condroitinsolfato ed il 6 condroitinsolfato, normalmente presenti nelle giunzioni osteo-articolari possono iniziare il deposito del nucleo fibrillare a pH fisiologico.

d-eparina e- 4-condroitinsolfato f- 6-condroitinsolfato

AJ Borysik et al.: Glycosaminoglycans in dialysis-related amyloidosis 2007

Nella foto e deposito di amiloide nella parete dei vasi (birifrangenza verde sotto luce polarizzata).

Nella foto f dimostrazione che i depositi di amiloide sono costituiti da beta 2 microglobulina (colorazione immunoistochimica specifica).

Un aumento di β2- microglobulina nei valori urinari è associato con la presenza di danno tubulare; quindi la determinazione di questa nelle urine è un mezzo adatto per la diagnosi e la valutazione successiva del danno renale tubulointerstiziale.

La metodica di scelta, per il dosaggio della β2−microglobulina a livello diagnostico, è una metodica nefelometrica, questa permette il dosaggio sia su campioni di siero o plasma che sulle urine.

Particelle di polistirene rivestite con anticorpi specifici anti-β2−microglobulina umana vengono aggregati dalla β2-microglobulina umana presente nel campione. Questi aggregati diffondono un fascio di luce che attraversa il campione. L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla concentrazione della relativa proteina presente nel campione. Il risultato può essere determinato confrontandolo con uno standard a concentrazione nota.

Nefelometria [dal greco nephélē “nebbia”, “nuvola”] : metodo di analisi ottica in cui viene misurata la dispersione della luce emessa lateralmente.

La nefelometria viene adottata soprattutto nella quantificazione dei componenti determinati immunologicamente di siero, plasma, urine e liquido CSF (mediante reazione antigene-anticorpo).

La variabile di misurazione è la luce dispersa su aggregati di antigeni-anticorpi in una soluzione rilevata fotometricamente. Questo metodo consente di ottenere misurazioni particolarmente sensibili.

Sorgente luminosa: LED a infrarossi

Lunghezza d'onda: 840 nmRilevatore: fotodiodo al silicio

Dr. G. Bruschetti © 2008 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.

L’effetto di dispersione della luce deriva dal fatto che gli immunocomplessisi comportano da elementi di emissione di luce secondaria in seguito all'impatto del raggio incidente.

Il grado di dispersione della luce dipende dalla concentrazione delle particelle in sospensione, dal loro diametro e da altri parametri che normalmente vengono tenuti fissi per un determinato sistema di reazione.

Misurano, ad un angolo variabile rispetto alla luce incidente, l’incremento della luce dispersa conseguente alla formazione dei complessi antigene-anticorpo.I sistemi Behring Nephelometer (BN) effettuano misure nell'infrarosso ad una lunghezza d'onda di 840 nm e con un angolo di sfasatura rispetto al raggio incidente compreso tra 13° e 24°A questa lunghezza d'onda le più comuni sostanze interferenti che possono essere contenute nel siero assorbono in misura molto limitata.

Dr. G. Bruschetti © 2008 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.

Kidney injury molecule 1 (KIM-1) o T cells immunoglobulin mucin 1 (Tim-1)

È un recettore fosfotidilserinico.Poco presente nel rene sano ma sovraespresso nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale del rene ischemico.Il suo dominio extracellulare è tagliato, vicino alla membrana da una metalloproteasi, ed è rilasciato in forma solubile.Questo rilascio spiega la sua presenza nelle urine di pazienti affetti da necrosi tubulare acuta.Bailly ha ipotizzato che questa forma solubile si leghi alle integrine, sopprimendo la loro funzione, permettendo così alle cellule epiteliali di muoversi durante la rigenerazione.

La parte extracellulare è tagliata da una metalloproteasi. La parte intracellulare ha un sito di fosforilazione della tirosina che potrebbe essere critico per la regolazione delle funzioni della KIM-1.

La famiglia genica è conosciuta come TIM perché queste proteine sono espresse dalle cellule T e contengono un dominio simile alle Ig ed uno simile alla mucina.Il primo prodotto genico TIM ad essere identificato è stato il KIM-1 nel rene ed il recettore cellulare per l’epatite A (HAVRC) nel fegato.

La famiglia consiste di 3 geni nel cromosoma 5q.

La struttura del dominio delle Ig è altamente conservata, mentre il dominio della mucina è variabile tra i membri ma sono tutti ricchi in treonina, serina e prolina.

KIM-1 è elevato nella nefrotossicità da farmaci, appare nelle urine, dopo insulto ischemico, entro 12 ore e prima che appaiano i cilindri.

È presente nel 100% delle biopsie da pazienti che mostrano danni tubulari.

La sua espressione potrebbe indicare una potenziale reversibilità del danno.

I suoi livelli potrebbero essere predittivi di rigetto del trapianto.

Nel danno tubulare la sovraespressione di KIM-1 è visibile lungo la superficie luminale del tubulo. (PT-tubulo prossimale, G-glomerulo).

Ichimura ipotizza che KIM-1 è un recettore funzionale che induce la fagocitosi delle cellule apoptotiche e che inoltre lega le LDL ossidate come le scavenger cells.

Le due azioni insieme eliminerebbero le cellule morte ed i detriti, facilitando la riparazione.

Anticorpi contro KIM-1 possono essere sia stimolatori che inibitori.

Kim-1–expressing tubule epithelial cells bind and internalize apoptotic bodies and necrotic debris in rat kidneys following ischemic injury. (A) By light microscopy, necrotic cellular debris (seen by differential interference contrast [DIC]) binds to apically located Kim-1 (dark brown) of surviving tubule epithelial cells (large arrows). An apoptotic body is seen in 1 Kim-1–positive epithelial cell (small arrow). (B) By fluorescence microscopy many DAPI-positive (blue) apoptotic bodies (large arrows) can be seen binding to the surface of Kim-1–positive (red) epithelial cells, and Kim-1–expressing cells have processes (red, small arrow) internalizing an apoptotic body (blue). In addition, apoptotic bodies have been internalized by Kim-1–positive epithelial cells (blue, arrowhead).

La KIM-1 legherebbe gli aminofosfolipidi espressi dalle cellule apoptotiche, con un meccanismo simile a quello usato dai macrofagi, ed innescherebbe l’internalizzazione dei detriti.

Inoltre sarebbe il primo recettore non legato alla linea mieloide che è in grado di legare non soltanto le LDL ossidate ma anche quelle native.

Il dosaggio della KIM-1 urinaria è effettuato con una metodica ELISA a sandwich basata su:

1. Ancoraggio di anticorpi di capra anti KIM-1 umana sul fondo di piastre a 96 pozzetti, seguito da un lavaggio

2. Legame della KIM-1 umana presente nel campione da parte dell’anticorpo ancorato

3. Legame di un anticorpo di capra anti KIM-1 biotilinato

4. Lavaggio del materiale non legato, seguito dall’aggiunta di perossidasi coniugata con la streptadivina che si lega all’anticorpo biotinilato

5. Lavaggio dell’enzima libero

6. Rilevazione della quantità di KIM-1 attraverso l’azione della perossidasi sul substrato (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina)

La rilevazione è fotometrica a 450 nm corretti per l’assorbimento a 540 nm

L’aumento dell’assorbimento è direttamente proporzionale alla quantità di KIM-1

La curva standard varia tra i 31.25 ai 2000 pg/mL

I campioni di urina vengono tenuti a 30’ a temperatura ambiente per una sedimentazione spontanea fino ad un massimo di 4h.

Il sovranatante viene aliquotato e conservato a -70°C fino al momento del dosaggio

Studi sul recupero mostrano che urine molto concentrate per la presenza di KIM-1 possono essere diluite fino ad 8x

Prove di stabilità hanno mostrato che la KIM-1 si mantiene abbastanza stabile fino a 14 giorni in ambiente refrigerato.

Valori di riferimento normali:

60-837 pg/mL

Linearità

Precisione

Chaturvedi S, Farmer T, Kapke GF. Assay validation for KIM-1: human urinary renal dysfunction biomarker.Int J Biol Sci. 2009;5(2):128-34

Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, Collings FB, Sunderland K, Gioules C, Bradwin G, Matsouaka R, Betensky RA, Curhan GC, Bonventre JV. Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in Humans. Clin Transl Sci. 2008 Dec;1(3):200-208.

Nanoparticelle d’oro colloidale vengono rivestite con Ab policlonali contro KIM-1

Si aggiunge il campione, se è presente la KIM-1, il complesso rapidamente migra, attraverso una membrana di nitrocellulosa, fino ad una linea dove incontra un Ab contro un altro epitopo della KIM-1

La presenza di KIM-1 viene rivelata in pochi minuti, dopo che le sfere si depositano sulla linea e vengono evidenziate da una linea rosso scura

TEST RAPIDO PER KIM-1

Range linearità= 1-20 ng/ml Limite inferiore di sensibilità= 0.8 ng/ml

Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB, Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck WC, Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A rapid urine test for early detection of k idney injury. Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14

I livelli che eccedono gli 800 pg/ml sembrano essere un ottimo cutoff (75% sensibilità, 89% specificità) tra pazienti con o senza AKI.

La correlazione tra ELISA e RenaStick è di r2 = 0.88

Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB, Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck WC, Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A rapid urine test for early detection of k idney injury.Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14

Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB, Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck WC, Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A rapid urine test for early detection of k idney injury.Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14

GRAZIE PER L’ATTENZIONE