H HLA™ 96/11 Δ A CE Δ B CE (ΑΝΑΦ: ΑΝΑΦ: Ο 1 2018/05/02CE... · 2018-05-14 ·...

0086ΠροετοιμάζειDNAγιαανάλυσηαλληλούχισηςστοIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗA&CEΚΑΙΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗB&CE

(ΑΝΑΦ:H32ΚΑΙΑΝΑΦ:H34)ΟΔΗΓΙΕΣΧΡΗΣΗΣ

ΕΚΔΟΣΗΣ12018/05/02

Γιαinvitroδιαγνωστικήχρήση

V1

OmixonHolotype96/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗ|ΔιαμόρφωσηA&CEκαιΔιαμόρφωσηB&CE|Οδηγίεςχρήσηςv1.Γιαinvitroδιαγνωστικήχρήση.Copyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Εμπιστευτικόκαιαποκλειστικήςκυριότητας

Σελίδα2│50

ΠίνακαςπεριεχομένωνΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ..................................................................................................................7

ΥΠΟΜΝΗΜΑΣΥΜΒΟΛΩΝ..........................................................................................................................7

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑΤΟΥΚΙΤHOLOTYPEHLA-96/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗA&CE(ΑΝΑΦ:H32)ΗΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗB&CE(ΑΝΑΦ:H34).........................................................................................................................................8

ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣΤΟΙΧΕΙΟΥΕΚΚΙΝΗΤΗ.....................................................................................................................................8ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣΤΟΙΧΕΙΟΥΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ..................................................................................8ΠΛΑΚΑΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΩΝ96ΠΗΓΑΔΙΩΝ.............................................................................................................................9ΒΙΒΛΙΟΕΡΓΑΣΙΑΣEXCEL..................................................................................................................................................9ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ–OMIXONHLATWIN...................................................................................................................................9

ΑΠΟΣΤΟΛΗΚΑΙΦΥΛΑΞΗ..........................................................................................................................10

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣΚΑΙΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ......................................................................................................10

ΓΝΩΣΤΟΙΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙΤΟΥΠΡΟΪΟΝΤΟΣ...........................................................................................................................10

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣΑΣΦΑΛΕΙΑΣ......................................................................................................................11

ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙΑΠΟΔΟΣΗΣ.........................................................................................................................11

ΤΕΧΝΙΚΗΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ..............................................................................................................................11

Τηλεφωνικήεξυπηρέτηση:..............................................................................................................................11

ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ,ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑΚΑΙΑΝΑΛΩΣΙΜΑ.....................................................................................12

ΤΕΧΝΙΚΕΣΣΥΣΤΑΣΕΙΣΚΑΙΣΥΣΤΑΣΕΙΣΣΧΕΤΙΚΑΜΕΤΟΝΕΞΟΠΛΙΣΜΟ..........................................................................................12ΣΥΣΤΑΣΕΙΣΣΧΕΤΙΚΑΜΕΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ............................................................................................................12

ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq..............................................................................................................13ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΑΑΝΑΛΩΣΙΜΑ..........................................................................................................................................13

ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗΝΟΜΙΚΟΥΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ................................................................................................14

ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗΧΡΗΣΗ.........................................................................................................................14

ΣΗΜΑΝΤΙΚΗΣΗΜΕΙΩΣΗΠΡΙΝΑΠΟΤΗΝΕΝΑΡΞΗ......................................................................................15

ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΗΑΠΟΜΟΝΩΣΗΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥDNA........................................................................................................15

ΑΡΧΗΤΗΣΜΕΘΟΔΟΥ...............................................................................................................................16

ΣΥΝΟΨΗΤΩΝΒΗΜΑΤΩΝ.........................................................................................................................17

ΓΛΩΣΣΑΡΙ/ΟΡΙΣΜΟΙ..................................................................................................................................18

ΒΗΜΑ1–ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΚΥΡΙΟΥΜΕΙΓΜΑΤΟΣΕΝΙΣΧΥΣΗΣHLA..............................................................19

ΛΙΣΤΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ...............................................................................................................................................19ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................................................19

Κύριομείγμα:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1...........................................................20Κύριομείγμα:HLA-DRB4..................................................................................................................................20Κύριομείγμα:HLA-DQB1Σετ3........................................................................................................................20

ΒΗΜΑ2–ΕΝΙΣΧΥΣΗHLAΤΑΞΗΣIΚΑΙII....................................................................................................21


ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1......................22ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-DQB1Σετ3.......................................................................................22


Σελίδα3│50

ΕνίσχυσηΤάξηςI(HLA-A,BκαιC)....................................................................................................................22ΕνίσχυσηΤάξηςII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1καιDQB1).........................................23Αναμενόμεναμεγέθηαμπλικονίων.................................................................................................................23

ΒΗΜΑ3–ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΚΑΙΚΑΝΟΝΙΚΟΠΟΙΗΣΗΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ(ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟΠΛΑΚΑΣ).....................................................................................................................24


Ομαδοποίησηαμπλικονίων.............................................................................................................................26ΚαθαρισμόςPCRExoSAP-ITExpress.................................................................................................................26

ΒΗΜΑ4–ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ.................................................................................................28


Κύριομείγμακατακερματισμού......................................................................................................................29Πρόγραμμακατακερματισμού........................................................................................................................29Κύριομείγμαεπιδιόρθωσηςάκρων................................................................................................................30Πρόγραμμαεπιδιόρθωσηςάκρων...................................................................................................................30Κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάση..................................................................................................................31Πρόγραμμασύνδεσηςμελιγάση.....................................................................................................................32Ομαδοποίησηκαικαθαρισμόςβιβλιοθήκης...................................................................................................32

ΒΗΜΑ5–ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΕΠΙΛΕΓΜΕΝΟΥΜΕΓΕΘΟΥΣ..................................................................................34


ΒΗΜΑ6–ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣΜΕΤΟΟΡΓΑΝΟQPCR.........................................35


ΜείγμαεκκινητήqPCR.....................................................................................................................................35ΚύριομείγμαqPCR...........................................................................................................................................36

ΒΗΜΑ7–ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣΤΟILLUMINAMISEQ.......................................................................................38

ΛΙΣΤΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ...............................................................................................................................................38ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq..............................................................................................................38

ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................................................38

ΒΗΜΑ8–ΑΝΑΛΥΣΗΤΩΝΔΕΔΟΜΕΝΩΝΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣHLA..................................................................40

ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................40ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................40Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................40

ΜΗΑΥΤΟΜΑΤΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΔΙΑΚΟΜΙΣΤΗ.....................................................................................................................40ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................40Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................40

ΜΗΑΥΤΟΜΑΤΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ.....................................................................................................................41ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................41Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................41

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣΕΙΚΟΝΕΣ..................................................................................................................42

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣΓΙΑΤΗΝΠΛΑΚΑΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ,ΠΛΑΚΑΕΝΙΣΧΥΣΗΣ,ΠΛΑΚΑΑΡΑΙΩΣΗΣ,ΠΛΑΚΑΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ(ΓΙΑΕΝΑΓΕΝΕΤΙΚΟΤΟΠΟ)ΚΑΙΠΛΑΚΑΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ........................................................................................42ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΠΡΟΤΥΠΩΝ............................................................................................42ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣQPCRΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣKAPA......................................................................43


Σελίδα4│50

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ1:PIPPINPREP....................................................................................................................44

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣΤΟΥPIPPINPREP...........................................................................................................................44ΕΚΤΕΛΕΣΗΤΟΥPIPPINPREP..........................................................................................................................................44

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ2:ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝΜΕΤΟΟΡΓΑΝΟQPCR.............................47


ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ3:ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣΜΕΧΡΗΣΗΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΗΣΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑΣΧΡΩΣΤΙΚΗΣDSDNA...........................................................................................................49



Σελίδα5│50

Ιστορικόεγγράφου–Σημαντικέςσημειώσειςκαιενημερώσεις

Έκδοση Ημερομηνία Συντάκτης Σύνοψηαλλαγών Εγκρίθηκεαπό Hμερομηνίαέκδοσης

V10 14/12/2017 TündeVágó πρώτηέκδοση EfiMelista 02/05/2018


Σελίδα6│50

Δήλωσηαποποίησηςευθυνών

Η Omixon έχει καταβάλλει κάθε προσπάθεια, ώστε οι παρούσες Οδηγίες χρήσης να είναιακριβείς. Η Omixon δεν φέρει καμία ευθύνη για τυχόν ανακρίβειες ή παραλείψεις πουενδεχομένωςέχουνπροκύψει.ΟιπληροφορίεςστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσηςυπόκεινταισεαλλαγήχωρίςπροειδοποίηση.ΗOmixonδεναναλαμβάνεικαμίαευθύνηγιατυχόνανακρίβειεςπουενδέχεταιναπεριλαμβάνονταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.

ΗOmixonδιατηρείτοδικαίωμαναβελτιώνειτιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσηςή/καιταπροϊόνταπουπεριγράφονταισεαυτές,ανάπάσαστιγμή,χωρίςπροειδοποίηση.

Σε περίπτωση που εντοπίσετε πληροφορίες στο παρόν εγχειρίδιο που είναι εσφαλμένες,παραπλανητικέςήελλιπείς,θαεκτιμούσαμετασχόλιακαιτιςπροτάσειςσας.Μπορείτενατιςστείλετεστηδιεύθυνση[email protected].


Σελίδα7│50

ΠληροφορίεςκατασκευαστήΌνομαεταιρείας:OmixonBiocomputingLtd

Διεύθυνσηεπίσκεψης:Fehérváriút50-52/6

Πόλη:Βουδαπέστη

Τ.Κ.:H-1117

Χώρα:Ουγγαρία

Υπόμνημασυμβόλων

Αριθμόςπαρτίδας

Αριθμόςαναφοράς/καταλόγου

ΣυμβουλευτείτετιςΟδηγίεςχρήσης

Περιέχει αντιδραστήριο για Ν αριθμόεξετάσεων

Νόμιμοςκατασκευαστής.Ηημερομηνίασεσυνδυασμόμεαυτότοσύμβολοαναφέρεταιστηνημερομηνίακατασκευής

Συνιστώμενηθερμοκρασίαφύλαξης

Ημερομηνίαλήξης

Invitroδιαγνωστικήιατροτεχνολογικήσυσκευή

ΠεριέχειανταλλακτικόΑνταλλακτικό


Σελίδα8│50

ΠεριεχόμενατουκιτHolotypeHLA-96/11ΔιαμόρφωσηA&CE(ΑΝΑΦ:H32)ήΔιαμόρφωσηB&CE(ΑΝΑΦ:H34)

ΣυσκευασίαστοιχείουεκκινητήΤο στοιχείο εκκινητή παρέχει συγκεκριμένα, έτοιμα για χρήση, διαλύματα εκκινητή γιαστοχευμένηενίσχυσηPCRμεγάλουεύρουςτωνγονιδίωνHLAA,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5,DPA,DPB1, DQA1 καιDQB1. Επιπλέον, περιέχει δύο τύπους πρόσθετων PCR (Ενισχυτή 1 καιΕνισχυτή2).

Μείγμαεκκινητή ΑΡ.ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Όγκος/

σωληνάριοΑρ.

σωληναρίωνΧρωματικόςκώδικας

HLA-A P012 96 220μL 1 ΚίτρινοHLA-B P022 96 220μL 1 ΚόκκινοHLA-C P032 96 220μL 1 ΠορτοκαλίHLA-DRB1/3 P042 96 220μL 1 ΠράσινοHLA-DRB4 P072 96 220μL 1 ΛευκόHLA-DRB5 P112 96 220μL 1 ΡοζHLA-DPA1 P132 96 220μL 1 ΜαύροHLA-DPB1 P072 96 220μL 1 ΜοβHLA-DQA1 P082 96 220μL 1 ΚαφέHLA-DQB1(Σετ3) P122 96 220μL 1 ΜπλεΕνισχυτής1 E01 96 1100μL 1 ΔιαφανέςΕνισχυτής2 E02 96 300μL 1 Διαφανές

ΣυσκευασίαστοιχείουαντιδραστηρίωνπροετοιμασίαςβιβλιοθήκηςΗ συσκευασία στοιχείου προετοιμασίας βιβλιοθήκης περιέχει αντιδραστήρια για τηνπροετοιμασία βιβλιοθήκης (κατακερματισμός, άμβλυνση και αδενυλίωση των άκρων τωναμπλικονίωνκαισύνδεσημελιγάσητωναλληλουχιώνπροσαρμοστώνμεδείκτεςσεαυτά)απόαμπλικόνιαHLA.


Σελίδα9│50

Αντιδραστήριο ΑΡ.ΑΝΑΦ.

Αντιδράσεις

Όγκος/σωληνάριο

Αρ.σωλη-ναρίων

Χρωματικόςκώδικας

Ένζυμοκατακερματισμού(Α) R11 96 278μL 1 ΚίτρινοΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β)

R21 96 278μL 1 Κόκκινο

Ένζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) R31 96 162μL 1 ΠράσινοΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ)

R41 96 324μL 1 Πορτοκαλί

Ένζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) R51 96 324μL 1 ΜπλεΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ)

R61 96 1800μL 2 Μαύρο

Πλάκαπροσαρμοστών96πηγαδιώνΤο στοιχείο της πλάκας προσαρμοστών 96 πηγαδιώνμε δείκτες περιέχει έτοιμους για χρήσηπροσαρμοστέςNGSμεδείκτες(ολιγονουκλεοτίδιαDNAδιπλήςέλικας)σεδιάλυμα5μLγιατηδημιουργίαμεμονωμένωνβιβλιοθηκώνNGS.Ηπλάκαπροσαρμοστών96πηγαδιώνμεδείκτεςπεριέχειεπαρκείςπροσαρμοστέςμεδείκτεςγιατηδημιουργία96μεμονωμένωνβιβλιοθηκώνNGSκαιγιααναγνώρισηδείγματοςκαθοδικά.

Έκδοσηκιτ Αντιδραστήριο ΑΡ.

ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Όγκος/πηγάδι

Αρ.πλακών

H32 ΠλάκαπροσαρμοστώνA(i1-96) N1 96 5μL 1H34 ΠλάκαπροσαρμοστώνB(i97-192) N2 96 5μL 1

ΒιβλίοεργασίαςExcelΔιατίθεταιέναβιβλίοεργασίαςExcelγιατηνυποστήριξητουπρωτοκόλλουHolotypeHLA96/11,με υπολογισμούς, διατάξεις πλακών, καταγραφή στοιχείων, δημιουργία φύλλου δείγματοςMiSeq και πολλά άλλα. Εφόσον επιθυμείτε ένα αντίγραφο, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση[email protected].

Λογισμικό–OmixonHLATwinΕπικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]γιατιςπιστωτικέςμονάδεςτουOmixonHLATwinπουαντιστοιχούνστηναγοράτουκιτHolotypeHLA96/11.

Σημαντικήσημείωση:ΧρησιμοποιείτεκαιτατρίαστοιχείατουκιτOmixonHolotypeHLA96/11καιτολογισμικόOmixonHLATwinστηνίδιαροήεργασιώνγιατηδημιουργίαμιαςροήςεργασιώνγιαinvitroδιαγνωστικήχρήση! Ανατρέξτε στην Ενότητα «Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις» για τους περιορισμούςχρήσηςτουπροϊόντος.


Σελίδα10│50

Ανταλλακτικάδιατίθενταιέπειτααπόειδικήαίτηση τουχρήστη.ΛάβετευπόψηότιηOmixonπαρέχει ανταλλακτικά για τις συσκευασίες των στοιχείων, όχι για μεμονωμένα φιαλίδια.Επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]γιαπερισσότερεςπληροφορίες.

ΑποστολήκαιφύλαξηΑποστέλλονται πάνω συσκευασίες ξηρού πάγου, σε κουτί μεταφοράς από Styrofoam, ενώπρέπεινααποθηκεύονταιστους-20°Cκατάτηνάφιξη.Επικυρώστετηδιαδικασίαελέγχουκαιπαρακολούθησης της θερμοκρασίας των καταψυκτών σας και εκτελείτε τη συντήρησή τουςτακτικά.Ταακέραιακιτδιατηρούνταισταθεράέως τηνημερομηνίαλήξης τουκιτ (αναγράφεταιστηνετικέτατουκιτ),εφόσοναποθηκεύονταιστους-20°C.Μετάτοάνοιγματουπροϊόντος,συνιστώνταιέωςκαιτέσσερις(4)κύκλοιψύξης/απόψυξηςγιατηδιασφάλισητηςσταθερότηταςτουπροϊόντος.Ταανοιγμένακιτδιατηρούνταισταθεράέωςκαιγια3μήνες,εφόσοναποθηκεύονταιστους-20°C.

ΠροειδοποιήσειςκαιπροφυλάξειςΠεριορισμοίχρήσηςπροϊόντος

Για βέλτιστη απόδοση, χρησιμοποιείτε τη ροή εργασιών του κιτ Holotype HLA 24/7 και τουλογισμικούOmixonHLATwinγιατηντυποποίησηHLAμεNGS,μεταυλικά,τααντιδραστήριακαιτονεξοπλισμόπουσυνιστάταιστηνενότητα«Εξοπλισμόςκαιαντιδραστήρια».Η χρήση διαφορετικών υλικών από εκείνα που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός καιαντιδραστήρια»πρέπειναεπαληθευτείκαιναεπικυρωθείαπότονχρήστη.ΜηνανασυστήνετεήαραιώνετετααντιδραστήριασεδιαφορετικούςόγκουςαπόεκείνουςπουπεριγράφονταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.ΜηχρησιμοποιείτεμικρότεροόγκοαντιδραστηρίωναπόεκείνονπουκαθορίζεταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.Οιενέργειεςαυτέςμπορούνναοδηγήσουνσεσφάλματααπόδοσης.ΗOmixonδενμπορείναπαράσχειυποστήριξηγιαενδεχόμεναπροβλήματα,ταοποίαπροκύπτουναπότημητήρησητωνβημάτωντουπρωτοκόλλουπουπεριγράφεταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.Μη χρησιμοποιήσετε το προϊόν σε περίπτωση που εντοπιστεί ζημιά σε στοιχεία (σπασμέναφιαλίδια,πλάκα,ξεβιδωμέναπώματα,κτλ.)

ΓνωστοίπεριορισμοίτουπροϊόντοςΑνατρέξτε στο έγγραφο Product Known Limitations Guide (Οδηγός γνωστών περιορισμώνπροϊόντος)γιατιςγνωστέςασάφειεςκαιτουςγνωστούςπεριορισμούςλογισμικούτουπροϊόντοςHolotypeHLA.ΟΟδηγόςπαρέχεταιμετιςΟδηγίεςχρήσης,ωστόσοδιατίθεταικαιστοδικτυακότόποτηςOmixon,στηνενότηταMyHolotype/SupportandServices/HLATwinInstructionsforUse,ήμπορείτενατονζητήσετεστηδιεύθυνση[email protected].


Σελίδα11│50

ΠληροφορίεςασφαλείαςΠροτούξεκινήσετε,διαβάστετιςενότητες«Πληροφορίεςασφαλείας»και«Σημαντικέςσημειώσεις»των αντιδραστηρίων ή κιτ που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός, αντιδραστήρια καιαναλώσιμα».Κατάτηνεργασίαμεχημικά,φοράτεπάντακατάλληληρόμπαεργαστηρίου,γάντιαμιαςχρήσηςκαι προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε τα κατάλληλαΔελτίαδεδομένωνασφαλείας(SDS)πουδιατίθενταιαπότοναντίστοιχοπρομηθευτήτουπροϊόντος.ΜιαεπισκόπησητωνχημικώνσυστατικώντωναντιδραστηρίωντουπροϊόντοςδιατίθεταισταΔελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS) του κιτ Holotype HLA 96/11 και παρέχεται κατόπιναιτήματος.Απορρίπτετεταστοιχείατουπροϊόντοςωςγενικάιατρικάαπόβλητα.

ΠαράμετροιαπόδοσηςΤεκμηριωμένεςκύριεςπαράμετροιαπόδοσης,σύμφωναμετηνεπικύρωσητουπροϊόντος.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Ευαισθησία 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Ειδικότητα 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Ακρίβεια 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Ορθότητα 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Αναπαραγωγιμότητα 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Επαναληψιμότητα 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

ΤεχνικήυποστήριξηΓιαγενικήυποστήριξη,όσοναφοράστοπαρόνπρωτόκολλο,επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]

Τηλεφωνικήεξυπηρέτηση:ΗνωμένεςΠολιτείες|+1(617)500-0790Ευρώπη|+36705748001Υπόλοιποςκόσμος|+1(617)500-0790


Σελίδα12│50

Εξοπλισμός,αντιδραστήριακαιαναλώσιμα

Τεχνικέςσυστάσειςκαισυστάσειςσχετικάμετονεξοπλισμό§ Θερμικόςκυκλοποιητήςμεμορφή96πηγαδιών§ Φθορισμόμετροπλάκας(ήοποιοδήποτεόργανομεδυνατότηταανίχνευσηςφθορισμούσε

μορφήπλάκας96πηγαδιών,γιαχρήσημετοΣύστημαPromegaQuantiFluordsDNA)§ ΣύστημαPippinPrep(Αρ.κατ.PIP0001)ήBluePippin(Αρ.κατ.BLU0001)τηςSAGEScience§ ΌργανοqPCRμεμορφήπλάκας96ή384πηγαδιών§ ΦθορισμόμετροQubit(Αρ.κατ.Q33216,ThermoFisherScientific)(προαιρετικό)§ IlluminaMiSeq(Αρ.κατ.SY-410-1003)§ Υπολογιστής64-bitμετουλάχιστον4πυρήνεςκαι16GBRAM§ Χώροςμακροπρόθεσμηςαποθήκευσηςδεδομένων(περίπου2TBδεδομένωνανάMiSeq

ετησίως)

Συστάσειςσχετικάμεαντίστοιχααντιδραστήρια§ ΚιτLongRangePCRτηςQiagen(Αρ.κατ.206401,206402ή206403)

§ Κάθεδείγμααπαιτεί4,4μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206401,(20)περιέχει8μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206402,(100)περιέχει40μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206403,(250)περιέχει100μLTaqπολυμεράσης

§ ExoSAP-ITτηςAffymetrix(Αρ.κατ.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLή75001-10ML)§ Κάθεομαδοποιημένοδείγμααπαιτεί4μLενζύμουExoSAP-IT§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-200περιέχει200μLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-1-MLπεριέχει1mLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-4X-1MLπεριέχει4mLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-10MLπεριέχει10mLενζύμουExoSAP-ITExpress

§ Κιτ ποσοτικοποίησης βιβλιοθήκης – Illumina/Universal της KAPA Biosystems (Αρ. κατ.KK4824)

§ ΚιτανάλυσηςQubitdsDNABR(Αρ.κατ.Q32850ήQ32853)(προαιρετικό)§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.Q32850περιέχει100αναλύσεις§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.Q32853περιέχει500αναλύσεις

§ ΣύστημαQuantiFluordsDNAτηςPromega(Αρ.κατ.E2670)§ ΣφαιρίδιαAgencourtAMPureXPτηςBeckmanCoulter(Αρ.κατ.A63880,A63881ήA63882)

§ ΚάθεεκτέλεσηHolotypeHLAαπαιτείτομέγιστο900μLσφαιριδίωνAMpureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63880περιέχει5mLσφαιριδίωνAMPureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63881περιέχει60mLσφαιριδίωνAMPureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63882περιέχει450mLσφαιριδίωνAMPureXP

§ Κασέτα πηκτώματος, 1,5% αγαρόζης, χωρίς χρωστική με εσωτερικό πρότυπο (ΔείκτηςK/R2)γιατοPippinPrep/BluePippin(Αρ.κατ.CDF1510γιατοPippinPrepκαιBDF1510γιατοBluePippin)

§ Αιθανόληυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληληγιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας(άνυδρηαλκοόλη)


Σελίδα13│50

§ Νερόυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας(χωρίςDNaseκαιRNase)

§ Υδροξείδιοτουνατρίου§ ΡυθμιστικόδιάλυμαTE1×(pH8,0)§ ΚιταντιδραστηρίωνMiSeqτηςIllumina

ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq

ΚιταντιδραστηρίωνIlluminaMiSeq

ΧρόνοςΏρες

96/11δείγματα

Std500Cycle(MS-102-2003)

~39 96


~24 72

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 20

Nano500Cycle(MS-103-1003)

~28 8


~17 4

Συνιστώμενααναλώσιμα§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρου1,5mL§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρουχαμηλήςπρόσδεσης1,5mL§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρουχαμηλήςπρόσδεσης2,0mL(συνιστάταιτοEppendorfDNA

LoBindΑρ.κατ.022431048)§ Σωληνάριαλεπτούτοιχώματος0,5mLγιατοόργανοQubit (συνιστώνται τασωληνάρια

ανάλυσηςQubitΑρ.κατ.Q32856)§ Πιπέτεςρυθμιζόμενουόγκου(χωρητικότητα1,0–1000μL)§ Πιπέτεςρυθμιζόμενουόγκου8καναλιών(χωρητικότητα1,0–100μL)§ Πλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοθερμικόκυκλοποιητή§ Οπτικέςπλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοφθορισμόμετροπλάκας§ Πλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοόργανοqPCR§ Φύλλασφράγισηςπλακώνγιαγενικήχρήση§ Φύλλασφράγισηςπλακώνσυμβατάμεθερμικούςκυκλοποιητές (δοκιμασμένεςγιαPCR

μεγάλουεύρους)§ ΦύλλασφράγισηςοπτικώνπλακώνσυμβατάμετοόργανοqPCR(προαιρετικά)§ Μαγνητικήβάσησυμβατήμεσωληνάριαμικροφυγόκεντρου2mL§ Στατώψύξης96πηγαδιών(2τεμάχια)§ Κωνικάσωληνάρια50mL§ Δοχεία50mL


Σελίδα14│50

ΑνακοίνωσηνομικούπεριεχομένουΟιΟδηγίεςχρήσηςτουHolotypeHLA96/11καιόλατουςταπεριεχόμεναείναιαποκλειστικήςκυριότηταςτηςOmixonBiocomputingLimited(«Omixon»)καιπροορίζονταιαποκλειστικάγιατησυμβατικήχρήσηαπότονπελάτη,όσοναφοράστοπροϊόν(ήσταπροϊόντα)πουπεριγράφονταισεαυτέςκαιδενπροορίζονταιγιακανένανάλλοσκοπό.Απαγορεύεταιηχρήσηήδιανομήγιαοποιονδήποτεάλλοσκοπόή/καιηεπικοινωνία,αποκάλυψηήαναπαραγωγήμεοποιονδήποτετρόπο του παρόντος εγγράφου και των περιεχομένων του, χωρίς την προηγούμενη γραπτήσυγκατάθεση της Omixon. Η Omixon δεν παραχωρεί καμία άδεια ευρεσιτεχνίας, εμπορικούσήματος,πνευματικώνδικαιωμάτωνήδικαιωμάτωνκοινούδικαίουήπαρόμοιωνδικαιωμάτων,ταοποίαανήκουνστηνκυριότητάτης,σετρίταμέρημέσωτουπαρόντοςεγγράφου.

ΗάδειαχρήσηςτουOmixonHLATwin(«Λογισμικό»)παραχωρείταιστονπελάτη,σύμφωναμετους όρους και τις προϋποθέσεις της Άδειας χρήσης τελικού χρήστη του Omixon HLA Twin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Στηνπερίπτωσηπουδενσυμφωνείτεμετουςόρουςκαιτιςπροϋποθέσειςπουπεριλαμβάνονται σεαυτήν, ηOmixonδενσας εκχωρείάδεια χρήσης τουΛογισμικούκαιδενπρέπεινατοχρησιμοποιήσετεήνατοεγκαταστήσετε.

Οιοδηγίεςτουπαρόντοςεγγράφουπρέπεινατηρούνταιαυστηράκαιρητάαπόειδικευμένοκαικατάλληλαεκπαιδευμένοπροσωπικό,προκειμένουναδιασφαλιστείηορθήκαιασφαλήςχρήσητουπροϊόντος(ήτωνπροϊόντων)πουπεριγράφεταισεαυτό.Διαβάστεκαικατανοήστεπλήρωςόλα τα περιεχόμενα του παρόντος εγγράφου, πριν από τη χρήση του προϊόντος (ή τωνπροϊόντων).

ΣΕΠΕΡΙΠΤΩΣΗΠΟΥΔΕΝΔΙΑΒΑΣΤΟΥΝΠΛΗΡΩΣΚΑΙΔΕΝΤΗΡΗΘΟΥΝΡΗΤΑΟΛΕΣΟΙΟΔΗΓΙΕΣΠΟΥΠΕΡΙΕΧΟΝΤΑΙΣΤΟΠΑΡΟΝ,ΕΝΔΕΧΕΤΑΙΝΑΠΡΟΚΛΗΘΕΙΥΛΙΚΗΖΗΜΙΑΣΤΟΠΡΟΪΟΝ(ΉΤΑΠΡΟΪΟΝΤΑ),ΤΡΑΥΜΑΤΙΣΜΟΣ,ΤΟΣΟΤΟΥΧΡΗΣΤΗΟΣΟΚΑΙΤΡΙΤΩΝ,ΚΑΙΥΛΙΚΕΣΖΗΜΙΣΣΕΑΛΛΗΠΕΡΙΟΥΣΙΑ.

ΗOMIXONΔΕΝΑΝΑΛΑΜΒΑΝΕΙΚΑΜΙΑΕΥΘΥΝΗΠΟΥΝΑΠΡΟΚΥΠΤΕΙΑΠΟΛΑΝΘΑΣΜΕΝΗΧΡΗΣΗΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ (Ή ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ) ΠΟΥ ΠΕΡΙΓΡΑΦΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΑΡΟΝ (ΣΥΜΠΕΡΙΛΑΜ-ΒΑΝΟΜΕΝΩΝ ΜΕΡΩΝ ΑΥΤΩΝ Ή ΛΟΓΙΣΜΙΚΟΥ) Ή ΑΠΟ ΟΠΟΙΑΔΗΠΟΤΕ ΑΛΛΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΥΤΩΝ, Η ΟΠΟΙΑ ΔΕΝ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΣΤΟ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΡΗΤΩΝ,ΕΓΓΡΑΦΩΝΑΔΕΙΩΝΧΡΗΣΗΣΉΔΙΚΑΙΩΜΑΤΩΝΠΟΥΠΑΡΑΧΩΡΟΥΝΤΑΙΑΠΟΤΗΝOMIXON,ΣΕΣΧΕΣΗΜΕΤΗΝΑΠΟΚΤΗΣΗΤΕΤΟΙΩΝΠΡΟΪΟΝΤΩΝΑΠΟΤΟΝΠΕΛΑΤΗ.

ΓΙΑINVITROΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΧΡΗΣΗ©2017OmixonBiocomputingLtd.Μετηνεπιφύλαξηπαντόςδικαιώματος.

ΠροβλεπόμενηχρήσηΤοπροϊόνHolotypeHLA96/11–ΔιαμόρφωσηA&CEκαιΔιαμόρφωσηB&CE(αναφέρεταιως«HolotypeHLA»)είναιέναςσυνδυασμόςαντιδραστηρίωνανάλυσηςγιαδιάγνωσηinvitroκαιενός λογισμικού ανάλυσης δεδομένων (Omixon HLA Twin™), που προορίζεται για τηναναγνώρισηκαιτονορισμόανθρωπίνωνλευκοκυτταρικώναντιγόνων(HLA)τάξεωςIκαιII,όπως,καιγιαχρήσηστηντυποποίησηHLA,χρησιμοποιώνταςτηνπλατφόρμααλληλούχισηςεπόμενηςγενιάςIllumina®MiSeq.ΤοHolotypeHLAπαρέχειπληροφορίεςανθρώπινηςιστοσυμβατότητας


Σελίδα15│50

τωνγενετικώντόπωνHLAΤάξηςI(A,BκαιC)καιΤάξηςII(DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4καιDRB5),χρησιμοποιώνταςανθρώπινογονιδιωματικόDNA.

Το λογισμικό Omixon HLA Twin™, το οποίο περιλαμβάνεται στο προϊόν Holotype HLA,προορίζεταιγιατηνερμηνείακαιαντιστοίχισηδεδομένωναλληλούχισης,προερχόμενωναπότοσύστημαIllumina®MiSeq,μεαποτέλεσματηνυψηλήςακρίβειας,μονήςδιέλευσης,τυποποίησηHLAεπίπεδουαλληλίωνμεπολύχαμηλόποσοστόασαφειώνστοεπίπεδοπεδίου2.

Το προϊόν Holotype HLA προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση από επαγγελματικόπροσωπικόυγειονομικήςπερίθαλψης,όπωςτεχνολόγουςεργαστηρίωνκαιιατρούς,πουέχουνεκπαιδευτείστηντυποποίησηHLAσεδιαγνωστικάεργαστήριαμεπιστοποίησηEFIήASHIήπουμπορούνναεργάζονταισύμφωναμετιςπροδιαγραφέςEFIήASHI.

Σημαντικήσημείωσηπριναπότηνέναρξη

ΣυνιστώμενηαπομόνωσηγονιδιωματικούDNAΤοανθρώπινογονιδιωματικόDNAπρέπειναπροετοιμάζεται,χρησιμοποιώνταςκαλάδοκιμασμένα,εμπορικά διαθέσιμα κιτ προετοιμασίας DNA, για την εξασφάλιση της συνέπειας στηνπροετοιμασία. Ανεξάρτητα από την προσέγγιση, απαιτείται ακριβής προσδιορισμός τηςσυγκέντρωσηςκαικαθαρότηταςγιατησωστήαπόδοσητηςανάλυσης.

ΤοDNAδενθαπρέπειναέχειμολυσματικέςουσίεςπουμπορείναεπηρεάσουναργότερατηνενίσχυση, την προετοιμασία βιβλιοθήκης και τα βήματααλληλούχισης (π.χ. αλκοόλη, άλατα,απορρυπαντικά,φορμαλδεΰδηκαιηπαρίνη).Τοαίμαδενπρέπεινασυλλέγεταισεηπαρινισμένασωληνάρια και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα αίματος από ασθενείς πουυποβάλλονταισεθεραπείαμεηπαρίνηκαιλιπαιμικάήαιμολυμέναδείγματα.

Το προετοιμασμένο γονιδιωματικό DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως, εάν έχειπροετοιμαστείσενερόχωρίςνουκλεάσηήεάνέχειαποθηκευτείγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματαστους-20°Cήχαμηλότερα.ΣυνιστάταιηχρήσηνερούγιατηνπροετοιμασίαgDNA,καθώςτοEDTAστορυθμιστικόδιάλυμαTEμπορείνακαταστείλειτιςαντιδράσειςPCRμεγάλουεύρους.Ηεπαναλαμβανόμενηψύξη–απόψυξηθαπρέπεινααποφεύγεται,καθώςμπορείναοδηγήσεισεαποδόμηση.

Συνιστάται συγκέντρωση DNA 20-30 ng/μL για την παροχή 100-150 ng γονιδιωματικού DNAεισόδουανάενίσχυσηPCR.ΣυνιστάταιθερμάηχρήσημεθόδουποσοτικούπροσδιορισμούμεβάσητονφθορισμόγιατονκαθορισμότηςσυγκέντρωσηςgDNA.

Συνιστάταιθερμάλόγοςαπορρόφησης1,7–2γιατιμές260nm/280nmκαι260nm/230nm.

ΓιατηνενίσχυσητωνHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1καιHLA-DQB1,απαιτούνται1,0-1,5µggDNA.


Σελίδα16│50

ΑρχήτηςμεθόδουΕδώ και πολλά χρόνια, η κοινότητα HLA εργάζεται για την ανάπτυξη μιας μεθόδου που θααναγνωρίζει με ακρίβεια τον εκτενή πολυμορφισμό των γονιδίων HLA και των γονιδιακώνπροϊόντων τους. Η έλευση της PCR, σε συνδυασμό με άλλες τεχνολογίες (αλληλούχιση κατάSanger,SSOP,SSP,Luminex),παρείχανέναντρόπογιατησημαντικήβελτίωσητηςανίχνευσηςτωνπολυμορφισμών των HLA, αν και με αρκετούς περιορισμούς, οι οποίοι εξακολουθούν ναδυσχεραίνουντηνικανότητάμαςναχαρακτηρίσουμεσυνολικάταγονίδιαHLA.Οιτεχνολογίεςπουέχουναναπτυχθείτατελευταίαχρόνια,πουονομάζονταισυνολικάαλληλούχισηεπόμενηςγενιάς (Next Generation Sequencing – NGS), έχουν παράσχει νέες ευκαιρίες, οι οποίεςεπιτρέπουντονπλήρηχαρακτηρισμότωνγονιδίωνHLAμεαπλοειδήτρόπο.ΗτεχνολογίαNGSέχει δύο ξεχωριστά χαρακτηριστικά, 1) κλωνική αλληλούχιση των θραυσμάτων DNA και 2)εξαιρετικάυψηλήκλίμακα.ΗτεχνολογίαNGSπαρέχειτηδυνατότητασταδιακήςεισαγωγήςτωνπολυμορφισμών,εξαλείφονταςμεαυτόντοντρόποκάθεασάφεια,ενώπαρέχειτυποποίησηHLAστο επίπεδοπεδίου τρία έως τέσσερα, χωρίς τηναυτόματη εκτέλεσηπρόσθετων εξετάσεων,παρουσιάζοντας,έτσι,μιαδυνητικάσυνολικήλύσηστοπρόβληματυποποίησηςHLA.ΤοπρωτόκολλοπουπεριγράφεταιεδώαξιοποιείαυτήντηντεχνολογίακαισυνδυάζειτηνενίσχυσηPCRμεγάλουεύρουςτωνγονιδίωνHLAμεαλληλούχισηστηνπλατφόρμαIlluminaMiSeq.Πιοσυγκεκριμένα,ταγονίδιαHLAA,B,C,DPA1,DQA1καιDQB1ενισχύονταιγιαολόκληροτομήκοςκωδικοποίησήςτους, συμπεριλαμβάνοντας στοιχεία από τις 5’ και 3’ αμετάφραστες περιοχές, ενώ ταDRB1,DRB3καιDRB4ενισχύονταιαπότοεσώνιο1έωςτοεσώνιο4καιταDRB5καιDPB1ενισχύονταιαπότοεσώνιο1έωςτην3'αμετάφραστηπεριοχή.Στησυνέχεια,τααμπλικόνιαυποβάλλονταισεεπεξεργασία,μέσααπόμιασειράβημάτωνπου:

1. ΚατακερματίζουντααμπλικόνιασεμέγεθοςκατάλληλογιατηναλληλούχισηστηνπλατφόρμαIllumina,

2. Πραγματοποιούνάμβλυνσηκαιαδενυλίωσητωνάκρωντωνκατακερματισμένωναμπλικονίων

3. Συνδέουν με λιγάση τις αλληλουχίες προσαρμοστών που χρησιμοποιούνται καθ' όλη τηδιαδικασίαστοMiSeqγια τηνκαταγραφή, τηνενίσχυσηκαι τηναλληλούχιση τουDNA.Οιπροσαρμοστέςπεριλαμβάνουν,επίσης,έναδείκτηπουείναιμιαμικρήαλληλουχία,μοναδικήγιακάθεπροσαρμοστή,πουπροσδιορίζειτηνπροέλευσητηςβιβλιοθήκης(δείγμα/τόπος).

Μετά από τη συγκέντρωση των βιβλιοθηκών με δείκτες, την επιλογή μεγέθους και τηνποσοτικοποίηση,τοδείγματοποθετείταιστοMiSeqγιααλληλούχιση.Ολόκληρηηδιαδικασίαδιαρκεί 3-5 ημέρες, ανάλογα με την επιλογή κυψελίδας ροής στην πλατφόρμα Illumina.Ησύνοψητωνβημάτωντουπρωτοκόλλουπαρουσιάζεταιστηνπαρακάτωεικόνα:


Σελίδα17│50

Σύνοψητωνβημάτων


Σελίδα18│50

Γλωσσάρι/ορισμοί§ Πλάκααμπλικονίων–Εναλλακτικόόνομαγιαμιαπλάκαενίσχυσης§ Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων – Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με το

φθορισμόμετροπλάκας,όπουπραγματοποιείταιποσοτικόςπροσδιορισμόςτωναραιωμένωναμπλικονίων

§ Πλάκαενίσχυσης–ΠλάκαPCR96πηγαδιώνπουχρησιμοποιείταιγιατηνενίσχυσητωνγενετικώντόπωνHLA

§ Τελικήβιβλιοθήκη–Βιβλιοθήκηπουπεριλαμβάνειόλες τιςΒιβλιοθήκεςδείγματοςπουείναιέτοιμεςνααλληλουχιστούνσεμίαανάλυσηMiSeq

§ Πλάκα αντίδρασης – Πλάκα όπου πραγματοποιούνται οι διαδοχικές αντιδράσεις πουκατακερματίζουν,επιδιορθώνουνταάκρακαισυνδέουνμελιγάσητουςπροσαρμοστέςμεδείκτεςστιςΒιβλιοθήκεςδείγματος

§ Πλάκα αντιδραστηρίων – Πλάκα που χρησιμοποιείται για τη διανομή κλασμάτων τωνδιάφορωναντιδραστηρίωνπουχρησιμοποιούνταιγιατηνπροετοιμασίατωνβιβλιοθηκών

§ Βιβλιοθήκηδείγματος–Βιβλιοθήκηπουπαρασκευάζεταιαπότονσυνδυασμό(ομαδοποίηση)όλωντωνγενετικώντόπωνHLAγιαδεδομένοδείγμα

§ Πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων –Πλάκα που περιέχει μια βιβλιοθήκη δείγματος(συνδυασμόςόλωντωνγενετικώντόπων)ανάπηγάδι

§ Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων – Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με τοφθορισμόμετροπλάκας,όπουτοποθετούνταιπρότυπαDNAγιατονποσοτικόπροσδιορισμόαμπλικονίων


Σελίδα19│50

Βήμα1–ΠροετοιμασίακύριουμείγματοςενίσχυσηςHLAΔιάρκεια:~2ώρεςΟ σκοπός αυτού του βήματος είναι η παρασκευή των κυρίων μειγμάτων που αφορούν σεσυγκεκριμένους γενετικούς τόπους, προκειμένου να ενισχυθεί μεμονωμένα κάθε στοχευμένοςγενετικόςτόποςHLA.Οιγενετικοίτόποιπουενισχύονταιαπόαυτότοπρωτόκολλοείναι:HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1καιHLA-DQB1.

Σημείωση:Τακύριαμείγματαπουπαρασκευάζονταισεαυτότοβήμαπεριλαμβάνουνόλατααντιδραστήριαπουαπαιτούνταιγιατηνενίσχυση,εκτόςαπότηνTaqπολυμεράση.

ΛίστααντιδραστηρίωνΣτοιχείο Φύλαξη Παρέχεταιαπότην

ΜείγμαεκκινητήHLA-A -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-B -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-C -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB1/DRB3 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB4 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB5 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DPA1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DPB1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DQA1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DQB1(Σετ3) -20°C OmixonΕνισχυτής1 -20°C OmixonΕνισχυτής2 -20°C OmixonLongRangePCRBuffer(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMτοκαθένα) -20°C QiagenH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

-20°C Qiagen

Πρωτόκολλο1.1 –Αφαιρέστεόλαταμείγματαεκκινητή,τονενισχυτή1και2,τοdNTPsκαιτορυθμιστικό

διάλυμα PCR μεγάλου εύρους (10×) από τη φύλαξη και αποψύξτε σε θερμοκρασίαδωματίου.

1.2 –Παρασκευάστετονσυνδυασμένοενισχυτή:προσθέστε132μLενισχυτή2στοσωληνάριοτου ενισχυτή 1. Αλλάξτε την ετικέτα του σωληναρίου του ενισχυτή 1 σε συνδυασμένοενισχυτή.ΦυλάξτετονυπόλοιποΕνισχυτή2γιαναχρησιμοποιηθείστηναντίδρασηPCRμεγάλουεύρουςτουDRB4.

1.3 –Παρασκευάστεένακύριομείγμαγιακάθεμείγμαεκκινητή,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες:


Σελίδα20│50

Κύριομείγμα:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1

Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/γενετικόςτόπος

Όγκος/96δείγματα/γενετικόςτόπος

Μείγμαεκκινητή 2μL 204μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 255μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 127,5μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

13,85μL 1412,7μL

Συνολικόςόγκος 19,6μL 1999,2μL

Κύριομείγμα:HLA-DRB4



Μείγμαεκκινητή 2μL 204μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 255μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 127,5μLΕνισχυτής2 0,6μL 61,2μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

13,25μL 1351,5μL


Κύριομείγμα:HLA-DQB1Σετ3



Μείγμαεκκινητή 2μL 204μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 255μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 127,5μLΣυνδυασμένοςενισχυτής 5,6μL 571,2μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

7,85μL 800,7μL


1.4 – Υποβάλετε το κάθε κύριο μείγμα σε περιδίνηση και, στη συνέχεια, σε σύντομηφυγοκέντρισηγια1δευτερόλεπτο.Τοποθετήστετακύριαμείγματασεπάγο.

1.5 –ΑραιώστεόλαταgDNAσεσυγκέντρωσημεταξύ30ng/μL(οελάχιστοςόγκοςείναι55μL).

Σημείωση:ΤοHolotypeHLAπεριέχειαρκετάαντιδραστήριαγια96αντιδράσεις,καθώςκαιπρόσθετοόγκογιααπώλειεςκατάτηδιανομήμεπιπέτακαιαποτυχημένηενίσχυση.


Σελίδα21│50

Βήμα2–ΕνίσχυσηHLAΤάξηςIκαιIIΔιάρκεια:~8ώρες10λεπτάΟσκοπόςτουβήματος2είναιηενίσχυσητωνγενετικώντόπωνHLA.ΟιενισχύσειςHLAΤάξηςIκαιΤάξηςIIέχουνβελτιστοποιηθεί,χρησιμοποιώνταςδύοδιαφορετικάσύνολασυνθηκώνPCR.Αφού ολοκληρωθούν οι αντιδράσεις PCR, η ενίσχυση επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σεπήκτωμααγαρόζης(προαιρετικά).

Γρήγορησυμβουλή–Ανκαιπροτείνεταιηηλεκτροφόρησησεπήκτωμααγαρόζης(βήμα 2.5), δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλουHolotype HLA. Όταν πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός τωναμπλικονίων(Βήμα3),οποιαδήποτεσυγκέντρωσηάνωτων50ng/μLθεωρείταιεπιτυχής ενίσχυση. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης αποτελεί ένασημαντικό βήμαποιοτικού ελέγχου και δεν πρέπει να παραλείπεται, όταν δενυπάρχειεπαρκήςεμπειρίαμετοπλήρεςπρωτόκολλοHolotypeHLA.


ΚύριομείγμαHLA-A -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-B -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-C -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB1/DRB3 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB4 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB5 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DPA1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DPB1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DQA1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DQB1(Σετ3) -20°C Βήμα1Taqπολυμεράση -20°C QiagengDNA 4°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

20°C Χρήστης

Πρωτόκολλο2.1 –ΑφαιρέστετηνTaqπολυμεράσηαπότηφύλαξη,φυγοκεντρίστεσύντομακαιπροσθέστε

τηνσεκάθεκύριομείγμα,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες,ξεπλένονταςσχολαστικάταρύγχητωνπιπετώνμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση:


Σελίδα22│50

ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1



Κύριομείγμααπότοβήμα1 19,6μL 1999,2μLTaqπολυμεράση 0,4μL 40,8μLΣύνολο 20μL 2040μL

ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-DQB1Σετ3



Κύριομείγμααπότοβήμα1 19,2μL 1958,4μLTaqπολυμεράση 0,8μL 81,6μLΣύνολο 20μL 2040μL

2.2 –ΥποβάλετεσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντρισηόλατακύριαμείγματαμεTaqπολυμεράση.Διανείμετε20μLκάθεκύριουμείγματοςμεTaqπολυμεράσησεξεχωριστάπηγάδιατωνπλακώνPCR96πηγαδιών.

Σημείωση:ΗενίσχυσηΤάξηςIκαιΤάξηςIIέχειβελτιστοποιηθεί,χρησιμοποιώνταςδύοδιαφορετικέςσυνθήκεςPCR,επομένωςτακύριαμείγματαΤάξηςIκαιΤάξηςIIδενπρέπειναβρίσκονταιστηνίδιαπλάκα.

2.3 – Προσθέστε 5 μL κάθε αραιωμένου gDNA στο κατάλληλο πηγάδι των πλακών πουπροετοιμάστηκανστοπροηγούμενοβήμα.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.Σφραγίστετιςμεθερμικόφύλλοσφράγισηςκαιεπιθεωρήστεοπτικάτοκάθεπηγάδι.Υποβάλετεόλεςτιςπλάκεςενίσχυσηςσεσύντομηφυγοκέντριση.

2.4 – Τοποθετήστε τις πλάκες ενίσχυσης σε θερμικούς κυκλοποιητές και εκτελέστε ταπρογράμματαγιατηνενίσχυσηΤάξηςIκαιΤάξηςII,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες:

ΕνίσχυσηΤάξηςI(HLA-A,BκαιC)

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 3λεπτά

3595°C 15δευτερόλεπτα65°C 30δευτερόλεπτα68°C 5λεπτά

1 68°C 10λεπτά1 4°C ∞


Σελίδα23│50

ΕνίσχυσηΤάξηςII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1καιDQB1)

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 3λεπτά

3593°C 15δευτερόλεπτα60°C 30δευτερόλεπτα68°C 9λεπτά

1 68°C 10λεπτά1 4°C ∞

Σημείωση:Ηεπιτυχίατηςενίσχυσηςμπορείναεπαληθευτεί,προσθέτοντας2μLαπόκάθεαμπλικόνιοσετυπικόπήκτωμααγαρόζης2%στα250Vγια30λεπτά.(Προαιρετικά)

Αναμενόμεναμεγέθηαμπλικονίων

ΓενετικόςτόποςHLA Αναμενόμενομέγεθοςαμπλικονίων(kb)HLA-A,BκαιC ~3HLA-DRB1/DRB3 ~4,3

HLA-DRB4 ~4,2HLA-DRB5 ~4,2HLA-DPA1 ~5,7HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6

HLA-DQB(Σετ3) ~6,6

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Τααμπλικόνιαμπορούννααποθηκευτούνστους4°Cκατάτηδιάρκειατηςνύχταςήστους-20°Cγιαμεγαλύτεροχρονικόδιάστημα.


Σελίδα24│50

Βήμα3–Ποσοτικόςπροσδιορισμόςκαικανονικοποίησηαμπλικονίων(χρησιμοποιώνταςφθορισμόμετροπλάκας)Διάρκεια:~2ώρεςΟποσοτικόςπροσδιορισμόςκαιηκανονικοποίησηαμπλικονίωνσυνιστάταιγιατηνεξασφάλισηεισόδου ακριβείας στο βήμα προετοιμασίας βιβλιοθήκης (προαιρετικό). Η συγκέντρωσηαμπλικονίων μετριέται, χρησιμοποιώντας το Σύστημα QuantiFluor dsDNA που περιέχει μιαφθορίζουσα χρωστικήπουδεσμεύειDNAκαι έναπρότυποDNAγια τον ευαίσθητοποσοτικόπροσδιορισμόμικρώνποσοτήτωνDNAδιπλήςέλικας(dsDNA).ΑνατρέξτεστοΠαράρτημα2γιαοδηγίεςσχετικάμετονποσοτικόπροσδιορισμόαμπλικονίων,χρησιμοποιώνταςόργανοqPCR.

Γρήγορησυμβουλή–Ανκαιπροτείνεταιοποσοτικόςπροσδιορισμόςαμπλικονίων,δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου Holotype HLA.Ηκανονικοποίησηαμπλικονίωνδεναπαιτείακριβήμέτρησητηςσυγκέντρωσηςτων αμπλικονίων. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια εκτίμηση τωνσυγκεντρώσεων αμπλικονίων με βάση την εμπειρία ή την ηλεκτροφόρηση σεπήκτωμα αγαρόζης. Ο ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίων δεν πρέπει ναπαραλείπεταιχωρίςσυνεχήεμπειρίαμετοπλήρεςπρωτόκολλοHolotypeHLA.


ΠλάκαενίσχυσηςΤάξηςI 4°C Βήμα2ΠλάκαενίσχυσηςΤάξηςII 4°C Βήμα2LambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C PromegaQuantiFluordsDNADye(200×) 4°C PromegaΡυθμιστικόδιάλυμαTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

20°Cέως25°C Χρήστης

ExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


Σελίδα25│50

Πρωτόκολλο3.1 –ΠαρασκευάστεπρότυπαDNAμέσωδιαδοχικώναραιώσεωντουπροτύπουDNAΛάμδα

(100 ng/μL) που παρέχεται στο κιτ QuantiFluor, σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακααραίωσης:

Ετικέταστοσωληνάριο DNAεισόδου ΌγκοςDNA(μL) Όγκος1xTE(μL) Τελικήσυγκ.

(ng/μL)Πρότυπο1 DNAΛάμδα 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLΠρότυπο2 Πρότυπο1 250μL 250μL 0,75ng/μLΠρότυπο3 Πρότυπο2 250μL 250μL 0,38ng/μLΠρότυπο4 Πρότυπο3 250μL 250μL 0,19ng/μLΠρότυπο5 Πρότυπο4 250μL 250μL 0,09ng/μLΠρότυπο6 Πρότυπο5 250μL 250μL 0,05ng/μLΤυφλό Τυφλό 0μL 250μL 0ng/μL

3.2 –Προετοιμάστετιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).Διανείμετε99μLρυθμιστικούδιαλύματοςTE1xσταπηγάδιαμιαςοπτικήςπλάκας96πηγαδιώνγιατονσυνολικόαριθμότωναμπλικονίωνγιαταοποίαπραγματοποιείταιποσοτικόςπροσδιορισμός.

3.3 –Προσθέστε1μLαμπλικονίωναπότααντίστοιχαπηγάδιατωνπλακώναμπλικονίωνσεμεμονωμέναπηγάδιατωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

3.4 – Παρασκευάστε διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, χρησιμοποιώντας τονπαρακάτωτύπο:0,5μLχρωστικήςQuantiFluor(200X)+99,5μLρυθμιστικόδιάλυμαTE1×.ΠαρασκευάστεεπαρκέςδιάλυμαεργασίαςχρωστικήςQuantiFluor1×,ώστεκάθεδείγμα(σύνολοδειγμάτωνστιςπλάκεςαμπλικονίων)καιπρότυπο(14συνολικά)ναλάβειγνωστόκλάσμα100μL.

3.5 –Προετοιμάστεμιαπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνκαιπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμού αμπλικονίων. Διανείμετε 100 μL διαλύματος εργασίας της χρωστικήςQuantiFluor 1× στα πηγάδια της οπτικής πλάκας 96 πηγαδιών, που θα αποτελέσει τηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων,καιστιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίωναπότοΒήμα3.2.

3.6 –Χρησιμοποιώνταςταπρότυπαπουπαρασκευάστηκανπαραπάνω,προσθέστε100μLαπόκάθεπρότυπο,ειςδιπλούν,σεμεμονωμέναπηγάδιαστηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων(14πηγάδιασυνολικά).Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

3.7 –Αναμίξτε,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

3.8 –Αναλύστετηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνστοφθορισμόμετροπλάκαςκαιέπειτατιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.


Σελίδα26│50

3.9 –ΥπολογίστετησυγκέντρωσηDNAστιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων,χρησιμοποιώντας δεδομένα RFUπου δημιουργήθηκαν από τοφθορισμόμετρο πλάκας.ΑνατρέξτεστηνκαρτέλαΑραίωση,στοπαρεχόμενοβιβλίοεργασίας,γιαβοήθειαμετουςυπολογισμούς.

3.10 –ΑραιώστεDNAστιςπλάκεςαμπλικονίωνμεH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκαικατάλληλογιαεφαρμογές μοριακής βιολογίας, ώστε η τελική συγκέντρωση DNA να είναι περίπου67ng/μL.

§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι150ng/μLήμεγαλύτερη:προσθέστε25μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι100-150ng/μL:προσθέστε10μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναιμικρότερηαπό100ng/μL:μηνπροσθέσετεH2O

Ομαδοποίησηαμπλικονίων3.11 – Ομαδοποιήστε όλους τους γενετικούς τόπους κάθε δείγματος σε μία πλάκα

ομαδοποιημένων αμπλικονίων. Συνδυάστε τους όγκους που παρατίθενται για κάθεγενετικότόποστονπαρακάτωπίνακα,γιαναλάβετετελικόόγκο35μL:

ΓενετικόςτόποςHLA ΟμαδοποιημένοςόγκοςA 3,5μLB 3,5μLC 3,5μL

DRB1/DRB3 3,5μLDRB4 3,5μLDRB5 3,5μLDPA1 3,5μLDPB1 3,5μLDQA1 3,5μL

DQB1σετ3 3,5μL

3.12 –Προσθέστε4μLExoSAP-ITExpressσεκάθεβιβλιοθήκηδείγματος.Εκπλύνετεταρύγχητωνπιπετώνμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση.Σφραγίστετηνπλάκαμεθερμικόφύλλοσφράγισηςκαιυποβάλετεσεσύντομηφυγοκέντριση.

3.13 – Τοποθετήστε τηνπλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίωνστοθερμικό κυκλοποιητή καιεκτελέστετοπαρακάτωπρόγραμμα:

ΚαθαρισμόςPCRExoSAP-ITExpress

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 37°C 4λεπτά1 80°C 1λεπτό1 4°C ∞


Σελίδα27│50

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Τααμπλικόνιαμπορούννααποθηκευτούνστους4°Cκατάτηδιάρκειατηςνύχταςήστους-20°Cγιαμεγαλύτεροχρονικόδιάστημα.


Σελίδα28│50

Βήμα4–ΠροετοιμασίαβιβλιοθήκηςΔιάρκεια:~3ώρεςΚατά τη διάρκεια αυτού του βήματος, τα ομαδοποιημένα αμπλικόνια προετοιμάζονται γιααλληλούχισηστοIlluminaMiSeq.Πραγματοποιείταιενζυμικόςκατακερματισμόςτωναμπλικονίων,επιδιόρθωσηκαιαδενυλίωσητωνάκρωνκαισύνδεσημελιγάσητωνπροσαρμοστώνμεδείκτεςστα άκρα. Στη συνέχεια, οι βιβλιοθήκες ομαδοποιούνται με ένα βήμα καθαρισμού καισυγκέντρωσηςπουεκτελείταιχρησιμοποιώνταςσφαιρίδιαAMPureXP.

Σημείωση:ΗOmixonσυνιστάόγκουςμεγαλύτερουςαπότουςαπαιτούμενουςγια96 δείγματα, καθώς πολλά από τα ένζυμα και τα ρυθμιστικά διαλύματα είναιιξώδη,μεαποτέλεσμασημαντικέςαπώλειεςκατάτηδιανομήμεπιπέτα.


Πλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίων 4°C Βήμα3Ένζυμοκατακερματισμού(Α) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β) -20°C OmixonΈνζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ) -20°C OmixonΈνζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ) -20°C OmixonΠλάκαπροσαρμοστών -20°C OmixonΣφαιρίδιαAMPureXP 4°C BeckmanCoulterΑιθανόλη80%(πρόσφαταπαρασκευασμένη) 20°Cέως25°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


Πρωτόκολλο4.1 – Ενεργοποιήστε τον θερμικό κυκλοποιητή. Επιβεβαιώστε ότι το θερμαινόμενο καπάκι

θερμαίνεται.

Σημείωση:Υποβάλετεσεπεριδίνησητοένζυμοκατακερματισμού(Α)πριναπότηχρήση.

4.2 –Παρασκευάστετοκύριομείγμακατακερματισμού,σύμφωναμετονπαρακάτωπίνακα:


Σελίδα29│50

Κύριομείγμακατακερματισμού

Αντιδραστήριο Όγκοςανάβιβλιοθήκη(μL)

Συνιστώμενοιόγκοιγια96βιβλιοθήκες(μL)


Ένζυμοκατακερματισμού(Α) 2μL 220,8μL ΚίτρινοΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β)

2μL 220,8μL Κόκκινο

Συνολικόςόγκος 4μL 441,6μL

4.3 –Προετοιμάστεμιαπλάκααντιδραστηρίων:τοποθετήστεμιανέαπλάκαPCR96πηγαδιώνσεέναστατώψύξηςκαιδιανείμετείσηποσότητατουκύριουμείγματοςκατακερματισμούσεκάθεπηγάδιμίαςστήλης.

Σημείωση:ΗαντίδρασηκατακερματισμούέχεισχεδιαστείώστεναπαρέχειτοιδανικόμέγεθοςDNAγιααλληλούχισηστοIlluminaMiSeq.Είναισημαντικό,τααντιδραστήριαναδιατηρηθούνσεχαμηλήθερμοκρασίαμέχριναξεκινήσειηαντίδρασηστοθερμικόκυκλοποιητή,προκειμένουνααποφευχθείουπερβολικόςκατακερματισμός.Συνιστάταιη χρήση πιπετών πολλών καναλιών για την ελαχιστοποίηση της πιθανότηταςυπερβολικούκατακερματισμού.

4.4 – Φυγοκεντρίστε την πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων για 10 δευτερόλεπτα καιτοποθετήστετηνσεπάγοήψυχρόμπλοκ.

4.5 – Προετοιμάστε μια πλάκα αντίδρασης: τοποθετήστε μια νέα πλάκα PCR 96 πηγαδιώνπάνωσεέναμπλοκψύξηςPCR.

4.6 –Προσθέστε4μLκύριουμείγματοςκατακερματισμούαπότηνπλάκααντιδραστηρίωνσταπηγάδια της πλάκας αντίδρασης, που αντιστοιχούν σε δείγματα στην πλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίων.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.

4.7 –Μεταφέρετε16μLκάθεαμπλικονίουαπότηνπλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίωνστοαντίστοιχοπηγάδι της πλάκαςαντίδρασης, χρησιμοποιώνταςπιπέταπολλών καναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

4.8 – Καλύψτε τηνπλάκααντίδρασηςμεθερμικόφύλλοσφράγισης καιφυγοκεντρίστε για10δευτερόλεπτα.

4.9 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςσεθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμακατακερματισμού

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 37°C 10λεπτά1 70°C 15λεπτά1 4°C ∞


Σελίδα30│50

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους 4 °C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 °C για μεγαλύτερο χρονικόδιάστημα.

4.10 – Παρασκευάστε το κύριο μείγμα επιδιόρθωσης άκρων, σύμφωνα με τον παρακάτωπίνακα:

Κύριομείγμαεπιδιόρθωσηςάκρων

Αντιδραστήριο Όγκοςανάβιβλιοθήκη(μL)

Συνιστώμενοιόγκοιγια96βιβλιοθήκες(μL)


H2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

1,25μL 139,2μL

Ένζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) 1,25μL 139,2μL ΠράσινοΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ)

2,5μL 278,4μL Πορτοκαλί

Συνολικόςόγκος 5μL μL

4.11 – Διανείμετε ίση ποσότητα κύριου μείγματος επιδιόρθωσης άκρων σε μία στήλη τηςπλάκαςαντιδραστηρίωνπουδεχρησιμοποιείται.

4.12 –Φυγοκεντρίστετηνπλάκααντίδρασης(πουπεριέχειτακατακερματισμέναδείγματα)για10δευτερόλεπτα.Προσθέστε5μLκύριουμείγματοςεπιδιόρθωσηςάκρωναπότηνπλάκααντιδραστηρίων σε κάθε πηγάδι της πλάκας αντίδρασης. Συνιστάται η χρήση πιπέταςπολλώνκαναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.


4.14 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςσεθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμαεπιδιόρθωσηςάκρων



4.15 – Βγάλτε την πλάκα προσαρμοστών με δείκτες από τη φύλαξη και αποψύξτε σεθερμοκρασίαδωματίου,μετάτηνεκκίνησητουπρογράμματοςεπιδιόρθωσηςάκρωνστον


Σελίδα31│50

θερμικόκυκλοποιητή.Μόλιςηπλάκαπροσαρμοστώνμεταβείσεθερμοκρασίαδωματίου,φυγοκεντρίστεγια3λεπτάστις3.000στροφέςανάλεπτό.

4.16 – Αφαιρέστε προσεκτικά το φύλλο σφράγισης από την πλάκα προσαρμοστών. Μηνανακινήσετε την πλάκα προσαρμοστών αφού αφαιρεθεί το φύλλο σφράγισης,προκειμένουνααποφευχθείηδιασταυρούμενημόλυνση.

4.17 – Μεταφέρετε όλο τον όγκο κάθε πηγαδιού από την πλάκα αντίδρασης (25 μL) στοαντίστοιχοπηγάδιτηςπλάκαςπροσαρμοστών.

Σημείωση: Εφόσον ΔΕΝ πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ολόκληρη η πλάκαπροσαρμοστών, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μόνο τον απαραίτητο αριθμόπροσαρμοστών. Κόψτε το φύλλο σφράγισης μεταξύ των πηγαδιών που θαχρησιμοποιηθούνκαιτωνπηγαδιώνπουθαδιατηρηθούν.Αφαιρέστεπροσεκτικάτοφύλλοσφράγισηςαπότηνπλάκαπροσαρμοστών,αφήνοντάςτοστηθέσητουπάνωαπόταπηγάδιαπουθαδιατηρηθούν.

α.Μεταφέρετε25μLαπόκάθεδείγμαμεεπιδιορθωμέναάκρααπότηνπλάκααντίδρασηςσεέναπηγάδιστηνΠλάκαπροσαρμοστών,αναμιγνύονταςκαλάμετηνπιπέτα,μεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση.

β. Μεταφέρετεόλοτονόγκοκάθεδείγματοςαπότηνπλάκαπροσαρμοστώνστοαρχικόπηγάδιτηςπλάκαςαντίδρασης.

γ. Σφραγίστεπάλιτηνπλάκαπροσαρμοστώνκαιεπαναφέρετέτηνστους-20°C.Χρησιμοποιήστετηνπλάκααντίδρασηςαντίγιατηνπλάκαπροσαρμοστώνγιαταυπόλοιπαβήματατουεγχειριδίου.

4.18 – Παρασκευάστε το κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση. Παρασκευάστε επαρκές κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάσηγιατοκάθεδείγμα.

Κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάση

Αντιδραστήριο Όγκος(μL) Συνιστώμενοιόγκοιγια96βιβλιοθήκες(μL)


Ένζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) 2,5μL 252,5μL ΜπλεΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ)

30μL 3030μL Μαύρο

Συνολικόςόγκος 32,5 3282,5μL

4.19 –Διανείμετετοκύριομείγμασύνδεσηςμελιγάσησε3στήλεςτηςπλάκαςαντιδραστηρίωνπουδεχρησιμοποιούνται.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.

4.20 –Προσθέστε32,5μLκύριουμείγματοςσύνδεσηςμελιγάσησεκάθεπηγάδιτηςπλάκαςαντίδρασης.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.



Σελίδα32│50

4.22 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςστοθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμασύνδεσηςμελιγάση



Ομαδοποίησηκαικαθαρισμόςβιβλιοθήκης4.23 –ΑφήστετασφαιρίδιαAMPureXPναμεταβούνσεθερμοκρασίαδωματίου.Βεβαιωθείτε

ότι είναι ομοιογενή (δεν υπάρχουν συσσωματώματα ή ιζήματα). Προετοιμάστε 5 mLπρόσφαταπαρασκευασμένηςαιθανόλης80%(4mLEtOH+1mLH2O).

4.24 –ΔημιουργήστετηΒιβλιοθήκη,συνδυάζονταςτογνωστόκλάσμααπόκάθεομαδοποιημένοαμπλικόνιο, τώρα πλέον μια βιβλιοθήκη συγκεκριμένου δείγματος, σε ένα σωληνάριομικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης2,0mL.

I. Για 16 ή περισσότερα δείγματα – Υπολογίστε την ποσότητα κάθε βιβλιοθήκηςδείγματοςγιαομαδοποίησησεμίαΒιβλιοθήκησυνολικούόγκου900μL.Διαιρέστετα900μLμετοναριθμότωνβιβλιοθηκώνδείγματος.ΑυτόςείναιοόγκοςγνωστούκλάσματοςπουπρέπειναληφθείαπόκάθεβιβλιοθήκηδείγματοςκαιναπροστεθείμεπιπέταστηΒιβλιοθήκη.

II. Γιαλιγότερααπό16δείγματα–Μεταφέρετε60μLκάθεβιβλιοθήκηςδείγματοςσεμιαΒιβλιοθήκη.

4.25 – Προσθέστε 900 μL σφαιριδίων AMPure XP στο σωληνάριο βιβλιοθήκης. Αναμίξτεσχολαστικάμεσύντομηπεριδίνησηκαιφυγοκέντριση.Μηνεπιτρέψετετοδιαχωρισμότωνσφαιριδίων.Επωάστετηβιβλιοθήκηγια10λεπτάσεθερμοκρασίαδωματίου.

Σημείωση: Εφόσον υπάρχουν λιγότερα από 900 μL βιβλιοθήκης στην τελικήομαδοποιημένηβιβλιοθήκη,προσθέστεισοδύναμηποσότητασφαιριδίωνAMPureXP.Θαπρέπειναυπάρχειαναλογία1:1τηςτελικήςομαδοποιημένηςβιβλιοθήκηςκαιτωνσφαιριδίωνAMPureXP.

4.26 – Τοποθετήστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης σε μια μαγνητική βάση και επωάστε για10λεπτά.

4.27 – Κρατώντας το σωληνάριο πάνω στη μαγνητική βάση, αφαιρέστε και απορρίψτεπροσεκτικά το υπερκείμενο από το σωληνάριο Βιβλιοθήκης, χωρίς να αγγίξετε τασφαιρίδια.


Σελίδα33│50

4.28 –Κρατώνταςτοσωληνάριοπάνωστημαγνητικήβάση,προσθέστε~1,5–2mLπρόσφαταπαρασκευασμένηςαιθανόλης80%στοσωληνάριοΒιβλιοθήκης.Οόγκος τηςαιθανόληςπουπροστίθεταιπρέπειναεπαρκείγιανακαλύψειτασφαιρίδια.

Σημείωση: Εφαρμόστε την αιθανόλη στο τοίχωμα του σωληναρίου χωρίςσφαιρίδια.

4.29 –ΕπωάστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςσεθερμοκρασίαδωματίουγια30δευτερόλεπτακαι,στησυνέχεια,αφαιρέστεκαιαπορρίψτεπροσεκτικάτουπερκείμενο.

4.30 –Επαναλάβετεταβήματα4.28και4.29.

4.31 –ΥποβάλετεγρήγορασεσύντομηφυγοκέντρισητοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςκαιτοποθετήστετοξανάστημαγνητικήβάσημετοκαπάκιανοικτό.Αφαιρέστετηνυπολειπόμενηαιθανόλημεμιαπιπέτα.Μηνακουμπήσετετασφαιρίδια.

Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι το ίζημα σφαιριδίων δεν περιέχει υπολειπόμενηαιθανόλη. Ενδεχομένως να απαιτηθεί η περιστροφή του σωληναρίου στημαγνητικήβάσηγιατηναπομάκρυνσητηςαιθανόλης,χωρίςναδιαταραχθείτοίζημασφαιριδίων.

4.32 –Αφήστετασφαιρίδιαναστεγνώσουνστοναέραγια5-8λεπτάστημαγνητικήβάση,μέχριναστεγνώσειτοίζημασφαιριδίων.

4.33 –ΑφαιρέστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςαπότημαγνητικήβάσηκαιδιενεργήστεέκλουσητηςΒιβλιοθήκηςμε31μLνερούυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας.Μηνεπιτρέψετεστορύγχοςτηςπιπέταςναακουμπήσειτασφαιρίδια,διότιθακολλήσουνεπάνωσεαυτό.

4.34 – Υποβάλετε σε περιδίνηση τη Βιβλιοθήκη, ώστε να επανεναιωρηθούν τα σφαιρίδια.Φυγοκεντρίστε σύντομα, εφόσον στα πλαϊνά τοιχώματα παραμένουν σταγονίδια.Βεβαιωθείτεότιτασφαιρίδιαπαραμένουνσεεναιώρημα.

4.35 –ΕπωάστετηΒιβλιοθήκησεθερμοκρασίαδωματίουγια2λεπτά.

4.36 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςστημαγνητικήβάσηγια2λεπτά.

4.37 –ΣυλλέξτετηΒιβλιοθήκη:Διατηρώνταςτοσωληνάριοτελικήςβιβλιοθήκηςστημαγνητικήβάση, συλλέξτε 31 μL του υπερκείμενου σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1,5ml.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.


Σελίδα34│50

Βήμα5–ΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςΔιάρκεια:~1ώραΤο βήμα 5 παίρνει τη Βιβλιοθήκη από το βήμα 4 και διενεργεί επιλογή μεγέθους,χρησιμοποιώνταςτοPippinPrep.ΤοPippinPrepμπορείναεπιλέξειαυτόματαέναεύροςμεγεθώνθραυσμάτων DNA και να διενεργήσει έκλουση σε ένα θάλαμο συλλογής. Σημείωση: Το BluePippinμπορείναχρησιμοποιηθείαντίγιατοPippinPrep.ΑνατρέξτεστοΠαράρτημα1γιατιςΟδηγίεςχρήσηςτουPippinPrep.

Λίστααντιδραστηρίων

Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεταιαπότην

Κασέταπηκτώματοςαγαρόζης1,5%,χωρίςχρωστική 20°Cέως25°C SageScienceΜείγμαδιαλύματοςφόρτωσης/δείκτηPippin(δείκτηςΚ) 4°C SageScienceΟμαδοποιημένηβιβλιοθήκη 4°C Βήμα4

Σημείωση:ΟΔείκτηςΚχρησιμοποιείται,συνήθως,μετοPippinPrep.ΤοBluePippinχρησιμοποιείτοΔείκτηR2.

Πρωτόκολλο5.1 –ΦέρτετοδιάλυμαφόρτωσηςΔείκτηΚσεθερμοκρασίαδωματίου.

5.2 – Συνδυάστε 31 μL της ομαδοποιημένης βιβλιοθήκης με 10 μL διαλύματος φόρτωσηςΔείκτηΚ.

5.3 –Αναμίξτε,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

5.4 –ΔιαμορφώστετοPippinPrep,έτσιώστενασυλλέξειθραύσματαDNAμεγέθουςμεταξύ650και1300bps.Φορτώστετοδείγμα40μLστηθύραδείγματοςκαιαναλύστε.Οχρόνοςανάλυσηςείναι45-50λεπτά.

5.5 –Συλλέξτεόλοτοπεριεχόμενο(περίπου40μL)απότηθύραέκλουσηςτουPippinPrepκαιμεταφέρετέτοσεένανέοσωληνάριομικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1,5ml.Αυτήείναιηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.


Σελίδα35│50

Βήμα6–Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκηςμε τοόργανοqPCRΔιάρκεια:~1ώρα15λεπτάΗποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθους είναι απαραίτητη για τη βέλτιστηχρήσητηςεξόδουτηςσυσκευήςαλληλούχισηςIlluminaMiSeq.ΗσυγκέντρωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςμπορείναμετρηθείμεακρίβειαμέσωqPCR.Προαιρετικά,μπορείτεναχρησιμοποιήσετετοκιτQubitdsDNABRκαιμιασυσκευήQubitγιατημέτρησησυγκέντρωσηςτηςβιβλιοθήκης.Γιααυτότοπρωτόκολλο,βλ.Παράρτημα3.


10×IlluminaPrimerPremix -20°C KAPABiosystems2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix -20°C KAPABiosystemsStd1(20.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0.20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0.02pM) -20°C KAPABiosystemsIlluminaDNAStandards -20°C KAPABiosystemsH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


ΡυθμιστικόδιάλυμαTE1×(pH8,0) 20°Cέως25°C ΧρήστηςΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους 4°C Βήμα5

Πρωτόκολλο1 –ΠαρασκευάστετομείγμαεκκινητήqPCR,χρησιμοποιώνταςτο10×IlluminaPrimerPremix

καιτο2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix:

Σημείωση:ΤααντιδραστήριατουκιτKAPASYBRFASTqPCR(κύριομείγμαqPCR,προμείγμαεκκινητήκαιδιαλύματαROX)συνδυάζονταικατάτηνπρώτηχρήσητουκιτ. Αυτό το συνδυασμένο διάλυμα διατηρείται σταθερό για τουλάχιστον30 κύκλους ψύξης/απόψυξης. Ακολουθήστε την τεκμηρίωση της KAPA για ναπροσδιορίσετεανταROXσυνιστώνταιγιατοόργανοqPCRσας.

ΜείγμαεκκινητήqPCR

Αντιδραστήριο Όγκος(mL)10×IlluminaPrimerPremix 1mL2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix 5mLΣυνολικόςόγκος 6mL


Σελίδα36│50

2 –ΠαρασκευάστετοκύριομείγμαqPCR.

ΚύριομείγμαqPCR

Αντιδραστήριο Όγκος(μL)ΜείγμαεκκινητήqPCR 228μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας 76μLΣυνολικόςόγκος 304μL

3 –Προετοιμάστεδιαδοχικήαραίωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους.

α. Παρασκευάστε διάλυμα 1:1000, προσθέτοντας 1 μL της βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθουςσε999μLρυθμιστικούδιαλύματοςTE1×(pH8,0),ξεπλένονταςσχολαστικάτορύγχοςτηςπιπέτας.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

β. Παρασκευάστε διάλυμα 1:2000, προσθέτοντας 100 μL του διαλύματος 1:1000 σε100μL τουρυθμιστικούδιαλύματοςTE1× (pH8,0). Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

4 – Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qPCR σε μια νέα πλάκα PCRσυμβατήμετοσύστημαqPCRσας.

5 –Διανείμετε16μLτουκύριουμείγματοςqPCRειςτριπλούνγιαταπρότυπα1-4,τοδιάλυμα1:1000καιτοδιάλυμα1:2000(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).

6 –Διανείμετε4μLτωνπροτύπων1-4,τουδιαλύματος1:1000καιτουδιαλύματος1:2000στααντίστοιχαπηγάδια.

7 – Σφραγίστε την πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qPCR και φυγοκεντρίστε την για10δευτερόλεπτα.

Σημείωση: Αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων στα πηγάδια της πλάκαςποσοτικού προσδιορισμού qPCR. Φυγοκεντρίστε, εφόσον απαιτηθεί για τηνεξάλειψητωνφυσαλίδων.

8 Ορίστετατριπλότυπα1:1000και1:2000ωςστοχευμέναδείγματακαιορίστεταπρότυπα(σημεία: 4, συγκέντρωση έναρξης: 20 pM, αραίωση: 1:10). Εκτελέστε το παρακάτωπρόγραμμαστοόργανοqPCR,προκειμένουναπροσδιορίσετετησυγκέντρωσηDNAστηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους:

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 5λεπτά25

(χωρίςκαμπύλητήξης)95°C 30δευτερόλεπτα60°C 90δευτερόλεπτα(λήψηδεδομένων)

9 –ΓιατημετατροπήτουαποτελέσματοςqPCRαπόσυγκέντρωσηpMσεnM,καταχωρίστετααποτελέσματα«Quantitymean»(Μέσηποσότητα)τωνδύοαντιγράφωνβιβλιοθήκηςστηνκαρτέλα«LibraryQuantitation»(Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκης)τουΒιβλίουεργασίαςOmixon.


Σελίδα37│50

10 –Χρησιμοποιώνταςτουςόγκουςαπότοβιβλίοεργασίας,αραιώστε10μLτηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους,σεσυγκέντρωση2nM,μεαποστειρωμένοH2Oσενέοσωληνάριομικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL. Φυλάξτε την υπόλοιπη βιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςστους-20°C.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.Σεπερίπτωσημακρόχρονηςφύλαξης,συνιστάται ιδιαίτερα η εκ νέου ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πριν από τηνανάλυσηστοMiSeq.


Σελίδα38│50

Βήμα7–ΑλληλούχισηστοIlluminaMiSeqΔιάρκεια:~24–40ώρεςΤο IlluminaMiSeq αποτελεί ένα αυτοματοποιημένο όργανο NGS που μπορεί να διενεργήσειαλληλούχισητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςπουπαρασκευάστηκεσταπροηγούμεναβήματα.Ηδιαίρεσητωνδειγμάτωνμεδείκτεςσεξεχωριστάαρχείαγιακάθεδείκτη/δείγμα(de-multiplexing)πραγματοποιείταιαυτόματα,κατόπινολοκλήρωσηςτηςεκτέλεσηςτηςαλληλούχισης.

Γρήγορησυμβουλή–Μπορείτεναχρησιμοποιήσετεέναπρόσθετο(spike-in)1%PhiXως επιπλέον μάρτυρα για την παρακολούθηση της αντίδρασης αλληλούχισης.ΑνατρέξτεστηντεκμηρίωσητουIlluminaγιαπερισσότερεςπληροφορίεςσχετικάμετομάρτυραPhiX.


Φύσιγγααντιδραστηρίου -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaΚυψελίδαροήςMiSeq 4°C IlluminaΒιβλιοθήκηστα2nM 4°C Βήμα6NaOH1Nή2N 20°Cέως25°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq

ΚιταντιδραστηρίωνIlluminaMiSeq

ΧρόνοςΏρες

Δείγματα96/7


~39 96


~24 96

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 28


~28 12


~17 6

Πρωτόκολλο7.1 –ΠροετοιμάστετοMiSeqσύμφωναμετατυπικάπρωτόκολλαIllumina.


Σελίδα39│50

7.2 – Παρασκευάστε μια αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 1 nM: Συνδυάστε 10 μL πρόσφαταπαρασκευασμένου 0,2 N NaOH και 10 μL της αραιωμένης βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθους 2 nM σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.Επωάστεαυτήτηναποδιαταγμένηβιβλιοθήκη1nMσεθερμοκρασίαδωματίουγια5λεπτά.

7.3 –Παρασκευάστεμιααποδιαταγμένηβιβλιοθήκη20pM:Προσθέστε980μLψυχρούHT1στα20μLτηςαποδιαταγμένηςβιβλιοθήκης1nM.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

7.4 –Παρασκευάστεμιααποδιαταγμένηβιβλιοθήκη9pM:Προσθέστε550μLψυχρούHT1και450 μL της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 20 pM σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1,5mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

7.5 – Μεταφέρετε 600 μL της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 9 pM στο δοχείο φόρτωσηςδειγμάτωντηςφύσιγγαςαντιδραστηρίουτουMiSeq.

Γρήγορησυμβουλή–ΣυνιστάταιηχρήσητουπαρεχόμενουβιβλίουεργασίαςγιατηδημιουργίατουφύλλουδείγματοςπουαπαιτείταιαπότοMiseq.


Σελίδα40│50

Βήμα8–ΑνάλυσητωνδεδομένωναλληλούχισηςHLAΤοIlluminaMiSeqθαυποβάλλεισεεπεξεργασίατηνομαδοποιημένηβιβλιοθήκη9pMκαιθαδημιουργήσειδεδομένααλληλούχισηςωςαρχείαfastq.ΑνατρέξτεστοεγχειρίδιοτουHLATwinγιαβοήθεια,όσοναφοράστησωστήεγκατάστασητουHLATwin,όπωςκαιγιαπληροφορίεςσχετικάμετηνερμηνείατηςανάλυσηςπροσδιορισμούγονοτύπουτωνδεδομένωναλληλούχισης.Γιατηνεφαρμογήτουαυτοματοποιημένουπρωτοκόλλουκαιτωνθεμάτωνπουσχετίζονταιμετηνεγκατάστασηήανάλυσηδεδομένων,επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected].

Αυτοματοποιημένοπρωτόκολλο

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT1. ΕγκαταστήστετοHLATwinServerστοΔιακομιστή.

§ Εγκαταστήστε το HLA Twin Client σε υπολογιστή-πελάτη. Στο διακομιστή μπορούν νασυνδεθούνπερισσότερααπόέναHLATwinClient.

§ ΕπικοινωνήστεμετηνΥποστήριξητηςOmixon([email protected])γιαεξατομικευμένεςοδηγίεςεγκατάστασηςγιααυτοματοποίηση.

Πρωτόκολλοανάανάλυση1. ΕκκινήστετοHLATwinClientκαισυνδεθείτε.

2. Τα δεδομένα έχουν ήδη υποβληθεί ή υποβάλλονται σε επεξεργασία. Ελέγξτε τααποτελέσματα,χρησιμοποιώνταςτοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.

3. Εξαγάγετε τα αποτελέσματα προσδιορισμού γονοτύπου ή/και τις συναινετικέςαλληλουχίεςανάλογαμετιςαπαιτήσεις.

Μηαυτόματοπρωτόκολλοδιακομιστή

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT§ ΕγκαταστήστετοHLATwinServerστοΔιακομιστή.§ ΕγκαταστήστετοHLATwinClientσευπολογιστή-πελάτη.

Πρωτόκολλοανάανάλυση§ ΕκκινήστετοHLATwinClientκαισυνδεθείτε.§ Επιλέξτε τα δεδομέναMiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίηση

HolotypeHLA.§ ΜόλιςολοκληρωθείητυποποίησηHolotypeHLA,ελέγξτετααποτελέσματα,χρησιμοποιώντας

τοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.§ Εξαγάγετετααποτελέσματαπροσδιορισμούγονοτύπουή/καιτιςσυναινετικέςαλληλουχίες

ανάλογαμετιςαπαιτήσεις.


Σελίδα41│50

Μηαυτόματοπρωτόκολλουπολογιστή

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT§ ΕγκαταστήστετοHLATwinDesktop.

Πρωτόκολλοανάανάλυση6 ΕκκινήστετοHLATwinκαισυνδεθείτε.

7 Επιλέξτε τα δεδομέναMiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίησηHolotypeHLA.

8 ΜόλιςολοκληρωθείητυποποίησηHolotypeHLA,ελέγξτετααποτελέσματα,χρησιμοποιώνταςτοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.

9 Εξαγάγετετααποτελέσματαπροσδιορισμούγονοτύπουή/καιτιςσυναινετικέςαλληλουχίεςανάλογαμετιςαπαιτήσεις.


Σελίδα42│50

Συμπληρωματικέςεικόνες

Παράδειγμαπλάκας για την πλάκααμπλικονίων, πλάκα ενίσχυσης,πλάκααραίωσης,πλάκαποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(γιαέναγενετικότόπο)καιπλάκααντίδρασης

Παράδειγμαπλάκαςποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων


Σελίδα43│50

Παράδειγμα πλάκας qPCR ποσοτικού προσδιορισμού βιβλιοθήκηςKAPA


Σελίδα44│50

Παράρτημα1:PippinPrep

ΠρογραμματισμόςτουPippinPrep1. ΚάντεκλικστηνκαρτέλαProtocolEditor(Επεξεργασίαπρωτοκόλλου)και,στησυνέχεια,

στοκουμπί«New»(Νέο).

2. ΚάντεκλικστοεικονίδιοφακέλουπουβρίσκεταιδίπλαστοπεδίοCassette(Κασέτα)καιεπιλέξτε«1.5%DFMarkerK»(ΔείκτηςΚDF1,5%)γιατοPippinPrepή«1.5%DFMarkerR2»(ΔείκτηςR2DF1,5%)γιατοBluePippin.

3. Στηστήληπουπρογραμματίζετε:

α. Επισημάνετετοπεδίο«Range»(Εύρος).β. Ορίστε την τιμή «Ref Lane» (Στήλη αναφοράς), ώστε να ταιριάζει με τον αριθμό

στήληςστονοποίοεργάζεστε.γ. Ορίστετοπεδίο«Start*»(Έναρξη*)στηντιμή650.δ. Ορίστετοπεδίο«End*»(Λήξη*)στηντιμή1300.

4. ΣτοπεδίοReferenceLane(Στήληαναφοράς),επιλέξτετηνστήληστηνοποίαεργάζεστε.

5. Κάντεκλικστοκουμπί«SaveAs»(Αποθήκευσηως)καιδώστεόνομαστοπρόγραμμάσας.

ΕκτέλεσητουPippinPrep1. Ενεργοποιήστε το Pippin Prep, πιέζοντας το κουμπί λειτουργίας στο πίσω μέρος της

συσκευής.

2. Επιθεωρήστεοπτικά τοPippinPrep.Βεβαιωθείτεότι οι 5 ενδεικτικές λυχνίες LEDείναιαναμμένεςκαιότιτοεσωτερικότηςσυσκευήςείναικαθαρόκαιστεγνό.

3. ΚάντεκλικστολογότυποSageScienceστηνκάτωδεξιάγωνίατηςοθόνης.Θασαςζητηθείνα καταχωρήσετε έναν κωδικό πρόσβασης. Ο εργοστασιακά προεπιλεγμένος κωδικόςπρόσβασηςείναι«pips».

4. ΚάντεκλικστηνκαρτέλαFactorySetup(Εργοστασιακήρύθμιση)καιβεβαιωθείτεότιητιμήBase-to-Threshold(Βάσηέωςκατώφλι)έχειοριστείσε0,02.

5. Τοποθετήστε τη διάταξη βαθμονόμησης στο εσωτερικό του Pippin Prep, φροντίζονταςώστεησκούραλωρίδαναείναιστραμμένηπροςτακάτωκαιπάνωαπότιςενδεικτικέςλυχνίεςLED.

6. ΣτηνκαρτέλαMain(Κύρια),κάντεκλικστοκουμπί«Calibration»(Βαθμονόμηση).

7. Στο παράθυροCalibration (Βαθμονόμηση), βεβαιωθείτε ότι το πεδίο «Target I pHmA»(ΣτόχοςIpHmA)έχειοριστείστηντιμή0,80(0,60γιατοBluePippin)και,στησυνέχεια,πιέστετοκουμπί«Calibration»(Βαθμονόμηση).

8. Μεταβείτε στην καρτέλα Protocols (Πρωτόκολλα). Κάντε κλικ στο κουμπί «Load»(Φόρτωση)καιεπιλέξτετοπρόγραμματουHolotypeHLAκαιτησυγκεκριμένηστήληπουθαχρησιμοποιήσετε.Βεβαιωθείτεότι:


Σελίδα45│50

α. Ησωστήστήληείναιενεργοποιημένηβ. Ηένδειξηεπιλογήςευρέωςφάσματοςείναιενεργοποιημένηγ. Ηστήληαναφοράςείναιηίδιαμετηστήληπουθαεκτελεστεί.

9. ΜεταβείτεστηνκαρτέλαMain(Κύρια).Βεβαιωθείτεότι:

α. Τοπρόγραμμαπουέχετεφορτώσειείναιτοεπιλεγμένο.β. Έχειεπιλεγείηκατάλληληστήληαναφοράςκαιότιείναιεπίσηςηστήληόπουθα

αναλυθείτοδείγμα.

10. Επιθεωρήστε την κασέτα. Προτού αφαιρέσετε την ταινία που σφραγίζει τα πηγάδια,βεβαιωθείτεότιδενυπάρχουνφυσαλίδεςπίσωαπότηθύραέκλουσης.Σεπερίπτωσηπουυπάρχουν φυσαλίδες πίσω από τη θύρα έκλουσης, χτυπήστε ελαφρά και κυλήστε τηνκασέταστοχέρισας,έτσιώστενααπομακρυνθούνοιφυσαλίδες.

11. Τοποθετήστετηνκασέτα,διατηρώνταςτηνταινίαπάνωαπόταπηγάδια,στοεσωτερικότουPippinPrep.

12. Αφαιρέστεπροσεκτικά την ταινία,φροντίζοντας να τηναπομακρύνετεαπό την καθαρήπλευράτηςκασέτας(στήλη5)προςτηχρησιμοποιημένηπλευρά(στήλη1).Προσέξτεναμηχυθείυγρόκατάτηναφαίρεσητηςταινίας,προκειμένουνααποφευχθείημόλυνση.

13. Αφαιρέστεόλοτονόγκοτουρυθμιστικούδιαλύματοςαπότηθύραέκλουσηςτηςστήληςπου θα χρησιμοποιήσετε και προσθέστε 40 μL νέου ρυθμιστικού διαλύματοςηλεκτροφόρησηςσεεκείνητηθύραέκλουσης.

14. Προσθέστεμιαστενήλωρίδαταινίαςπάνωστιςθύρεςέκλουσης.

15. Οιτυχόνδεξαμενέςπουείναιπλήρειςλιγότεροαπότα3/4πρέπεινασυμπληρωθούνμερυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Μην παραγεμίσετε τα πηγάδια! Το άκρο τουρυθμιστικούδιαλύματοςπρέπειναφτάνειοριακάτοπλαστικό,ναμηνείναιυψηλότερο,γιατηναποφυγήμετακίνησηςκατάτηνολίσθησητουκαπακιού.Εφαρμόστερυθμιστικόδιάλυμααπότακαθαράπηγάδια(Στήλη5)σταχρησιμοποιημέναπηγάδια(Στήλη1).

16. Βεβαιωθείτε ότι τα πηγάδια φόρτωσης (πηγάδια με αγαρόζη) έχουν πληρωθεί μερυθμιστικόδιάλυμαηλεκτροφόρησης.Τορυθμιστικόδιάλυμαπρέπειείναιοριακάπάνωαπότηναγαρόζηκαιεντελώςεπίπεδο.

17. Κλείστε το Pippin Prep αργά, φροντίζοντας, ώστε το ρυθμιστικό διάλυμα να μηνακουμπήσειτοκαπάκικαθώςκλείνετετησυσκευή.

18. Εκτελέστετηδοκιμήσυνέχειας.Μόλιςστεγνώσουνελαφρώςοιαισθητήρες,ηαποτυχίατηςδοκιμήςσυνέχειαςμιαφοράαποτελείσυνηθισμένοφαινόμενο.Εφόσοναποτύχειηδοκιμήσυνέχειας,εκτελέστετηνμίαακόμηφορά.Μόλιςολοκληρωθείηδοκιμήσυνέχειας,ανοίξτε αργά το Pippin. Φροντίστε να μην υπάρξει μεταφορά υγρού κατά μήκος τηςκασέταςαπότοκαπάκιτουPippinPrep.

19. Υποβάλετε το διάλυμα φόρτωσης Δείκτη Κ σε σύντομη περιδίνηση και σύντομηφυγοκέντριση.Προσθέστε10μLδιαλύματοςφόρτωσηςΔείκτηΚστηβιβλιοθήκη~30μL.

20. Υποβάλετετηβιβλιοθήκησεσύντομηπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.


Σελίδα46│50

21. Αφαιρέστε 40 μL ρυθμιστικού διαλύματος από το πηγάδι δείγματος που θαχρησιμοποιήσετε.

22. Προσθέστε 40 μL της βιβλιοθήκης με τον Δείκτη Κ στο πηγάδι δείγματος που θαχρησιμοποιήσετε.

23. Σημειώστετααρχικάτουτεχνικούκαιτηνημερομηνίαστηστήληπουχρησιμοποιείτε.

24. ΚλείστετοPippinPrepκαικάντεκλικστοκουμπί«Start»(Έναρξη).Βεβαιωθείτεότιέχειενεργοποιηθείηκατάλληληστήλη.Τοδείγμαθαυποβληθείσεεπεξεργασίαγιαπερίπου45λεπτά.

25. Μόλιςολοκληρωθείηεπεξεργασία,ανοίξτεπροσεκτικάτοPippinPrep.Προσέξτεναδείτεεάντοκαπάκιμεταφέρειτυχόνυγρόκατάμήκοςτηςκασέτας.

26. Αφαιρέστετηνταινίααπότιςθύρεςέκλουσης,προσέχονταςναμηνπιτσιλιστείυγρό.

27. Μεταφέρετε όλο τον όγκο από τη θύρα έκλουσης σε ένα νέο σωληνάριο χαμηλήςδέσμευσης1,5mL.

28. Καλύψτε όλα τα ανοικτά πηγάδια με δύο κομμάτια της ταινίας σφράγισης πλακών.Θυμηθείτε να αφήσετε μια προεξοχή στην καθαρή πλευρά. Αυτή θα διευκολύνει τηναφαίρεσητηςταινίαςαπότηνκαθαρήπροςτηχρησιμοποιημένηπλευρά.

29. Τοποθετήστετησφραγισμένηκασέταστηθήκητηςκαιαφήστετηνστηνάκρη.

30. ΠάρτετηνκασέταπλύσηςκαιγεμίστετηνμενερόMiliQ.ΚλείστεπροσεκτικάτοκαπάκιτουPippinPrep,προσέχονταςναμημεταφέρετευγρόκατάμήκοςτηςκασέταςπλύσης.

32. ΔιατηρείστετοPippinPrepκλειστόγιααρκετάδευτερόλεπτα.

33. Ανοίξτε το Pippin Prep, προσέχοντας να μη μεταφέρετε υγρό κατά μήκος της κασέταςπλύσης.

34. Αφαιρέστετηνκασέταπλύσης,αδειάστετονερόκαιαφήστετηνναστεγνώσει.

35. ΣκουπίστετυχόννερόαπότοPippinPrepκαικλείστετοπροσεκτικά.

36. Επιλέξτετοκουμπί«ShutDown»(Τερματισμόςλειτουργίας)στομενούτουPippinPrep.


Σελίδα47│50

Παράρτημα 2: Ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίωνμετοόργανοqPCRΔιάρκεια:2ώρες


ΡυθμιστικόδιάλυμαTE20×(pH7,5) 4°C PromegaLambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C PromegaΧρωστικήQuantiFluordsDNA200× 4°C PromegaΑποστειρωμένοH2O 20°Cέως25°C ΧρήστηςΠλάκα(ες)ενίσχυσηςΤάξηςI 4°C Βήμα2Πλάκα(ες)ενίσχυσηςΤάξηςII 4°C Βήμα2

Πρωτόκολλο2. Δημιουργήστεμιαδιαδοχικήαραίωση,χρησιμοποιώνταςσωληνάριαμικροφυγόκεντρου

1,5 mL και το πρότυπο DNA Λάμδα της QuantiFluor (100 ng/μL). Ακολουθήστε τονπαρακάτωπίνακααραίωσης:

Ετικέταστοσωληνάριο DNAεισόδου ΌγκοςDNA(μL) Όγκος1xTE

(μL)Τελικήσυγκ.

(ng/μL)Πρότυπο1 DNAΛάμδα 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLΠρότυπο2 Πρότυπο1 250μL 250μL 0,75ng/μLΠρότυπο3 Πρότυπο2 250μL 250μL 0,38ng/μLΠρότυπο4 Πρότυπο3 250μL 250μL 0,19ng/μLΠρότυπο5 Πρότυπο4 250μL 250μL 0,09ng/μLΠρότυπο6 Πρότυπο5 250μL 250μL 0,05ng/μLΠρότυπο7,Τυφλό Τυφλό 0μL 250μL 0ng/μL

3. Προετοιμάστετιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες). Διανείμετε 49,5μL ρυθμιστικούδιαλύματος TE1xσταπηγάδιαμιας καθαρήςπλάκας 96 πηγαδιών για τον συνολικό αριθμό των αμπλικονίων για τα οποίαπραγματοποιείταιποσοτικόςπροσδιορισμός.

4. Προσθέστε0,5μLαμπλικονίωναπότααντίστοιχαπηγάδιατωνπλακώναμπλικονίωνσεμεμονωμέναπηγάδιατωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

5. Παρασκευάστε διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, χρησιμοποιώντας τονπαρακάτωτύπο:0,25μLχρωστικήςQuantiFluor(200X)+49,75μLρυθμιστικόδιάλυμαTE1×. Παρασκευάστε επαρκές διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, ώστε κάθε


Σελίδα48│50

δείγμα(σύνολοδειγμάτωνστιςπλάκεςαμπλικονίων)καιπρότυπο(14συνολικά)ναλάβειγνωστόκλάσμα50μL.

6. Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων και πλάκες ποσοτικούπροσδιορισμού αμπλικονίων. Διανείμετε 50 μL διαλύματος εργασίας της χρωστικήςQuantiFluor1×σεπηγάδιαοπτικώνπλακών96πηγαδιών,χρησιμοποιώνταςτημορφήτηςπλάκαςποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνκαιτωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).

7. Χρησιμοποιώνταςταπρότυπαπουπαρασκευάστηκανπαραπάνω,προσθέστε50μLαπόκάθεπρότυπο,ειςδιπλούν,σεμεμονωμέναπηγάδιαστηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων(14πηγάδιασυνολικά).

8. Αναμίξτεσχολαστικά,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

9. ΤοποθετήστεκάθεπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούστοόργανοqPCR,μίακάθεφορά,καιεκτελέστετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 25°C 10δευτερόλεπτα

225°C 15δευτερόλεπτα25°C 30δευτερόλεπτα(λήψηδεδομένων)

10. Υπολογίστε τη συγκέντρωση DNA στις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων,χρησιμοποιώνταςταανεπεξέργασταδεδομέναRFUπουδημιουργήθηκαναπότοόργανοqPCR.

11. Αραιώστε DNA στις πλάκες αμπλικονίων με αποστειρωμένο H2O, έτσι ώστε η τελικήσυγκέντρωσηDNAναείναιπερίπου67ng/μL.

§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι150ng/μLήμεγαλύτερη:προσθέστε25μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι100-150ng/μL:προσθέστε10μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναιμικρότερηαπό100ng/μL:προσθέσετε0μLH2O


Σελίδα49│50

Παράρτημα 3: Ποσοτικός προσδιορισμός βιβλιοθήκηςμε χρήση παρεμβαλλόμενης φθορίζουσας χρωστικήςdsDNAΔιάρκεια:~15λεπτάΗσυγκέντρωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςμπορείναμετρηθείμεακρίβεια,μέσωπαρεμβαλλόμενης φθορίζουσας χρωστικής dsDNA, όπως η SYBR green ή ισοδύναμη. Ταεμπορικάδιαθέσιμακιτκαιόργαναγιααυτόντονσκοπόπεριλαμβάνουν,ενδεικτικά,τησυσκευήανάγνωσηςQubitτηςThermoFisher(χρησιμοποιείτοκιτανάλυσηςQubitBroad-RangedsDNA),τησυσκευήανάγνωσηςQuantus τηςPromega (χρησιμοποιεί τηφθορίζουσαχρωστικήdsDNAQuantifluor) και άλλα. Εδώ περιγράφεται η μέθοδος Qubit, καθώς είναι το όργανο πουχρησιμοποιείταισυνήθως.Σεπερίπτωσηπουχρησιμοποιείταιάλλοόργανοκαικιτ,ακολουθήστετιςτυπικέςοδηγίεςτουκατασκευαστή.

Σημείωση:ΑυτήηφθοριομετρικήμέθοδοςdsDNAείναιέναςγρήγορος,ωστόσοαρκετάακριβής,τρόποςκαθορισμούτηςσυγκέντρωσηςτηςτελικήςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους.ΜετράειόλοτοdsDNAπουβρίσκεταιστηβιβλιοθήκη.


ΚιτανάλυσηςQubitdsDNABR θερμοκρασίαδωματίου ThermoFisherΠρότυπαQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους 4°C Βήμα5

Πρωτόκολλο6.1 – Φέρτε τα Πρότυπα Qubit σε θερμοκρασία δωματίου. Προετοιμάστε τα σωληνάρια

ανάλυσηςQubit(500μL,λεπτούτοιχώματος)γιατηβιβλιοθήκη,ειςδιπλούν,καιγιαταδύοπρότυπα.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαιφυγοκέντρισηταπρότυπακαιτηβιβλιοθήκη.

6.2 – Προσθέστε 995 μL ρυθμιστικού διαλύματος και 5 μL χρωστικής σε σωληνάριοφυγοκέντρισης1,5mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

6.3 –Μεταφέρετε190μLαπότομείγμααντιδραστηρίωνστασωληνάριαQubit για ταδύοπρότυπα.Μεταφέρετε198μLαπότομείγμααντιδραστηρίωνσταδύοσωληνάριαQubitγιαταδιπλότυπατηςβιβλιοθήκης.

6.4 –Προσθέστε10μLτουπροτύπου1στοαντίστοιχοσωληνάριοQubitκαιυποβάλετέτοσεπεριδίνησηγια2δευτερόλεπτα.Επαναλάβετεμετοπρότυπο2.

6.5 –Προσθέστε2μLτηςβιβλιοθήκηςσταδύοαντίστοιχασωληνάριαQubitκαιυποβάλετεσεπεριδίνησηγια2δευτερόλεπτα.


Σελίδα50│50

6.6 –ΕπωάστετασωληνάριαQubitσεθερμοκρασίαδωματίουγια2λεπτά.

6.7 –ΕνεργοποιήστετοόργανοQubitκαιεπιλέξτεπρωτόκολλοBR.

6.8 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοQubitμετοπρότυπο1καιπιέστεGO.Επαναλάβετεμετοπρότυπο2.

6.9 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοβιβλιοθήκηςστοQubitκαιπιέστεGO.Επαναλάβετεγιατοαντίγραφο.

6.10 –ΓιατημετατροπήτουαποτελέσματοςQubitαπόσυγκέντρωσηng/μLσεnM,καταχωρίστετη μέση συγκέντρωση των δύο αντιγράφων βιβλιοθήκης στην καρτέλα «LibraryQuantitation»(Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκης)τουΒιβλίουεργασίαςOmixon.

6.11 – Χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα από τη μέτρηση Qubit, αραιώστε 10 μL τηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους,σεσυγκέντρωση2nM,μεαποστειρωμένοH2Oσενέοσωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL. Φυλάξτε την υπόλοιπηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςστους-20°C.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.Σεπερίπτωσημακρόχρονηςφύλαξης,συνιστάται ιδιαίτερα η εκ νέου ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πριν από τηνανάλυσηστοMiSeq.

H HLA™ 96/11 Δ A CE Δ B CE (ΑΝΑΦ: ΑΝΑΦ: Ο 1 2018/05/02CE... · 2018-05-14 ·...

Documents

Transcript of H HLA™ 96/11 Δ A CE Δ B CE (ΑΝΑΦ: ΑΝΑΦ: Ο 1 2018/05/02CE... · 2018-05-14 ·...